Yöntem makalesi

Rekombinant Örümcek İpek Elyafı Üretimi için El Çizimi ve Islak İplik Eğirme Tekniklerinin Optimize Edilmesi ve Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/68714

⸱

29 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, 2Department of Chemistry, Dalhousie University, 3School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan protokol, eğirme için rekombinant ipek proteinlerinin çözünmesini optimize etmek için çok yönlü bir yöntem seti sağlar; elle çizim ile eğirilebilirliği test edin; otomatik ıslak eğirme ile uzun, sürekli lifler üretin; ve liflerin morfolojisini, moleküler hizalamasını, mekanik davranışını ve liflerin içindeki protein ikincil yapısal içeriğini karşılaştırmalı olarak değerlendirin.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örümcek ipekleri, ayırt edici yüksek mukavemet, yüksek uzayabilirlik veya bunların bir kombinasyonu ile yüksek tokluğa yol açan mekanik özellikleriyle ünlüdür. Tipik bir dişi küre dokuma örümceği, her biri tipik olarak türe özgü protein(ler)den eğrilmiş ve farklı bir hayatta kalma işlevi için mekanik olarak uyarlanmış yedi farklı ipek türü üretir. Rekombinant örümcek ipeği üretimi, bu malzemeleri elde etmek için umut verici bir yol sağlar, büyük miktarlarda doğal ipek elde etmedeki zorlukları ortadan kaldırır ve örneğin bölgeye yönelik mutajenez veya füzyon proteini yapımı yoluyla protein özelleştirmesine izin vermede avantajlar sağlar.

Sunulan protokolde, hem elle çizim hem de ıslak eğirme yaklaşımlarıyla eğirme için protein uygunluğunu değerlendirmek için bir metodolojinin ana hatlarını çiziyoruz. Uygun şekilde saflaştırılmış bir liyofilize protein tozu ile başlayarak, yüksek konsantrasyonlu bir "eğirme uyuşturucu" durumu sağlamak için ilk çözünmüş protein durumunu optimize etme yöntemleri detaylandırılır. Daha sonra, eğirme işleminin bir parçası olarak bir sıkma sonrası çekme kullanarak lif davranışını modüle etme yöntemleri hakkında bir tartışma da dahil olmak üzere, elle çekme ve ıslak eğirme yaklaşımları karşılaştırılır. Elde edilen ipek liflerini karakterize etmek ve hangi eğirme koşullarının verimli olma olasılığının en yüksek olduğuna karar vermek için tipik bir iş akışı daha sonra, lif çapını ve homojenliğini değerlendirmek için optik mikroskopi de dahil olmak üzere detaylandırılır; fiber içinde elde edilen (supra) moleküler hizalama derecesini tahmin etmek için polarize ışık mikroskobu; mukavemet, uzayabilirlik, Young modülü ve tokluğu değerlendirmek için çekme testi; ve lif içindeki protein ikincil yapılanmasını değerlendirmek için Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektromikroskobu.

Bu protokolün, asiform (sarma) ipeğin tekrarlayan ve tekrar etmeyen alanlarına dayalı olarak birkaç farklı rekombinant örümcek ipeği proteini için uygun olduğu kanıtlanmıştır; piriform ipek; ve asiform, piriform ve/veya majör ampullat (dragline) ipek içeren füzyon proteinleri. Daha geniş uygulanabilirlik, koşulların ve parametrelerin tek bir proteinin davranışına uyacak ve fonksiyonel sonuçta farklılıklar elde edecek şekilde değiştirilebildiği birkaç vurgulanmış adımla sağlanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örümcekler, ağ yapımı, av yakalama ve yumurta koruma dahil olmak üzere çeşitli özel görevler için ipek üretir1. Örümcek ipekleri, bilinen en doğal ve sentetik malzemelerinkini aşan olağanüstü mekanik özellikler sergiler2 ve çeşitli endüstriyel ve biyomedikal uygulamalar için tasarlanmış ve geliştirilmiş örümcek ipek malzemelerinin üretimine yönelik önemli çabalara yol açar. Örümcek ipeğini oluşturan protein olan spidroin, tekrarlayan olmayan N-terminal ve C-terminal alanları3 ile sınırlanan nispeten büyük, tekrarlayan bir alandan oluşur ve bazı ipek türlerinin benzersiz mekanik özellikleri, tekrarlayan alan 4,5,6 içindeki kısa motiflerin tekrarı ile bağlantılıdır. Hasat için uygun tutarlı bir koza formatında büyük miktarlarda ipek üreten ticari olarak yetiştirilen dut ipekböceğinin (Bombyx mori) aksine, örümcekler doğası gereği sınırlı miktarlarda ipek üreten yamyam ve bölgesel organizmalardır, bu nedenle tarımsal üretim ve toplama için bir zorluk teşkil eder7. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, rekombinant örümcek ipeği üretimi, uygulama için yeterli miktarda örümcek ipeğini kontrollü bir şekilde elde etmek için daha uygulanabilir ve sürdürülebilir bir alternatif olarak geliştirilmiştir.

Rekombinant örümcek ipeğinin üretimi, protein ekspresyonu için uygun bir konakçının seçilmesini gerektirir. Örümcek ipeği, bakteri 8,9, mayalar10,11, böcek hücreleri12, bitkiler13,14 ve memeli hücreleri15,16 dahil olmak üzere çeşitli konakçı sistemlerde eksprese edilmiştir ve Escherichia coli en yaygın kullanılan konakçı sistemdir. 700 kDa'ya kadar ulaşabilen spidroinlerin yüksek moleküler ağırlıkları7, tam uzunlukta yapıların ifadesi için önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Doğal örümcek ipeklerininkine göre karşılaştırılabilir veya geliştirilmiş özelliklere sahip rekombinant örümcek ipeği üretmek için, kullanılan birincil strateji, sınırlı sayıda tekrar eden birime sahip yapılar (tekrarlayan olmayan alanlar olsun veya olmasın), farklı ipek türlerinin kombinasyonlarından oluşan kimeralar ve ipek olmayan proteinlerle kaynaşmış hibrit ipekler gibi kesilmiş varyantların ifadesidir. Örneğin, rekombinant majör ampullat spidroin (284.9 kDa), metabolik olarak tasarlanmış bir E. coli'de başarılı bir şekilde eksprese edildi ve elde edilen ipek, doğal majör ampullat ipek9 ile karşılaştırılabilir mekanik özellikler sergiledi. Ek olarak, iki tekrar birimi piriform spidroin ve iki tekrar birimi asiform spidroinden oluşan bir mühendislik ipek lifi, doğal flagelliform ipek17 ile karşılaştırılabilir, bileşen piriform veya asiform ipeklerden herhangi birine üstün uzayabilirlik göstermiştir.

