Yöntem makalesi

Ücretsiz Hesaplama Araçlarını Kullanarak Kütle Spektrometresi Tabanlı Proteomik Verilerde Gezinme

DOI:

10.3791/68707

⸱

19 Ağustos 2025

 , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Molemuse Biotech Studio

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik veriler açık veritabanlarında mevcuttur ve ücretsiz araçlar kullanılarak erişilebilir. Veritabanı aramalarının ve açıklamalarının karmaşıklığı göz önüne alındığında, birçok biyolog bu veri kümelerini kullanma bilgisinden yoksundur. Burada, temel proteomik veri aramaları için ücretsiz araçların kullanımına ilişkin bir kılavuz sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veriye Bağlı Edinim (DDA) ve Veriden Bağımsız Edinim (DIA) dahil olmak üzere kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik veriler, biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, proteomik verilerin etkili bir şekilde nasıl aranacağı ve analiz edileceğine dair net gösterilerin olmaması nedeniyle, bu veri kümelerinin doğrulama çalışmalarında uygulanması hala sınırlıdır. Bu boşluğu doldurmak için, proteomik veri analizi iş akışını ve protein arama sonuçlarının aşağı akış sonrası işlenmesini daha iyi göstermek için PRoteomics IDEntifications Database (PRIDE) veri havuzunda depolanan bir DDA ve bir DIA veri seti seçtik. Gösterim amacıyla iki ücretsiz hesaplama aracı kullandık: DDA veri kümeleri için FragPipe (v22.0) ve DIA veri kümeleri için DIA-NN (2.1.0). Volkan grafikleri ve düzensiz protein listeleri oluşturma gibi işlem sonrası adımlar, R kodu kullanılarak gösterildi. Bu çalışma, proteomik verileri aramak ve analiz etmek için temel protokoller sağlayarak, proteomik veri kümelerini etkili bir şekilde ele almak için temel bir başlangıç kılavuzu görevi görür. Bu çalışma sayesinde, araştırmacıları biyolojik araştırmalarında proteomik verilerden yararlanmak için gerekli bilgilerle güçlendirmeyi amaçlıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomik alanı, araştırma yeteneklerini geliştirmede ve veri paylaşımı kültürünü teşvik etmede etkili olan açık erişimli veri havuzlarının ve özgür yazılım araçlarının1 yaygın olarak benimsenmesiyle devrim yaratmıştır. PRIDE2 gibi merkezi kaynakların kurulması ve İnsan Proteom Organizasyonu (HUPO) Proteomik Standartlar Girişimi (PSI)3 tarafından standartlaştırılmış veri formatlarının geliştirilmesi, verilerin yeniden kullanımı ve entegrasyonu için benzeri görülmemiş bir fırsat yaratmıştır. Bununla birlikte, proteomik verilerin analizi ve yorumlanması, özellikle kendi deneysel sonuçlarının ortogonal doğrulamasını yapmak isteyen biyologlar ve doktor bilim adamları için hala önemli teknik engeller sunmaktadır4. Bu makale, araştırmacıların kamu proteomik verilerini kendi bulgularıyla bağımsız olarak sorgulamaları, analiz etmeleri ve entegre etmeleri için erişilebilir bir çerçeve sağlamak için satıcıdan bağımsız bir hesaplama iş akışı sunarak bu zorluğu doğrudan ele almaktadır, böylece ek ıslak laboratuvar deneylerine ihtiyaç duymadan sağlam ortogonal doğrulamayı kolaylaştırmaktadır. Bu çalışma, kendi deneylerinde tanımlanan spesifik proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu ortogonal olarak doğrulamak ve çok çeşitli yayınlanmış çalışmalarda ilgilendikleri proteinlerin ekspresyon modellerini keşfederek yeni hipotezler oluşturmak isteyen araştırmacılar için özellikle uygundur. Adım adım bir kılavuz sağlayarak, daha geniş bir bilim insanı yelpazesini kamu proteomik verilerinin tam potansiyelinden yararlanmaları için güçlendirmeyi ve sonuçta araştırmalarının sağlamlığını ve etkisini artırmayı amaçlıyoruz.

Kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomiklerde, MS1 ve MS2 taramaları veri toplama için temeldir. MS1 taramaları veya anket taramaları, bir numunedeki tüm iyonların kütle-yük (m/z) oranlarını tespit eder ve ölçer ve iyon popülasyonuna kapsamlı bir genel bakışsağlar 5. Parçalanma taramaları olarak da adlandırılan MS2 taramaları, MS1 taramasından seçilen spesifik öncü iyonların izole edilmesini ve parçalanmasını içerir ve peptit tanımlaması için parça iyon spektrumları oluşturur6.

Veriye bağlı edinim (DDA), MS2 parçalanması için MS1 taramalarından en bol bulunan iyonları seçer ve analizi kolaylaştıran daha basit spektrumlar üretir. Bununla birlikte, DDA, karmaşık örneklerde stokastik örneklemeye ve eksik değerlere yol açarak tekrarlanabilirliği sınırlayabilir7. Buna karşılık, veriden bağımsız edinim (DIA), tüm iyonları önceden tanımlanmış m/z pencereleri içinde sistematik olarak parçalayarak kapsamlı kapsama alanı sağlar ve eksik değerleri en aza indirir. Bu, nicel doğruluğu ve tekrarlanabilirliği8 artırır, ancak DIA, son derece karmaşık MS2 spektrumlarını9 çözmek için gelişmiş hesaplama araçları gerektirir.

PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride)2, proteomik verilerin paylaşılması için küresel bir platform olan ProteomeXchange Konsorsiyumu (https://www.proteomexchange.org)10 içinde lider bir havuzdur. Kullanıcılar, ilgilendikleri veri kümelerini bulmak için anahtar kelime aramalarını kullanarak bu geniş kaynakta verimli bir şekilde gezinebilir.

Derin sinir ağlarından yararlanan bir yazılım paketi olan DIA-NN11, veriden bağımsız edinim (DIA) proteomik verilerini analiz etmek için altın standart bir araçtır. Tanımlama ve nicelik belirleme doğruluğunda mükemmeldir, bu da onu karmaşık DIA veri kümelerini işlemek için özellikle etkili kılar12. Veriye bağlı edinim (DDA) iş akışları için, FragPipe boru hattına entegre edilen MSFragger13, ultra hızlı peptit tanımlaması sunar. Yenilikçi parça-iyon indeksleme yaklaşımı, geleneksel aletlerden 100 kattan fazla daha hızlı performans göstererek hızlı spektral eşleştirmeye olanak tanır.

Bu kapsamlı veri tabanları ve gelişmiş araçlarla donatılan araştırmacılar, çapraz çalışma doğrulaması ve yeni biyolojik keşifler için proteomik verileri kolayca yeniden kullanabilirler. Bu erişilebilirlik, çeşitli hastalıklarda çok sayıda protein biyobelirtecinintanımlanmasını sağlamıştır 14,15, prognoz tahmininiiyileştirdi 16 ve proteomik profillere17 dayalı moleküler alt tip sınıflandırmasını mümkün kıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: İş akışına genel bir bakış için Şekil 1'eve kullanılan yazılımın ayrıntılı açıklamaları için Malzeme Tablosuna bakın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Çalışma tasarımına genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Örnek dosya ve yazılım kurulumu

NOT: Tüm uygulamalar bireysel araştırma kullanımı için ücretsizdir ve kişisel bir bilgisayarda çalıştırılabilir (Windows ve Linux desteklenir).

