Sinir onarımı ve fonksiyonel iyileşme için fare siyatik sinir transeksiyonu/yeniden dikme prosedürü

Summary

Bu protokol, yetişkin dorsal kök ganglion nöronları kullanılarak periferik sinir yenilenmesini incelemek için farelerde siyatik sinir kesimini ve yeniden dikiş modelini tanımlar. Sinir yaralanması sonrası akson yeniden büyümesi, kas reinnervasyonu ve fonksiyonel iyileşmenin in vivo analizini mümkün kılar.

Abstract

Sinir onarımı, aksonal yaralanmadan sonra işlevin yeniden sağlanması için çok önemlidir. Ancak, merkezi sinir sistemindeki (CNS) olgun nöronların yaralanmadan sonra aksonlarını yenileme kapasitesi azalması ve düşmanca bir ortam nedeniyle sınırlı bir yetenek vardır. Buna karşılık, periferik sinir sistemindeki (PNS) nöronlar sağlam bir yenilenebilirlik potansiyeli sergiler. Bunlar arasında, yetişkin dorsal kök ganglion (DRG) nöronları özellikle periferik sinir hasarlarının ardından etkili şekilde yenilenme yetenekleriyle tanınır ve bu da onları sinir onarımının yatağında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesi için ideal bir model yapar. Burada, farelerde siyatik sinir kesimi ve yeniden dikiş modeli oluşturmak için "döngü-öncesi-transeksiyon" olarak adlandırılan modifiye edilmiş bir mikrosütür tekniği tanımlanır; ardından akson yenilenmesi analiz edilir. Davranışsal değerlendirmeler ve kas reinnervasyonu da fonksiyonel iyileşmeyi değerlendirdiği gösterilmiştir. Siyatik sinir kesimi ve yeniden dikme sonrası, hayvanlarda başlangıçta davranışsal bozukluklar görülür, ancak yaralanmadan 30 gün sonra tam iyileşme genellikle gözlemlenir. Yaralanma bölgesinde aksonal füzyonu teşvik eden ilaçların uygulanması, fonksiyonel iyileşmeyi önemli ölçüde hızlandırır. Bu model sistemi, memeli sinir onarımını in vivo yöneten mekanizmaları araştırmak için güçlü bir araç sunar.

Introduction

Aksonal yaralanma, beyin ve omurilik hasarının yaygın ve ciddi bir sonucudur; genellikle travmatik yaralanmalar, nörotoksinler veya sinirsel bağlantıyı bozan ve aksonal rejenerasyonu bozan nörolojik^{bozukluklar nedeniyle oluşur 1,2}. Tüm nöronlar özgün yenilenme kapasitesine sahip değildir ve bu da kesilmiş aksonların onarımı için hayati öneme sahiptir. Aksonal rejenerasyon hızı, nöronların içsel büyüme potansiyeli, protein sentezi verimliliği, sitoskelet dinamikleri, miyelin döküntüsünün temizlenmesi ve büyüme^{faktörleri 3,4'ün} bulunabilirliği gibi birçok faktörden etkilenir.

Yetişkin memeli merkezi sinir sisteminde (CNS), aksonal yaralanma, öncelikle içsel büyümeyi teşvik eden faktörlerin eksikliği ve inhibitör dış^{ipuçlarının bulunması nedeniyle} azalan rejeneratif kapasiteye yol açar ^1,5. Buna karşılık, periferik sinir sistemindeki (PNS) aksonlar, periferik nöronların içsel kendi kendini onarma mekanizmaları ve pro-rejeneratif büyüme programlarının hızlı yeniden aktivasyonu sayesinde yaralanma sonrası güçlü bir yenilenme yeteneğine sahiptir. Yaralanma üzerine, aksonun distal segmenti nöronal soma ile bağlantısı kesilir ve aksonal parçalanma ve parçalanma ile karakterize edilen Waller^{dejenerasyonuna uğrar 6,7}. Glial hücreler tarafından aksonal ve miyelin kalıntılarının etkin şekilde temizlenmesi, başarılı rejenerasyon için gereklidir; çünkü aksonal büyümeyi engelleyebilecek skar oluşumunu^önler. Bu süreç, yaralı aksonların sitoskelet yeniden şekillendirilmesiyle birlikte, proksimal kütüğün yeniden büyümesini destekler ve hedef reinnervasyonu kolaylaştırır. Bu olaylar, ATF3 ve c-Jun gibi transkripsiyon faktörlerinin yaralanma kaynaklı aktivasyonu, pro-rejeneratif gen ekspresyonları programlarını teşvik ettiği kısmen örtüşen^{aşamalarda gerçekleşir 4,9,10}.

