Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

2.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68749

⸱

18 Temmuz 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

Bu makalede

Özet

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Özet

Üç kritik ve birbirine bağlı süreç mayotik faz I'i tanımlar: homolog kromozomlar bir araya gelmelidir, homologları birbirine bağlamak için sinaptonemal kompleks formları adı verilen proteinli bir yapı (sinapsis) ve homologlar rekombinasyona uğrar, çapraz geçişler (CO'lar) oluşturmak için karşılıklı olarak genetik materyali değiştirir. Bu süreçlerdeki hatalar erken yumurtalık yetmezliği, anöploidi ve nihayetinde gebelik kaybı ve kısırlık ile sonuçlanabilir. Mayotik rekombinasyon, oositlerde özellikle hataya eğilimlidir, insan oositlerinin %7'sinden fazlası çaprazlama olmadan en az bir kromozom çifti içerir ve yumurtaların %20-80'ine karşılık spermlerin %2.5-7'si anöploiddir. Bununla birlikte, kromozomal hataların neden bu kadar çarpıcı cinsiyet eşitsizlikleri gösterdiği belirsizliğini korumaktadır. Bu protokol, sırasıyla fetal ve juvenil farelerden oosit profaz I ve metafaz I kromozom yayılımlarının hazırlanması ve analizi için yöntemleri açıklamaktadır. Mayotik faz I boyunca kritik kromozom dinamiklerini izlemek için bu protokol, mayotik rekombinasyon için ortak belirteçlerin immünofloresan boyamasını kullanır (çift iplikçik kırılmaları için RAD51, CO ara ürünleri için MSH4 ve çoğu CO'yu tanımlamak için MLH1 / MLH3) ve sinapsis (kromozom eksenleri için SYCP3, sinapslı bölgeler için SYCP1 ve asinapslı bölgeler için HORMAD1). Ayrıca, bu protokol, metafaz I'de eşleştirilmiş kromozomların (iki değerliler) sayısını ve toplam çaprazlama sayısını (kiazma) değerlendirmek için toplanan oositlerin in vitro olgunlaşmasını kullanır.

Giriş

Mayoz bölünme, haploid gametlerin üretimi için gerekli olan özel bir hücre bölünmesidir. Profaz I sırasında, homolog kromozomlar (her biri kohezin tarafından bir arada tutulan kardeş kromatitlerden oluşur) üç kritik görevi yerine getirmelidir: 1) birbirlerini tanır ve eşleştirir, 2) yanal eksenleri arasında sinaptonemal kompleksi (SC) oluşturarak bir araya getirir ve 3) homolog rekombinasyon yoluyla DNA alışverişi yapar, bu da kardeş olmayan kromatitler arasında çaprazlamalar (CO'lar) ile sonuçlanır 1,2. Kohezin tarafından sürdürülen çaprazlama oluşumundan kaynaklanan fiziksel bağlantı, metafazI 3,4,5 sırasında uygun kromozom bioryantasyonunu ve ayrışmasını sağlar.

Mayotik profaz I, her biri sinapsis6'nın durumu ile tanımlanan beş aşamadan oluşur. Leptonema'da (Yunanca ince iplik anlamına gelir), kromozom eksenleri boyunca eksenel eleman (SYCP3 ile işaretlenir) oluşurken kromozomlar yoğunlaşır. Zygonema (birleştirilmiş iplikler) sırasında, SC'nin enine elemanı (SYCP1) eksenler7 arasında oluştuğunda homologlar sinaps yapmaya başlar. Pakinemada (kalın iplik), kromozomlar tüm uzunlukları boyunca sinapslanır. SC daha sonra diplonema (iki iplik) sırasında sökülür ve homologları yalnızca geçiş bölgelerinde (chiasmata) bağlı bırakır. Kiasmata, DNA çift iplikli kopmaların (DSB'ler) programlanmış indüksiyonu ile başlatılan bir süreç olan homolog rekombinasyonun ürünüdür. Yüzlerce DSB'den yalnızca ~%10'u CO olur. Farelerde, çoğu (% 90 -% 95), MutLγ (MLH1-MLH3) tarafından kolaylaştırılan sınıf I CO yolu yoluyla oluşur, kalan CO'lar MUS81-EME1 tarafından sınıf II CO yolu 8,9,10,11 yoluyla yapılır.

Eşleştirme, sinapsis ve rekombinasyon yüksek düzeyde düzenlenmiş ve birbirine bağlı süreçlerdir. Hatalar tipik olarak kontrol noktası mekanizmalarını tetikleyerek hücre ölümüne yol açar. Dişilerde, erken faz I hatalarından kaynaklanan germ hücresi kaybı, erken yumurtalık yetmezliğine12,13 neden olabilirken, geç hatalar (örneğin, homologların CO oluşturamaması, CO'ların yanlış yerleştirilmesi veya erken kohezin kaybı) kromozom yanlış ayrışmasına ve anöploidiye yol açabilir. İnsanlarda mayotik hatalar, gebelik kaybı ve kısırlığın önde gelen bir nedenidir. Kadın mayozu özellikle hataya eğilimlidir. İnsan yumurtalarının yaklaşık% 20 -% 80'i (spermlerin% 2.5 -% 7'sine karşı) anormal kromozom sayıları taşır ve çoğu ilk mayotik bölünme14,15,16,17'deki hatalardan kaynaklanır. Yaş, maternal anöploidinin en büyük nedeni olarak tanımlanmış olsa da, oositlerin hatalara bu kadar duyarlı olmasının nedeni belirsizliğini korumaktadır.