Rekombinant protein üretimi aynı zamanda fonksiyonel peptit veya protein segmentlerinin ipek proteinlerine doğrudan dahil edilmesini sağlayarak, belirli uygulamalara göre uyarlanmış özelliklere sahip biyomalzemelerin üretilmesini sağlar. Örneğin, RGD hücre bağlama motiflerinin majör ampullat spidroinlerden türetilen genetik olarak tasarlanmış bir ipek ile genetik ve kimyasal füzyonu, fibroblast yapışmasını ve proliferasyonunu önemli ölçüde artıran filmlerle sonuçlandı18. Ayrı bir çalışmada, iki tekrar birimi asiform spidroin ve majör bir ampullat spidroinin C-terminal alanını içeren kimerik bir proteine kaynaşmış bir sinir büyüme faktörü-β (NGF) bağlama motifinden oluşan hibrit bir ipek yapının, nöron benzeri hücre büyümesini ve farklılaşmasını desteklediği gösterilmiştir19.

Rekombinant bir ipek proteininin başarılı bir şekilde ekspresyonu ve saflaştırılması göz önüne alındığında, daha sonra amaçlanan uygulamaya bağlı olarak hidrojeller, filmler, lifler, nanopartiküller, köpükler ve süngerler gibi çeşitli formlarda işlenebilir20,21. Yapay ipek elyafı üretimini mümkün kılmak için, örümceklerin son derece karmaşık ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş doğal elyaf eğirme işleminin belirli yönlerini taklit eden eğirme yöntemleri geliştirilmiştir. Doğal majör ampullat ipeğinde, spidroinler majör ampullat bezindeki epitel hücreleri tarafından üretilir ve lümen içinde yüksek konsantrasyonlarda (%50'ye kadar (a/h))22 çözünür bir durumda depolanır ve sulu bir eğirme ilacı oluşturur. Eğirme uyuşturucusu eğirme kanalı boyunca hareket ederken, hem kanalın daralmasından hem de sıvı ipek proteinlerinin katı lifleredönüşmesine neden olan lif pultrüzyon işleminden kaynaklanan pH, iyon konsantrasyonu, su içeriği ve kesme kuvvetlerinde değişiklikler yaşar 23,24. Bu nedenle, eğirme ilacı oluşturmak için rekombinant ipek proteinlerini yüksek konsantrasyonda çözebilen veya askıya alabilen uygun bir çözücünün tanımlanması, yapay elyaf eğirme işleminde kritik bir ilk adımdır.

İpek proteini eğirme doplarının formülasyonu için çok çeşitli çözücüler kullanılmış ve çözücü seçiminin lif oluşumunu ve mekanik özellikleri etkilediği gösterilmiştir25,26. Sonuç olarak, elde edilen lif özelliklerini optimize etmek için uyuşturucu çözücü seçiminin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi esastır. Eğirme dopları, 1,1,1,3,3,3-heksafloroizopropanol (HFIP)27, heksafloroaseton (HFA)28, trifloroasetik asit (TFA) ve 2,2,2-trifloroetanol (TFE)26 karışımları, formik asit29 ve sodyum fosfat/Tris tamponu30 gibi organik veya sulu çözücüler kullanılarak formüle edilebilir. Protein çözünürlüğü tipik olarak pH, iyonik kuvvet ve konsantrasyon gibi faktörlerden etkilendiğinden, uygun bir dope çözücüsünün tanımlanması genellikle çeşitli çözücülerin sistematik değerlendirmesini, pH ve protein konsantrasyonlarının optimizasyonunu ve bazı durumlarda, optimal eğirme uyuşturucu koşullarını belirlemek için çözücü-su karışımlarının kullanılmasını içerir. Ayrıca, eğirme işleminin viskozitesi, eğirme işleminden önce değerlendirilmesi gereken önemli bir parametredir, çünkü yüksek viskoziteli bir uyuşturucu çözeltisi eğirme sırasında sıvı akışını engelleyebilirken, yetersiz viskoziteli bir uyuşturucu tipik olarak lif oluşumu için uygun olmayacaktır31,32. Sert spin uyuşturucu koşullarının kullanılmasının, uzun süreli maruz kalma durumunda protein yapısını değiştirebileceğine dikkat edilmelidir; Bu nedenle, çevre dostu uyuşturucu çözücülerin geliştirilmesi aktif bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir.

Elle çizim ve ıslak eğirme, rekombinant ipek elyaf eğirmenin iki yaygın yöntemidir. Her bir yöntem kullanılarak üretilen liflerin mekanik özellikleri, hem eğirme koşullarının kendisine hem de eğirme sonrası işlemeye büyük ölçüde bağlıdır. Çekme eğirme olarak da adlandırılan elle çizim, liflerin normalde bir pipet ucu, forseps veya cımbız kullanılarak saflaştırılmış protein çözeltilerinden çekildiği ve ardından havayla kurutma ve karakterizasyonunyapıldığı basit bir lif üretim yöntemidir 33,34,35,36,37. Elle çizim, çeşitli ipek elyaf oluşum koşullarını hızlı bir şekilde taramak ve genel olarak ortaya çıkan elyaf mekanik davranışını sınıflandırmak için mükemmel bir yaklaşım sağlarken, bu teknik uzun (yani çok metre uzunluğunda) sürekli elyaflara kolayca ölçeklendirilemez. Alternatif olarak, tipik olarak su ve etanol veya metanol 9,15,31,38,39,40 karışımından oluşan sulu veya organik bir çözücü olan bir pıhtılaşma banyosuna sabit bir hızda eğirme doçusunun sürekli ekstrüzyonunu uygulayan ıslak eğirme kullanıyoruz . Eğirme dopesunun pıhtılaşma banyosuna daldırılması, hızlı protein çözünmesine neden olur ve bu da sürekli liflerinoluşumuna neden olur 24. Daha sonra, lifler pıhtılaşma banyosundan sabit bir hızda çekilir, ya eğrilmiş (AS) lifler sağlamak için ekstrüzyon hızıyla eşleştirilir ya da tipik olarak gelişmiş mekanik özelliklere sahip eğrilmiş (PS) lifler sağlamak için bir sıkma sonrası çekmeye tabi tutulur. Sıkma sonrası çekme tipik olarak, liflerin havada, bir çözücüde veya çözücüye daldırıldıktan sonra orijinal uzunluklarının 2-8 katı oranında gerilmesini içerir ve her parametre belirli mekanik özelliklere 15,17,31,38 katkıda bulunur.

Bu protokol elle çizim ve ıslak eğirme yöntemlerine odaklanırken, bu yöntemleri bağlam içine yerleştirmek önemlidir. Hem sulu hem de organik koşullardan rekombinant örümcek ipekleri için elektroeğirme yöntemleri rapor edilmiştir, bu da elyaf paspasların, hizalanmış elyafların ve ipliklerin üretimini sağlar ve elyaflar tipik olarak41 çapında nanometre ölçeğindedir. Bu, nano ölçekli liflerin potansiyel avantajını ve mikron ölçekli liflerin istenmesi durumunda buna karşılık gelen zorluğu sağlar, tipik olarak mekaniği ve su uyumluluğunu iyileştirmek için β tabaka yapısına dönüşümü indüklemek için sıkma sonrası işlem gerçekleştirme gereksinimi vardır. Mikron ölçeğinde genişlik ve kalınlıkta çok metrelik rekombinant örümcek ipek kurdeleleri, organik çözücü42'den kuru eğirme ile elde edilmiştir ve son zamanlarda spin uyuşturucu aşamasında metal iyonu katılımının mekaniği43 iyileştirdiği gösterilmiştir. Doğal spinneret45'i taklit etmek için tasarlanmış mikroiğne spinneretleri ile 3D baskı teknolojisinin yeni bir kombinasyonunu içeren mikroakışkan bazlı eğirme44, yüksek derecede kontrol edilebilir rekombinant ipek elyaf eğirme için uygundur. İpek (veya ipek benzeri) elyaf üretimi için uygun olduğu bildirilen çok çeşitli yöntemlere rağmen, bu protokoller elle çizim ve ıslak eğirme yoluyla rekombinant ipek elyafı üretimini detaylandırmaktadır, çünkü bu yöntemlerin elimizde birkaç farklı rekombinant ipek varyantına çevrilebileceği kanıtlanmıştır ve biyomalzeme geliştirme ve karşılaştırmalı değerlendirme için izlenebilir bir başlangıç noktası sağlar.

