Burada, cilt segmentasyonu için ücretsiz bir ImageJ tabanlı makro olan SCAnED kullanarak cilt bölümlerindeki bağışıklık ve bağışıklık olmayan hücreleri tanımlamak ve ölçmek için yarı otomatik bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
SCAnED - Epidermal ve Dermal Cilt Bölmelerinde Yarı Otomatik Hücre ve Çekirdek Tespiti için Açık Kaynaklı Bir Cilt Segmentasyon Makrosu
Bu makalede
Özet
Özet
İmmün ve immün olmayan hücrelerin dokular içindeki mekansal dağılımı ve hücreye özgü belirteçlerin ekspresyonu, yerinde hücre fonksiyonu hakkında temel bilgiler sağlar. İnsan derisi, çeşitli fenotiplere sahip farklı hücrelerden oluşan tanımlanmış bölmelere sahip oldukça karmaşık bir organdır. Çoklu floresan etiketleme kullanılarak, farklı cilt hücresi popülasyonları belirlenebilir ve daha fazla karakterize edilebilir. Bununla birlikte, şu anda, hücrelerin özellikle epidermis veya dermis içinde tek hücreli bir çözünürlükte in silico segmentasyonuna izin veren cilt örneklerinin görüntü analizi için ticari olmayan araçların mevcudiyeti sınırlıdır. Burada, cilt bölümlerinin immünofloresan boyama, konfokal mikroskopi ve ücretsiz olarak kullanılabilen SCAnED (Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis) kullanarak görüntü analizi için adım adım bir protokol sunuyoruz. SCAnED makrosu, insan derisinin hem epidermal hem de dermal bölümlerindeki hücrelerin ve çekirdeklerin hassas bir şekilde tanımlanmasını ve sınıflandırılmasını sağlar. Sitoplazma ve çekirdek gibi farklı hücrelerde ve hücresel bölmelerde maker ekspresyonunun ortalama yoğunluk seviyelerinin nasıl belirleneceğine ve bu belirteçlerin değişen miktarlarını ifade eden hücrelerin, Google Colab'da yürütülen kullanıma hazır bir Jupyter not defteri olarak sağlanan eşlik eden bir Python işlem hattıyla nasıl ölçüleceğine ilişkin yönergeler sunuyoruz. Bu protokol, deneyimsiz kullanıcıların cilt dokusu içindeki hücreye özgü ekspresyon profillerini belirlemesine ve epidermal ve dermal bölmeler içindeki hücrelerin uzamsal dağılımı hakkında bilgi vermesine olanak tanıyarak insan derisinin karmaşık doku yapısı ve hücre bileşiminin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır.
Giriş
Deri dokularını hücresel düzeyde anlamak ve hücre fenotiplerini, morfolojisini ve bunların hem epidermal hem de dermal kompartmanlar içindeki lokalizasyonunu ayırt etmek dermatolojik araştırmalarda ve histopatolojide çok önemlidir 1,2. Sağlıklı koşullar altında keratinositleri, melanositleri ve Langerhans hücrelerini kapsayan epidermis içindeki hücresel bileşim, enflamatuar cilt hastalıklarında ve kanserde büyük ölçüde dengesiz hale gelir. Ayrıca, epidermisin altında yer alan ve fibroblastları ve bağışıklık hücrelerinin çoğunu barındıran dermis içindeki hücrelerin fenotipi ve lokalizasyonu hastalıkta önemli ölçüde değişebilir. Bu nedenle, hücre ve çekirdek segmentasyonu, hücre sayısı, protein ekspresyonu, morfoloji ve mekansal organizasyon gibi hücresel özellikleri ve boyut, şekil ve transkripsiyon faktörü ekspresyonu gibi çekirdek özelliklerini değerlendirmek için zorunludur, böylece cilt homeostazı ve hastalıklarının anlaşılmasına yardımcı olur 3,4,5.
QuPath6, CellProfiler7 ve ilastik8 gibi genel amaçlı görüntü analiz platformlarının mevcudiyetine rağmen, bu araçlar genellikle cilt dokusunun yapısal karmaşıklığına ve heterojen hücre morfolojisine uyum sağlamak için kapsamlı özelleştirme ve komut dosyası oluşturma gerektirir. Epidermal ve dermal bölmelerin otomatik segmentasyonu için özel olarak uyarlanmış çok az araç vardır ve mevcut birçok çözüm ticaridir ve serbestçe erişilebilir değildir. Bu sınırlamalar, uzman olmayanların cilde özel analizler için verimli boru hatları uygulamasını zorlaştırır.