Rejeneratif aksonal füzyon, aksonal yaralanma sonrası nöron bağlantısının yeniden sağlanması için etkili bir^{mekanizmayı temsil eder 11}. Bu süreç ilk olarak 1967 yılında Procambarus clarkii kerevitinde^{tanımlanmış ve} o zamandan beri Caenorhabditis elegans¹⁷ dahil olmak üzere birçok tür 13,14,15,16 üzerinde belgelenmiştir. Memelilerde aksonal füzyona dair doğrudan kanıtlar sınırlı olsa da, sinir onarımını artırmak için başarıyla füzyon indükleyici stratejiler^{kullanılmıştır11}. Özellikle, kimyasal fusogen polietilen glikol (PEG), membranın yeniden kapamasını teşvik eder ve memeli modellerde hem periferik sinir hem de omurilik yaralanmalarının ardından fonksiyonel iyileşmeyi kolaylaştırdığı^{gösterilmiştir} 18,19,20,21,22,23,24. Son bulgular, glutatyon peroksidaz (GPX) azalmasının C. elegans^25'te aksonal füzyonu teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, Gpx4 koşullu nakavt fareleri veya GPX inhibitörü ML162 ile tedavi edilenler, siyatik sinir kesiminden sonra, muhtemelen gelişmiş aksonal^{füzyon 25} yoluyla hızlı fonksiyonel iyileşme göstermiştir.

Siyatik sinir, duyusal, somatik motor ve otonom motor^{aksonlardan oluşan karışık bir sinirdir 26}. Farelerde L4 ve L5 omurga^{segmentlerinden, farelerde 28} ise L3 ve L4 segmentlerinden kaynaklanır. Erişilebilirliği ve anatomik tutarlılığı nedeniyle, siyatik sinir yaralanması, periferik sinir yenilenmesini incelemek için en yaygın kullanılan modellerden^{biri haline gelmiştir 29,30}. Bu modeller, hem içsel nöronal mekanizmaların hem de aksonal büyüme ve fonksiyonel iyileşmeyi etkileyen dışsal çevresel faktörlerin ^{incelenmesini mümkün kılar 3,4,9}. Siyatik sinir ezilmesinin sinirbilimde deneysel bir paradigma olarak kullanılması 19^{. yüzyılın} sonlarına kadar uzanır. Sinir ezme modellerine ek olarak, sinir kesimleri akson yenilenmesi ve fonksiyonel iyileşme çalışmalarında yaygın olarak kullanılır. Ancak, farelerde klasik siyatik sinir kesiminden sonra dikiş ile birlikte incelenmesi, sinirin küçük boyutu ve kırılgan dokusu nedeniyle sıçanlara göre genellikle daha az tekrarlanabilir ve^{güvenilirdir.}

"Döngü öncesi transeksiyon" olarak adlandırılan modifiye siyatik sinir kesimi ve yeniden dikiş modeli kullanılarak, tekrarlanabilir siyatik sinir kesimi ve yeniden dikiş modelleri başarıyla^{üretildi 25}. Bu yaklaşım, kesimden önce dikişin önceden yerleştirilmesiyle transsection sonrası sinir işlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır; böylece mekanik stresi azaltır ve cerrahi tekniğe bağlı değişkenliği en aza indirir. Fare siyatik sinirinin tam kesiminden sonra fonksiyonel iyileşmeye orta düzeyde GPX^{modülasyonu katkısı bulundu 25}. Siyatik sinir kesiminde (SNT) / yeniden dikiş lezyonunda düşük konsantrasyonlar ML162 (0.25 μM)³², GPX inhibitörü ve polietilen glikol (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 ile birlikte tedavi edilmesi, iğne batma, ayak hata asimetrisi ve parmak yayılması testi ^25,33 ile değerlendirilen davranış puanını başarıyla ^artırdı.34. Memeli dorsal kök ganglionu (DRG) nöronlarının amputasyon distal akson parçaları 3 gün içinde dejenere olur; bu da nöromüsküler birleşimlerin (NMJ)^6,35 bozulmasına yol açar ve rejeneratif DRG nöronları kasların işlevlerini yeniden kazanmak için yeniden innerve edilir. SNT/resuture-ML162/PEG ortak tedavi grubu, erken zaman noktasında (ameliyattan 3 gün sonra) innerve edilmiş NMJ'ler ve gelişmiş davranış puanları gösterdi; bu da nöromüsküler fonksiyonun erken iyileşmesini^{gösteriyor 25}.

