Yöntem makalesi

Nakavt Fare Üretimi için Oviduktal Nükleik Asitler Teslimatına Dayalı In Vivo Elektroporasyon Tekniği ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68704

⸱

26 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

Bu makalede

Özet

Oviductal Nükleik Asitler Yoluyla Geliştirilmiş Genom Düzenleme (I-GONAD) yönteminin etkinliği, donör dişilerden zigot toplanmasını ve yalancı hamile kadınlara aktarılmasını gerektiren geleneksel mikroenjeksiyon ile karşılaştırılabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 ile indüklenen mutasyonları kromozom 6'daki ROSA26 lokusuna sokarak etkinliğini gösterir.

Özet

Nakavt fareler oluşturma yöntemleri tipik olarak üç ana adımı içerir: (1) donör dişilerden embriyoların toplanması, (2) genetik yapıların ex vivo olarak zigotlara mikroenjekte edilmesi ve (3) bunların cerrahi olarak yalancı hamile dişilerin yumurta kanalına aktarılması. Bu süreç, sadece donör dişileri değil, aynı zamanda vazektomize edilmiş erkekleri ve yalancı gebe kadınları da içerdiğinden önemli sayıda hayvan gerektirir. Ayrıca, fare zigotlarının sitoplazmasına veya pronükleusuna yapılan mikroenjeksiyonlar, iğne tıkanması, yüksek elastikiyet nedeniyle zar geçirgenliği sorunları ve potansiyel embriyo ölümü gibi zorluklar sunar. Nepa21 gibi gelişmiş elektroporatörlerin geliştirilmesi, Oviductal Nucleic Acid Delivery (I-GONAD) Yoluyla Geliştirilmiş Genom Düzenleme olarak bilinen bir yöntemle tek bir adımda hedeflenen gen nakavtlarına sahip fareler üretmek için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu teknik, CRISPR-Cas bileşenlerinin (Cas9 proteini ve kılavuz RNA) gebe kaldıktan 0.7 gün sonra hamile kadınların yumurta kanallarına mikroenjekte edilmesini ve ardından bu bileşenleri doğrudan zigotlara iletmek için in vivo elektroporasyonu içerir. I-GONAD prosedürünü takiben, hamile fare, hedeflenen gen nakavtı ile yavruları taşır ve doğurur. Bu makale, farelerde I-GONAD yönteminin uygulanması için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlayarak, geleneksel nakavt fare oluşturma tekniklerine daha verimli ve erişilebilir bir alternatif sunar.

Giriş

Hastalıkların genetik temellerini anlamak, etiyolojilerinin ve patogenezlerinin altında yatan moleküler mekanizmaları tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bu araştırmadaki önemli bir adım, insan hastalıklarını simüle eden hedefli gen nakavtlarına sahip hayvan modellerinin geliştirilmesidir. Fareler, insanlara genel genomik benzerlikleri, küçük boyutları, kısa ömürleri ve yüksek doğurganlıkları nedeniyle bu çalışmalar için özellikle değerlidir. Fare modelleri hem temel araştırmalar hem de klinik öncesi testler için önemlidir1.

CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak nakavt bir fare oluşturmak için, araştırmacılar tipik olarak bir zigota bir kılavuz RNA ve Cas9 nükleaz kompleksi enjekte eder, bu da hedef DNA'da çift iplikli bir kırılmaya neden olur ve böylece hücrenin onarım sistemini kırılma bölgesinde bir mutasyona neden olacak şekilde aktive eder 1,2. Zigotlara mikroenjeksiyon bu amaç için altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, bu yöntem birkaç adım gerektirir: embriyoları donör dişilerden izole etmek, genetik yapıların zigotlara mikroenjeksiyonlarını yapmak ve bunları cerrahi olarak yalancı hamile kadınların yumurta kanallarına aktarmak. Sonuç olarak, donör dişiler, vazektomize erkekler ve yalancı gebe dişiler dahil olmak üzere çok sayıda hayvanın bakımı gereklidir. Ek olarak, zigotların izolasyonu, donör dişilerin ötenazisini gerektirir. Bu nedenle, 3R'lerin (Değiştirme, Azaltma, İyileştirme) ilkelerine uygun olarak hayvan kullanımını en aza indiren protokoller tercih edilir3.

