Örneklemeden Veriden Bağımsız Edinim Kütle Spektrometresine Nöropeptit Karakterizasyonu İş Akışı

Summary

Bu protokol, sıçan beyin dokusunda veriye bağlı edinim-paralel birikim-seri parçalanma (DDA-PASEF) ve veriden bağımsız edinim (DIA) kütle spektrometrisini birleştiren kapsamlı bir nöropeptidomik iş akışını ana hatlarıyla belirtir.

Abstract

Endojen nöropeptitler, davranış, stres, ağrı ve homeostatik regülasyonda kritik roller oynayan beyin fonksiyonunun anahtar modülatörleridir, ancak analizleri hala zordur. Biyolojik olarak, bol miktarda bulunurlar, hızla bozunurlar ve öncül proteinlerden değişken bir şekilde işlenirler, ekspresyonları küçük, lokalize hücre popülasyonlarıyla sınırlıdır. Teknik olarak, bunların tespiti, geniş bir dinamik aralık, çeşitli öteleme sonrası modifikasyonlar ve kütle spektrometresi veri kümelerindeki seyrek sinyaller nedeniyle karmaşıktır. Bu protokol, bir timsTOF platformunda hem veriye bağlı edinim (DDA) hem de veriden bağımsız edinim (DIA) kütle spektrometresi (MS) kullanarak Rattus norvegicus beyin dokusunda nöropeptit analizi için kapsamlı bir iş akışını ana hatlarıyla belirtir. Diseksiyon, peptit ekstraksiyonu ve temizleme dahil olmak üzere optimize edilmiş beyin numunesi hazırlamanın ardından, algılama hassasiyetini ve doğruluğunu artırmak için iyon hareketlilik gaz fazı fraksiyonlaması ile nano sıvı kromatografisi (LC)-MS gerçekleştirilir. DDA tarafından oluşturulan spektral kitaplık, Skyline'da DIA tabanlı nicelemeyi destekleyerek yüksek güvenilirlikli MS2 düzeyinde ölçümler sağlar. Bu entegre iş akışı, nöropeptit kapsamını artırır ve kantitatif tekrarlanabilirliği artırarak karmaşık beyin dokusundaki nöropeptitleri incelemek için sağlam bir platform sağlar.

Introduction

Nöropeptitler, nöronal iletişim, sinir ve nöroendokrin sistem fonksiyonlarının kritik modülatörleri olarak görev yapan, fonksiyonel olarak çeşitli endojen sinyal molekülleri sınıfıdır. Nöromodülatörler, hormonlar veya yardımcı transmiterler olarak hareket ederek, ağrı modülasyonu, stres tepkisi, sirkadiyen düzenleme ve iştah kontrolü dahil olmak üzere çok çeşitli fizyolojik süreçleri etkilerler. Küçük moleküller halinde sentezlenen klasik nörotransmiterlerin aksine, nöropeptitler, mRNA'nın translasyonu yoluyla sentezlenen büyük öncü proteinler içinde kodlanır. Öncü proteinler veya prohormonlar daha sonra yoğun çekirdekli veziküller (DCV'ler) halinde paketlenen aktif peptitleri serbest bırakmak için proteolitik işleme tabi tutulur. Stimülasyon üzerine, nöropeptitler, G-proteinine bağlı reseptörler ile etkileşimler yoluyla modülatör, tipik olarak daha yavaş ve daha uzun süreli etkiler uygulamak için salınır. Merkezi ve periferik sinir sistemi fonksiyonlarının sürdürülmesindeki önemleri onları yoğun bir biyolojik ve klinik ilgi alanı haline getirmiştir 1,2,3,4,5.

Alaka düzeylerine rağmen, nöropeptitlerin karakterize edilmesi analitik olarak zor olmaya devam etmektedir. Oldukça heterojen yapıları - kısadan uzun dizilere kadar değişen, genellikle amidasyon, asetilasyon, fosforilasyon, amino asit izomerizasyonu veya kesme gibi çeşitli translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler) taşıyan - kütle spektrometresinde (MS) iyonlaşma ve parçalanma davranışlarında değişkenliğe yol açar (MS)1,6,7,8 . Ayrıca, tipik olarak biyolojik matris bileşenlerine göre düşük konsantrasyonlarda bulunurlar, kolayca bozunurlar ve sinir sisteminin karmaşık dokusu içinde uzamsal olarak kısıtlı bir şekilde lokalize olurlar. Bu özellikler, özellikle öngörülebilir enzimatik sindirime ve tek tip peptit özelliklerine^dayanan geleneksel proteomik yaklaşımlar kullanıldığında hem tanımlamayı hem de nicelemeyi karmaşıklaştırır ^9,10,11.