Burada, farelerde yukarıda görülmeleri mümkün kılan "döngü-öncesi döngü" mikrosütür yöntemi ve ilaç uygulaması tanımlanmıştır. Önceden kurulmuş ve kopmuş fare sinirlerinin hızlı onarımını sağlayan PEG-füzyon protokolü^{değiştirildi 18}. Polietilen glikolün (PEG), kesilen kerevit medial dev aksonlarının (MGA) dış bağlantısını in vitro³⁶ olarak teşvik ettiği ilk olarak bildirilmiştir. PEG-füzyon protokolleri, sıçan siyatik sinirinin ezilme-kesilme yaralanmalarını içeren çalışmaların %25-%30'unda davranışsal sonuçları iyileştirdi, ancak fonksiyonel iyileşme erken zaman^{noktalarında gözlemlenmedi 34}. Sonraki iyileştirmeler ise endojen membran mühürleme^{kavramını içermiştir 37}. Sinir hasarından sonra, hızlı plasmalemmal onarım nöroprotektif bir yapıya sahiptir ve nörodejenerasyonu önler. Ca²⁺ kaynaklı zar bağlanmış veziküllerin birikimi bu mühürleme sürecini kolaylaştırır³⁸. Tam sinir kesimleri, lezyon bölgesindeki endoneuryal, perineurial ve epinöral kılıfları hem aksolemma hem de bozar. Epinöral kılıfın mikro dikişi proksimal ve distal sinir kütüklerini hizalar. Dikiş aşamasında, Ca²⁺ serbest hipotonik salin kullanımı, membrana bağlı veziküllerin oluşumunu azaltır, endoneuryal ve perineuryal kılıfları açık tutar ve epinöral dikişlerle yakınlaştırılmasına olanak tanır. Bunun ardından, Ca²⁺ içeren tuzlu su uygulaması, kalan plazmalemmal^{bozulmayı kapatmak} için vezikül birikimini indükler 18.

Bu protokolde, yetişkin FVB fareleri (8-10 haftalık) ve C57BL/6 fareleri kullanıldı ve suş spesifik bir fark gözlemlenmedi. Farelerde siyatik sinir, gluteal kasın yaklaşık 1-2 mm altında, orta uyluk seviyesinde yer alır ve sıçanlara göre belirgin şekilde daha ince ve kırılgandır; bu nedenle diseksiyon ve dikiş sırasında daha fazla cerrahi hassasiyet gereklidir. Sinir aşırı gerilmesi veya fonksiyonel iyileşmeyi tehlikeye atabilecek aşırı manipülasyondan kaçınmak için özen gösterilmelidir. Bu yaklaşım, sinirin tamamen kesilmesini içerir ve proksimal ile distal kütük arasında fiziksel bir boşluk oluşur. Bu boşluk doğrudan aksonal yenilenmesi engelleydiğinden, başarılı iyileşme genellikle mikrocerrahi müdahale veya sinir grefti gerektirir.

Fare siyatik siniri sıçanınkinden daha ince ve hassas olduğundan, daha fazla cerrahi hassasiyet gereklidir. Mikro dikiş yaygın olarak kullanılsa da, aşırı manipülasyon veya tekrarlayan iğne geçişleri nedeniyle istemeden ek travmaya yol^{açabilir 39}. Bu sınırlamalar, değişkenlik yaratabilir ve yeni tedavi stratejilerinin değerlendirilmesini engelleyebilir. Bu nedenle, dikiden kaynaklanan sinir hasarını en aza indirirken tutarlı cerrahi sonuçlar elde etmek, sinir geçiş modellerinde fonksiyonel iyileşmeyi güvenilir şekilde değerlendirmek için gereklidir. Bu "döngü-öncesi transeksiyon" yöntemi kullanılarak, tekrarlanabilir siyatik sinir kesimi ve yeniden dikiş modelleri oluşturuldu ve PEG ile ML162 ile çift tedavinin fonksiyonel iyileşme üzerindeki etkileri değerlendirildi. Genel olarak, yaygın kullanımına rağmen, fare siyatik sinir geçiş modeli, sinirin küçük boyutu ve kırılganlığı nedeniyle teknik zorluklar yaratmaktadır. Burada açıklanan bu modifiye yeniden dikiş yöntemi, mekanik hasarı en aza indiren, tekrarlanabilir, standartlaştırılmış bir mikrocerrahi protokole kritik ihtiyacı karşılar.