Nepa21 sisteminin kullanımı gibi elektroporasyon teknolojisindeki gelişmeler, Oviductal Nükleik Asitlerin Verilmesi (I-GONAD) yoluyla Geliştirilmiş Genom düzenlemesi olarak bilinen bir teknik kullanarak tek bir adımda hedeflenen gen nakavt fareleri oluşturmak için eşsiz bir fırsat sağlar4. Süper Elektroporatör NEPA21 Tip II, yüksek embriyo canlılığını korurken yüksek elektroporasyon verimliliği sağlayan 4 aşamalı çok darbeli bir elektroporasyon sistemi kullanır. I-GONAD, CRISPR-Cas bileşenlerinin (Cas9 proteini (500-600 ng / μl) ve kılavuz RNA (80-100 ng / μl)) gebe kaldıktan 0.7 gün sonra hamile farelerin yumurta kanallarına mikroenjekte edilmesini ve ardından bu bileşenleri doğrudan zigotlara5 vermek için in vivo elektroporasyonu içerir. I-GONAD prosedüründen sonra, hamile fare, hedeflenen gen nakavt 6,7,8 ile yavrular doğurur. Bu yöntemin etkinliği istenen hedefe bağlı olarak değişir, ancak standart mikroenjeksiyon bazlı tekniklerle karşılaştırılabilir (yaklaşık %50)9,10. Ek olarak, I-GONAD potansiyel olarak diğer türlerde genom düzenleme için uyarlanabilir.

Bu makalede, nakavt fareler oluşturmak için I-GONAD yöntemini uygulamak için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Örnek olarak, etkinliği, fare kromozomu 6 üzerindeki ROSA26 genom lokusunu hedef alarak gösterilmiştir. Bu lokus, daha sonra çeviri yapılmadan yapısal transkripsiyona tabi tutulduğu için seçilmiştir. Bu nedenle, bu lokusta bir mutasyonun ortaya çıkmasının, ortaya çıkan yavruların sağlığı üzerinde olumsuz bir etkisi olması olası değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Saint Petersburg Devlet Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No. 131-03-5, 11 Ekim 2022). Tüm prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen yönergelere sıkı sıkıya bağlı kalmıştır. Ortak laboratuvar dışı yetiştirilmiş suşu CD1 fareleri, Rusya Bilimler Akademisi Fizyolojik Olarak Aktif Bileşikler Enstitüsü (IPAC RAS) Toplu Kullanım Merkezi'nden elde edildi. 2-3 aylık dişi CD1 fareleri (ortalama ağırlık 27-30 g), 2.5-4 aylık (ortalama ağırlık 35-37 g) erkek CD1 fareleri ile çiftleşme için kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tasarımı ve transfeksiyon için hazırlanması