  1. Bir proje için yeni bir dizin oluşturun.
  2. JMU_LM2_8526_55.raw, JMU_LM2_8568_51.raw, JMU_LM2_8696_37.raw, JMU_LM2_2112_87.raw, JMU_LM2_2195_91.raw, JMU_LM2_2377_73.raw, 20150127_liver_XH03_T_01.raw, 20150127_liver_XH03_T_02.raw, 20150127_liver_XH03_T_03.raw, 20150127_liver_XH03_P_01.raw, 20150127_liver_XH03_P_02.raw, PRIDE'dan 20150127_liver_XH03_P_03.raw.
    NOT: İki dosya grubu https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273'dan indirilebilir ve ayrı ayrı https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 edilebilir (Şekil 2).
  3. Gerekli yazılım araçlarını indirin ve yükleyin.
    1. DIA-NN'nin en son sürümünü .msi dosyası olarak indirin. DIA-NN, Windows için bir .msi dosyası veya Linux için .zip dosyası olarak ücretsiz olarak https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0
    2. MSFileReader'ın en son sürümünü .exe dosyası olarak indirin. MSFileReader, ham biçimlendirilmiş Thermo Fisher DIA verilerini işlemek için gerekli olan https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe'dan bir .exe dosyası olarak ücretsiz olarak kullanılabilir.
    3. .NET SDK'nın en son sürümünü .exe dosyası olarak indirin. .NET SDK, Windows'ta MSFileReader'ı yürütmek için gerekli olan https://dotnet.microsoft.com/en-us/download'dan .exe bir dosya olarak ücretsiz olarak kullanılabilir.
    4. FragPipe'ın en son sürümünü .zip dosyası olarak indirin. FragPipe, https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases'dan .zip bir dosya olarak ücretsiz olarak edinilebilir. FragPipe'ı çalıştırmak için gerekli olan Windows için bir Java çalışma zamanı içerdiğinden jre içeren zip dosyası önerilir. MSFragger, FragPipe'a gömülüdür.
  4. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'den R ve Rstudio ve R betik dosyalarının en son sürümünü indirin. R ve RStudio, https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe ve https://posit.co/download/rstudio-desktop/'dan ücretsiz olarak indirilebilir.
  5. Sıkıştırılmış dosyaları açın ve üzerine tıklayın. exe veya .msi Uygulamaları yüklemek için Dosyalar.

2. DIA-NN kullanarak DIA veri analizi

  1. Referans proteome fasta dosyasını UniProt'tan indirin. Homo sapiens referans proteomunu indirmek için (izoform bilgileri dahil değildir) https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 gidin (Şekil 3A).
  2. Referans proteom dosyasını DIA-NN'ye yüklemek için FASTA Ekle düğmesine tıklayın.
  3. Öncü iyon oluşturma bölümü altında kitaplıksız arama / kitaplık oluşturma ve Derin öğrenme tabanlı spektrumlar, RT'ler ve lMs tahmini için FASTA özeti olmak üzere iki seçeneği seçin. Tahmin edilen bir spektral kitaplık oluşturmak için Çalıştır düğmesine tıklayın (Şekil 3B).
    1. Tahmin edilen spektral kitaplık dosyası oluşturulduktan sonra, tahmin edilen kitaplığı eklemek için Spektral düğmesine tıklayarak bunu aynı deneysel edinim ayarlarındaki diğer deneyler için yeniden kullanın.
  4. Öncü iyon oluşturma bölümü altındaki iki seçeneğin işaretini kaldırın ve DIA verilerini yüklemek için Giriş bölümü altındaki dosya biçimiyle ilişkili olan Tür düğmesine tıklayın.
  5. Algoritma altındaki Kütle Doğruluğu ve MS1 Doğruluğunu 0.0 ppm olarak ayarlayın.
  6. Deneysel ayarlara göre Öncü iyon oluşturma parçası altındaki öncü ve parça kütle aralığı ayarlarını yapın.
  7. Diğer varsayılan ayarları koruyun.
    1. DIA-NN'nin öncü üretimi, kısmi sindirimi modellemek için 1 kaçırılmış bölünme ile Tripsin / P (prolin tarafından takip edilmedikçe K / R'den sonra ayrılır) kullanır; kanonik olmayan peptitler (ör., immünopropetinomikler) için N-term M eksizyonunu devre dışı bırakın veya daha uzun peptitler için kaçırılan bölünmeleri 2'ye çıkarın.
    2. Translasyon sonrası modifikasyon (PTM) çalışmaları için Değişken modifikasyonları (varsayılan olarak devre dışıdır) açıkça etkinleştirin (örneğin, oksidasyon için Ox (M), ubikitinasyon için K-GG) ve peptit filtrelerini genişletin (uzunluk: 7-30 aa; şarj: 1-4+; öncü M/Z: 300-1800) büyük PTM'ler veya triptik olmayan sindirmeler için deneysel ayarlara (örn. uzunluk: 5-50 aa, şarj=1-6) göre.
    3. Algoritma ayarları, hassas kütle hizalaması için otomatik kalibrasyondan (kütle doğruluğu=0,0 ppm) yararlanır (düşük çözünürlüklü cihazlar için manuel toleranslarla (örneğin, 10 ppm) geçersiz kılar ve Çalıştırmalar Arası Eşleştirme (MBR), kimlikleri çalıştırmalar arasında aktarır (heterojen örnekler için devre dışı bırakır).
    4. Sinir ağı puanlaması, tanımlama güvenilirliğini artırır (düşük veri kalitesi olmadıkça korur), Quant Etiketsiz Kütle Spektrometresi (UMS) ise yüksek hassasiyetli etiketsiz niceleme sağlar; izobarik etiketler (örneğin, TMT) için MS2 miktar tayinine geçin. Spektral kitaplık gereksinimlerini atlamak için kitaplıksız aramayı yalnızca yüksek çözünürlüklü DIA verileriyle kullanın.
  8. Çalıştır düğmesine tıklayın. İşlem arayüzünde çalıştırmanın tamamlandığını belirten Bitti mesajı görüntülenene kadar sonuçları bekleyin (Şekil 3C).