Burada, Rattus norvegicus'un beynindeki endojen peptitlerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için nöropeptitlere özel bir vurgu yaparak kapsamlı bir strateji sunuyoruz. Buradaki iş akışı, optimize edilmiş beyin örnekleme prosedürleriyle başlar, ardından kapsamlı sıvı kromatografisi (LC) ayrımları ile devam eder ve sıkışmış bir iyon hareketlilik spektrometresi (TIMS) platformunda paralel birikim-seri parçalanma (PASEF) kullanılarak yüksek çözünürlüklü MS analizi ile sona erer 12,13,14,15,16. Öncü seçiminden önce iyon hareketliliği gaz fazı fraksiyonlamasını (IM-GPF) dahil ederek, veriye bağlı edinim-PASEF (DDA-PASEF) yaklaşımı, gelişmiş öncü ayrımı ve düşük bolluktaki nöropeptitlerin gelişmiş tespitini sağlar, aksi takdirde çoğu tek boyutlu DDA iş akışlarında gözden kaçırılır¹⁷.

DDA, yüksek kaliteli MS / MS spektrumları nedeniyle peptit tanımlamasında en yaygın kullanılan strateji olmaya devam ederken, doğası gereği, düşük bolluktaki türlere karşı önyargılı olan^yoğunluğa göre öncü iyon seçimine dayanmasıyla sınırlıdır ^18,19,20. Ayrıca, yarı stokastik örneklemesi, kopyalar arasında eksik değerlere yol açarak tekrarlanabilir nicelemeyi engeller. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, daha sonra veriden bağımsız edinim (DIA) analizi için kullanılabilecek DDA-PASEF verilerimizi kullanarak sağlam bir spektral kitaplık oluşturduk. DDA'nın aksine, DIA, tanımlanmış m/z pencereleri içindeki tüm öncü iyonları örnekleyerek hem bol hem de nadir peptitlerin tutarlı bir şekilde örneklenmesini sağlar ve Skyline'daki spektral kitaplık ve hedeflenmiş analiz ile birleştirildiğinde, hassas ve tekrarlanabilir MS2 düzeyinde nicelemeye izin verir 21,22,23,24.

Beyin peptit ekstraksiyonu, kromatografik ayırma, iyon hareketliliği ile geliştirilmiş MS edinimi ve hibrit DDA / DIA tabanlı nicelemeyi kapsayan bu bütünleştirici yaklaşım, nöropeptitlerin karmaşıklığı göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Veri kaybını en aza indirirken peptit kapsamını en üst düzeye çıkarır ve daha basit bir DDA güdümlü peptidomiklerin temel sınırlamalarını ele alır. Bu nedenle, memeli beynindeki nöropeptit manzarasını keşfetmek için çok çeşitli deneysel sorulara ve doku örneklerine kolayca uyarlanabilen esnek ve güçlü bir platform sunuyoruz.

Protocol

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (23228) tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolüne uygun olarak, hayvanlara etik muamele ve bakım için hem ulusal hem de ARRIVE standartlarına sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan diseksiyonu ve beyin izolasyonu

1. Nöropeptit bütünlüğünü korumak, bozunma artefaktlarını en aza indirmek ve aşağı akış peptidomik analiz için veri kalitesini artırmak için hemen ardından soğuk salin perfüzyonu ve ardından doku dondurma işlemi gerçekleştirin.
2. Kurumsal hayvan bakımı yönergelerini izleyerek CO₂ yöntemini kullanarak sıçanı ötenazi yapın. Kalp atışı yokluğu ve refleks eksikliği ile ölümü onaylayın.
3. Fareyi sırtüstü yerleştirin; Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için bir kesi yapın.
4. Kalbin sol ventrikülünde küçük bir kesi yapın.
5. Kan ve perfüzyon solüsyonunun dışarı çıkmasına izin vermek için sağ atriyumda küçük bir kesi yapın.
6. 50 mL buz gibi soğuk fizyolojik çözelti (ör.,% 0.9 salin veya mGBSS) ile doldurulmuş 60 mL'lik bir şırıngaya bağlı, boyutuna göre kesilmiş bir plastik pipet ucunu sol ventriküle yerleştirin.
7. Hayvan vücudunu solüsyonla perfüze edin. Keskin bir makas veya giyotin kullanarak farenin kafasını kesin.
8. Beynin üzerindeki deriyi ve kafatasını rongeurs veya ince makasla çıkarın.
9. Beyni kraniyal boşluktan dikkatlice kaldırın ve gerektiğinde kraniyal sinirleri kesin.
10. Beyni hemen kuru buz üzerinde dondurun veya kuru buz üzerinde soğutulmuş izopentan içinde dondurun.
11. Etiketli kriyoviyallere veya folyoya aktarın, ardından -80 °C'de saklayın.

2. Sıçan beyin dokusundan peptit ekstraksiyonu

1. Tüm beyin örnekleri için, donmuş her dokuyu analitik bir terazi kullanarak hızlı bir şekilde tartın. 10:1 (h/a) çözücü-doku oranı kullanarak %10 buzlu asetik asit ve metanol içinde %1 su içeren LC-MS dereceli çözelti kullanarak dokuyu homojenize edin.
2. Homojenize edilmiş numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
3. Numuneleri 16.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Peletleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice toplayın.
4. Peletleri 10:1 (h/a) çözücü-doku oranı kullanarak LC-MS dereceli suda yeniden süspanse edin ve inkübasyonu buz üzerinde 20 dakika tekrarlayın.
5. Aynı koşullar altında (16.000 × g, 20 dakika, 4 °C) tekrar santrifüjleyin ve ikinci süpernatanı toplayın.
6. Her iki süpernatanı birleştirin ve toplam hacmin 1 / 10'unu sonraki işlemler için yeni bir tüpe aktarın. Bu alikotu tamamen kuruyana kadar bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun. Kalan ekstraktı ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

3. C18 spin kolonları kullanılarak katı faz ekstraksiyonu (SPE)

NOT: Tüm çözücüler LC-MS sınıfı olmalıdır. Aksi belirtilmedikçe, santrifüjleme adımları, bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak oda sıcaklığında 1.500 × g'da gerçekleştirilir.