  1. Seçilen ilgilenilen geni hedefleyen potansiyel sgRNA dizilerini belirlemek için CHOPCHOP, SYNTHEGO Nakavt Kılavuz Tasarımı veya CRISPOR gibi hesaplamalı analiz araçlarını kullanın.
    NOT: Yazılım, tüm gen boyunca potansiyel sgRNA dizilerini tanımlayabilir ve çıktıda birden fazla varyant önerir. Bu araçlar, en uygun sgRNA seçeneklerini önerecek ve kullanıcının gerekirse tanımlanan tüm varyantlar arasından seçim yapmasına izin verecektir. Seçim yaparken aşağıdaki kriterleri göz önünde bulundurun:
    1. Ekzon yakınlığı: İstenen mutasyon noktasına mümkün olduğunca yakın olan eksonlarda bulunan dizileri seçin. Daha iyi sonuçlar için, alternatif ekleme izoformlarını göz önünde bulundurun ve çoğu izoformda bulunan hedef diziyi seçin. Doğru ekzon seçimi için genom tarayıcılarını (örneğin, Ensembl) düşünün.
    2. Hedef dışı hususlar: Aracın puanlama sistemini kullanarak potansiyel hedef dışı etkileri analiz edin ve tahmin edilen en düşük hedef dışı etkinliği sergileyen dizileri seçin.
      NOT: CHOPCHOP veya Synthego gibi hesaplama araçları, ekzon yakınlığını ve hedef dışı etkileri değerlendirmek için oldukça etkilidir ve hassas genom düzenleme için en uygun sgRNA dizilerini belirlemeye yardımcı olur. Kılavuz RNA'ları tasarlarken, kullanılan fare suşunda ilgilenilen genin spesifik dizisini dikkate almak önemlidir. Bazı fare suşları için (örneğin, C57Bl, CBA, C3H), tam genomik dizi mevcuttur. Bu tür veriler mevcut değilse, planlanan düzenleme bölgesinde hedef genin ön diziliminin yapılması tavsiye edilebilir. Polimorfizmlerin neden olduğu kılavuz RNA'daki tek uyumsuzluklar, düzenleme verimliliğini tehlikeye atabilir. ROSA 26 fare genom lokusu, sgRNA dizisi ile hedeflendi: 5'-ACTCCAGTCTTTATTAGA-3'.
  2. Tablo 1'de açıklandığı gibi sgRNA şablonu PCR amplifikasyonu için bir dizi primer sipariş edin.
    NOT: gRNA, sgRNA veya crRNA:tracrRNA dubleks olarak başka bir yerde sipariş edilebilir.
  3. Doğrusal bir dsDNA şablonu oluşturun.
    1. Ana karışımı Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlayın. Sonunda polimerazı ekleyin ve stabiliteyi korumak için ana karışımı buz üzerinde tutun.
    2. PCR'yi aşağıdaki koşullar altında çalıştırın: İlk denatürasyon: 95 °C'de 30 sn; 30 döngü: 95 °C'de 20 sn (denatürasyon), 55 °C'de 20 sn (tavlama), 72 °C'de 15 sn (uzatma); Son uzama: 72 °C'de 2 dakika; 4 °C'de tutun.
  4. PCR reaksiyon karışımını daha fazla In Vitro Transkripsiyon (IVT) reaksiyonunda kullanın.
    1. IVT ana karışımını Tablo 2'de belirtildiği gibi hazırlayın ve 37 ° C'de 1,5 saat inkübe edin. Tutarlı sıcaklık kontrolü için bir termodöngüleyici kullanın.
    2. 2 μL DNaz I ekleyin ve DNA şablonunu çıkarmak için 37 ° C'de 30 dakika daha inkübe edin.
    3. Reaksiyon karışımını 75 ° C'de 5 dakika inkübe ederek DNaz I'i inaktive edin.
    4. Üreticinin protokolüne göre TRIZOL reaktifi kullanarak RNA'yı saflaştırın.
      NOT: TRIZOL reaktifinin ve DNAse1'in, çözeltilerinin veya herhangi bir yan ürününün atılması, belirlenmiş kimyasal atık kaplarına yerleştirilmelidir.
    5. Bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün (bir reaksiyonun tipik verimi 3-5 μg'dir). A260 / A280 ve A260 / A230 oranlarını kontrol edin. A260 / A280 en az 2.0 olmalı ve A260 / A230 oranı da en az 2.0 olmalıdır (yani proteinler veya organik çözücüler tarafından kontaminasyon yoktur). sgRNA'ları kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
  5. RNP karışımını transfeksiyon için hazırlayın
    1. Transfeksiyon karışımı, Cas9 proteini ve sgRNA'nın bir karışımı olan bir RNP kompleksinden oluşur. RNP karışımını hazırlamak için şu adımları izleyin:
    2. 1 M Tris-HCl (pH 7.5) tamponunu nükleaz içermeyen su kullanarak 100 mM'ye seyreltin ve 0.022 μM gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresi kullanarak süzün, 10 μL'lik porsiyonlarda alikot yapın ve kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
    3. Nükleaz içermeyen bir tüpte, son konsantrasyonlarda aşağıdaki bileşenlerin transfeksiyon karışımını hazırlayın: 500 ng/μL spCas9 nükleaz, 80 ng/μL sgRNA, DEPC ile muamele edilmiş su ile seyreltilmiş 10 mM Tris-HCl.
      NOT: Protokolün uygun verimliliğini sağlamak için RNP karışım bileşenlerinin yüksek konsantrasyonları gereklidir.
    4. RNP kompleksinin oluşumuna izin vermek için transfeksiyon karışımını 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    5. Karışımı, tek bir I-GONAD seansı için uygun olan küçük hacimlere (2 μL) ayırın.
    6. I-GONAD seansı sırasında alikotları 4 °C'de tutun. Karışım, stabiliteyi korumak için her I-GONAD elektroporasyon seansı için taze olarak hazırlanır.
      NOT: Optimum aktivite ve verimliliği sağlamak için RNP karışımı her I-GONAD seansı için taze olarak hazırlanmalıdır.