Protocol

Tüm hayvan işlemleri, Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi San Antonio'daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Protokol Numarası: 20200082AR). Burada tanımlanan JoVE deneysel prosedürleri için yetişkin erkek ve dişi FVB fareleri (8-10 haftalık, 20-25 g) kullanıldı. C57BL/6 fareleri (8-10 haftalık, 20-25 g) yalnızca resmi deneylerden önce yapılan ön uygulama ameliyatlarında kullanıldı; böylece kullanım ve dikiş hassasiyeti optimize edildi. Bu çalışma seansları, "geçiş öncesi döngü" prosedürünün her iki suşta da benzer sonuçlar verdiğini doğruladı; bu nedenle, bu el yazmasında sunulan tüm resmi veriler FVB farelerinden alınmıştır. Başlangıçta siyatik sinir kesimiyle toplam on FVB faresi (beş erkek ve beş kadın) dahil edildi, ardından ML162 + PEG tedavisi yapıldı. Bir hayvanda siyatik sinirin kesişim noktasından önce iki ana dala ayrıldığı ve cerrahi tamamlanmamış cerrahi ile analizden hariç tutulduğu doğuştan anatomik bir varyasyon sergiledi. Bu nedenle, dokuz hayvan üzerinde davranışsal ve histolojik analizler yapıldı (n = 9). Her iki cinsiyette de benzer rejeneratif ve davranışsal iyileşme gösterildi ve cinsiyete özgü bir fark gözlemlenmedi. Ek bir fare, sinir kesimsiz çift dikiş penetrasyonu (sahte kontrol) geçirerek dikiş prosedürünün davranışsal sonuçlar üzerindeki potansiyel etkisini değerlendirdi. Cinsiyetler arasında rejeneratif yanıtta belirgin bir fark gözlemlenmedi. Hayvanlar, 12 saat ışık/karanlık döngüyle, 75 °F ve %40-60 göreli nemde, yiyecek ve suya ima kadar imkansız erişim sağlanarak standart koşullarda barındırıldı. Hem erkek hem dişi fareler kullanıldı ve erkek ile dişi hayvanlar arasında belirgin bir fark gözlemlenmedi. Cerrahi işlemler, SomnoSuite düşük akışlı anestezi sisteminin izofloran anestezisi altında gerçekleştirildi. Davranışsal testler, ameliyat sonrası 2. günden itibaren yapıldı ve ilgili şekillerde belirtildiği gibi 4, 7, 10, 14, 18, 22 ve 27. günlerde tekrarlandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Siyatik sinir kesim/yeniden dikme ve ilaç tedavisi