Oositlerde yüksek hata oranlarının altında yatan faktörlerin anlaşılmasının önemine rağmen, profaz I olayların düzenlenmesi hakkındaki bilgilerimizin çoğu erkek mayoz bölünme çalışmalarından gelmektedir. Yetişkin testis materyalinin küçük bir parçası, mayotik ve mayotik sonrası germ hücrelerinin tüm aşamalarını değerlendirmek için yeterli materyal sağladığından, erkek mayoz bölünme araştırmacılar tarafından uzun zamandır daha kolay erişilebilir olmuştur. Buna karşılık, dişi mayoz bölünme süreksiz bir şekilde gerçekleşir. Farelerde, faz I, koitumdan yaklaşık 14 gün sonra başlayarak fetal yumurtalıkta yarı eşzamanlı olarak ilerler (dpc; Şekil 1A), gonadal cinsiyet tayininden kısa bir süre sonra 18,19,20. Doğum anında, oositler yumurtlama aylarına (farelerde) veya on yıllar (insanlarda) sonrasına kadar diktiyat durmasına girer 21,22,23. Sonuç olarak, spesifik faz I aşamalarına yalnızca sınırlı gelişimsel pencereler sırasında erişilebilir (Şekil 1A), profaz I sonrası olaylar genç ve yetişkinde bir seferde sadece birkaç oositte meydana gelir. Teknik ilerlemeler memeli oosit mayoz bölünme çalışmalarını iyileştirmiş olsa da, bu yöntemler erkek çalışmalarında kullanılan karşılaştırılabilir tekniklere kıyasla zorlu ve zaman alıcı olmaya devam etmektedir.

Kadın mayotik analizi, alt evreleme pakiten oositlerindeki sınırlama ile daha da karmaşıktır - çapraz atama ve olgunlaşmayı incelemek için kritik öneme sahiptir. Erkek çalışmaları, iyi karakterize edilmiş cinsiyet kromozomu eşleşme dinamiklerinden ve erken, orta ve geç pakinema için belirteç görevi gören histon varyantı H1t'nin varlığından yararlanır 24,25,26. Bununla birlikte, pakiten oositlerin alt evrelendirilmesi için güvenilir bir yöntem resmileştirilmemiştir.

Burada sunulan protokoller, erken profaz I'den metafaz I'e kadar fare oositlerinde sinapsis ve rekombinasyonun kapsamlı bir analizini kolaylaştırır. Bu çalışma, Peters ve ark.27 ve Tarkowski28 tarafından geliştirilen klasik kromozom yayılma tekniklerine ve bu yöntemlerin Hunt29 ve Sun ve Cohen30 tarafından önceki iyileştirmelerine dayanmaktadır. Bu protokol aşağıdakileri vurgulamak için geliştirilmiştir: 1) Spesifik faz I alt aşamalarının zenginleştirilmesi ve tanımlanması, 2) fetal yumurtalık çifti başına gerçekleştirilen uygulama sayısının en üst düzeye çıkarılması ve 3) sinapsis kusurlarının değerlendirilmesi için kapsamlı, erişilebilir ölçümler ve odaklardan kiazmataya rekombinasyon.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan işleme ve prosedürleri, 2004-0063 protokolü kapsamında Cornell Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirilmiştir.