1. Reaktif hazırlama
   1. Aktivasyon çözeltisi hazırlayın (A): Suda %50 asetonitril/%50 %0.1 formik asit.
   2. Dengeleme ve yıkama çözeltisi (B) hazırlayın: Suda% 0.1 formik asit.
   3. Elüsyon çözeltisi (C) hazırlayın: Suda %50 asetonitril/%50 %0.1 formik asit.
2. Numune hazırlama
   1. Kurutulmuş peptit ekstraktını 200 μL çözelti (B) içinde sulandırın.
   2. Numuneyi 16.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   3. SPE için süpernatanı dikkatlice toplayın.
3. Kolon koşullandırma ve dengeleme
   1. C18 döndürme kolonuna 150 μL çözelti (A) ekleyin.
   2. 1.500 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
   3. Etkinleştirmenin tamamlanmasını sağlamak için 3.3.1 ve 3.3.2 adımlarını iki kez tekrarlayın.
   4. 150 μL çözelti (B) ekleyin.
   5. 1 dakika santrifüjleyin.
   6. 3.3.4 ve 3.3.5 adımlarını iki kez tekrarlayın.
4. Numune yükleme ve yıkama
   1. Hazırlanan numune çözeltisinden 200 μL'yi kolona yükleyin.
   2. 1 dakika santrifüjleyin.
   3. Peptit tutulmasını en üst düzeye çıkarmak için akışı kolona üç kez geri yükleyin.
   4. 150 μL çözelti (B) ekleyin.
   5. 1 dakika santrifüjleyin.
   6. Tutulmayan kirleticileri çıkarmak için 3.4.4 ve 3.4.5 adımlarını üç kez tekrarlayın.
5. Peptit elüsyonu
   1. Kolona 150 μL elüsyon çözeltisi (C) ekleyin.
   2. 1 dakika santrifüjleyin.
   3. 3.5.1-3.5.2 elüsyon adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
   4. Her iki elüatı birleştirin ve buz üzerinde saklayın veya vakum altında kurutmaya devam edin.

4. LC-MS/MS Analizi

1. Çözelti hazırlayın (A): Suda% 0.1 formik asit, çözelti; (B): asetonitril içinde% 0.1 formik asit, çözelti; (C): 25 fmol / μL tutma süresi standardı (iRT) suda% 0.1 formik asit.
2. LC-MS enjeksiyonundan önce numuneleri 20 μL çözelti (C) içinde yeniden süspanse edin.
   NOT: İki biyolojik numune analiz edildi ve her biri hem DDA hem de DIA çalışmaları için beş kez enjekte edildi, bu da numune başına yöntem başına beş teknik kopya ile sonuçlandı.
3. Peptit ayrımını, çözelti (A)'dan oluşan mobil faz A ve çözeltiden (B) oluşan mobil faz B ile yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) sistemi kullanarak gerçekleştirin.
4. Yirmi beş C18 analitik kolonuna (150 μm × 250 mm, 1,9 μm partiküller, 120 şgözenek boyutu) 1 μL numune yükleyin ve çalışma boyunca 40 °C'de tutun.
5. Aşağıdaki gradyan profilini kullanarak LC ayrımını 600 nL/dk'lık bir akış hızında gerçekleştirin: 0-5 dk: %2-10 B; 5-85 dk: %10-45 B; 85-87 dk: %45-50 B; bunu yüksek organik yıkama ve yeniden dengeleme izler.
   NOT: LC, bir iyon kaynağı aracılığıyla doğrudan bir timsTOF MS'ye bağlandı.
6. DDA analizi için, timsTOF MS üzerinde varsayılan uygulama yöntemi DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime'ı kullanın.
   1. Kısaca, kütle spektrometresini dinamik dışlama etkinken PASEF modunda çalıştırın. Her döngüyü, 1,1 s'lik bir görev döngüsü boyunca 10 PASEF MS/MS taramasından oluşacak şekilde ayarlayın.
   2. 100,0 ms'lik bir rampa süresi kullanarak kütle aralığını m/z 100-1700 ve iyon hareketlilik aralığını 0,60 ila 1,60 V·s/^cm2 olarak ayarlayın. İyon hareketliliğinin bir fonksiyonu olarak çarpışma enerjisini 20,0'dan 59,0 eV'ye yükseltin.
7. İyon hareketlilik gaz fazı fraksiyonasyonu (IM-GPF)
   1. 0,6-1,6 V·s/^cm2'lik iyon hareketlilik aralığını üst üste binen üç pencereye bölün: 0,6-1,0, 0,9-1,3 ve 1,2-1,6 V·s/^cm2.
   2. Bunu yapmak için, timsControl veya timsControl düzenleyicisinin TIMS ayar sekmesindeki mobilite başlangıç ve bitiş değerlerini ilgili pencere değerlerine değiştirin.
   3. Her pencere için veri alın. Tüm iyon hareketliliği toplama pencereleri için, 100 ms'lik sabit bir birikim ve rampa süresi kullanın.
   4. Adım 4.6'da ayrıntılı olarak açıklanan aynı parametreleri kullanarak DDA-PASEF modunda veri alın.
8. DIA analizi için, 400-1200 m/z kütle aralığında 25 m/z'lik bir izolasyon penceresi genişliği kullanın. DDA yönteminde kullanılan aynı iyon hareketliliği deneysel (IMEX) ayarlarını kullanın.
   1. Ek DIA ayarları, bir MS1 rampası ve ardından döngü başına 16 MS/MS rampası içerir ve toplam 1,8 s'lik bir döngü süresi sağlar.
   2. DIA yöntemi geliştirme için şablon olarak varsayılan proteomik DIA-PASEF yöntemini kullanın. DIA metodunu oluşturduktan sonra, Hystar'ın metod sekmesine yükleyin. DIA modunun etkinleştirilmesi gerekmez.
      NOT: DIA yöntemi, başarıyla yüklendikten sonra otomatik olarak kaydedilecektir.