1. Hayvanı, siyatik sinirin stereo diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenebileceği ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin (Şekil 1A).
2. SomnoSuite düşük akışlı anestezi sistemiyle fareyi anestezi altına alın.
   NOT: Ameliyata başlamadan önce anestezi derinliğini, örneğin parmak sıkıştırmasına verilen tepki gibi refleks tepkilerin olmaması ile doğrulayın. Kornea kuruluğunu önlemek için veteriner oftalmik merhemi gözlerine uygulayın.
3. Uyluk ve çevredeki tüyleri tıraş edin.
   NOT: Tıraş edilmiş ve düşen tüyleri mümkün olduğunca temiz bir şekilde çıkarın. Aksi takdirde, tüyler 10-0 naylon dikişe yapışır ve siyatik siniri kirler. Kalan tüyler, tıraş edildikten sonra laboratuvar bandı veya skot bantla nazikçe çıkarılarak temiz bir cerrahi alan sağlanabilir. Ameliyat bölgesini, tıraş edilmiş alanı %70 etanol, betadin ile sıralı olarak silerek dezenfekte edin ve son bir silindreği %70 etanol ile otoklavlanmış pamuk toplarıyla silin.
4. Femur kemiğini konumlandırın ve ince cerrahi makasla orta uyluk seviyesinde, yaklaşık ~1 mm arka ve femur kemiğine paralel olarak yaklaşık 1,0 cm (0,8-1,2 cm aralığında) küçük bir deri kesisi yapın.
   1. Gluteus maximus'u nazikçe geri çekerek alttaki biceps femoris'i ortaya çıkarın. Sonra, makas uçlarını kullanarak biseps femoris'in ön ve arka başlarını kesmeden nazikçe ayırarak siyatik siniri siyatik çentikin altındaki açığa çıkarın. Bu adımlar mikroskop altında değil, doğrudan görsel gözlem altında gerçekleştirilir.
5. Siyatik siniri mikro-diseksiyon forsepsiyle vücuttan çekip, siyatik sinir ameliyatını kolaylaştırın (Şekil 1A).
   NOT: Forsepsleri belirli bir seviyenin ötesine yayılmasını önlemek için bantla sabitleyin; siyatik sinirdeki hasarı en aza indirin. Forsepsin ucunu siyatik sinirin altına yerleştirin ve siyatik siniri fare uyluğunu bir dayak noktası olarak kullanarak yukarıya doğru kaldırın. Siniri sadece dikişi kolaylaştırmak için gereken kadar kaldırmaya dikkat edin ve gerginlik uygulamaktan veya dışarı çekmekten kaçının, çünkü aşırı gerilme aksonlara veya çevredeki yapılara zarar verebilir.
6. Mikroskobu maruz kalan siyatik sinire odaklayın. Bu adımdan itibaren mikroskop kullanarak 15. Adıma geçin (Şekil 1A).
7. 10-0 naylon dikişle siyatik siniri iki kez delin (Şekil 1B,C). Kesilmemiş kontrol için 1-8. Adımlara geçin. Sinir kesimi için 1-11. Adımlara gidin.
   NOT: İki penetrasyon, yaklaşık bir sinir genişliğinde (~0,7 mm) yapıldı ve hedeflenen kesim noktasının her iki yanında simetrik olarak konumlandırıldı. Bu aralık, proksimal ve distal kütüklerin doğru hizalanmasını sağlarken lezyonda mekanik stresi en aza indirdi. Dikişle siyatik sinirin merkezinden penetrasyon yapın, böylece dikiş tarafından yapılan iki penetrasyonun tam paralel olmasını sağlar. 10-0 dikişler küçüktür ve süper ince cımbızla kontrol edilmelidir. Emilmez 10-0 naylon kullanıldı çünkü 30 günlük gözlem süresinde mükemmel çekme stabilitesi ve minimum doku reaktivitesi sağladı. Bu malzeme, fare ve sıçanlarda mikrocerrahi sinir onarım modellerinde yaygın olarak^{kullanılır 18,31}. Emilebilir dikişler kullanılmadı çünkü kademeli bozulma, fonksiyonel iyileşme tamamlanmadan önce kesilmiş sinir kütüklerinin hizalanmasını bozabilirdi. Operatöre bağlı değişkenliği en aza indirmek için, tüm cerrahi işlemler kapsamlı bir mikrocerrahi uygulamadan sonra tek bir eğitimli cerrah tarafından stereomikroskop altında gerçekleştirildi. "Geçişten önceki döngü" yöntemi, transsection sonrası sinir manipülasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırarak değişkenliği daha da azaltır ve böylece hayvanlar arasında tutarlı hizalama ve gerilimi sağlar. Bu, oldukça pratik ve yüksek düzeyde kontrol becerileri gerektirir. Hayvan ameliyatı yapmadan önce, yeni başlayanlar diş ipi gibi ince sentetik ipliklerle dikiş hareketini pratik ederek stereomikroskop altında çeviklik ve kontrol geliştirmeyi faydalı bulabilirler.
8. Naylon dikişle dikkatlice bir düğüm bağlayın.
9. Açıkta kalan siyatik siniri kas katmanının altına yerleştirin ve cildi 4-0 naylon dikişlerle kapatın.
10. 10-0 naylon dikişle siyatik sinirin çift penetrasyonunun fare davranışını etkilemediğini belirleyin.