3. FragPipe kullanarak DDA veri analizi

  1. Kurulumdan sonra ~\FragPipe\fragpipe\bin klasöründeki Fragpipe simgesine tıklayın. Tüm bağımlı ayarlar Config sekmesinde görülebilir. Bilgisayarınızda üç modülün (MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN ve Python) bulunup bulunmadığını kontrol edin. Değilse, İndir/Güncelle veya İndir'e tıklayarak indirin (Şekil 4A).
  2. Sonraki sekme olan İş Akışı'na geçin. İş akışı için Varsayılan'ı seçin ve İş akışını yükle'ye tıklayın. Dosya yolları eklemek için Dosya ekle'ye tıklayın. Dosya ata altında deney adı ve biyoçoğalt numarası atayın veya bırakın (Şekil 4B).
  3. Şimdi, Veritabanı'na tıklayın ve o sekmeye dönün. Örneklerin türüne göre bir fasta dosyası yükleyin veya herhangi bir fasta dosyasını indirin. İndirirken, basit bir çalıştırma için Yalnızca gözden geçirilen diziler, Tuzaklar ekle ve Ortak kirleticiler ekle seçeneklerini seçin (Şekil 4C).
  4. Ardından sekmeyi değiştirmek için MSFragger'a tıklayın. Kapalı Arama varsayılan yapılandırmasını seçin ve Yükle'ye tıklayın.
    NOT: Kapalı arama, temel olarak ayarladığınız değişiklikler için bir aramadır, açık arama ise verilerden olası tüm değişiklikleri keşfeder, bu da daha fazla zaman ve bellek tüketir.
  5. Tepe eşleştirme için, zaman kazandıracağı için Kalibrasyon ve Optimizasyon için Hiçbiri'nin seçilmesinin önerilmesi dışında varsayılan ayarları koruyun.
  6. Protein sindirimi için parametreleri deney koşullarına göre ayarlayın. Aşağıdaki varsayılan ayarları koruyun (Şekil 5A).
    NOT: Öncü ve parça kütle toleransları (± 20 ppm), deneysel spektrumları teorik peptitlerle eşleştirmek için izin verilen maksimum kütle hatasını tanımlar ve yüksek çözünürlüklü cihazlar için daha sıkı değerler önerilir. Enzim kuralları (sıkı tripsin) bölünme özgüllüğünü belirtir (K / R'den sonra, P tarafından takip edilmedikçe), kaçırılan bölünmeler (2) kısmen sindirilmiş peptitlere izin verir. Peptit uzunluğu (5-50 kalıntı) ve kütle (500-5000 Da) filtreleri olası adayları hariç tutar. Değişken modifikasyonlar (örneğin, oksidasyon için metiyonin üzerinde +15.9949 Da, fosforilasyon için S/T/Y üzerinde +79.96633 Da) kimyasal değişikliklerin saptanmasına izin verirken, Max kombinasyonları (5), arama alanını yönetmek için peptit başına eşzamanlı modifikasyonları sınırlar. Site başına maksimum değişken mod (örneğin, M'de 3) değişiklik sıklığını kontrol eder. Bölünmüş veritabanı, büyük proteomlar için verimliliği artırır ve izotop hatası (0/1/2), yanlış atanmış izotopik zirveleri açıklar. Bu ayarlar, peptit tanımlamasında hassasiyeti, özgüllüğü ve hesaplama yükünü toplu olarak dengeler.