5. Veri işleme

NOT: Veri toplamayı takiben, peptit tanımlaması PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant veya benzer platformlar gibi biyoinformatik araçlar kullanılarak yapılmalıdır. Bu çalışmada, .d formatında ham verilerle çalışabilen Peaks Online kullanılmıştır.

1. Veritabanı araması
   1. Peptit aramaları için, küratörlüğünde bir sıçan sinyal peptit veritabanı, bir sıçan proteomu veya insan proteomu veya numune kaynağına dayalı olarak küratörlüğünde bir sinyal peptit veritabanı gibi uygun bir referans veritabanı kullanın.
      NOT: Bu veri tabanları NCBI veya UniProt (https://www.uniprot.org/) gibi güvenilir kaynaklardan elde edilebilir. Not: Yalnızca veritabanındaki protein veya peptitler tanımlanacaktır. Sıçan sinyal verileri, sıçan proteomunun UniProt'taki "Sinyal peptidi" ek açıklaması ile filtrelenmesiyle küratörlüğünü yaptı. Uniprot terimleriyle, "Sinyal peptidi" ile filtreleme, proteomun salgılanması, membran lokalizasyonu veya bölmeli kaçakçılıkta yer alan proteinlere daraltılması anlamına gelir. Bu özel veritabanı 5630 protein içerir. Protein veri tabanının boyutunu 50.000 ila 5.000 arasında sınırlamak çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, rastgele peptit-spektrum eşleşmelerinin olasılığını azaltarak tanımlama güvenilirliğini artırır, böylece peptit atamalarının doğruluğunu artırır. İkincisi, daha küçük bir veritabanı, daha hızlı işlem sürelerine ve hesaplama kaynaklarına olan talebin azalmasına olanak tanıyarak hesaplama verimliliğini artırır. Üçüncüsü, daha özlü bir veri tabanı, yanlış keşif oranının (FDR) daha iyi kontrol edilmesine yol açarak daha güvenilir ve istatistiksel olarak sağlam protein tanımlamaları ile sonuçlanabilir. Bununla birlikte, yapay güven puanlarının şişirilmesini ve yanlış FDR tahminini önlemek için veritabanının nispeten büyük olması gerekir.
   2. Program GUI'sinde veritabanı aramasını aşağıdaki önerilen parametrelerle yapılandırın: Öncü kütle hata toleransı: 10-25 ppm; parça kütle hata toleransı: 0.01-0.05 Da; enzim özgüllüğü: yok (spesifik olmayan sindirim); Peptit uzunluk aralığı: 4-45 amino asit.
   3. Aramaya dahil edilecek PTM kümesini tanımlayın.
   4. Veritabanı aramasını tamamladıktan sonra, standart tam mobilite aralığı (0.6-1.6 V·s/^cm2) dahil olmak üzere her bir iyon mobilite penceresine karşılık gelen pepxml ve mzXML (veya MGF) dosyalarını dışa aktarın.
2. Skyline kütüphane inşaatı
   1. Skyline'ı açın ve yeni bir belge oluşturun, Proteomics arayüzünün seçili olduğundan emin olun ve aksi belirtilmedikçe varsayılan ayarları kullanın.
   2. Dosya > İçe Aktarma > peptid aramasına gidin.
   3. Peptit Arama Sihirbazı'nı İçe Aktar'da Oluştur'u seçin ve ilgili pepxml dosyalarını ekleyin (karşılık gelen mzXML veya MGF dosyalarının aynı dizinde olduğundan emin olun).
   4. iRT standart peptitlerini Otomatik olarak ayarlayın, iş akışı olarak DIA'yı seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
   5. Kütüphane yapımından sonra, kopyalar arasında hizalama için iRT standartları olarak yaklaşık 10-15 peptit seçin. iRT'yi yeniden kalibre etmeniz istenirse, devam etmek için Tamam'a tıklayın.
   6. Kromatogramları Ayıkla sayfasında, tüm DIA raw dosyalarını seçmek ve içe aktarmak için Gözat'a tıklayın, ardından devam'a tıklayın.
   7. Geçiş Ayarları penceresinde, öncü ücret aralığını 1-5 olarak, ürün ücret aralığını 1-3 olarak, İyon türlerini ,p,y,b olarak ayarlayın ve ürün iyon seçimini İyon 2'den son iyona tanımlayın. Önerilen diğer ayarlar: iyon eşleşme toleransı: 0,05 Da, Seçilecek tepe değerleri: 5.