Elyaf eğirme ve toplamayı takiben, eğirme işleminden sonra özellikleri karakterize etmek için optik, mekanik ve spektroskopik tekniklerin bir kombinasyonu rutin olarak kullanılır. Her yöntem, elyaf oluşum süreci ve bunun malzeme performansı ile ilişkisi hakkında önemli bilgiler sağlar. Burada, ipek lifi özellikleri ve performansı hakkında temel bilgiler sağlayan birçok başka metodoloji olduğuna dikkat çekerek bu yöntemlerin bir alt kümesine odaklanıyoruz. Optik mikroskopi, lif morfolojisini değerlendirmek için kullanılır ve hem aynı hem de değişen koşullar altında eğrilen liflerin çaplarının karşılaştırılmasına izin verir 17,31,38,46. Bu teknik, sonraki karakterizasyondan önce kusurlu veya anormalmiş lif segmentlerinin tanımlanması ve ortadan kaldırılması için de önemlidir. Ek olarak, fiber içindeki moleküler hizalama derecesini değerlendirmek için polarize ışık mikroskobu kullanılabilir, çünkü daha yüksek hizalama seviyeleri tipik olarak gelişmiş mekanik özelliklerleilişkilendirilir 17,26,47. Mekanik karakterizasyon, gerilme-gerinim eğrilerinin ölçüldüğü ve çekme mukavemeti, uzayabilirlik, Young modülü ve tokluk gibi parametreleri ölçmek için kullanıldığı çekme testi yoluyla gerçekleştirilir ve yapısal veya biyomedikal uygulamalarda lif uygunluğunu değerlendirmek için temel bilgileri sağlar 17,33,48. Burada ele alınan son teknik, Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektromikroskobu, protein ikincil yapısını, özellikle β tabaka oluşumunun derecesini araştırmak için uygulanır, çünkü bu, lif stabilitesinde ve mekanik mukavemette çok önemli bir rol oynar 17,46,49. Bu teknikler birlikte, rekombinant olarak üretilen ipek liflerinin morfolojisi, yapısı ve mekanik davranışı hakkında kapsamlı bir anlayış sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, başlangıç noktasının liyofilize bir ipek protein tozu olduğunu varsayıyoruz. Bu, çalışmamızda en tipik olarak rekombinant bir örümcek ipek proteini olacaktır. Protokole genel bir bakış, aşağıda ayrıntıları verilen aşağıdaki beş adımın her biri ile Şekil 1'de verilmiştir: (1) eğirme uyuşturucu hazırlama ve optimizasyonu; (2) ipek elyaf el çizimi veya ıslak eğirme; (3) optik mikroskopi ile lif çapı ve morfolojik değerlendirme; (4) çekme testi ile mekanik değerlendirme; ve (5) FTIR spektromikroskobu ile ikincil yapı değerlendirmesi.

figure-protocol-1
Şekil 1: Rekombinant örümcek ipeği proteini lifi üretimi, toplanması ve karakterizasyonu için protokoldeki temel adımlara şematik genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Eğirme uyuşturucu hazırlama ve optimizasyonu

NOT: Elyaf eğirme uyuşturucu çözeltisinin optimizasyonu için, dope çözeltileri hazırlamak için farklı çözücülerde değişen konsantrasyonlarda rekombinant örümcek ipek proteinini çözündürmeye çalışın (Tablo 1). Lif eğirme girişimleri için sadece proteini çözen, çökeltisiz ve berrak bir dope çözeltisi veren çözücüler kullanılmalıdır.

  1. Çözücülerin hazırlanması
    1. 8:1:1 TFA/TFE/H2O yapmak için, çeker ocak içindeki bir cam tüpe 800 μL TFA, 100 μL TFE ve 100 μL tip 1 ultra saf su ölçün. Tüm bileşenleri iyice karıştırın. Uçucu bileşenlerin buharlaşmasını önlemek için cam tüpü kapatın ve parafilm ile kaplayın.
      NOT: Elyaf eğirme için her zaman taze bir çözelti hazırlayın.
      DİKKAT: TFA ve TFE'yi dikkatli kullanın, TFA oldukça aşındırıcı ve uçucudur, TFE ise yanıcı ve toksiktir. Ciltle teması ve soluma olasılığını önlemek için eldivenler, laboratuvar önlükleri ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun KKD kullanın.
    2. Bir çeker ocak içinde 3:1:1 TFA/TFE/H2O yapmak için 300 μL TFA, 100 μL TFE ve 100 μL tip 1 ultra saf suyu bir cam tüpe aktarın ve bileşenleri karıştırın. Uçucu bileşenlerin buharlaşmasını en aza indirmek için cam tüpü kapatın ve parafilm ile kaplayın.
      NOT: Elyaf eğirme için her zaman taze bir çözelti hazırlayın.
    3. 7:3 HFIP/H2O yapmak için, 1 mL çözelti yapmak için 700 μL 1,1,1,3,3-hekzafluroro-2-propanol (HFIP) ile 300 μL tip 1 ultra saf su karıştırın. Gerektiğinde çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
      DİKKAT: HFIP'yi bir çeker ocak içinde tutun ve solumaktan veya cilt temasından kaçının.
    4. 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) yapmak için, bir beherde 800 mL deiyonize su alın ve 1.199 g potasyum dihidrojen fosfatı çözün (KH2PO4- MW. 136.09 g/mol) ve içinde 7.173 g potasyum fosfat dibazik (K2HPO4- MW. 174.18 g/mol) bulunmaktadır. Tüm bileşenleri iyice karıştırın ve çözeltinin pH'ını NaOH veya HCl kullanarak ayarlayın. Hacmi deiyonize su ile 1 L'ye kadar doldurun ve oda sıcaklığında saklayın.
    5. 10 mM Tris-Cl tamponu (pH 8.0) yapmak için, 1.21 g Tris-hidroklorürü (MW. 157.60 g / mol) 800 mL deiyonize suda çözün. NaOH kullanarak pH'ı ayarlayın ve son hacmi deiyonize su ile 1 L'ye yükseltin. Çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın.
    6. 20 mM Na-asetat tamponu (pH 5.0) yapmak için, 450 mL deiyonize suda 0.55 g sodyum asetat (MW. 82.03 g/mol) ve 0.02 M (6 mL) asetik asidi çözün. Hacmi deiyonize su ile 500 mL'ye kadar doldurun ve oda sıcaklığında saklayın.
    7. 1 M sitrat fosfat tamponu (pH 7.0) yapmak için 11.69 g disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4- MW. 141.96 g / mol) ve 1.85 g sitrik asit (MW. 192.12 g / mol) 400 mL deiyonize su. HCl veya NaOH kullanarak çözeltinin pH'ını ayarlayın ve deiyonize su kullanarak son hacmi 500 mL'ye ayarlayın.