1. Oosit profaz I kromozom yayılım slaytının hazırlanması

  1. Öğleden sonra geç saatlerde, C57BL / 6J dişi farelerin (2 - 6 aylık) erkeklerle (2 - 12 aylık) zamanlanmış çiftleşmelerini ayarlayın. Ertesi günden başlayarak, dişileri her sabah (sabah 9'dan önce) çiftleşme tıkaç için kontrol edin. Fişin takıldığı gün öğlen 0.5 dpc olarak tanımlanır.
  2. Hamile fareleri kurban etmeden önce aşağıdakileri hazırlayın.
    1. Oda sıcaklığında H2O olan nemlendirilmiş bir oda kurun.
    2. Milli-Q suda 30 mM Tris-HCl, 50 mM sükroz, 17 mM sodyum sitrat, 5 mM EDTA, 2.5 mM DTT ve 0.5 mM PMSF'den oluşan 10 mL hipotonik ekstraksiyon tamponu (HEB; bakınız Tablo 1) hazırlayın. DTT ve PMSF eklemeden önce, 50 mM borik asit kullanarak pH'ı 8,2 - 8,4'e ayarlayın. HEB'i taze yapın ve DTT ekledikten sonra 2 saat içinde kullanın.
    3. 10 mL ultra saf H2O'ya 342 mg sükroz ekleyerek 100 mM sükroz hazırlayın. Kullanılmadığı zaman 4 ° C'de saklayın.
    4. Ultra saf H2O'yu standart bir mikrodalgada 1 dakika (90 - 95 ° C'ye kadar) önceden ısıtın. Bir davlumbaz altında, ısıtılmış ultra saf H2O ila 0,5 g Paraformaldehit (PFA) ekleyin. İki damla 1 N NaOH ekleyin, karıştırmak için girdap yapın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. 50 mM borik asit kullanarak pH'ı 9,2 - 9,3'e ayarlayın ve Triton X-100'ü %0,15 (h/h) ekleyin. 50 mL'lik son hacme (%1 PFA fiksatif solüsyonu) ultra saf H2Oekleyin ve fiksatifi 50 mL'lik bir cam Coplin boyama kavanozuna dökün.
      NOT: Bu protokol, PFA'yı hazırlamak için kaynamaya yakın su kullanılarak optimize edilmiştir; bununla birlikte, PFA'nın 65 °C'nin üzerindeki çözelti içinde ısıtılması, bozulmaya ve toksik dumanların salınmasına neden olabilir. Alternatif olarak, ultra saf H2O'yu bir su banyosunda 60 ° C'ye önceden ısıtın.
    5. Cam mikroskobu slaytlarını %70 etanol ile temizleyin. Üç kareye kadar çizmek için hidrofobik bir bariyer PAP kalemi kullanın (yaklaşık 20 x 20 mm; bkz. Şekil 1E). Tek bir çift yumurtalık, altı kare (veya her biri 3 kareden oluşan iki slayt) için yeterli malzeme sağlayacaktır.
  3. Hamile fareleri 14.5 - 18.5 dpc CO2 asfiksisyon ve servikal çıkık ile IACUC yönergelerine göre kurban edin.
    1. C57BL / 6J farelerinde faz I'in belirli aşamalarının zenginleştirilmesi için zaman noktaları Şekil 1A'da özetlenmiştir. Verilen gelişimsel zaman noktaları için, faz I'in her aşamasındaki oositlerin yaklaşık yüzdesi, Evans ve ark. (1982)31. Zigoten oositler için 16.5 dpc'de toplayın; 17.5 DPC'de erken pakiten; ve orta pakiten - 18.5 dpc'de diploten.
  4. Karın boşluğunu açmak ve uterus boynuzlarını çıkarmak için diseksiyon makası kullanın.
  5. Fetal fareleri uterus boynuzundan, yaprak döken dokudan ve yumurta sarısı kesesinden diseksiyon yapın. Fetal fareleri 1x fosfat tampon salin (PBS) içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
  6. Yumurtalıkları bir seferde bir dişi fetüsten diseksiyon yapın, geri kalanını 1x PBS'de tutun. Fetal fareleri IACUC yönergelerine göre dekapitasyon ile kurban edin. Paslanmaz çelik numune pimleri kullanarak, gövde ventral yüzeyini bir diseksiyon kabındaki silikon bir pede kadar sabitleyin.
  7. Göbek deliğinin hemen altında bir karın kesisi yapmak için mikrodiseksiyon makası kullanın ve arterleri çentiklemekten kaçınmaya dikkat edin. Fetal uterus boynuzları görünene kadar bağırsağı yerinden çıkarmak için ince forseps kullanın.
  8. Yumurtalıkları bulmak için, her bir uterus boynuzunu mesaneden böbreğe doğru dışa doğru takip edin. Over ve yumurta kanalı, uterus boynuzlarının ucunda, böbreğin hemen altında ve periton boşluğunun arka kısmına yakın küçük globül yapılar olarak görünecektir (Şekil 1B).
  9. Yumurtalıkları sıkıştırmak için ince forseps kullanın ve bunları 750 μL 1x PBS ile doldurulmuş küçük bir saat camında toplayın.
  10. Yumurtalığı çevre dokulardan ayırın ve her iki yumurtalığı da 750 μL HEB içeren bir saat camına yerleştirin, yumurtalıkların tamamen suya batırıldığından emin olun (Bkz. Şekil 1C ve 1D). Yumurtalıkları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  11. 35 μL 100 mM sükrozu içbükey bir lam üzerine pipetleyin. Her iki yumurtalığı da HEB'den sakaroza aktarmak için ince forseps kullanın.
  12. Bir yumurtalığı slayta sabitlemek için 25G'lik bir iğne kullanın ve yumurtalıktaki oositleri dışarı bastırmak için ikinci bir iğne kullanın, aşağı doğru eğim verin.
    1. Yumurtalık şeffaf ve jöle benzeri hale geldiğinde, yumurtalığı HEB'den çıkarın ve işlemi ikinci yumurtalık ile tekrarlayın. Hücreleri dağıtmak için çözeltiyi nazikçe pipetleyin.
  13. Slaytı PFA'nın Coplin boyama kavanozuna batırın ve slaytın kenarını bir kağıt havluya kısa bir süre bastırın. PFA, her karenin hidrofobik sınırı boyunca küçük damlalar halinde toplandıktan sonra (Şekil 1E), her bir PFA damlasına 5 μL oosit-sükroz çözeltisi pipetleyin.
  14. Slaytları hafifçe ileri geri eğerek oositleri kare bölümlere yayın. Herhangi bir karedeki çözeltinin bitişik karelere dökülmesine izin vermemeye dikkat edin.
  15. Slaytı nemli bir odaya yerleştirin ve oosit-sükroz çözeltisi bitene kadar slaytlar yapmaya devam edin.
  16. Tüm dişi fetüsler kullanılana kadar 1.6 - 1.15 arasındaki adımları tekrarlayın. Slaytları nemli bir odada oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  17. Kuluçka işleminden sonra nemli odayı açın. Çoğu (hepsi olmasa da) sıvı/fiksatifin slayt yüzeyinde hala bulunması gerektiğinden (her kare bölümde yaklaşık 10 μL), slaytları nazikçe bir kağıt havluya aktarın ve slaytların bir laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında tamamen kurumasına izin verin (bu işlem yerel neme bağlı olarak tipik olarak 30 - 60 dakika sürer).
    NOT: Slaytlar, artık PFA dumanlarına olası maruziyeti azaltmak için bir çeker ocak altında havayla da kurutulabilir. Bu aynı zamanda kurumayı yaklaşık 20 - 30 dakikaya kadar kısaltacaktır.
  18. Slaytları %0,4 ıslatıcı madde içinde ultra saf H2O içinde 2 dakika yıkayın. Slaytların tamamen kurumasını bekleyin.
    NOT: Bu noktada, slaytlar -80 °C'de saklanabilir; bununla birlikte, bazı epitoplar kararsızdır (örneğin, deneyimlerimize göre, MLH1 kötü boyanır ve SYCP3 boyaması donmadan sonra önemli artefaktlara sahiptir). Slaytların derhal immün şekilde boyanması şiddetle tavsiye edilir.