   8. Peptit Ayarları penceresinde, 4.1.3'te açıklanan Peaks arama ayarıyla eşleşen değişiklikleri ayarlayın.
   9. Yalıtım Şeması sayfasında, yalıtım ve düzen için bir ad girin ve Önceden Belirlenmiş Yalıtım Pencereleri'ni seçin. Denemenin izolasyon penceresi yapılandırmasını otomatik olarak içe aktarmak için içe aktar'a tıklayın ve DIA dosyalarından birini yükleyin.
   10. Aşağıdaki parametrelerle Tam tarama alma ayarlarını ayarlayın. Edinme yöntemi: DIA; Ürün kütle analizörü: Centroided; İzolasyon şeması: Yukarıda tanımlananı kullanın; Kütle doğruluğu: 10-20 ppm; Hareketlilik çözme gücü: 30-50; Yalnızca tahmini RT'den sonraki 5 dakika içindeki taramaları kullan seçeneğini etkinleştirin; İsteğe bağlı olarak, MS1 kromatogramlarının içe aktarılması gerekiyorsa MS1 Filtreleme'yi değiştirin. Optimum MS1 kromatogram ekstraksiyonu için uygun bir kütle analizörü ve çözünürlüğü seçin.
   11. FASTA'yı içe aktarın ve tuzaklar oluşturun. Yem oluşturma yöntemini ayarlayın: Karıştırma Sırası.
   12. Enzim seçin: endojen peptit analizinde sindirim spesifik değildir. Açılır enzim menüsünden ekle'yi seçerek enzimi düzenleyin. Enzimin adını, Yazın her ikisine de ayarlayın, c-terminalini KR'ye bölün ve N-terminalini KR'ye bölün , yarı bölünmeye izin verin ve Tamam'a tıklayın. Kaçırılan bölünmeleri 3 olarak ayarlayın.
   13. Hedef FASTA dosyasını içe aktarın ve ardından Son'a tıklayın. İstenirse İlişkili Proteinler Sayfasını onaylayın.
   14. Spektral kitaplığın başarıyla oluşturulduğundan ve DIA verilerinin içe aktarıldığından emin olun. Tanımlanan peptitlerin listesini manuel olarak inceleyin ve aşağı akış kantitatif ve kalitatif analize devam edin.
3. Kalitatif ve kantitatif ölçümler
   NOT: Kalitatif ve kantitatif analizler Skyline'da yapılmaktadır. Skyline'daki DIA verilerinin analiziyle ilgili ayrıntılar için https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath ziyaret edin.
   1. DDA verileri yüklenmişse, menüden Ayarlar > Geçiş Ayarı'nı seçin, Alım Yöntemi'nde DDA'yı seçin; Ayarlar > Peptit Ayarı'nda, miktar tayini için MS 1 seviyesini seçin.
   2. DIA verileri yüklenirse, Ayarlar > Geçiş Ayarı, Edinme Yönteminde DIA'yı seçin; Ayarlar > Peptit Ayarı'nda, miktar tayini için MS 2 seviyesini seçin.
   3. View > Document Grid (Belge Kılavuzunu Görüntüle) bölümünde Peptide Quantification'ı (Peptit Niceleme) seçin, ardından Export the walletsheet (Elektronik tabloyu dışa aktar) seçeneğini belirleyin. DDA sonuçlarından ve DIA sonuçlarından elektronik tabloları birleştirin.
      NOT: Elektronik tablo, tüm örneklerde kitaplıktaki tüm peptitler için tepe alanlarını özetler. Bu deneyde, peptit tepe alanları, Pierce tutma süresi karışımının bir parçası olan tutma süresi standardı peptit GISNEGQNASIK'e normalize edildi. Normalizasyon, her bir peptidin tepe alanının standardınkine oranı hesaplanarak gerçekleştirildi.

Results

Temsili bir deney şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Hem standart iyon hareketlilik aralığı hem de IM-GPF kullanılarak elde edilen DDA-PASEF verilerinin (Şekil 2) analizi, IM-GPF yaklaşımı için önemli ölçüde daha yüksek bir peptit kapsamı ortaya çıkarmıştır (Şekil 2B). Özellikle, standart DDA-PASEF yöntemi kullanılarak tanımlanan çoğu peptit, IM-GPF veri setinde bulunanlarla örtüşüyordu. Peptit tanımlama kapsamını en üst düzeye çıkarmak için, her iki yaklaşımdan gelen tanımlamaları entegre ederek kapsamlı bir spektral kütüphane oluşturuldu.