figure-protocol-2

figure-protocol-3








figure-protocol-4



figure-protocol-5

figure-protocol-6





Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İdeal bir döndürülebilir dope çözeltisi, tam protein çözünmesini gösteren berrak, çökeltisiz ve viskoz bir çözeltidir (Şekil 7A). Tersine, eksik çözünme ya sütlü bir süspansiyon ya da görünür çökeltiler ile sonuçlanır (Şekil 7B, C). Tam protein çözünmesi için gereken süre, çözücünün bir fonksiyonu olarak değişir, TFA / TFE / H2O karışımları gibi bazı çözücüler, tipik olarak proteini 30 dakikalık bir zaman aralığında tamamen çözerken, HFIP gibi diğerleri, ara sıra girdaplamanın yanı sıra gece boyunca çalkalama gerektirebilir.

figure-results-1
Şekil 7: Eğirme uyuşturucu çözeltisi optimizasyonu. (A) Proteini tamamen çözebilen bir çözücü, berrak ve viskoz eğirilebilir bir uyuşturucu çözeltisi verir. Proteinin optimal olmayan bir çözücü seçimi ile kısmen çözünmesi veya süspansiyonu, (B) genellikle görünür çökelti veya (C) sütlü bir süspansiyon ile aşırı viskoz bir duruma neden olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2E, temsili bir elle çizilmiş elyafı gösterirken, Şekil 4D , makaralanmış ıslak eğrilmiş bir elyafı göstermektedir. Herhangi bir aşağı akış analizinden önce, fiber kalitesini değerlendirmek için optik mikroskopi gereklidir. Aşağı akış analizine uygun olan ve iki farklı koşul kullanılarak eğrilen ıslak eğrilmiş rekombinant ipek liflerinin temsili optik mikrografları (numune ıslak eğirme konfigürasyonları için Şekil 3'e bakınız) Şekil 8'de gösterilmektedir. Optik mikroskopi ile (Şekil 8A), bu liflerin düzgün bir çap sergilediği ve bir sıkma sonrası çekme uygulandığında azalmış bir çap ile (yani, eğrilmiş olarak (AS) ve @ etanol (4x-EtOH) içinde 4x oranında gerilmiş bükülmüş olarak görülmüştür) açıktır. Polarize ışık mikroskobunda (Şekil 8B) daha büyük bir kontrast ile sonuçlanan daha yüksek çift kırılma derecesi, spin sonrası çekme işleminin bir sonucu olarak fiberde gelişmiş bir moleküler hizalama ile tutarlıdır. Son olarak, değerlendirilen liflerin bazı kısımlarında büyük olasılıkla kusurların gözleneceği ve belirli bir lif segmentini aşağı akış analizi için uygun olmayan hale getireceği belirtilmelidir. Bu tür iki örnek Şekil 9'da gösterilmiştir.

figure-results-2
Şekil 8: Islak eğrilmiş rekombinant örümcek ipek liflerinin temsili optik mikrografları. AS durumundaki ve etanolde (EtOH) 4x sıkma sonrası gerilmeyi takiben lifler, optik mikroskopi (sol sütun) ve polarize ışık mikroskobu (sağ sütun) ile gözlemlenen kimerik bir piriform-asiform ipek yapısı (Py2W2) için gösterilmiştir. Görüntüler Ghimire ve ark.17'nin izniyle çoğaltılmıştır. Ölçek çubukları = 30 μm. Kısaltmalar: AS = as-spun; EtOH = etanol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 9: Optik mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilen potansiyel fiber kusurları örneği. (A) "Şişkin" bir kusur örneği. (B) Bir "boyun" kusuru örneği. Ölçek çubukları = 20 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Belirli bir elyaf segmentinde kusur bulunmadığından emin olduktan ve çap belirlemesini takiben (protokol bölüm 3.2), çekme testi yapılabilir (örneğin, Şekil 6). Farklı koşullar kullanılarak eğrilmiş bir kimerik rekombinant örümcek ipeği için elde edilen temsili gerilim-gerinim eğrileri Şekil 10'da gösterilmiştir. Eğirme koşullarına bağlı olarak, elde edilen lifler kırılgandan (AS durumu) AS durumuna benzer mukavemete sahip yüksek derecede uzayabilir (2x-hava durumu) ile çok daha güçlü ve daha az uzayabilir liflere (4x-EtOH durumu) kadar değişir. Mekanik davranışı açık ve titiz bir şekilde değerlendirmek için birden fazla elyaf segmentinin ve eğrilmiş elyaf partilerinin değerlendirilmesi gerektiğine dikkat edilmelidir.

figure-results-4
Şekil 10: Çeşitli koşullardan eğrilmiş liflerin temsili gerilim-gerinim eğrisi. Lifler ya eğrilmiş durumda (AS) ya da otomatik sıkma sonrası gerdirme (çekme oranı ve gerdirme koşulu (hava ve çözücü) belirtilmiştir) kullanılarak üretim yoluyla analiz edildi. Şekil Ghimire ve ark.(2024)17'nin izniyle uyarlanmıştır. Kısaltma: AS = as-spun. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, lif durumu ikincil yapısı ATR-FTIR spektromikroskobu kullanılarak değerlendirilebilir. Bu metodoloji ile elde edilen tipik ipek lifi spektrumları (Şekil 11A,B), geniş bir amid bir tepe noktası (~ 3.300 cm-1 etrafında merkezlenmiş), bir amid I tepe noktası (~ 1.600-1.700 cm-1) ve bir amid II tepe noktası (~ 1.500-1.600 cm-1) dahil olmak üzere karakteristik protein bantlarına sahip olacaktır. Burada, amid I bölgesinin değerlendirilmesine odaklanıyoruz (örneğin, Şekil 11C,D). İkinci türev analizi, amid I zirvesinin (Şekil 11E,F) temel bileşenlerinin tanımlanması için bir araç olarak yararlıdır ve belirli bir koşul altında eğrilmiş bir ipek elyafında gözlemlenen ikincil yapı tipinin oranlarının değerlendirilmesine ve karşılaştırılmasına izin veren kantitatif pik dekonvolüsyonuna (Şekil 11G-J) güvenilirlik sağlar.