  7. Doğrulama sekmesine geçin. DIA verileri için olan RT'yi Tahmin Et ve Spektrumları Tahmin Et seçeneklerinin işaretini kaldırın (Şekil 5B).
  8. Quant (MS1) sekmesine tıklayın. MS1 quant'ı çalıştır'ı seçin ve Load Quant defaults'a tıklayın. IonQuant'ı seçin ve varsayılan ayarları koruyun (Şekil 6A). Kararsız bekletme süreleri için MBR'yi devre dışı bırakın veya küresel ölçeklendirme yanlılıkları ortaya çıkarsa Yoğunluk normalleştirmesini devre dışı bırakın; Büyük veri kümeleriyle RAM'i korumak için Dizini diskte tut'u etkinleştirin.
    NOT: Quant (MS1), protein başına ≥1 benzersiz iyon gerektiren MaxLPQ (MaxLFQ tabanlı Protein Miktar Tayini, MaxLFQ yöntemini protein gruplarına genişleten bir algoritma) kullanarak etiketsiz miktar tayinini optimize etmek için varsayılan olarak kullanır (kapsama pahasına daha yüksek sıkılık için ≥2'ye yükseltin). Çalıştırmalar Arası Eşleştirme (MBR), tutma süresi (RT) toleransı (varsayılan 0,4 dk; kararlı kromatografi için 0,2 dakikaya sıkın veya gradyan değişkenliği için gevşetin) ve iyon hareketliliği (IM) toleransı (varsayılan 0,05 1/k0 [ters azaltılmış hareketlilik]; IM hassasiyetine göre ayarlayın) kullanarak %≤1 FDR (Yanlış Keşif Oranı; varsayılan MBR iyon FDR=0,01; titizlik için 0,005'e düşük) kullanarak çalıştırmalar arasında tanımlamaları aktarır. Protein çıkarımı, uniquer+rascor (protein gruplaması için jilet peptit ataması) kullanır. Özellik algılama, 10 ppm kütle toleransı kullanır (düşük çözünürlüklü MS için 20 ppm'ye yükseltin veya yüksek çözünürlük için 5 ppm'ye düşürün).
  9. Şimdi, Çalıştır sekmesine tıklayın. Çıktı dizini'ni seçin. Verileri analiz etmeye başlamak için ÇALIŞTIR'a tıklayın (Şekil 6B).
    NOT: Değişikliklere odaklanmayan veya etiket tabanlı niceleme kullanmayan etiketsiz proteomik veriler için PTM'ler, Glyco ve Quant (İzobarik) sekmeleri kullanılmaz.

4. DIA-NN/FragPipe aşağı akış analizi

NOT: Bu çalışmada kullanılan detaylı kodlar Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2 olarak yer almaktadır. Bu çalışmada kullanılan paket versiyonları Ek Dosya 3'te bulunabilir.