2. Dişi farelerin oviductal nükleik asit iletimi yoluyla genom düzenleme için hazırlanması

  1. Dişi farelerin çiftleşmesi ve seçimi: CD1 dişi fareleri gece boyunca tek yuvalı CD1 erkek farelerle eşleştirin. Sabahları, dişi farelerde çiftleşme tıkaçlarının varlığını kontrol edin. Çiftleşme tapaları olan dişileri seçin ve daha sonraki prosedürler için yeni bir kafese aktarın.
    NOT: Genetik mozaikliği en aza indirmek için, genetik yapının verilmesi için en uygun zaman, tek hücreli (zigot) aşama10'da çiftleşmeden 0.7 gün sonradır. Bu, çiftleşme tapasının tespit edildiği gün yaklaşık olarak saat 16:00'ya karşılık gelir. Bu aşamada, yumurta kanalının diseksiyonu, zigotların ampullada kalmalarına rağmen daha az kümülüs hücresine sahip olduğunu ortaya çıkarır. Özellikle, kümülüs hücreleri, elektroporasyon sırasında eksojen nükleik asitleri veya proteinleri de alabilir. Prosedür daha önce, örneğin çiftleşmeden 10 saat sonra gerçekleştirilirse, kümülüs hücreleri hala zigotları sıkıca çevreler, bu da nükleik asitlerin zigotlara verimli elektroforetik verilmesini engelleyebilir. Hormonal olarak uyarılan fareleri kullanmayın, çünkü aşırı sayıda oosit verebilirler ve bu da düşüklere neden olabilir.
  2. Cerrahi aletlerin hazırlanması: Steriliteyi sağlamak için tüm paslanmaz çelik cerrahi aletleri otoklavlayın.
  3. Farelerin anestezi ve hazırlanması: Seçilen dişi fareleri tartın ve ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı kullanarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre).
    1. Yeterli anesteziyi doğrulamak için fareleri ayak parmağı sıkıştırma refleksinin kaybı açısından izleyin. İşlem sırasında vücut ısısını korumak için anestezi uygulanmış fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Veteriner merhemi uygulayarak anestezi sırasında farenin gözlerini kuruluktan koruyun.