figure-results-5
Şekil 11: FTIR spektrumları ve ikincil yapı analizi. (A,B) (A) eğrilmiş (AS) durumda ıslak eğirme ile üretilen ve (B) etanolde 2 sıkma sonrası gerilme içeren Py4W4 liflerinin FTIR spektrumları. (C,D) Sırasıyla A ve B'de gösterilen FTIR spektrumlarının amid I bölgeleri. (E-F) Sırasıyla C ve D'de gösterilen amid I bölgelerinin ikinci türevi, belirtilen yazılım paketi kullanılarak hesaplanmıştır. (G-J) (G ve I) OMNIC veya (H ve J) OriginPro yazılım paketleri kullanılarak gerçekleştirilen amid I tepe evrişimi, G ve I panelleri C ve H ve J'den D'ye karşılık gelen evrişimdir. Kısaltmalar: FTIR = Fourier dönüşümü kızılötesi; AS = döndürüldüğü gibi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bireysel tekniklerin ötesine geçmek, ikincil yapılandırma, mekanik performans ve (supra) moleküler oryantasyon verilerinin korelasyonu, hem farklı eğirme parametrelerinin elde edilen malzeme üzerindeki etkilerinin anlaşılması hem de eğirme işleminin rasyonel optimizasyonu için tipik olarak gereklidir. Şekil 11'de gösterilen FTIR dekonvolüsyonlarında, örneğin, kimerik bir ipek için AS ile 4×-EtOH koşullarının karşılaştırılması, amid I bandına önemli β yaprak katkıları her iki koşul için de açıktır, ancak dekonvolüsyon yönteminden bağımsız olarak, AS durumuna göre eğrilme sonrası gerilmiş durum için toplam ikincil yapının daha büyük bir bölümünü içerir (örn. Şekil 11G,H ve Şekil 11I,J). Bu, hem 4×-EtOH koşulu için AS durumundan (Şekil 10) önemli ölçüde daha yüksek mukavemet hem de AS durumuna göre 4×-EtOH koşulunda moleküler hizalamadaki iyileşme ile tutarlıdır (Şekil 9). Şekil 10'da gösterilen koşul aralığını kapsayan ayrıntılı karakterizasyon ve analiz daha öncerapor edilmiştir 17. Bu nedenle, burada tüm analizi özetlemedik, bunun yerine bu ikili karşılaştırmayı, bu üç veri sınıfının birbirini nasıl tamamladığının bir göstergesi olarak kullandık ve tek başına herhangi bir teknikten çok daha kapsamlı bir lif davranışı anlayışının geliştirilmesini sağladık.

Ek Dosya 1: Fiber çapı ölçümü, mekanik veri işleme ve FTIR veri toplama ve işlemeyi gösteren Ek Şekiller S1-S34'ü içeren bir dosya. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Kütle ve zaman verilerinden temel mekanik özelliklerin (yani gerilim, gerinim, Young modülü ve tokluk) belirlenmesini sağlayan bir elektronik tablo. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant protein üretimi, malzemeleri çok çeşitli formatlarda üretmek için heyecan verici bir potansiyel sağlar ve son gelişmeler, bu protein bazlı malzemelerin daha yaygın endüstriyel kullanıma yaklaştığını ima etmektedir58. Burada, rekombinant ipekten elyaf üretimine odaklandık, çünkü bu, doğrudan yerli lifli örümcek ipekleriyle ilgili rekombinant ipek formatıdır. İpek lifleri, doğal örümcek ipeklerinin ünlü mekanik özellikleri ve sürdürülebilir bir şekilde yüksek performanslı lifler üretme potansiyeli nedeniyle çok sayıda potansiyel uygulamaya sahip olarak lanse edilmiştir32. Önerilen uygulamalar, yüksek performanslı tekstillerden enerji emici malzemelere, kişisel bakım ürünlerine ve sağlık hizmeti kullanımına kadar uzanmaktadır58,59. Örümcek ipeği bazlı cihazlar ve giyilebilir formatlardaki veya elektriksel iletkenliğin arttırıldığı diğer bağlamlardaki malzemeler de hem biyomedikal hem de daha geniş uygulama için aktif olarak araştırılmaktadır60. Bu nedenle, örümcek ipeği bazlı malzemelerin geliştirilmesi, optimize edilmesi ve özelleştirilmesine büyük ilgi vardır. Bu protokolde, yeni bir rekombinant ipek proteininin hazırlanmasını takiben veya halihazırda eğirilebilir olduğu tespit edilmiş bir rekombinant ipeğin malzeme özelliklerini modüle etmeyi takiben hızlı elyaf üretimini hedefleyen bir dizi prosedürün ana hatlarını çiziyoruz.

Kullanılan eğirme yönteminden bağımsız olarak, burada ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, çözücü/tampon koşullarının ve protein konsantrasyonunun taranması yoluyla spin uyuşturucu üretimini mümkün kılan koşulların belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Nihai hedef, proteinin, "üretken" eğirmeyi önleyecek agregalara veya diğer çözünmeyen türlere yol dışı kendi kendine montaj olmaksızın bir elyafa hızlı bir şekilde dönüştürülmesini sağlamak için yeterince yüksek bir konsantrasyonda çözündürülmesidir. Bu tipik olarak şeffaf, nispeten viskoz bir çözeltidir ve büyük olasılıkla miseller/nanopartiküller26,61 ve/veya sıvı-sıvı faz ayrımı62 gibi kendi kendine bir araya gelen türleri içerir. Bu protokol, çeşitli spin dope'larının ve eğirme konfigürasyonlarının yinelemeli değerlendirmesi yoluyla başarılı lif eğirme elde edilebildiğinden, spin uyuşturucu durumunu kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için yöntemleri detaylandırmaz. Spin uyuşturucu durumuna ilişkin ayrıntılı moleküler ve supramoleküler bilgiler, viskometri, ışık saçılımı, uzak UV dairesel dikroizm spektroskopisi, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve/veya elektron mikroskobu26 gibi tekniklerle elde edilebilir. Ayrıca, rekombinant proteinin kendisinin, spidroin çözünürlüğünü artırmak için bir yöntemin bir örneği olan, tekrarlayan tekrarlayan N ve C terminal alanlarının dahil edilmesiyle, eğirme davranışını geliştirmek için modifiye edilebileceği de belirtilmelidir32. Kısacası, uygun spin uyuşturucu tanımlaması olmadan, eğirme koşullarının karşılaştırmalı testine devam etmek mümkün değildir.

Bir veya daha fazla spin uyuşturucu koşulu belirlendikten sonra, elle çizim, ipek elyaf özelliklerini değerlendirmek için hızlı bir yol sağlar. Verimli el çizimi için önemli ölçüde daha düşük hacimlerde uyuşturucu gerektiğinden, çok daha düşük saf protein kütleleri gereklidir, bu da bunu otomatik ıslak eğirme yaklaşımlarının mükemmel bir öncüsü haline getirir. Bu aynı zamanda, farklı spidroinlerin33 lif özelliklerini doğrudan karşılaştırmak için çok izlenebilir ve basit bir yöntem sağlar, yine lif üretiminin küçük miktarlarda protein ile nispeten basit olması yararıyla. Bu, ıslak eğirme için gereken daha yüksek verimi elde etmek için protein ekspresyonu ve saflaştırma protokollerinin optimizasyonunun en umut verici spidroinlere odaklanabileceği anlamına gelir. Dezavantajı, elbette, elle çizimin ne uzun sürekli liflerin ne de aerodinamik bir şekilde önemli miktarlarda lif üretimine uygun olmamasıdır.