2. Profaz I kromozom yayılımlarının immünofloresan boyanması

  1. 1x PBS'de %10 (h/h) Normal Keçi Serumu, %3 (a/h) sığır serum albümini (BSA) ve %0.05 Triton X-100 içeren 10x antikor seyreltme tamponu (ADB; bakınız Tablo 2) hazırlayın. Filtre: 0,45 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
  2. Slaytları %0,4 ıslatıcı madde içeren bir Coplin boyama kavanozunda 1x PBS'de 10 dakika yıkayın. Slaytları 1x PBS'de% 0.1 Triton X-100 içeren bir Coplin boyama kavanozunda 10 dakika yıkayın. Slaytları 1x ADB'lik bir Coplin boyama kavanozunda 10 dakika boyunca bloke edin.
  3. Seçilen primer antikorları 10x ADB'de seyreltin (Antikorların listesi ve ilgili dilüsyonları için Malzeme Tablosuna bakınız).
    1. Multipleks immün boyama için dört antikor kombinasyonu hazırlayın: (1) SYCP332,33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; ve (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. Slaytları ADB'den çıkarın, fazla sıvıyı boşaltın ve slaytları oda sıcaklığında su ile nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Her slaydın kare bölümü başına 30 μL seyreltilmiş antikor uygulayın, bir kareden gelen antikorların bitişik karelere dökülmemesine dikkat edin.
  5. Nemlendirilmiş odayı kapatın ve slaytların gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesine izin verin.
  6. Ertesi sabah, nemli odayı açın ve seyreltilmiş antikorları slaytlardan çıkarın. Adım 2.2'yi tekrarlayın.
  7. Seçilen ikincil antikorları 10x ADB'de seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Bu noktadan itibaren, slaytlar ve antikorlar ışığa duyarlıdır. Sonraki tüm inkübasyonları karanlıkta tamamlayın.
  8. Slaytları ADB'den çıkarın, fazla sıvıyı boşaltın ve slaytları nemlendirilmiş oda sıcaklığında su haznesine yerleştirin. Her bir slaydın kare bölümü başına 30 μL seçilmiş seyreltilmiş antikor uygulayın, bir kareden gelen antikorların bitişik karelere dökülmemesine dikkat edin.
  9. Nemlendirilmiş odayı kapatın ve slaytların oda sıcaklığında 2 saat inkübe etmesine izin verin.
  10. Slaytları 3x PBS'de% 0.4 ıslatıcı madde içeren Coplin boyama kavanozlarında her biri 5 dakika boyunca 1 kez yıkayın. Slaytları, ultra saf H2O içinde% 0.4 ıslatıcı madde içeren bir Coplin boyama kavanozunda 5 dakika yıkayın.
  11. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) veya eşdeğer nükleik asit boyası ile küçük bir damla (yaklaşık 10 μL) antifade montaj ortamı uygulayın. Her sürgünün üzerine 60 mm x 24 mm No. 1.5 cam lamel yerleştirin ve fazla sıvıyı dikkatlice kurulayın.
    NOT: Slaytlar şeffaf oje veya kauçuk çimento ile kapatılabilir. Kürleme montajcısı kullanılıyorsa, kızakların sızdırmaz hale getirilmesi gereksizdir. Slaytlar 4 °C'de bir slayt kutusunda veya klasörde saklanmalıdır. Slaytları boyamadan kısa bir süre sonra görüntülemek en iyi uygulama olsa da, deneyimlerimize göre karanlıkta 4 °C'de saklanan slaytlar sinyal yoğunluğunu birkaç aydan bir yıla kadar koruyabilir. Daha uzun süreli depolama için, slaytları sinyal kalitesinde önemli bir kayıp olmadan birkaç yıl boyunca -20 °C'de tutabilirsiniz.
  12. Epifloresan mikroskobu kullanarak hücreleri 63x'te görüntüleyin (bkz. Eksen boyunca tüm kanalların SC uzunluğunu ve floresan yoğunluğunu ölçmek için görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ'nin Zen'i, Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Sentromerden (CREST veya DAPI yoğun bölge) başlayarak her bir kromozom ekseninin (SYCP3) uzunluğunu izleyin.
    1. HORMAD1 ve SYCP1'in analizi için, floresan sinyal tepe noktalarının uzunluklarını kaydedin. HORMAD1 veya SYCP1 tepe noktalarının toplam uzunluklarını hesaplayın ve bunları kromozom ekseninin uzunluğuna bölün.
    2. MSH4 analizi için, her SYCP3 ölçümü için floresan sinyal tepe noktalarının sayısını ölçün. Hem çekirdek başına toplam MSH4 tepe noktası sayısını hem de MLH3 tepe noktalarıyla örtüşen MSH4 tepe noktalarının sayısını kaydedin. Tepe noktalarını karşılık gelen odak sayısıyla karşılaştırarak MSH4 sayılarını onaylayın.