DDA- ve DIA-PASEF (Şekil 3) yoluyla elde edilen replike veri kümelerinin küratörlü bir sıçan sinyal peptit veritabanı kullanılarak daha fazla veritabanı analizi, her iki yöntemde de ortak olan 217 proteini ortaya çıkardı. Ek olarak, 115 protein DIA-PASEF tarafından benzersiz bir şekilde tanımlanırken, 69'u DDA-PASEF'e özeldi. DDA ve IM-GPF verilerinden türetilen spektral kütüphaneleri kullanan keşif analizleri, DIA-PASEF'IN NPAFLFQPQRF (nöropeptit SF) ve YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (proenkefalinden türetilen) gibi nöropeptitlerin güvenli bir şekilde tespit edilmesini sağladığını gösterdi. Bu nöropeptitler, zayıf tepe ataması nedeniyle ilgili DDA-PASEF veri kümelerinde güvenilir bir şekilde tespit edilmemiştir (Şekil 3B, C).

Kantitatif bir perspektiften bakıldığında, Şekil 4A'daki dağılım grafiği, her iki yaklaşımın da aynı peptitleri ölçtüğü ancak farklı iyon tiplerini yakaladığı göz önüne alındığında, beklendiği gibi, DDA öncü yoğunluğu ile DIA fragmanı iyon yoğunluğu arasında orta derecede pozitif bir korelasyon ortaya koymaktadır. Şekil 4B'de gösterilen seçilmiş peptitler için kutu grafikleri, her iki yaklaşımla elde edilen kantitatif ölçümlerin tekrarlanabilirliğini daha da göstermektedir. Kutu grafikleri, DIA ve DDA tarafından ölçülen her bir peptit için göreceli tepe alanlarını gösterir ve hata çubukları, teknik kopyalar arasında ölçüm değişkenliğini temsil eder. Seçilen peptitler, her ikisi de ağrı ve analjeziyi modüle etmede merkezi rol oynayan proenkefalin (PENK) ve prodynorphin (PDYN) dahil olmak üzere opioid prohormonlardan türetilir.

Şekil 1: Sıçan beyin dokusundan endojen peptitlerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için peptidomik iş akışına genel bakış. İş akışı, doku diseksiyonu, peptit ekstraksiyonu ve saflaştırması, gaz fazı fraksiyonasyonu (IM-GPF) kullanarak LC-iyon hareketliliği-MS (LC-IM-MS) veri toplama ve spektral kitaplıklar oluşturmak ve kantitatif analiz gerçekleştirmek için veri işlemeyi içerir. Figürün bazı bölümleri BioRender'da oluşturulmuştur. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Veritabanı Peptit ve Protein Tanımlaması. (A) Farklı iyon hareketlilik pencerelerinde tanımlanan toplam öncül sayısını, peptit-spektrum eşleşmelerini (PSM'ler) ve benzersiz peptitleri karşılaştıran çubuk grafik. (B) Tüm hareketlilik pencerelerinde yaygın olarak tanımlanan peptitlerin oranını ve tek tek pencerelerde benzersiz olarak tespit edilenleri gösteren pasta grafiği. (C,D) Tam mobilite aralığı (0,6-1,6 V·s/^cm2) (C) ve kısıtlı mobilite penceresi (0,6-1,0 V·s/^cm2) (D) için m/z ve iyon hareketlilik boyutları boyunca iyon sinyallerinin dağılımını gösteren ısı haritaları. (E) DDA ve DIA yöntemleri kullanılarak elde edilen veri kümelerinde tanımlanan protein sayısını gösteren, paylaşılan ve benzersiz protein tanımlamalarını vurgulayan üzgün grafik. (F) DIA ile edinilen replikalarda (üst panel) ve DDA ile edinilen replikalarda (alt panel) tanımlanan proenkefalin öncüsünden türetilen peptitleri temsil eden ısı haritası. Dört DDA replikasının ikisinde leu-enkefalin tespit edilmedi, bu da DDA tabanlı edinimde potansiyel eksik değerleri gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Spektral kütüphaneler kullanılarak DDA-PASEF ve DIA-PASEF verilerinin karşılaştırmalı ve keşifsel analizi. (A) Nöropeptid SF'nin DIA ve DDA-PASEF replikasyonları arasında alıkonma süresi hizalaması. (B) PENK'in (212-229) EIC'si, DIA (üstte) ve DDA (altta) veri kümelerinden iyonları parçalar. (C) DIA'dan nöropeptit SF'nin fragman iyon kromatogramları, yüksek ko-elüsyon ve spektral kalite gösteren replikasyonlardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: DIA-PASEF (MS2 seviyesi) ve DDA-PASEF (MS1 seviyesi) arasındaki kantitatif ölçümlerin karşılaştırılması. (A) Bu dağılım grafiği, DIA ve DDA modları kullanılarak elde edilen peptit sinyal yoğunluklarını karşılaştırır. Spesifik olarak, x ekseni, DDA'dan log₁₀ dönüştürülmüş öncü tepe alanını temsil ederken, y ekseni her peptit için DIA'dan log₁₀ dönüştürülmüş fragman tepe alanını gösterir. (B) Kutu grafikleri, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 ve PDYN 235-248 olmak üzere dört temsili peptitin göreceli tepe alanlarını temsil eder. Hata çubukları, teknik kopyalar arasındaki değişkenliği temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Peptidomiklerde, özellikle endojen peptitleri analiz ederken, doğal peptit profilinin korunması, veri bütünlüğü ve biyolojik yorumlama için çok önemlidir. Soğuk tuzlu su perfüzyonu sadece kanı uzaklaştırmakla kalmaz, aynı zamanda beyni de soğutur, bu da endojen proteazların aktivitesine bağlı olarak hızla meydana gelen ölüm sonrası proteolitik bozulmayı önemli ölçüde azaltır. Beyin sıcaklığını düşürerek, enzimatik aktivite yavaşlar ve dolaşımdaki proteazlar vaskülatürden temizlenirken, aynı zamanda ölüm sonrası metabolik değişiklikleri de azaltır^25,26. Buz gibi tuzlu su ile perfüzasyon ayrıca beynin damar sistemindeki kanı da temizler. Kan, nöropeptit tespitine müdahale edebilecek yüksek miktarda proteinler (albümin ve globulinler gibi) ve dolaşımdaki proteazlar içerdiğinden bu adım özellikle önemlidir. Bol miktarda kan proteinlerinin ölüm sonrası bozunması, nöropeptit ekstraktlarının karmaşıklığını artırabilir ve düşük bolluk sinyallerini maskeleyebilir, sonuçta hem tanımlamayı hem de nicelemeyi tehlikeye atabilir 25,26,27. Beyin dokusunun kuru buz üzerinde veya soğutulmuş izopentan içinde ani dondurma yoluyla anında dondurulması, enzimatik süreçleri neredeyse anında durdurur. Bu koruma, düşük bollukta ve tam uzunlukta olgun nöropeptitleri tespit etmek ve güvenilir miktar tayini sağlamak için özellikle önemlidir. Bu adımlar olmadan, peptit bozunması, hem tanımlamayı hem de nicelemeyi tehlikeye atan artan değişkenliğe ve artefaktlara yol açabilir. Bu nedenle, kanın alınması, soğuk perfüzyon ve hızlı beyin soğutması, ölçümlerden önce peptidomik verilerin kalitesini, hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini doğrudan etkileyen temel tekniklerdir.