3. Cerrahi prosedür

  1. Farenin sırt (sırt) bölgesini %70 etanol kullanarak dezenfekte edin.
  2. Alt sırt bölgesinde 0,7 cm boyuna bir cilt kesisi yapın.
  3. Kesi bölgesini %70 etanole batırılmış pamuklu bir bezle silin ve kesi çevresindeki tüyleri alın.
  4. Hafifçe açılmış makas uçları ile yanal iterek kesiği 1,3 cm'ye kadar uzatın.
  5. Karın boşluğuna erişmek için peritonda dikkatlice küçük bir kesi (0,7 cm) yapın.
  6. Hafifçe açılmış makas uçları ile yanal iterek kesiği 1,1 cm'ye kadar uzatın.
  7. Yumurtalığa bağlı yağ pedini bulun ve yumurtalık, yumurta kanalı ve rahim açıkça görünene kadar forseps kullanarak yavaşça dışarı çekin.
  8. Bir damar kelepçesi kullanarak yağ pedini yerine sabitleyin.
  9. Hassas manipülasyon için yumurta kanalını stereoskopik mikroskop altında görselleştirin (Şekil 1).
  10. 2 μL enjeksiyon karışımını bir Striptizci Pipetleyici kullanarak plastik bir kılcal damara yükleyin.
    NOT: Başlangıçta IVF kliniklerinde embriyolarla manipülasyonlar için tasarlanmış plastik kılcal damarlı Striptizci Pipetleyici, I-GONAD prosedürlerinde embriyo transferi ve CRISPR / Cas9 yapı dağıtımı dahil olmak üzere birden fazla uygulamayı destekleyebilir. Pipetleyici, hassas bir sıvı dağıtıcı olarak işlev görür; Tek kullanımlık esnek kılcal damarlarla birlikte steriliteye izin verir ve çapraz kontaminasyonu önler. Plastik kılcal damarlar, hassas dokular için daha az travmatik olduklarından, yumurta kanalına transfeksiyon için RNP karışımını enjekte etmek için cama tercih edilir. Cam kılcal damarların aksine, tek kullanımlık plastik olanlar, yerleştirmeden önce keskin kenarları düzleştirmek için alevle parlatma gerektirmez, bu da hazırlık süresini ve hasar riskini azaltır.
  11. Mikro makas kullanarak, ampullanın birkaç milimetre yukarısındaki yumurta kanalı duvarında küçük bir kesi (0,2 cm) yapın.
  12. Plastik kılcal damarlı Stripper Pipetleyiciyi dikkatlice insizyona yerleştirin ve enjeksiyon karışımını yumurta kanalına boşaltın.
    NOT: Elektroporasyonun verimliliğini etkileyebileceğinden, yumurta kanalına hava girmediğinden emin olun.
    Bunu önlemek için, enjeksiyon plastik kılcal damarını gerekenden daha fazla enjeksiyon karışımı ile doldurun ve tam enjeksiyondan kaçının. Plastik kılcal damarlar hem infundibulum transferi hem de infundibulum ile ampulla arasında direkt yumurta kanalı duvar diseksiyonu için uygundur. Direkt yumurta kanalı duvarı diseksiyon yöntemi, infundibulum transferinden daha az travmatik olabilir, çünkü infundibulum transferi, yumurta kanalını ve infundibulumu kaplayan ince bursa membranından ilk insizyon gerektirir. CD1 farelerinde, bu zar oldukça vaskülarizedir ve kesilmesi küçük kanamaya neden olabilir, bu da görünürlüğü engelleyebilir ve RNP karışımının mikroenjeksiyonunu zorlaştırabilir.