3. Kiazmata gözlemi için diakinezi / prometafaz preparatları

  1. Mayotik olarak yetkin oositlerin verimini en üst düzeye çıkarmak için, genç dişi fareler (25-28 günlük) kullanın.
    NOT: Oosit toplamadan 48 saat önce 5 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) ile intraperitoneal olarak enjekte edilen dişi farelerle stimülasyon, verimi artırmak için yapılabilir. Bununla birlikte, kiazmata analizlerinin amaçları doğrultusunda, uyarılmamış dişilerden yeterli germinal vezikül (GV) oositleri toplanabilir.
  2. Fareleri feda etmeden önce, aşağıdaki reaktifleri ve çözeltileri hazırlayın.
    1. M2 (fare başına 3 mL) ve KSOM'un (fare başına 1 mL) bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2) en az 1 saat dengelenmesine izin verin.
      NOT: Donmuş ortam alikotlarının tüpleri, oosit toplanmasından önceki akşam kapakları gevşetilerek inkübatöre yerleştirilebilir ve yaklaşık 14 saatlik bir dengeleme sağlar.
    2. M2 ortamını 2.5 μM milrinon (mayotik yeniden başlamayı önleyen bir fosfodiesteraz izoenzim inhibitörü) ile hazırlayın36. Beş adet 20 μL damla M2 + milrinonu 35 mm'lik bir Petri kabına pipetleyin ve hafif mineral yağ ile kaplayın (Şekil 2C).
    3. Beş adet 20 μL KSOM'luk pipeti 35 mm'lik bir Petri kabına damlatın ve hafif mineral yağ ile kaplayın (Şekil 2C).
      DİKKAT: Sıcaklık ve pH kontrolü, oositin in vitro olgunlaşması için kritik öneme sahiptir. Oositlerin toplanması ısıtılmış (37 °C) bir tezgah üzerinde yapılmalıdır. Tüm ortamlar kullanılana kadar inkübatörde tutulmalı ve ortam havasına maruz kalmanın neden olduğu bozulmayı önlemek için ortam kapları birer birer çıkarılmalıdır.
    4. Cam mikroskobu %70 etanol ile kayar ve havayla kurumaya bırakın. Cam mikroskop slaytlarının arkasına, ~ 4 mm x 4 mm karelerden oluşan 5 x 5'lik bir ızgarayı hafifçe çizin (elmas uçlu bir kalemle) veya çizin (suya dayanıklı bir mürekkeple) (Bir örnek Şekil 2B'de gösterilmiştir ve ızgarayı izlemek için kullanılabilir).
  3. Her seferinde bir fareden oosit toplayın. IACUC yönergelerine göre CO2 boğulması ve servikal çıkık ile dişi bir fareyi kurban edin.
  4. Karın boşluğunu açmak için diseksiyon makası kullanın. Bağırsakları yerinden çıkarmak için ince forseps kullanın.
  5. Her uterus boynuzunu mesaneden böbreğe doğru takip edin. Yumurtalıklar ve yumurta kanalları, böbreğin yakınında küçük bir yağ yastığı ile ilişkilendirilecektir.
  6. Yumurtalıkları çıkarmak için mikrodiseksiyon makası kullanın ve bunları milrinon ile gazlı M2 ortamına yerleştirin.
  7. Yumurtalıklardan tüm yağ ve diğer dokuları (bursa dahil) çıkarmak için mikrodiseksiyon makası kullanın. Antral folikülleri yırtmak için 25G iğneler kullanın.
  8. M2 + milrinon içindeki oositleri 100 mm'lik bir Petri kabında ince bir tabaka halinde yaymak için bir transfer pipeti kullanın ve ortamın tabağın kenarlarına temas etmesine izin vermemeye dikkat edin (Şekil 2C).
  9. GV oositlerini görselleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu (büyütme 25x - 50x) kullanın (Şekil 2F). GV oositleri, bir kümülüs-oosit kompleksindeki (COC) kümülüs hücreleri ile ilişkili olabilir. Tekrarlanan pipetleme ile kümülüs hücrelerini çıkarın.
  10. Ağızla çalıştırılan bir cam pipet (100 - 150 μm çapında; Şekil 2A). GV oositlerini hafif mineral yağ ile kaplanmış 20 μL'lik bir damla M2 + milrinona aktarın (Şekil 2C). Tek bir damlaya 30'dan fazla yumurta koymayın.
  11. Tüm GV oositleri toplandığında, herhangi bir somatik hücreyi çıkarmak için hafif mineral yağ ile kaplanmış iki veya üç adet 20 μL damla M2 + milrinondan geçirin.
  12. GV oositlerini (mümkün olduğunca az medya ile) 30 μL'lik bir KSOM damlasına aktarın. Oositleri beş KSOM damlasından geçirerek milrinonu yıkayın (Şekil 2C).
  13. Tüm GV oositlerini, KSOM damlası başına maksimum 30 oosit olmak üzere hafif mineral yağ ile kaplanmış 20 μL KSOM damlasına aktarın (Şekil 2C). Oositleri bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin (37 ° C,% 5 CO2).
  14. Oositleri yaklaşık 5 saat inkübe edin.
    NOT: GV arızası (nükleer zarfın kaybolduğunu ve mayotik yeniden başladığını gösterir; Şekil 2G) Tipik olarak kültürde 2 saat sonra ortaya çıkar, ancak oosit olgunlaşma hızı fare suşuna veya hormon stimülasyonuna bağlı olarak değişebilir. Deneyimlerimize göre, kültürde toplam 5 saat, çoğu fare suşunda chiasmata yayılımları için en iyi şekilde optimize eder. Çok uzun süre olgunlaşmaya bırakılırsa, ilk mayotik bölünme ve polar cisim ekstrüzyonu meydana gelebilir (Şekil 2H).