Sıçan beyninden ekstrakte edilen peptitlerin analizi, iki farklı iyon hareketliliği tüyünün varlığını ortaya çıkardı (Şekil 2C, D). Bu fenomen, farklı moleküler sınıflara veya peptitlerin değişen yük durumlarına bağlanabilir. Tüyler farklı moleküler sınıflara karşılık geliyorsa, peptit olmayan türler, seçim ve parçalanma için peptitlerle rekabet edebilir. Ayrıca, ayrılma şarj durumlarındaki farklılıklardan kaynaklanıyorsa, yüksek yüklü peptitler içeren tüyün, daha güvenli peptit tanımlamasını kolaylaştırarak daha yüksek kaliteli MS / MS spektrumları vermesi beklenir.

Bunu araştırmak için, üç ayrı hareketlilik penceresinde veri elde ederek bir iyon hareketliliği fraksiyonlama stratejisi uyguladık: 0.6-1.0, 0.9-1.3 ve 1.2-1.6 V·s/cm². Bu pencereler topluca, peptitler için standart DDA-PASEF deneylerinde tipik olarak analiz edilen tam iyon hareketlilik aralığını kapsar. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tespit edilen toplam öncü sayısı tam tarama aralığında (0.6-1.6 V·s/^cm2) en yüksek olmasına rağmen, 0.6-1.0 V·s/^cm2 penceresinde önemli ölçüde daha fazla sayıda peptit-spektrum eşleşmesi (PSM) gözlenmiştir. Bu bulgu, iki tüyün varlığının gerçekten de diğer moleküllerden gelen girişimden kaynaklanabileceğini düşündürmektedir.

İyon hareketliliğine dayalı öncü fraksiyonlama, geleneksel tam tarama yöntemine kıyasla peptit kapsamında %30'luk bir artışa neden oldu. Tam tarama veri setinde tanımlanan peptitlerin yaklaşık% 82'si, fraksiyonlama kullanılarak tanımlanan peptitlerle örtüştü (Şekil 2B), fraksiyonlama stratejisinin tutarlılığını ve sağlamlığını vurguladı. Bu gözlemlere dayanarak, DIA-PASEF kullanarak nöroendokrin peptitlerin kantitatif analizi için spektral kütüphaneler oluşturmak için iyon hareketliliği fraksiyonlamasını ve tam tarama verilerini kullandık.

DDA ve DIA yoluyla elde edilen replike veri kümelerinin veri tabanı analizi, DIA tarafından benzersiz bir şekilde tanımlanan 115 protein dahil olmak üzere DIA verilerinde daha fazla sayıda peptit ve protein tanımlaması ortaya çıkardı (Şekil 2E). Bunlar, Pro-FMRFamid ile ilişkili peptitler FF ve VF gibi nöropeptitleri içeriyordu. Buna karşılık, 69 protein yalnızca DDA tarafından tanımlandı ve bunların çoğu hücre yapışması ve nöronal gelişim ile ilişkilendirildi. Bu bulgular, DDA ve DIA metodolojilerinin daha geniş peptit kapsamı elde etmek için tamamlayıcı bir şekilde uygulanabileceğini düşündürmektedir.