Burada, yarı otomatik görüntü analizi boru hattımızı kullanarak doku boyamadan görüntü analizine kadar tüm hayati adımları kapsayan, cilt dokusu ve bölmelerindeki hücrelerin ve çekirdeklerin analizi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Epidermis/dermis segmentasyonu için E-kaderin ve hücre/çekirdek tespiti için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyama dahil olmak üzere cilt dokusunun immünofloresan boyaması hakkında ayrıntılı bilgilerle başlıyoruz. Doğrulama amacıyla iki ilgi belirteci, Vimentin (VIM) ve CD90 dahil edildi. Optimize edilmiş konsantrasyonlarda antikorlar kullanmanızı (bkz. Tablo 1) ve tekrarlanabilirliği sağlamak için lazer yoğunluğu, maruz kalma süresi ve çözünürlük için tutarlı ayarlarla konfokal mikroskopi kullanarak görüntü yakalamanızı öneririz.
Ayrıca, Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis anlamına gelen özel olarak tasarlanmış ImageJ9 macro SCAnED'i tanıtıyoruz ve hem epidermis hem de dermis içindeki çekirdeklerin ve hücrelerin in silico segmentasyonu ve tespiti için gerekli tüm adımları sağlıyoruz. Kullanıcılar, SCAnED protokolüne devam etmeden önce basit ve hızlı eşikleme veya derin öğrenme aracı StarDist10 ve eğitimli cilt modelimizi kullanarak iki farklı çekirdek algılama yöntemi arasından seçim yapabilir. Genel araçlardan farklı olarak SCAnED, cilt histolojisi için özel olarak geliştirilmiştir ve epidermal ve dermal bölgelerin otomatik olarak bölümlere ayrılmasını ve her iki bölgede çoklu belirteçlerin entegre miktar tayinini sağlayarak bunlardan daha iyi performans gösterir. Bu, özellikle programlama veya derin öğrenme konusunda uzmanlığı olmayan araştırmacılar için kullanışlıdır ve cilt imajı analizi için özel olarak tasarlanmış kullanıma hazır bir araç sunar.
Ayrıca, beş farklı ilgilenilen belirteçin immünofloresan görüntülerinden hücre başına ortalama yoğunluk seviyelerinin nasıl çıkarıldığını gösteriyoruz. Son olarak, Google Colab11'de yazılıp yürütülen ve Jupyter not defteri olarak paylaşılan elde edilen tek hücreli verilerin istatistiksel analizi için bir Python kodu sağlıyoruz. Protokolümüz ve SCAnED makrosu, gelişmiş immünofloresan ve bilgi işlem uzmanlığı olmayan cilt araştırmacılarına, epidermal ve dermal bölmelere odaklanarak insan derisindeki hücreleri ve belirteç ekspresyonunu etiketlemek ve yarı otomatik olarak ölçmek için pratik bir araç sağlamayı amaçlamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. E-kaderin, VIM ve CD90'ın immünofloresan etiketlemesi ve parafine gömülü cilt bölümlerinde DAPI ile nükleer boyama
NOT: Protokol, parafine gömülü bölümler için adımları gösterir. Taze ve donmuş doku örnekleri için, doku kesitlerini sabitleyin ve protokolün 1.3 adımıyla devam edin.
- Bir fan veya fırın kullanarak parafini eritin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Önceki bir çalışmada, bir sitoplazmik protein olan lizil oksidazın (LOX) ve insan derisinin dermisindeki hücrelerde transkripsiyon faktörü hipoksi ile indüklenebilir faktör 1'in (HIF-1) hücrelerini ve ekspresyon seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için SCAnED'yi başarıyla kullandık12 bu aracın cilt araştırmaları için uygulanabilirliğini vurgulamaktadır.