  1. RStudio'yu açın ve DIA-NN veya FragPipe tarafından oluşturulan protein ekspresyon verilerini okuyun. DIA-NN'den .pg_matrix.tsv ile biten protein grubu matris verileri ve FragPipe'dan .tsv ile biten birleşik protein verileri normalde analiz için kullanılır.
  2. NA'yı doldurmadan eksik değerleri çıkarın ve ikiden az benzersiz peptit ile tanımlanan ve ölçülen protein gruplarını filtreleyin.
    NOT: Bu çalışmadaki DIA rakamları filtrelenmiş protein grupları tarafından üretilirken, DDA rakamları filtrelenmemiş protein gruplarındandı.
  3. Numuneler arasında medyan ölçeklendirme veya nicelik normalleştirme kullanarak protein yoğunluklarını normalleştirin. Bu çalışmadaki DIA verileri medyan normalizasyon ile normalleştirilirken, iki yöntemi daha iyi göstermek için DDA verileri kantil normalizasyon ile normalleştirildi.
    NOT: Medyan normalleştirme, aykırı değerlere karşı sağlamdır ve proteinlerin çoğunun numuneler arasında değişmeden kaldığı senaryolar için uygundur, bu da medyan protein bolluğunu kararlı bir referans noktası haline getirir. Bununla birlikte, oldukça diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin18 olduğu senaryolarda başarısız olabilir. Kantil normalleştirme, numuneler arasında protein bolluklarının tekdüze bir dağılımını sağlar, bu da farklı dağılımlara sahip numuneleri karşılaştırırken yardımcı olur. İstatistiksel gücü azalttığı ve verileri aşırı normalleştirebileceği ve potansiyel olarak gerçek biyolojik farklılıkları maskeleyebileceği gösterilmiştir18. Proteomikte, medyan normalizasyon, MS cihaz performansıyla ilgili sistematik önyargıları ortadan kaldırmak için etiketsiz çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kantil normalleştirme, büyük ölçekli veri kümeleri, diferansiyel ifade analizi ve küme analizi için tercih edilir19,20.
  4. Log2 kat değişikliklerini hesaplayın (ör., PDAC Serum'a karşı Normal) ve t-testi p değerleri. Benjamini-Hochberg yöntemini kullanarak düzeltilmiş p değerlerini hesaplayın. Anlamlılık eşiklerini tanımlayın (örneğin, |log2FC| > 1, p_adj (FDR) < 0.05).
    NOT: Bu çalışmanın rakamlarında kullanılan kesme p değerleri, ham değerleri temsil eder, çünkü düzeltilmiş p değerlerinin (p_adj) kullanılması, bu sınırlı veri kümelerinin istatistiksel gücü dahilindeki tüm saptanabilir proteinleri ortadan kaldıracaktır.
  5. Eksik/NA değerlerinin varlığını kontrol edin ve hariç tutun. Önemli isabetleri görselleştirmek için bir yanardağ grafiği oluşturun.
  6. Önemli ölçüde düzensiz proteinleri seçin. Protein ekspresyon değerlerine Z-skoru normalizasyonu uygulayın. Örnek grup ek açıklamaları ile kümelenmiş bir ısı haritası çizin.
  7. org kullanarak proteinleri Entrez ID'lerine eşleyin. Hs.eg.db. GO zenginleştirme (Biyolojik Proses) ve KEGG yolu analizi yapın.
    NOT: Biyolojik Süreç (BP) kategorileri, Gen Ontolojisi (GO) analizinde yaygın olarak seçilir, çünkü bunlar çoklu moleküler aktiviteler tarafından gerçekleştirilen daha büyük süreçleri veya biyolojik programları tanımlar20. Bu terimler, hücre döngüsü düzenlemesi, metabolik süreçler vb. gibi temel süreçler de dahil olmak üzere kanser gibi hastalıklarda ters giden hücresel işlevlere odaklanır. GO analizi, BP'ye ek olarak Moleküler Fonksiyon (MF) ve Hücresel Bileşen (CC) kategorilerini de içerir. MF terimleri, iyon taşıma veya DNA bağlama yetenekleri gibi gen ürünlerinin biyokimyasal aktivitelerini ana hatlarıyla belirtir. CC terimleri, çekirdek gibi gen ürünlerinin işlevlerini yerine getirdiği çekirdek, mitokondriyal zar veya hücre iskeleti gibi hücresel konumları tanımlar.