    NOT: Bunu doğrulamak için, transeksiyon olmadan çift dikiş penetrasyonu geçiren fareler, deneysel gruplarda kullanılan aynı davranış testlerine tabi tutuldu; bunlar arasında iğne batması, ayak hata asimetrisi ve parmak yayılması da yer aldı. Bu fareler, operasyon yapılmayan vahşi tip kontrollerle eşdeğer tam puanlar elde etti; bu da dikiş prosedürünün tek başına siyatik sinir fonksiyonunu bozmadığını gösteriyor.
11. Siyatik siniri iki 10-0 naylon dikiş arasında bir neşter ile kesin (Şekil 1D).
    NOT: Değişkenliği en aza indirmek için, tüm ameliyatlar aynı eğitimli deneyci tarafından standartlaştırılmış bir prosedürle gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, "geçişten önce döngü" tasarımı, transeksiyon sonrası sinir kontrolünden kaçınarak değişkenliği doğal olarak en aza indirir ve tüm hayvanlarda tutarlı dikiş yerleşimi ve gerilimini sağlar. Dikişlerin konumu, hayvanlar arasında uniforme sağlamak için diseksiyon mikroskobu altında doğrulandı.
12. Pensi kaldır.
13. Kesilen sinir, kalsiyum klorür olmadan hazırlanmış Ca²⁺ serbest fosfatlı tuzlu (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7.4) ile yıkanır.
    NOT: Kesilen sinir kütüğünü kalsiyumsuz PBS ile yaklaşık 10-20 saniye boyunca durulayın, böylece kan temizlendi ve erken kapalı oluşmayı önleyin. Yeniden dikme, hizalanmayı ve doku canlılığını korumak için 1-2 dakika içinde hemen tamamlanmalıdır.
14. Ca²⁺ serbest PBS'yi bir doku ile emerek çıkarın.
15. Naylon dikişle dikkatlice bir düğüm bağlayın (Şekil 1E). Eğer ilaç tedavisi planlanmazsa veya gerekli değilse, Step 20'ye geçin.
    NOT: Mikrodikiş için standart bir kare düğüm kullanıldı; iki zıt atıştan oluşuyordu ve stereomikroskop altında ince forsepsle nazikçe sıkıldı. Dikişle birbirine bağlı iki kopmuş akson orijinal şekline yakın bir şekle geri döner. Kopmuş bir kan damarının yeniden bağlanması, proksimal ve distal sinir kütüklerinin doğru hizalandığının görsel bir göstergesi olabilir. İşlem sırasında doku taze ve nemli görünmelidir, soluk veya sıkışma olmadan. Dikişi çok sıkı bağlamaktan kaçının, çünkü bu kan damarlarını çökertebilir veya siniri deforme edebilir. Son düğümü bağlamadan önce, sinir uçlarının gerilim olmadan yaklaşık olarak olduğundan emin olun. Gerekirse, siniri çekmek yerine doğal hizalanmayı kolaylaştırmak için uzuvu nazikçe yeniden konumlandırın; çünkü aşırı gerginlik nöroma veya fibroz riskini artırabilir.
16. 0,25 μM ML162'yi PBS ile seyreltilmiş DMSO'ya bir şırınga ile dikilmiş siyatik sinirin üzerine yerleştirin. Dikişli siyatik siniri ilacın içine 1 dakika batırılmasına izin verin.
17. ML162'yi steril pamuk çubukla emerek çıkarın.
18. 500 mM PEG'i damıtılmış suya yerleştirin, 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış ve dikişli siyatik sinirin üzerine bir şırınga ile yerleştirilin. Dikişli siyatik siniri ilacın içine 1 dakika batırılmasına izin verin.
    NOT: 500 mM PEG, yoğun bir çözeltidir ve çalışma odası sıcaklığında katı hale gelebilir. Operasyon sırasında şırıngayı ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirerek PEG'nin sıvı kalmasını sağlar. PEG'nin, bitişik lipid çift katmanlar arasındaki su moleküllerini uzaklaştırarak zar füzyonu teşvik ettiği düşünülür; böylece yakın membran teması ve kendiliğinden füzyon mümkün kılar. Kesin moleküler mekanizma hâlâ araştırılsa da, bu yaklaşımın aksonal sürekliliği kolaylaştırdığı ve periferik sinir hasarı modellerinde fonksiyonel iyileşmeyi artırdığı gösterilmiştir.
19. PEG'i bir doku ile emerek çıkarın.
20. Dikişli siniri Ca²⁺ içeren PBS ile yıkayın (PBS 1 mM CaCl₂; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM fosfat tamponu, pH7.4) takviye edilmiş.
21. Ca²⁺ içeren PBS'yi bir doku ile emerek çıkarın.
22. Açıkta kalan siyatik siniri kas katmanının altına yerleştirin ve cildi 4-0 naylon dikişlerle kapatın.
23. Hayvan anesteziden kurtulduktan sonra kafesine geri döndürülür.
    NOT: Deri kapandıktan sonra, cerrahi bölge ağrı kesici içeren topikal antibiyotik merhem ile tedavi edildi. Her hayvan, göğsüm yatağını koruyacak kadar bilinç kazanana kadar bir ısıtma pediyle izlendi. Hayvanlar daha sonra bireysel olarak yerleştirildi ve ancak motor fonksiyonları tam iyileştikten sonra gruplarına geri döndü. Cerrahi ortam laminar akış başlığı altında korunmamış olsa da, tüm cerrahi aletler sterilize edilmiş ve işlemler eldivenli eller ve steril aletlerle aseptik teknikle gerçekleştirilmiştir.