  13. Plastik kılcal damarı yumurta kanalından yavaşça çıkarın.

4. Elektroporasyon ve dikiş

  1. Ön paneldeki düğmeye basarak elektroporatörü açın.
  2. Elektroporasyon parametrelerini ayarlayın: Gözenek darbesi: Voltaj: 50 V, Darbe uzunluğu: 5 m, Darbe aralığı: 50 ms, Darbe sayısı: 3, Bozunma oranı -% 10, Polarite: +/-; Transfer darbesi: Voltaj: 10 V, Darbe uzunluğu: 50 ms, Darbe aralığı: 50 ms, Darbe sayısı: 3, Bozunma oranı -% 40, Polarite: +/-; Akım sınırı: in vivo.
  3. Cımbız tipi elektrotları kullanarak, yumurta kanalını dikkatlice kavrayın ve elektroporatör üzerindeki kΩ düğmesine basarak direnç değerini kontrol edin. Direncin optimum 350-400 Ω aralığında kalması için elektrotların yeterince sıkıştırıldığından emin olun.
    NOT: Bu, sağlam yumurta kanalı aralarına sıkıştırıldığında iki elektrot arasındaki mesafeyi ayarlayarak elde edilebilir.
    1. Direnci ölçtükten hemen sonra, elektroporasyonu başlatmak için Başlat düğmesine basın. Bu adım, CRISPR-Cas bileşenlerinin zigotlara4 verimli bir şekilde iletilmesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Ω düğmesinin bir "son" sinyali göstermesini bekleyin. Ölçümler çerçevesinde gösterilen değerleri not edin.
      NOT: Empedans değeri, canlılık ve transfer verimliliği arasında optimum dengeyi sağlamak için voltaj değerinin yaklaşık 250-400 Ω/150-250 mA olmalıdır. Bu dengeyi korumak için, bazı protokollerde önerilen Dulbecco'nun modifiye fosfat tamponlu tuzlu suyuna (DPBS) batırılmış bir ıslak kağıt parçasıyla yumurta kanalı bölgelerinin kaplanmasından kaçının, çünkü bu adım direnci optimum aralığın ötesinde önemli ölçüde azaltabilir. Azalan direnç, voltajı 250 mA'nın üzerine çıkararak hücre ölümüne yol açabilir.
  4. Bir yumurta kanalında elektroporasyonu tamamladıktan sonra, üreme sistemini dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin. 4-0 poliglikolik asit cerrahi sütür kullanarak insizyonu dikin.
  5. İkinci yumurta kanalında işlemi ve elektroporasyonu tekrarlayın. Tamamlandığında, üreme sistemini karın boşluğuna geri koyun ve insizyonu yukarıda tarif edildiği gibi dikin.
  6. İşlem sonrası izleme: Fareyi iyileşme için ılık (37 °C), temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin.
    NOT: Ameliyattan sonra fareleri, kafes başına iki fare içeren kafeslere koyun. Sadece bir fare ameliyat olduysa, ona eşlik eden bir dişi fare sağlayın. Bu uygulama, cerrahi fare için gereksiz stresi azaltmaya yardımcı olur ve daha doğal bir sosyal ortamı teşvik eder.