Yeterli protein verildiğinde, ıslak eğirme daha sonra uzun, sürekli liflerin düzenli üretimi için avantajlar sağlar32. Sadece bu değil, aynı zamanda elyaf özellikleri eğirme işlemi boyunca kolayca modüle edilebilir. Örneğin, eğirme uyuşturucu koşullarının seçimi, elyaf mekaniğini iyileştirmek için net bir yol sağlar. Örneğin, ~60 kDa'lık bir rekombinant asiform ipek proteini durumunda, diğer tüm eğirme parametreleri sabit kalırken bir spin dope'dan diğerine geçiş, elyaf uzayabilirliğinde dramatik değişikliklere yol açmıştır26. Bu da, asiform spidroinin eğirmeden önce spin dope'da toplanma şekliyle ilişkilendirilebilirdi, spin dope'da kendi kendine monte edilen nanopartiküllerin geliştirilmiş homojenliği, geliştirilmiş lif mekaniği ile ilişkilendirildi. Çekme oranının belirli bir elyaf türü için optimize edilmesi gerektiğine dikkat çekerek, bir spin sonrası çekmenin dahil edilmesi, aynı zamanda tipik olarak, geliştirilmiş moleküler hizalama ve örneğin lifleri güçlendiren β tabakalı kristalitlere gelişmiş dönüşümün bazı kombinasyonları yoluyla ipek elyaf mekaniğini iyileştirir32. Son olarak, sıkma sonrası çekme aşamasında farklı koşulların kullanılması, lif özelliklerini modüle etmek için bir araç sağlar. Çekme işleminden hemen önce veya çekme sırasında solvente maruz kalma, elyafın mekanik ve yapısal özelliklerini önemli ölçüde değiştirebilir17,38, farklı spidroinlerin farklı solvent tercihlerine ve toleranslarına sahip olacağına dikkat çeker (örneğin, rekombinant asiform liflerin su ile yüksek oranda uyumlu olması26,31 ve suda büzülmeye uğrayan rekombinant piriform lifler38 vs. kimerik piriform-asiform spidroin lifleri, kütlece proteinin yarısından daha az olmasına rağmen, asiform spidroinin su uyumluluğunu sergiler17).