2. Davranış testi - Iğne Sapı

NOT: Yaralanma sonrası yüksek eşik mekanik hassasiyet tepkisini^{değerlendirmek için 33}.

1. Fareyi tel ağı bir ızgara yerleştirin ve yeni ortama alışması için 30 dakika boyunca serbestçe dolaşmasına izin verin.
2. Arka patinin plantar yüzeyinin en yan kısmı 5 alana (A'dan E'ye) ayrılmıştır. Austerlitz'i (beden 000) ipsilateral patinin plantar yüzeyine nazikçe uygulayın. Iğne batması, en yan parmaktan (A alanı) topuk (E alanı) kadar iki kez uygulandı.
   NOT: Deriye girmeyin.
   NOT: Hayvan iki iyne batma uyarıcısından hızlı bir şekilde patisini çektiğinde bir yanıt olumlu olarak kabul edildi. Fare bu alan için 1 derecelendirildi ve ardından bir sonraki bölge için test edildi (Maksimum 5). Başvurulardan hiçbiri olumlu yanıt almadıysa, genel not 0 idi. Aynı ipsilateral tarafın safen bölgesini pozitif kontrol olarak kullanın. Her zaman olumlu bir tepki alacaktır.

3. Davranış testi - Ayak hatası (FF) asimetrisi

NOT: Siyatik aksonların daha proksimal kasları ne kadar iyi innerve ettiğini^{ölçmek için 34}.

1. Hayvanların kafesin üzerinde yükseltilmiş tel örgülü ızgara üzerinde özgürce dolaşmasına izin verin, böylece ortama alışın. Bir deneme, arka uzuv başına toplam 50 basamaktan oluşur.
2. Hayvanlar yanlış adım attığında puan al. Puan kriterleri aşağıdaki gibidir.
   Skor 1: Kısmi hata. Bacak tamamen uyluğa kadar düşmeden önce geri çekildi.
   Skor 2: Tam hata. Tamamen kasıklara kadar düştü.
3. Her ameliyat sonrası dönemde tüm hayvanların yaralı ve yaralanmamış arka uzuvlarından bileşik ayak hata puanını hesaplayın.
   Bileşik ayak hata puanı = (# kısmi arızalar x 1) + (# tam fay x 2)
4. Bileşik ayak fay puanını 50'ye (toplam adım/uzuv) bölerek her arka uzuv için kuya yüzdesini elde edin.
   % ayak hata = Bileşik ayak hata puanı/50 (toplam adım) x %100
5. Yaralı arka ayuvdaki ayak kuyruklarını, sağlam arka uzuvdaki ayak fayılarının oranından çıkararak her hayvan için belirli bir ameliyat sonrası zamanda asimetri puanı elde edin.
   Ayak hatası (FF) asimetri puanı = %FF (sağlam uzuv) - %FF (yaralı uzuv)

4. Davranış testi - Parmak açılması

NOT: Sinir yaralanması sonrası motor iyileşmeyi değerlendirmek için. Önceki bir çalışmaya göre, parmak yayılması motor testi, siyatik sinir yaralanmasından sonra motor fonksiyonun iyileşmesini tespit etmek için yürüyüş analizinden^{daha hassastır 30}.