  15. 5 - 10 oositi (mümkün olduğunca az KSOM ile) 30 μL'lik bir hipotonik çözeltiye (ultra saf H2O'da% 0.9 sodyum sitrat) aktarın. Oositleri hipotonik çözelti içinde 5-10 dakika inkübe edin.
  16. Hazırlanan slaytlardaki karelerden birine küçük bir damla (~ 1 μL) asitlenmiş su (50 mL ultra saf H2O içinde 8 damla buzlu asetik asit) pipetleyin (Şekil 2B).
  17. 100 - 150 μm çapında ağızla çalışan bir cam pipet kullanarak bir oositi asitlenmiş su damlasından hızlı bir şekilde aktarın. Oosit ile mümkün olduğunca az hipotonik çözelti aktarın. Oosit slayta yapışana kadar sıvının bir kısmını çıkarmak için aynı pipeti kullanın.
    NOT: Oosit etrafındaki sıvı hacmi kritiktir. Fiksasyondan önce oositin kurumaması için yeterli sıvı olmalı, ancak oositin slayta yapışamayacağı kadar fazla olmamalıdır.
  18. Hızlı bir şekilde 150 μm çaplı cam pipet ucuna geçin. Oosite bir damla taze Carnoy fiksatifi (üç kısım mutlak metanol ila bir kısım buzlu asetik asit) ekleyin. Sabitleyicinin slayt üzerinde dağılmasına izin verin. Fiksatiften gelen asit zona pellucida'yı çözdükçe ve hücreler patladıkça oosit daha az belirgin hale gelmeli ve erimelidir.
  19. Fiksatifin önü kasılmaya başladığında, hızlı bir şekilde 2-3 damla daha fiksatif ekleyin. Kurumayı hızlandırmak için sürgüye hafifçe üfleyin.
  20. Hipotonik solüsyondan ek oositlerle 3.16 - 3.19 arasındaki adımları tekrarlayın.
  21. Tüm yumurtalar sabitlenene kadar 3.15 - 3.20 arasındaki adımları tekrarlayın. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak kromozomların yayılmasını kontrol edin.
  22. Slayt tamamen kuruduğunda, slaytı ddH2O'da 50 mL% 4 Giemsa (v / v) içeren bir Coplin boyama kavanozuna yerleştirin.
  23. Slaytları oda sıcaklığında ddH2O'da her biri 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Slaytların tamamen kurumasını bekleyin.
  24. 60 mm x 24 mm No. 1.5 cam kapak kızağı boyunca ince bir tabaka (~ 60 μL) Permount uygulayın. Slaytları lamellerin üzerine ters çevirerek ve fazla sıvıyı dikkatlice kurutarak monte edin. Parlak alanda 63x'te görüntülemeden önce slaytların gece boyunca kurumasını bekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Pakiten benzeri hücrelerde sinapsis defektlerinin değerlendirilmesi
Bu deney, pakiten oositlerdeki sinapsis defektlerini değerlendirir ve profaz I ilerlemesini izler (Şekil 3A). SYCP3 (eksenel/lateral SC elemanları), SYCP1 (merkezi SC elemanı) ve HORMAD1 (sinapssız/sinapsif dışı kromozom eksenleri) için immün boyama, evreleme ve sinapsis değerlendirmesini mümkün kılar. HORMAD1, zygonema ve diplonema sırası...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Memeli oositleri, spermatositlere kıyasla özellikle hataya eğilimlidir. Oositin daha az verimli iğ montaj kontrol noktası (SAC) bu güvenlik açığına katkıda bulunurken 14,52,53, Hassold ve Hunt, çoklu isabetlerin anöploidiye yol açtığını ve kusurlu rekombinasyonun birincil faktör olduğunu öne sürmektedir 54. İnsan çalışmaları, anöploidi yetersiz çaprazlama güvencesi ve yet...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarın ifşa edecek herhangi bir çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu projenin finansmanı, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve Gelişimi Enstitüsü'nden (HD112986 TH'ye) bir K99 ödülü ile sağlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 μ m Şırınga FiltresiMillipore SigmaSLHAR33SBağızla çalışan pipet yapmak için
0.5 M EDTA, pH 8.0Corning46-034-CI HEB için
25 kalibre, 16 mm iğneli 1 mL Steril ŞırıngeFisher Scientific14-817-125 Yırtılan yumurtalıklar için
100 x 15 mm Petri kabıVWR25384-302 
14,6 cm tek kullanımlık borosilikat cam Pasteur pipetleriFisher Scientific13-678-20B ağızla çalışan pipet yapmak için
35 x 10 mm Petri kabıCorning351008
40 mm x 0.45 mm #3 Entomoloji için paslanmaz çelik pinlerAmazonB0CSSPW5S7Diseksiyon için fetal fareleri sabitlemek için
Asetik Asit, BuzulFisher ScientificA38-212Carnoy'un fiksatifi için
Kalibre edilmiş mikrokapiler pipetler için aspiratör tüp montajlarıMillipore SigmaA5177-5EAağızla çalışan pipet yapmak için
B.P.I. Watch GlassNDS Technologies 1580-00Alternatif olarak 30 mm diametr x 12 mm derinliğinde bir embriyo çanakı kullanın (Elektron Mikroskopi Bilimleri SKU: 70543-30)