  8. Etkileşimler için STRINGdb'yi sorgulayın (güvenilirlik puanı 400≥). VisNetwork'ü kullanarak etkileşimli bir ağ oluşturun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomik veri kümeleri aramasını daha iyi göstermek için, bu analiz için iki tür veri kümesi seçtik. Klinik bağlamlarda düzensiz proteinleri göstermeyi amaçlayarak, klinik gibi anahtar kelimeler kullanarak Pride'da arama yaptık. Spesifik olarak, Klinik Proteomik Tümör Analizi Konsorsiyumu'ndan (CPTAC)21 DIA analizine uygun bir veri seti ve Çin İnsan Proteom Projesi'nden (CNHPP)22 DDA analizine uygun başka bir veri seti seçtik. Bu seçimler, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan protokol, DIA-NN ve FragPipe gibi ücretsiz araçları entegre ederek proteomik veri analizini göstermektedir. Başarı, cihaza bağlı ve tam peptit tanımlaması için çok önemli olan DIA-NN'de (adım 2.3)27 spektral kütüphane üretimi için doğru öncü iyon seçimi ve kütle doğruluğu ayarları gibi kritik adımlara bağlıdır. Benzer şekilde, tuzak oluşturma ve kirletici filtreleme dahil olmak üzere FragPipe'da (adım 3.4) titiz veritabanı kurulumu, FDR'yi kontrol etmek iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.Z., Molemuse Biotech Studio'nun kurucusudur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje Molemuse Biotech Studio tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
.NET SDK'sı v. 9.0.203Microsofthttps://dotnet.microsoft.com/en-us/download
DIA-NN ve 2.1.0https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0 
FragPipe v. 22.0https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases
MSFileReader v. 3.1 Termo Balıkçıhttps://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe
R 4.5.0https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe
Rstudio v. 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedrioli, P. G. A., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  2. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database at 20 years: 2025 update. Nucl Acids Res. 53 (D1), D543-D553 (2025).
  3. Deutsch, E. W., et al. Proteomics Standards Initiative at Twenty Years: Current Activities and Future Work. J Proteome Res. 22 (2), 287-301 (2023).
  4. Schubert, O. T., Röst, H. L., Collins, B. C., Rosenberger, G., Aebersold, R. Quantitative proteomics: challenges and opportunities in basic and applied research. Nat Protoc. 12 (7), 1289-1294 (2017).
  5. Wang, X., Shen, S., Rasam, S. S., Qu, J. MS1 ion current-based quantitative proteomics: A promising solution for reliable analysis of large biological cohorts. Mass Spectro Rev. 38 (6), 461-482 (2019).
  6. Vaudel, M. MS2-Based Quantitation. Proteome Inform. , 155-177 (2016).
  7. Meyer, J. G. Qualitative and Quantitative Shotgun Proteomics Data Analysis from Data-Dependent Acquisition Mass Spectrometry. Shotgun Proteomics. 2259, 297-308 (2021).
  8. Fröhlich, K., et al. Data-Independent Acquisition: A Milestone and Prospect in Clinical Mass Spectrometry-Based Proteomics. Mol Cell Proteomics. 23 (8), 100800(2024).
  9. Zhang, F., Ge, W., Ruan, G., Cai, X., Guo, T. Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry-Based Proteomics and Software Tools: A Glimpse in 2020. Proteomics. 20 (17-18), 1900276(2020).
  10. Deutsch, E. W., et al. The ProteomeXchange consortium at 10 years: 2023 update. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1539-D1548 (2023).
  11. Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. DIA-NN:neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Meth. 17 (1), 41-44 (2020).
  12. Zhang, F., et al. A Comparative Analysis of Data Analysis Tools for Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 22 (9), 100623(2023).
  13. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nat Meth. 14 (5), 513-520 (2017).
  14. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  15. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci. 113 (8), E968-E977 (2016).
  16. Cao, L., et al. Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell. 184 (19), 5031-5052.e26 (2021).
  17. Dong, L., et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Cell. 40 (1), 70-87.e15 (2022).
  18. Dubois, E., Galindo, A. N., Dayon, L., Cominetti, O. Comparison of normalization methods in clinical research applications of mass spectrometry-based proteomics. 2020 IEEE Conf Computat Intelligence Bioinfo Computat Biol. , 1-10 (2020).