1. Hayvanı nazikçe bir bezle örtün ve arka patileri net gözlemlemek için kuyruğunu kaldırın.
   NOT: Alternatif olarak: Farenin ensesini nazikçe tutun, kuyruğu düzeltin, çevirin ve fareyi kıpırdanarak ayak parmağının hareketini gözlemleyin.
2. Parmak açılma puanını aşağıdaki şekilde verin:
   Skor 2: Tam yayılmış. Tüm parmakların en az 2 saniye boyunca tam, geniş ve sürekli açılması olarak tanımlanır.
   Skor 1: Ara yayılma. Tam yayılma puanına ulaşmayan herhangi bir hareket. Hafifçe titre ya da kısmi hareket et.
   Puan 0: Yayılma yok. Hiç hareket yok.
   NOT: Tüm davranışsal değerlendirmeler (iğne batması, ayak hatası ve ayak parmak yayılması) tedavi gruplarına kör bir deneyci tarafından çift kez kontrol edildi. Hayvanlar, önceki çalışmamızda (Ko ve ^ark.25) kullanılan tasarıma uygun olarak ameliyat sırasında tedavi gruplarına rastgele atanmıştır; bu çalışma dört deneysel durumu (sadece Dikiş, PEG, ML162, ML162 + PEG) içermektedir. Mevcut makale, ML162 + PEG grubundan verileri orijinal deneysel titizliği koruyarak bağımsız olarak analiz edilmiş şekilde sunmaktadır.

5. Histoloji için doku perfüzyonu ve işleme

1. Hayvanı derinlemesine anestezi edin ve sol ventrikül üzerinden fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) ile transkard perfüzyonu gerçekleştirin.
2. Tam kan akışı için sağ atriyumu kesin.
3. Toplanan dokuları gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) içine batırarak fiksasyon yapın.
4. Sabit dokuları PBS ile üç kez yıkayıp ardından gece boyunca 4 °C'de PBS'de kuluçkaya geçirin.
5. Dokuları gece boyunca 4 °C'de %30 sukroza batırarak kriyokoruma yapın.
6. Dokuları OCT bileşiğine gömül, dondur ve kriostat kullanarak 12 μm kalınlıkta kesimlen.
7. Doku bloklarını -80 °C'de, kriyoseksiyonlarda ise -20 °C'de saklayıp kullanılana kadar.
8. Sadece siyatik sinir toplama için perfüzyon çıkarılabilir, çünkü kan içeriği bu periferik dokularda immünboyama kalitesini anlamlı şekilde etkilemez.

Results

Önceki PEG-füzyon^{protokolü 18} , tutarlı cerrahi sonuçları korumak ve dikiş²⁵ nedeniyle oluşan sinir hasarını en aza indirmek için değiştirildi. Dikişin sinirden geçmeden önce sinirden geçmesine yerleştirilerek, cımbızla çimdiklenme veya kesişme sonrası iğneyle batma sonucu oluşan hasar en aza indirildi. Siniri deşen bir dikişin bağlanmasının işlevi üzerindeki etkisini test etmek için, dikiş sağlam bir sinirden iki kez geçirilip düğümlendi (...

Discussion

Sinir dönüşüm çalışmaları, sinir dönüşüm modelleri kullanılarak fare siyatik^{siniri üzerinde yaygın olarak gerçekleştirilmektedir 31,39}. Ancak, küçük boyutu ve yumuşak dokusu nedeniyle fare siyatik siniri cerrahi aletlerle nazikçe tutulması zordur ve doku dikiş sırasında yırtılır. Mikrosütür süreci, genellikle aşırı manipülasyonu içerir ve sinir deformasyonuna ve travmaya yol açabilir. Gereksiz enstrüman uyarısı en aza indirilse b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Pensetler	Dumostar-Biyoloji	11295-51	Her iki elde bir tane. 10-0 naylon dikişi kavramak için iki tane gerekecek.
10-0 naylon dikiş	DemeTECH	NL761000,4F0P
4-0 naylon dikiş	Matris Büyücüsü	0197
Anti-beta-tubulin	R& D Sistemleri	MAB1195
Anti-NF-200	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz boyutu 000			Pinprick testi için
CF488 konjuge alfa-bungarotoksin	Biyotyum	00005
Makasların diseksiyon	Kent Scientific
İnce dikiş makası	Kent Scientific
İris forsepsi	Kent Scientific
K& H Küçük Hayvan Isıtmalı Pad	K& H evcil hayvan ürünleri
ML162	Millipore Sigma	SML2561
Fare cerrahi kiti	Kent Scientific
İğne tutacağı	Kent Scientific
Polietilen glikol (PEG)	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific		İzofloran anestezi için
Splitter forcep			Siyatik siniri ortaya çıkarmak için kullanılırdı.