Borik AsitFisher ScientificBP168-1HEB, PFA pH ayarlaması için
Sığır Serum AlbüminiMillipore SigmaA7906-100GADB için
CO2 Tankıkuluçka makinesi için
Corning Mikroskobu SlaytlarıMillipore SigmaCLS294875X25Sol x B 75 mm x 25 mm, bir tarafı buzlu
Corning mikroskop slaytları, bir tarafı buzlu, bir ucuVWR294875X25
Cam dikdörtgen kapa. 60 x 24 mm, #1.5VWR48393-251
Diseksiyon TabağıElektron Mikroskopi Bilimleri70540
Diseksiyon MikroskobuHerhangi bir standart model
Diseksiyon Makası, Keskin Uç, 4.5"VWR82027-578
Ekstra ince, keskin uçlu penslerVWR76548-836
Giemsa LekesiMillipore SigmaGS500-500Chiasmata yayılımlarını boyamak için
ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP PenVektör LaboratuvarlarıH-4000
Kuluçka makinesiCO2 ve su kaplamalı teknolojiye sahip herhangi bir standart model
IVF İş IstasyonuK-SystemsIsıtılan tezgah üstü olan herhangi bir model
Kodak Photo-Flo 200 ÇözümüBH Fotoğrafı & Video1464510Sürgü yıkamalar için
MetanolFisher ScientificA412-4Carnoy'un fiksatifi için
MP Biyomedikal Coplin Boyama KavanozuFisher ScientificICN17006201
Normal Keçi SerumuGibco16210-072ADB için
Paraformaldehit, EM Derecesi, Saflaştırılmış PrillElektron Mikroskopi Bilimleri19200
PermountFisher ScientificSP15-100for  Chiasmata yayımları için montaj kaydırmaları
ProLong Cam Antifade Mountant ve NucBlue BoyalıTermo BilimselP36985İmmünbotinli slaytların montajı için
Silikon tüp, iç çap: 0.125", dış çap: 0.25"VWR89068-474ağızla çalışan pipet yapmak için
Sodyum Sitrat DihidratFisher ScientificS279-500HEB için hipotonik çözelti
StainTray Sürgü Boyama SistemiElektron Mikroskopi Bilimleri71396-BNemlendirilmiş bir oda olarak kullanılmak için. İmmünofluoresans boyama için siyah kapağı kullanmak zorundadır. Alternatif olarak, opak bir sürgü kutusunun veya tupper çüýşesinin altını nemli kağıt havlularla kaplayabilir;
Stripper İpuçları - 100Cooper CerrahiMXL3-100ağızla çalışan pipet için
Stripper İpuçları - 150Cooper CerrahiMXL3-150ağızla çalışan pipet için
SucroseMillipore SigmaS-8501HEB için, Sukroz hipotonik çözelti
Tris ÜssüFisher ScientificBP152-5HEB için
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 PFA, ADB ve Triton-PBS için
United Scientific Coplin Boyama KavanozuFisher ScientificS17495AFotosensitif ikincil antikor eklendikten sonra yıkama ve bloklama slaytları için opak beyaz plastik
Birleşik Bilimsel Cam Kavuruşu SlaytlarıFisher ScientificS1395331,3 mm kalınlığında, 2 kuyulu sayım
Vannas Mikrodiseksiyon Makasları 5mm düzVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Zen Blue 3.11 YazılımıCarl ZeissGörüntü edinim ve analiz yazılımı
Antikorlar
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Parça Keçi Fare Karşıtı IgG, Fc parçasına özelJackson ImmunoResearch Laboratuvarları MM.115-546-0711:1.000 seyreltme kullanıldı
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Parça Keçi Anti-Tavşan IgG, Fc Fragment ÖzelJackson ImmunoResearch Laboratuvarları MM.111-546-0461:1.000 seyreltme kullanıldı
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Parça Keçi Anti-İnsan IgG, Fcγ Parçaya özgüJackson ImmunoResearch Laboratuvarları MM.109-606-1701:1.000 seyreltme kullanıldı
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Guinea Pig IgG, Fc fragment specifiJackson ImmunoResearch Laboratuvarları MM.106-605-0081:1.000 seyreltme kullanıldı
Gine Domuzu anti-MLH3 pAbThermo-Fisher ile özel olarak üretilmiş, 1:500 seyreltme kullanılmış
Gine Domuzu anti-SYCP1 pAbChrister Hö'dan; ö g (Kouznetsova ve ark. 2005), 1:200 seyreltme kullandı
İnsan anti-Centromere proteini pAbAntikorlar Inc.15-2341:1.000 seyreltme kullanıldı
Fare anti-MLH1 mAbBD Biosciences5508381:100 seyreltme kullanıldı
Fare anti-SYCP3 mAbAbcamab976721:1.000 seyreltme kullanıldı
Tavşan anti-HORMAD1 pAbProteintech13917-1-AP1:500 seyreltme kullanıldı
Tavşan anti-MSH4 pAbAbklonalA85561:100 seyreltme kullanıldı
Tavşan anti-RAD51 pAbMilliporePC1301:500 seyreltme kullanıldı
Tavşan anti-SYCP3 pAbAbcamAB150931:1.000 seyreltme kullanıldı
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Parça Keçi Fare Karşıtı IgG, Fc parçasına özelJackson ImmunoResearch Laboratuvarları MM.115-296-0711:1.000 seyreltme kullanıldı
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Parça Keçi Anti-Tavşan IgG, Fc Fragment ÖzelJackson ImmunoResearch Laboratuvarları MM.111-296-0461:1.000 seyreltme kullanıldı