Daha ileri analizler, DIA ediniminin, DDA kullanılarak yapılan endojen peptit analizinde sıklıkla karşılaşılan eksik değer sorununun bir kısmını etkili bir şekilde ele aldığını göstermiştir. Örneğin, Leu-enkefalin, dört DDA replikasından sadece ikisinde tespit edildi (Şekil 2F, alt panel), oysa dört DIA replikasının hepsinde tutarlı bir şekilde tanımlandı (Şekil 3F, üst panel).

Kantitatif proteomik için yaygın olarak kullanılan bir platform olan Skyline, hem DDA hem de DIA-PASEF veri kümelerini analiz etmek için kullanıldı²⁸. Yazılım, spektral kitaplık eşleştirme, parça iyon ko-elüsyonu ve tutma süresi hizalaması yoluyla peptit tanımlamasını kolaylaştırır. DIA-PASEF'in eksik tanımlamayı azaltma yeteneğini değerlendirmek için, yalnızca DIA veri setinde tespit edilen peptitlerin kalitatif bir değerlendirmesini yaptık.

Şekil 3D'de gösterildiği gibi, nöropeptid SF, aynı tutma süresi penceresi içinde tüm DIA replikalarında tutarlı bir şekilde tespit edildi. DDA replikalarında algılama, 25 dakika ile 45 dakika arasında değişen tutma süreleri ile önemli ölçüde değişkenlik göstermiştir (Şekil 3A). Düşük güven puanlarına sahip tepe yanlış atamaları da dahil olmak üzere gözlemlenen tutarsızlıklar, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, muhtemelen sınırlı veya düşük kaliteli parça iyonu kapsamından kaynaklanıyordu. Buna karşılık, Şekil 3C, nöropeptit SF'ye karşılık gelen fragman iyonlarının tüm DIA replikaları boyunca iyi bir şekilde hizalandığını ve güvenli otomatik tanımlamayı desteklediğini göstermektedir.

Proenkefalinden türetilen PENK (212-229) peptidi için MS / MS spektral kalitesinin karşılaştırılması, DIA-PASEF'in avantajlarını daha da göstermiştir. DIA'dan elde edilen spektrumlar, DDA'ya göre daha yüksek yoğunluk ve gelişmiş fragman iyon kalitesi sergiledi (Şekil 3), bu da düşük bolluklu endojen peptitleri tespit etmek için özellikle faydalıdır.

Kantitatif analiz, DIA-PASEF'in DDA ile karşılaştırılabilir performansla biyolojik replikasyonlar arasında tutarlı ve tekrarlanabilir ölçümler sağladığını doğruladı (Şekil 4). Ayrıca, DIA, MS2 seviyesinde miktar tayinini mümkün kılarak parça iyon seviyesi özgüllüğü ve MS1 bazlı DDA'ya göre peptit tanımlamasında artan güven sunar. Bu bulgular, DIA-PASEF'in karmaşık biyolojik matrislerde, özellikle veri bütünlüğü ve tekrarlanabilirliğin kritik olduğu durumlarda, hedeflenen nöropeptit miktar tayini için güvenilir ve verimli bir yaklaşım olarak kullanılmasını desteklemektedir.

Bu protokol, nöropeptit analizi ve miktar tayini için kapsamlı bir stratejinin ana hatlarını çizmektedir. IM-GPF yaklaşımı, yüksek kaliteli spektral kütüphanelerin oluşturulmasını kolaylaştırır. DIA-PASEF, DDA-PASEF'e kıyasla daha iyi tekrarlanabilirlik ve daha fazla peptit kapsamı sunarken, aynı zamanda MS2 tabanlı miktar tayinini de geliştirir. Her iki edinim stratejisinin birleştirilmesi, genel peptit kapsamını arttırır, çünkü her bir yöntem farklı peptitlerin tanımlanmasına benzersiz bir şekilde katkıda bulunur (Şekil 2E). Bu protokolün sınırlaması, hem spektral kütüphane üretimini hem de DDA ve DIA-PASEF yöntemleri aracılığıyla veri toplamayı desteklemek için bol miktarda numune materyali gerekliliğidir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
% 0.1 Formik Asit Su	Fisher Scientific	LS118-500	LC / MS sınıfı
Asetik Asit	Fisher Bilimsel	A11350	LC / MS sınıfı
Asetonitril	Fisher Scientific	AA47138K7	LC / MS sınıfı
Formik Asit	Fisher Scientific	PI28905	LC / MS sınıfı
Metanol	Fisher Scientific	AA47192K7	LC / MS sınıfı
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18 döndürme sütunları	Fisher Scientific
Pierce Peptit Tutma Süresi Kalibrasyon Karışımı	Thermo Fisher	A11351	LC/MS sınıfı
SpeedVac vakum yoğunlaştırıcı	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	Bu çalışmada kullanılan özel model artık üreticiden temin edilememektedir. Referans
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	LC / MS notu