  19. Dressler, F. F., Brägelmann, J., Reischl, M., Perner, S. Normics: Proteomic Normalization by Variance and Data-Inherent Correlation Structure. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100269(2022).
  20. Dimmer, E. C., et al. The Gene Ontology - Providing a Functional Role in Proteomic Studies. Proteomics. 8 (23-24), pmic.200800002(2008).
  21. Lih, T. M., et al. Detection of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma-Associated Proteins in Serum. Mol Cell Proteomics. 23 (1), 100687(2024).
  22. Chinese Human Proteome Project (CNHPP) Consortium. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature. 567 (7747), 257-261 (2019).
  23. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Matsuura, Y., Ishiguro-Watanabe, M. KEGG: biological systems database as a model of the real world. Nucl Acids Res. 53 (D1), D672-D677 (2025).
  24. Campello, E., Ilich, A., Simioni, P., Key, N. S. The relationship between pancreatic cancer and hypercoagulability: a comprehensive review on epidemiological and biological issues. Br J Cancer. 121 (5), 359-371 (2019).
  25. Fang, L., Xu, Q., Qian, J., Zhou, J. Y. Aberrant Factors of Fibrinolysis and Coagulation in Pancreatic Cancer. OncoTargets Ther. 14, 53-65 (2021).
  26. Vlodavsky, I., Elkin, M., Ilan, N. Impact of heparanase and the tumor microenvironment on cancer metastasis and angiogenesis: basic aspects and clinical applications . Rambam Maimonides Med J. 2 (1), (2011).
  27. Fröhlich, K., et al. Benchmarking of analysis strategies for data-independent acquisition proteomics using a large-scale dataset comprising inter-patient heterogeneity. Nat Comm. 13 (1), 2622(2022).
  28. Polasky, D. A., et al. MSFragger-Labile: A Flexible Method to Improve Labile PTM Analysis in Proteomics. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100538(2023).
  29. Gerault, M. A., Camoin, L., Granjeaud, S. DIAgui: a Shiny application to process the output from DIA-NN. Bioinfo Adv. 4 (1), (2024).
  30. Hsiao, Y., et al. Analysis and Visualization of Quantitative Proteomics Data Using FragPipe-Analyst. J Proteome Res. 23 (10), 4303-4315 (2024).
  31. Yu, F., Deng, Y., Nesvizhskii, A. I. MSFragger-DDA+ enhances peptide identification sensitivity with full isolation window search. Nat Comm. 16 (1), 3329(2025).
  32. Li, K., Teo, G. C., Yang, K. L., Yu, F., Nesvizhskii, A. I. diaTracer enables spectrum-centric analysis of diaPASEF proteomics data. Nat Comm. 16 (1), 95(2025).
  33. Qiao, R., Li, H., Bian, H., Xin, L., Shan, B. De Novo sequencing-assisted homology search for DIA data analysis enables low abundance peptide variants discovery. Biorvix. 10, (2025).
  34. Meissner, F., Geddes-McAlister, J., Mann, M., Bantscheff, M. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery. Nat Rev Drug Disc. 21 (9), 637-654 (2022).
  35. Zheng, Y., et al. Multi-omics data integration using ratio-based quantitative profiling with Quartet reference materials. Nat Biotechnol. 42 (7), 1133-1149 (2024).
  36. Bubis, J. A., et al. Challenging the Astral mass analyzer to quantify up to 5,300 proteins per single cell at unseen accuracy to uncover cellular heterogeneity. Nat Meth. 22 (3), 510-519 (2025).
  37. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100129(2021).
  38. Schneider, M., et al. A Scalable, Web-Based Platform for Proteomics Data Processing, Result Storage and Analysis. Proteome Res. 24 (3), 1241-1249 (2025).
  39. Jalili, V., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2020 update. Nucl Acids Res. 48 (W1), W395-W402 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Proteomic Data AnalysisData Dependent AcquisitionData Independent AcquisitionProtein QuantificationVolcano PlotGene Ontology AnalysisKEGG Pathway AnalysisProtein Interaction Network

İlgili makaleler