5. Genotipleme

  1. Astar tasarımı
    1. Genotipleme için, uzunluğu 300-600 bp arasında olan bir PCR ürününü çoğaltmak için astarlar tasarlayın. Primerler 18-21 nükleotid uzunluğunda ve erime sıcaklığı (Tm) yaklaşık 60 °C olmalıdır.
    2. İkincil yapılar veya astar dimerleri oluşturan dizilerden kaçının. Astar kalitesini sağlamak için PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 veya benzeri yazılım araçlarını kullanın.
    3. Primer özgüllüğünü doğrulamak ve spesifik olmayan amplifikasyondan kaçınmak için fare genom veritabanında bir BLAST araması yapın11.
      NOT: Aşağıdaki primerler, hedef dizinin genotiplendirilmesi için tasarlanmıştır: İleri primer: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'; Ters astar: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', beklenen PCR ürün uzunluğu: 320 bp ve Tm 62°C. Sanger dizilimi için, Cas9 kesim bölgesinden 150-200 bp uzakta tavlayan bir sıralama astarı tasarlayın.
  2. DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Hızlı DNA ekstraksiyonu için, Hotshot izolasyon protokolü12 en basit olanıdır.
    1. Bir kulak zımbası kullanarak, farenin kulağından küçük bir doku parçası (yaklaşık 2 mm) toplayın.
    2. 100 μL lizis tamponu ekleyin (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA, pH = 12).
    3. 95 ° C'de 60 dakika inkübe edin, karışımı her 20 dakikada bir girdaplayın.
    4. 100 μL Nötralize Edici Tampon (40 mM Tris-HCl, pH = 5) ekleyin ve iyice girdaplayın.
    5. PCR için son hazırlığın 1-5 μL'sini kullanın.
  3. PCR amplifikasyonu ve dizileme. PCR ana karışımını Tablo 3'te belirtildiği gibi hazırlayın. Yüksek doğruluğu sağlamak için bir düzeltme okuması DNA polimeraz kullanın. Ana karışımı gerekli sayıda tüpe yerleştirin ve genomik DNA ekleyin.
    NOT: Sıralama analizi için kontrol olarak her zaman vahşi tip bir DNA örneği ekleyin.
  4. ROSA26 genotiplemesi için PCR'yi çalıştırın. Aşağıdaki koşullar kullanıldı: İlk denatürasyon: 95 ° C'de 30 s; 28 döngü: 95 °C'de 20 sn (denatürasyon), 62 °C'de 20 sn (tavlama), 72 °C'de 20 sn (uzatma); Son uzama: 72 °C'de 2 dakika; 4 °C'de tutun.
    NOT: Sağlanan protokol, adım 1.1.2'deki primerler kullanılarak ROSA26 lokus fragmanı (tahmini boyut 320 bp) amplifikasyonu için doğrudur. Daha spesifik ve doğru amplifikasyon için, amplifikasyon döngülerinin sayısını 28-30 ile sınırlayın.
  5. Sıralama ve analiz
    1. Elde edilen PCR fragmanlarının Sanger dizilimini gerçekleştirin (adım 5.4).
    2. Sıralama sonuçlarının analizi
      NOT: Başarılı transfeksiyon, dizileme kromatogramında nükleaz kesim bölgesinin yakınında ek DNA dizilerinin ortaya çıkmasıyla tanımlanabilen mozaik hayvanlarla sonuçlanacaktır. Genomdaki kesin indelleri tanımlamak ve ölçmek için EditCo ICE Analysis veya TIDE13 gibi hesaplama araçlarını kullanın.
      1. ICE Analizini kullanmak için, elde edilen Sanger dizileme dosyalarını yükleyin (düzenleme olmadan wt mouse PCR ürün dizisi için kontrol .ab1 dosyası ve deney faresi PCR ürün dizisi için deney .ab1 dosyası), kılavuz RNA dizisini girin ve CRISPR deneyinde kullanılan nükleazı seçin.
        NOT: ICE Analiz aracı, genel düzenleme verimliliğini hesaplayacak ve örnekte bulunan tüm farklı düzenleme türlerinin profillerini ve göreli bolluklarını belirleyecektir.
      2. TIDE'yi kullanmak için kılavuz RNA dizisini girin, elde edilen Sanger dizileme dosyalarını yükleyin (düzenleme olmadan wt fare PCR ürün dizisi için .ab1 dosyasını kontrol edin ve deney faresi PCR ürün dizisi için deney .ab1 dosyasını deneyin) ve Parametreleri kontrol edin (bazı durumlarda, Gelişmiş ayarlar 10 bp'den büyük indelleri bulmaya yardımcı olabilir).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Elektroporasyon başarılı olursa, deney fareleri: (1) bir avuç yavru doğuracak ve (2) bazı hayvanların genomunda farklı indeller olacaktır. Genotipleme primerleri iyi tasarlanmışsa ve PCR programı optimalse, PCR ürünü agaroz jel üzerinde istenen boyutta bir şeffaf bant olarak bulunacaktır. Nükleaz hedef DNA'yı başarılı bir şekilde keserse, elde edilen hayvanlar muhtemelen mozaik olacak ve genomda bir dizi indel'e sahip olacaktır. Genomdaki tam indelleri bulmak için EditCo ICE Analysis vey...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