Açıklanan protokol, rekombinant örümcek ipeklerinin eğirilebilirliğini ve lif özelliklerini değerlendirmek ve optimize etmek için oldukça özelleştirilebilir ve çok yönlü bir yaklaşım sağlar. Her durumda, ortaya çıkan lif özellikleri tutarlı ve sağlam bir şekilde analiz edilmeli ve karşılaştırılmalıdır. Burada, polarize ışık mikroskobu, çekme testi ve FTIR spektromikroskobu dahil olmak üzere optik mikroskopi, bu amaç için tekniklerin "standart bir araç seti" olarak kullanılmasını öneriyoruz. Elde edilen liflerin anlaşılmasını genişletmek için ek biyofiziksel ve malzeme karakterizasyon teknikleri uygulanabilir, ancak bu teknik seti, morfoloji, intrafibriller hizalama / anizotropi, mekanik performans ve protein ikincil yapılanmasının temel özelliklerinin olağanüstü bir şekilde kapsanmasını sağlar. Özellikle, FTIR spektromikroskobu, ipek elyafı ikincil yapılanmasını değerlendirmek için nispeten basit bir araç sağlasa da ve polarize ışık mikroskobu, elde edilen gelişmiş moleküler hizalama derecesi hakkında çıkarımlara izin verse de, katı hal NMR spektroskopisi63,64, X-ışını kırınımı 64, polarize Raman spektromikroskobu65 ve/veya doğrusal olmayan optik mikroskopi54 tam yapı-mekanik ilişkisinin aydınlatılması için ipek lifleri içindeki kristalliği, hizalamayı ve yapılanmayı daha kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için düşünülmelidir. Islak eğirmenin diğer protein türleri66 için uygunluğu göz önüne alındığında, bu protokolün genel olarak rekombinant ipeklerin ötesinde uygulanabilir olmasını bekliyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan K. Rainey, 3DBioFibR, Inc. ile öz sermaye veya hisse senetleri ve finansman hibelerini içeren bir ilişki olduğunu bildiriyor. Diğer yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın finansmanı, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Keşif Hibeleri (RGPIN-2020-06083'ten X-QL'ye ve RGPIN-2023-05912'den JKR'ye), Ulusal Savunma Bakanlığı/NSERC Eki (DGDND-2023-05912'den JKR'ye), 3DBioFibR Inc ile ortaklaşa bir NSERC İttifak Hibesi (ALLRP-578541-22'den JKR'ye) ve NSERC Araştırma Araçları ve Araçları Hibeleri tarafından sağlanmıştır. AG, Molly Appeal Bağışçılarının desteğiyle finanse edilen Doktora düzeyinde Nova Scotia Yüksek Lisans Bursu (NSGS-D) ve Dalhousie Tıp Fakültesi 2024 Yüksek Lisans Öğrenciliği sahibidir; HB, NSERC tarafından finanse edilen bir Vanier Kanada Yüksek Lisans Bursu, bir Killam Doktora Öncesi Bursu (Seviye 2) ve bir NSGS-D alıcısıdır; ve SE, bir NSERC Doktora Yüksek Lisans Bursu (PGS-D), bir NSERC / Ulusal Savunma Bakanlığı Ek Finansman Ödülü ve bir Walter C. Sumner Memorial Bursu sahibidir. Yazarlar, Sophie Haverstock ve Emily Smith'in teknik desteği için minnettardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,1,1,3,3,3-heksafloropropanol (HFIP)Thermo Fisher Scientific 445820500Dope hazırlığı için kullanılır
1725LTSN şırınga Luer uçlu çimentolu iğne ile Hamilton81100Islak eğirme için kullanılır
2,2,2-trifloroetanol (TFE)Sigma-AldrichT63002-500GDope hazırlığı için kullanılır
Mutlak etanolFisher ScientificBP28184Koagülasyon banyosu için kullanılır 
Asetik asitFisher ScientificA38-212Dope hazırlama için kullanılır
Analitik dengeMettler Toledo XS105 Çift AralıklıÇekme test cihazı
Kalsiyum klorür (CaCl2)Sigma-AldrichC-3881Dope hazırlama için kullanılır
Sitrik asit Millipore Sigma77-92-9Dope hazırlık için kullanılır
BilgisayarRaspberry PiRaspberry Pi 4 Model B Islak eğirme cihazı - step motorları kontrol etmek için grafik kullanıcı arayüzünü kullanma yeteneği sağlar
Disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4)Millipore Sigma7558-79-4Dope hazırlama için kullanılır
Formik asit Fisher ScientificA118-500Dope hazırlık için kullanılır
Cam kaydırıcılar Millipore SigmaS8902-1PAKFiber montajı için kullanılır
Hidroklorik asit (HCl)EM ScienceHX0603-53Dope hazırlığı için kullanılır
MCT-A Soğutmalı Dedektör Thermo Fisher Scientific840-199300Fiber ikincil yapının FTIR değerlendirmesi
Montaj plakasıŞirketIslak eğirme cihazı
NEMA 17 Biopolar Step MotorSTEPPERONLINE17HS15-1504S-X1Islak eğirme cihazı - not: spin sonrası gerdirme işlemini gerçekleştirmek için birden fazla motor gerekir
Nicolet iN10 FTIR spektromikroskopThermo Fisher Scientific912A0604Fiber ikincil yapısının FTIR değerlendirmesi
Nicolet iN10 Haritalama AşamasıThermo Fisher Scientific840-198800Fiber ikincil yapısının FTIR değerlendirmesi
Nicolet iN10 Motorlu Sahne Joystick Thermo Fisher Scientific840-199800FTIR fiber ikincil yapı değerlendirmesi
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350Thermo Fisher Scientific840-194800 Fiber ikincil yapısının FTIR değerlendirmesi
1.7.224Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR enstrüman kontrol yazılımı
OMNIC ver. 9.11.745Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR enstrümana özel veri işleme ve analiz yazılımı
Optik/Polarize ışık  mikroskopZeiss CanadaAxio Observer A1Ters optik mikroskop
OriginPro 2025 10.2 SR1OriginLab CorporationOriginPro 10.200196Üçüncü taraf FTIR veri işleme ve analiz yazılımı
Potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4)Fisher ScientificP285-10Uyuşturucu hazırlamak için kullanılır
Potasyum fosfat dibazik (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500Uyuşturucu hazırlamak için kullanılır
Güç kaynağıALITOVEALT-1205Islak dönen cihaz - 12V 5A Güç Kaynağı Adaptör Dönüştürücü AC 100-240V Giriş 5.5x2.5mm DC Çıkış Jakı ile - not: optimal performans için, her motor için ayrı bir güç kaynağı gerektirebilir
Sodyum asetat Sigma-AldrichS2889-1KGDope hazırlama için kullanılır
Sodyum hidroksit (NaOH)Millipore Sigma1310-73-2Dope hazırlama için kullanılır
Dönen silindirler ŞirketIslak eğirme
Step Motor KablolarıXMSJSIYB0BD5FV3R2Islak eğirme cihazı - step motor kontrolörlerinden step motorlara bağlantı sağlar
Step Motor Kontrol Cihazı (Pi HAT)AdafruitDC & Raspberry Pi için Step Motor HATIslak eğirme cihazı motor kontrolörü permütasyonu 1 - ~46 rpm ile sınırlı motor dönüş hızına dikkat edin
Step Motor Kontrol Cihazı (USB)PoluluTic T249Islak eğirme cihazı motor kontrolörü permütasyonu 2 - 46 rpm'den daha hızlı dönüş gerektiğinde kullanın
Şırınga pompasıKD ScientificModel 100Çekme test cihazı ve ıslak eğirme cihazı
Trifloroasetik asit (TFA)Millipore SigmaTX1276-7Dope hazırlama için kullanılır
Tris-hidroklorür EMD Millipore9310-500GMUyuşturucu hazırlama için kullanılır
USB HubAcasisB07Q3TYF15 Islak eğirme cihazı - 48W Elektrikli USB Hub - ACASIS 10 Bağlantı Noktalı USB 3.0 Veri Merkezi - Bireysel Açma/Kapama Anahtarları ve 12V/4A Güç Adaptörü USB Ayırıcı ile - Raspberry Pi ve Tic T249 step motor kontrolörleri arasındaki arayüz
içinde üretilmiştir içinde üretilmiştir için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gosline, J. M., Demont, M. E., Denny, M. W. The structure and properties of spider silk. Endeavour. 10 (1), 37-43 (1986).
  2. Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J Exp Biol. 202 (23), 3295-3303 (1999).
  3. Lewis, R. V. Spider silk: Ancient ideas for new biomaterials. Chem Rev. 106 (9), 3762-3774 (2006).
  4. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New opportunities for an ancient material. Science. 329 (5991), 528-531 (2010).
  5. Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int J Biol Macromol. 24 (2-3), 271-275 (1999).
  6. Römer, L., Scheibel, T. The elaborate structure of spider silk: structure and function of a natural high performance fiber. Prion. 2 (4), 154-161 (2008).
  7. Altman, G. H., et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24 (3), 401-416 (2003).
  8. Fahnestock, S. R., Irwin, S. L. Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 23-32 (1997).
  9. Xia, X. -X., et al. Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coli results in a strong fiber. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (32), 14059-14063 (2010).
  10. Fahnestock, S. R., Bedzyk, L. A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 33-39 (1997).
  11. Bogush, V. G., et al. Recombinant analogue of spidroin 2 for biomedical materials. Dokl Biochem Biophys. 441, 276-279 (2011).
  12. Huemmerich, D., et al. Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins. Curr Biol. 14 (22), 2070-2074 (2004).
  13. Menassa, R., et al. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: Accumulation and field production. Plant Biotechnol J. 2 (5), 431-438 (2004).
  14. Hauptmann, V., et al. Native-sized spider silk proteins synthesized in planta via intein-based multimerization. Transgenic Res. 22, 369-377 (2013).
  15. Lazaris, A., et al. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295 (5554), 472-476 (2002).