Epidermal ve dermal bölmelerdeki hücreleri ve çekirdekleri tanımlamada cilt segmentasyon makromuzun hassasiyetini daha...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
SCAnED protokolü, insan cilt dokusundaki hem immün hem de immün olmayan hücrelerin kompartmana özgü analizi için yarı otomatik bir yöntemdir. İş akışı, epidermis ve dermis segmentasyonunu, DAPI tabanlı çekirdekleri ve hücre tespitini ve ardından ImageJ tabanlı makromuzu kullanarak çekirdeklerde ve hücrelerde işaretleyici ekspresyonunun nicelleştirilmesini sağlamak için E-kaderin tabanlı bir boyama protokolünü entegre eder. Ayrıca, ayıklanan tek hücreli verileri görselleştirmek için Pytho...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu görüntü analizi boru hattının geliştirilmesi, Tuna Alerjisi Araştırma Kümesi'nin bir parçası olarak Land Niederösterreich ve Fellinger Krebsforschung tarafından finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %0,3 Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| BSA (Sığır serumu albümini) | Sigma Aldrich | ||
| CD90 | Hücre sinyalizasyonu | D3V8A | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Deionize su | |||
| E-cadherin | Abcam | AB1416 | |
| Floresans montaj ortamı | Dako | S3023 | |
| Keçi Fare Karşıtı IgG1 Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 (AF 488 fare karşıtı) | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Keçi Fare Karşıtı IgG2a Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 (AF 647 anti-fare) | Thermo Fisher Scientific | A-21241 | |
| Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbasyona Sahip İkincil Antikor, Alexa Fluor 568 (AF 568 anti-tavşan) | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Keçi serumu & nbsp; | Agilent Technologies & Ouml; sterreich GmbH, Dako | X0907 | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Vimentin | Dako | M7020 | |
| Malzemeler | |||
| Odalı kutu (ıslak kutu) | |||
| Coverslips | Thermo Fisher | ||
| Sıvı itici süren sürgü kalemi boyama (hidrofobik) & nbsp; | Daido Sangyo | Z377821 | 24x50mm |
| Çözümler | |||
| Permeabilizasyon tamponu (PBS'de %0,3 Triton X) | Tablo 2'ye bakınız | ||
| Boyama tamponu (PBS'de %2 BSA) | Tablo 2'ye bakınız | ||
| Yazılım ve Veri Setleri | |||
| Konfokal lazer tarama mikroskobu | Olympus | Ters IX83 tabanlı FV3000 | 10x objektif (NA 0.4), 4 lazer hattı (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, Koherent) ile donatılmıştır. |
| Fiji (ImageJ) | V1.54h | ||
| Google Colab | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc. | Prizma 10 | Daha fazla istatistiksel analiz için |
| HALE | Indica Laboratuvarları | ||
| Python programı | Python 3.11.12 | ||
| QuPath | açık yazılım (Bankhead, P. ve diğerleri, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5) | v0.5.1 | |
| StarDist | TF1.15.0 CPU sürümünü kur |
Kaynaklar
- Lichtenberger, B. M., Kasper, M. Cellular heterogeneity and microenvironmental control of skin cancer. J Intern Med. 289 (5), 614-628 (2021).
- Watt, F. M. Mammalian skin cell biology: at the interface between laboratory and clinic. Science. 346 (6212), 937-940 (2014).
- Bergstresser, P. R., Pariser, R. J., Taylor, J. R. Counting and sizing of epidermal cells in normal human skin. J Invest Dermatol. 70 (5), 280-284 (1978).
- Régnier, M., Patwardhan, A., Scheynius, A., Schmidt, R. Reconstructed human epidermis composed of keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 821-824 (1998).
- Régnier, M., Staquet, M. J., Schmitt, D., Schmidt, R. Integration of Langerhans cells into a pigmented reconstructed human epidermis. J Invest Dermatol. 109 (4), 510-512 (1997).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biol. 16 (7), e2005970(2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A., Schnabel, J., Davatzikos, C., Alberola-Lopez, C., Fichtinger, G. 11071, Springer. Cham. Lecture notes in Computer Science 265-273 (2018).
- Google Colab. , Google. https://colab.research.google.com/ (2025).
- Balsini, P., et al. Stiffness-dependent lysyl oxidase regulation through hypoxia-inducing factor 1 drives extracellular matrix modifications in psoriasis. J Invest Dermatol. 1145 (7), 1653-1669.e10 (2024).
- Mahrle, G., Bolling, R., Osborn, M., Weber, K. Intermediate filaments of the vimentin and prekeratin type in human epidermis. J Invest Dermatol. 81 (1), 46-48 (1983).
- de Waal, R. M., Semeijn, J. T., Cornelissen, M. H., Ramaekers, F. C. Epidermal Langerhans cells contain intermediate-sized filaments of the vimentin type: an immunocytologic study. J Invest Dermatol. 82 (6), 602-604 (1984).
- Bata-Csorgo, Z., Hammerberg, C., Voorhees, J. J., Cooper, K. D. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med. 178 (4), 1271-1281 (1993).
- Nakamura, Y., et al. Expression of CD90 on keratinocyte stem/progenitor cells. British Journal of Dermatology. 154, 1062-1070 (2006).
- Wetzel, A., et al. Increased neutrophil adherence in psoriasis: role of the human endothelial cell receptor Thy-1 (CD90). J Invest Dermatol. 126 (2), 441-452 (2006).
- RRID:SCR_018350. , Indica Labs. https://www.indicalab.com/halo/ (2025).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