I-GONAD yöntemini kullanarak nakavt fareler üretmenin verimliliği, geleneksel mikroenjeksiyon teknikleriyle karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, geleneksel yöntemler, zigotların donör dişilerden izole edilmesini, mikroenjeksiyonların yapılmasını ve embriyoların yalancı hamile kadınların yumurta kanallarına nakledilmesini içerir. Buna karşılık, I-GONAD yöntemi, genom düzenleme bileşenlerini doğrudan hamile kadınların yumurta kanallarına ileterek, zigot izolasyonu ve nakli ihtiyacını ort...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, St Peterburg Üniversitesi Araştırma Parkı, Moleküler ve Hücre Teknolojileri Merkezi'ne minnettardır. Dizileme, Saint Petersburg Devlet Üniversitesi Bilim Parkı, Moleküler ve Hücre Teknolojileri Kaynak Merkezi'nde bir ABI 3500 xL Genetik Analiz Cihazı (Thermo Fisher Scientific, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Yazarlar, belgelerin düzenlenmesi ve sunulmasındaki yardımları için Maria Rubel'e minnettardır. Bu araştırma Saint Petersburg Devlet Üniversitesi, araştırma projesi ID: 129658320 tarafından finanse edildi ve Luibov Shkodenko, Rusya Bilim Vakfı tarafından desteklendi (proje 25-26-00247).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5– 5 uL pipet Termo Bilimsel4642020
1.5 mL tüpAptaca1003/G
100-1000 uL pipet Termo Bilimsel4642090
200 uL tüpAxygenPCR-02-C
20-200 uL pipet Termo Bilimsel4642080
2-20 uL pipet Termo Bilimsel4642060
4x Jel Yükleme BoyaBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963,0500
DNaz I, RNaz-free (1 U/μ L)Thermo FisherEN0521
dNTP Set, 100 mM ÇözümTermo BilimselR0181
DreamTaq Yeşil DNA Polimeraz (5 U/μ L)Termo BilimselEP0713
Dulbecco' s modifiye fosfat-tamponlu tuzluSigma AldrichD8537
EditCo ICE Analizihttps://ice.editco.bio/#/04.06.2025 tarihinde erişildi
EDTA 0.5M çözeltisi, pH = 8AppliChemA4892,0500
Topluluk  https://www.ensembl.org/index.html09.06.2025 tarihinde erişildi
Ethidium bromidBiolabmixEtBr-10
Göz jeli damlaları" Oftagel"URSAPHARM204604
Gel-belgeleme sistemi ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  09.06.2025 tarihinde erişildi
Entegre DNA Teknolojileri https://eu.idtdna.com09.06.2025 tarihinde erişildi
Mikrocerrahi makasMedin URALM124
NEPA21 elektroporatörüNepa GeniNEPA21CUY652P2.5X4 elektrodla
NTP Seti, 100 mM ÇözümTermo BilimselR0481
OligonukleotidlerEvrogenDoğrudan düzen, standart tuz arıtma arıtma
Opti-MEM I İngenezilmiş Serum OrtamıThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netSürüm 1.1.21.
Füzyon Yüksek Hassasiyetli DNA Polimeraz (2 U/μ L)Termo BilimselF530L
Pipet 10 uL uçlarıUlplastHT-10-960
Pipet 1000 uL uçlarıUlplastHT-1000-576
Pipet 200 uL uçlarıUlplastHT-200-960
Güç kaynağı " Elf-4"DNA teknolojisiPS-400 YENI
RNAse/DNA içermeyen suInvitrogen10977049
Tuzlu çözeltiPanEcoP011n
SE-1 horisontal elektroforez sistemiHeliconSE-1
Sodyum HidroksitSigma-AldrichS5881-500G
Step100 DNA MerdiveniBiolabmixS-8100
Stereomikroskop SMZ1000Nikon5-363376
Soyucu mikropipetterCooperSurgicalMXL3-STR
Soyucu uçlarıORIGIOMXL3-125
Cerrahi İğne;KMIZ4A1- 0,6& kez; 20
Dikiş pensepleriMedin URALM302.2
Dikiş pensepleriMedin URALM303
Dikiş ipliği POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
SYNTHEGO Knockout Rehberi Tasarımı https://design.synthego.com/#/09.06.2025 tarihinde erişildi
T100 amplifikatörüBioRad10014822
T7 RNA polimeraz Termo BilimselEP0111
TBE 10x tamponBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/04.06.2025 tarihinde erişildi & NBSP;
Tris hidroklorürSuzhou Yacoo BilimiSYS-S0005-0.5
Trizma hidroklorür çözeltisiSigma AldrichT2663
TRIzol ReaktifiInvitrogen15596026
TrueCut Cas9 ProteiniInvitrogenA36499
Evrensel makasMedin URALM147
KsilazinInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilVirbac Laboratuvarı2000443714739.00

Kaynaklar

  1. Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
  2. Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Kobayashi, Y., et al. Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9 (4), 957(2020).
  5. Takabayashi, S., et al. Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein. Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).
  6. Sato, M., et al. Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice. Cells. 9 (3), 546(2020).
  7. Kessler, S., et al. A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest. Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).
  8. Kaneko, T., Tanaka, S. Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts. Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).
  9. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  10. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19 (1), 25(2018).
  11. Marshall, O. J. PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).
  12. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  13. Brinkman, E. K., Van Steensel, B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).
  14. Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).
  15. Iwata, S., et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation. Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).
  16. Abe, M., et al. A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes. Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).
  17. Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo. STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9Ribon kleoprotein KompleksiZigot ElektroporasyonuSanger DizilemeRehber RNA Tasar mPCR Genotipleme

İlgili makaleler