  16. Xu, H. T., et al. Construct synthetic gene encoding artificial spider dragline silk protein and its expression in milk of transgenic mice. Anim Biotechnol. 18, 1-12 (2007).
  17. Ghimire, A., Xu, L., Liu, X. Q., Rainey, J. K. A recombinant chimeric spider pyriform-aciniform silk with highly tunable mechanical performance. Mater Today Bio. 26, 101073(2024).
  18. Wohlrab, S., et al. Cell adhesion and proliferation on RGD-modified recombinant spider silk proteins. Biomaterials. 33 (28), 6650-6659 (2012).
  19. Baker, L. A., et al. Nerve growth factor-binding engineered silk films promote neuronal attachment and neurite outgrowth. Adv Funct Mater. 32 (45), 2205178(2022).
  20. Kluge, J. A., Rabotyagova, O., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Spider silks and their applications. Trends Biotechnol. 26 (5), 244-251 (2008).
  21. Bakhshandeh, B., Nateghi, S. S., Gazani, M. M., Dehghani, Z., Mohammadzadeh, F. A review on advances in the applications of spider silk in biomedical issues. Int J Biol Macromol. 192, 258-271 (2021).
  22. Hijirida, D. H., et al. 13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk gland. Biophys J. 71 (6), 3442-3447 (1996).
  23. Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid Crystalline Spinning of Spider Silk. Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).
  24. Doblhofer, E., Heidebrecht, A., Scheibel, T. To spin or not to spin: spider silk fibers and more. Appl Microbiol Biotechnol. 99, 9361-9380 (2015).
  25. Koeppel, A., Holland, C. Progress and trends in artificial silk spinning: A systematic review. ACS Biomater Sci Eng. 3 (3), 226-237 (2017).
  26. Xu, L., Weatherbee-Martin, N., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Recombinant silk fiber properties correlate to prefibrillar self-assembly. Small. 15 (12), 1805294(2019).
  27. Teulé, F., et al. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat Protoc. 4 (3), 341-355 (2009).
  28. Yang, M., Kawamura, J., Zhu, Z., Yamauchi, K., Asakura, T. Development of silk-like materials based on Bombyx mori and Nephila clavipes dragline silk fibroins. Polymer. 50 (1), 117-124 (2009).
  29. Lewis, R. V., Hinman, M., Kothakota, S., Fournier, M. J. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. Protein Express Purif. 7 (4), 400-406 (1996).
  30. Arcidiacono, S., et al. Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
  31. Weatherbee-Martin, N., et al. Identification of wet-spinning and post-spin stretching methods amenable to recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 17 (8), 2737-2746 (2016).
  32. Schmuck, B., et al. Strategies for making high-performance artificial spider silk fibers. Adv Funct Mater. 34 (35), 2305040(2024).
  33. Xu, L., et al. Structural and mechanical roles for the C-terminal nonrepetitive domain become apparent in recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 18, 3678-3686 (2017).
  34. Xu, L., Rainey, J. K., Meng, Q., Liu, X. Q. Recombinant minimalist spider wrapping silk proteins capable of native-like fiber formation. PLoS One. 7 (11), e50227(2012).
  35. Exler, J. H., Hümmerich, D., Scheibel, T. The amphiphilic properties of spider silks are important for spinning. Angew. Chem, Int Ed. 46 (19), 3559-3562 (2007).
  36. Teulé, F., Furin, W. A., Cooper, A. R., Duncan, J. R., Lewis, R. V. Modifications of spider silk sequences in an attempt to control the mechanical properties of the synthetic fibers. J Mater Sci. 42, 8974-8985 (2007).
  37. Khan, A. Q., et al. Innovations in spider silk-inspired artificial gel fibers: methods, properties, strengthening, functionality, and challenges. SusMat. 4 (3), e205(2024).
  38. Simmons, J. R., Xu, L., Rainey, J. K. Recombinant pyriform silk fiber mechanics are modulated by wet-spinning conditions. ACS Biomater Sci Eng. 5 (10), 4985-4993 (2019).
  39. Seidel, A., Liivak, O., Jelinski, L. W. Artificial spinning of spider silk. Macromolecules. 31 (19), 6733-6736 (1998).
  40. Venkatesan, H., et al. Artificial spider silk is smart like natural one: Having humidity-sensitive shape memory with superior recovery stress. Mater Chem Front. 3 (11), 2472-2482 (2019).
  41. Sommer, C., Scheibel, T. Suitable electrospinning approaches for recombinant spider silk proteins. Open Ceramics. 15, 100420(2023).
  42. Wang, M. Y., et al. Dry-spinning of artificial spider silk ribbons from regenerated natural spidroin in an organic medium. Macromol Rapid Commun. 44 (12), 2300024(2023).
  43. Chang, M., Zhang, X., Yang, Z. Artificial metal-ion doped spider silk fibers with excellent mechanical property and humidity-driven actuator property. Macromol Chem Phys. 226 (10), 2400502(2025).
  44. Kang, E., et al. Digitally tunable physicochemical coding of material composition and topography in continuous microfibres. Nat Mater. 10 (11), 877-883 (2011).
  45. Lin, B., et al. Overexpressed artificial spidroin based microneedle spinneret for 3D air spinning of hybrid spider silk. ACS Nano. 18 (37), 25778-25794 (2024).
  46. Gonska, N., et al. Structure-function relationship of artificial spider silk fibers produced by straining flow spinning. Biomacromolecules. 21 (6), 2116-2124 (2020).
  47. Blackledge, T. A., Cardullo, R. A., Hayashi, C. Y. Polarized light microscopy, variability in spider silk diameters, and the mechanical characterization of spider silk. Invert Biol. 124 (2), 165-173 (2005).
  48. Greco, G., et al. Properties of biomimetic artificial spider silk fibers tuned by postspin bath incubation. Molecules. 25 (14), 3244(2020).
  49. Andersson, M., et al. Biomimetic spinning of artificial spider silk from a chimeric minispidroin. Nat Chem Biol. 13 (3), 262-264 (2017).
  50. Tremblay, M. L., et al. Spider wrapping silk fibre architecture arising from its modular soluble protein precursor. Sci Rep. 5 (1), 11502(2015).
  51. Schmuck, B., et al. Impact of physio-chemical spinning conditions on the mechanical properties of biomimetic spider silk fibers. Commun Mater. 3 (1), 83(2022).
  52. Yue, X., et al. A novel route to prepare dry-spun silk fibers from CaCl2-formic acid solution. Mater Lett. 128, 175-178 (2014).
  53. Sulekha, A., et al. An engineered recombinant spider silk protein providing disulfide-locked control over self-assembly and fiber formation. Adv Funct Mater. 35 (15), 2420254(2025).
  54. Harvey, M., Ghimire, A., Cisek, R., Kreplak, L., Rainey, J. K., Tokarz, D. Polarization-resolved second harmonic generation microscopy of silk fibers is sensitive to β-sheet orientation and molecular structure. ACS Appl Bio Mater. 8 (6), 5229-5238 (2025).
  55. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  56. Huan, Y., et al. Experimental study of the mechanical properties of a novel supramolecular polymer filament using a microtensile tester based on electronic balance. Exp Tech. 40, 737-742 (2014).
  57. Hu, X., Kaplan, D., Cebe, P. Determining beta-sheet crystallinity in fibrous proteins by thermal analysis and infrared spectroscopy. Macromolecules. 39 (18), 6161-6170 (2006).
  58. Breslauer, D. N. Current progress on scale-up and commercialization of microbially-produced silk. Adv Funct Mater. 35 (15), 2408386(2025).
  59. Branković, M., et al. Review of spider silk applications in biomedical and tissue engineering. Biomimetics. 9 (3), 169(2024).
  60. Pan, L., et al. A supertough electro-tendon based on spider silk composites. Nat Commun. 11 (1), 1332(2020).
  61. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
  62. Malay, A. D., et al. Spider silk self-assembly via modular liquid-liquid phase separation and nanofibrillation. Sci Adv. 6 (45), eabb6030(2020).
  63. Asakura, T., Naito, A. Structure of spider silk studied with solid-state NMR. Adv Funct Mater. 35 (15), 2407544(2024).
  64. Yarger, J. L., Cherry, B. R., Van Der Vaart, A. Uncovering the structure-function relationship in spider silk. Nat Rev Mater. 3 (3), 1-11 (2018).
  65. Lefèvre, T., Paquet-Mercier, F., Rioux-Dubé, J. F., Pézolet, M. Structure of silk by Raman spectromicroscopy: from the spinning glands to the fibers. Biopolymers. 97 (6), 322-336 (2012).
  66. Schiller, T., Scheibel, T. Bioinspired and biomimetic protein-based fibers and their applications. Commun Mater. 5 (1), 56(2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
Posted by JoVE Editors on 9/08/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68714

Etiketler

r mcek pe i retimipe in Elle ekilmesipe in Islak E irme Y ntemiyle retimipek Lifi OptimizasyonuE irme zeltisi Haz rlamaE irme Sonras ekmeOptik Mikroskopiekme TestiFTIR Spektromikroskopi
Video yakında

İlgili makaleler