Kaynaklar

  1. Gray, S., Cohen, P. E. Control of Meiotic Crossovers: From Double-Strand Break Formation to Designation. Annu Rev Genet. 50, 175-210 (2016).
  2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7, a016618(2015).
  3. Kudo, N. R., et al. Resolution of Chiasmata in Oocytes Requires Separase-Mediated Proteolysis. Cell. 126, 135-146 (2006).
  4. Murdoch, B., et al. Altered Cohesin Gene Dosage Affects Mammalian Meiotic Chromosome Structure and Behavior. PLoS Genet. 9, 1003241(2013).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1β-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37, 1351-1355 (2005).
  6. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances Between Homologs. Ann Rev Genet. 57, 1-63 (2023).
  7. Billmyre, K. K., et al. SYCP1 head-to-head assembly is required for chromosome synapsis in mouse meiosis. Sci Adv. 9, eadi1562(2023).
  8. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171, 447-458 (2005).
  9. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31, 385-390 (2002).
  10. Oh, S. D., Lao, J. P., Taylor, A. F., Smith, G. R., Hunter, N. RecQ Helicase, Sgs1, and XPF Family Endonuclease, Mus81-Mms4, Resolve Aberrant Joint Molecules during Meiotic Recombination. Mol Cell. 31, 324-336 (2008).
  11. Holloway, J. K., Booth, J., Edelmann, W., McGowan, C. H., Cohen, P. E. MUS81 generates a subset of MLH1-MLH3-independent crossovers in mammalian meiosis. PLoS Genet. 4, e1000186(2008).
  12. Edelmann, W., et al. Mammalian MutS homologue 5 is required for chromosome pairing in meiosis. Nat Genet. 21, 123-127 (1999).
  13. Kneitz, B., et al. MutS homolog 4 localization to meiotic chromosomes is required for chromosome pairing during meiosis in male and female mice. Genes Dev. 14, 1085-1097 (2000).
  14. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13, 493-504 (2012).
  15. Capalbo, A., Hoffmann, E. R., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human female meiosis revised: new insights into the mechanisms of chromosome segregation and aneuploidies from advanced genomics and time-lapse imaging. Hum Reprod Update. 23, 706-722 (2017).
  16. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365, 1466-1469 (2019).
  17. Gruhn, J. R., Hoffmann, E. R. Errors of the Egg: The Establishment and Progression of Human Aneuploidy Research in the Maternal Germline. Ann Rev Genet. 56, null(2022).
  18. Soygur, B., et al. Intercellular bridges coordinate the transition from pluripotency to meiosis in mouse fetal oocytes. Sci Adv. 7, eabc6747(2021).
  19. Bowles, J., et al. Retinoid Signaling Determines Germ Cell Fate in Mice. Science. 312, 596-600 (2006).
  20. Bullejos, M., Koopman, P. Germ cells enter meiosis in a rostro-caudal wave during development of the mouse ovary. Mol Reprod Dev. 68, 422-428 (2004).
  21. Borum, K. Oogenesis in the mouse: A study of the meiotic prophase. Exp Cell Res. 24, 495-507 (1961).
  22. Grive, K. J., Freiman, R. N. The developmental origins of the mammalian ovarian reserve. Development. 142, 2554-2563 (2015).
  23. Hu, M., et al. PRC1-mediated epigenetic programming is required to generate the ovarian reserve. Nat Commun. 13, 4510(2022).
  24. Drabent, B., Bode, C., Bramlage, B., Doenecke, D. Expression of the mouse testicular histone gene H1t during spermatogenesis. Histochem Cell Biol. 106, 247-251 (1996).
  25. Goetz, P., Chandley, A. C., Speed, R. M. Morphological and temporal sequence of meiotic prophase development at puberty in the male mouse. J Cell Sci. 65, 249-263 (1984).
  26. Solari, A. J. The spatial relationship of the X and Y chromosomes during meiotic prophase in mouse spermatocytes. Chromosoma. 29, 217-236 (1970).
  27. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  28. Tarkowski, A. K. An Air-Drying Method for Chromosome Preparations from Mouse Eggs. Cytogenetics. 5, 394-400 (2008).
  29. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  30. Sun, X., Cohen, P. E. Studying Recombination in Mouse Oocytes. Mammalian Oocyte Reg Meth Protoc. , 1-18 (2013).
  31. Evans, C. W., Robb, D. I., Tuckett, F., Challoner, S. Regulation of meiosis in the foetal mouse gonad. Development. 68, 59-67 (1982).
  32. Horan, T. S., et al. The DNA helicase FANCJ (BRIP1) functions in double strand break repair processing, but not crossover formation during prophase I of meiosis in male mice. PLoS Genet. 20, e1011175(2024).
  33. Wood, A. J., et al. CNTD1 is crucial for crossover formation in female meiosis and for establishing the ovarian reserve. J Cell Biol. 224, e202401021(2025).
  34. Horan, T. S., et al. Replacement Bisphenols Adversely Affect Mouse Gametogenesis with Consequences for Subsequent Generations. Curr Biol. 28, 2948-2954.e3 (2018).
  35. Lee, C., Oh, J. S. Novel BRCA1-PLK1-CIP2A axis orchestrates homologous recombination-mediated DNA repair to maintain chromosome integrity during oocyte meiosis. Nuc Acid Res. 53, gkae1207(2025).
  36. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biol Reprod. 71, 1142-1149 (2004).
  37. Wojtasz, L., et al. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, Two Conserved Meiotic Chromosomal Proteins, Are Depleted from Synapsed Chromosome Axes with the Help of TRIP13 AAA-ATPase. PLoS Genet. 5, e1000702(2009).
  38. Kogo, H., et al. Differential phosphorylation of two serine clusters in mouse HORMAD1 during meiotic prophase I progression. Exp Cell Res. 440, 114133(2024).
  39. Jiao, X., et al. Aberrant activation of chromosome asynapsis checkpoint triggers oocyte elimination. Nat Commun. 16, 2260(2025).
  40. Cloud, V., Chan, Y. L., Grubb, J., Budke, B., Bishop, D. K. Rad51 Is an Accessory Factor for Dmc1-Mediated Joint Molecule Formation During Meiosis. Science. 337, 1222-1225 (2012).
  41. Lan, W. H., et al. Rad51 facilitates filament assembly of meiosis-specific Dmc1 recombinase. Proc Natl Acad Sci. 117, 11257-11264 (2020).
  42. Hinch, A. G., et al. The Configuration of RPA, RAD51, and DMC1 Binding in Meiosis Reveals the Nature of Critical Recombination Intermediates. Mol Cell. 79, 689-701.e10 (2020).
  43. Snowden, T., Acharya, S., Butz, C., Berardini, M., Fishel, R. hMSH4-hMSH5 recognizes Holliday Junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous chromosomes. Mol Cell. 15, 437-451 (2004).
  44. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA Damage Checkpoint Eliminates Mouse Oocytes with Chromosome Synapsis Failure. Mol Cell. 67, 1026-1036.e2 (2017).
  45. Premkumar, T., et al. Genetic dissection of crossover mutants defines discrete intermediates in mouse meiosis. Mol Cell. 83, 2941-2958.e7 (2023).
  46. Polani, P. E., Crolla, J. A., Seller, M. J., Moir, F. Meiotic crossing over exchange in the female mouse visualised by BUdR substitution. Nature. 278, 348-349 (1979).
  47. Imai, H. T., Moriwaki, K. A re-examination of chiasma terminalization and chiasma frequency in male mice. Chromosoma. 85, 439-452 (1982).
  48. Kanda, N., Kato, H. Analysis of crossing over in mouse meiotic cells by BrdU labelling technique. Chromosoma. 78, 113-121 (1980).
  49. Hultén, M., Lawrie, N. M., Laurie, D. A. Chiasma-based genetic maps of chromosome 21. Am J Med Genet. 37, 148-154 (1990).
  50. Lawrie, N. M., Tease, C., Hultén, M. A. Chiasma frequency, distribution and interference maps of mouse autosomes. Chromosoma. 104, 308-314 (1995).
  51. Speed, R. M. The effects of ageing on the meiotic chromosomes of male and female mice. Chromosoma. 64, 241-254 (1977).
  52. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139, 1941-1946 (2012).
  53. Sebestova, J., Danylevska, A., Dobrucka, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11, 3011-3018 (2012).
  54. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: recombination and human aneuploidy. Prenatal Diagnos. 41, 584-590 (2021).
  55. Oliver, T. R., et al. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033(2008).
  56. Ghosh, S., Feingold, E., Dey, S. K. Etiology of Down syndrome: Evidence for consistent association among altered meiotic recombination, nondisjunction, and maternal age across populations. Am J Med Genet A. 149A, 1415-1420 (2009).
  57. Wang, S., et al. Inefficient crossover maturation underlies elevated aneuploidy in human female meiosis. Cell. 168, 977-989.e17 (2017).
  58. Shin, Y. H., McGuire, M. M., Rajkovic, A. Mouse HORMAD1 Is a Meiosis I Checkpoint Protein That Modulates DNA Double-Strand Break Repair During Female Meiosis. Biol Reprod. 89, 29(2013).
  59. Kogo, H., et al. HORMAD1-dependent checkpoint/surveillance mechanism eliminates asynaptic oocytes. Genes Cells. 17, 439-454 (2012).
  60. Ward, J. O., et al. Mutation in Mouse Hei10, an E3 Ubiquitin Ligase, Disrupts Meiotic Crossing Over. PLoS Genet. 3, e139(2007).
  61. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  62. Hodges, C. A., Hunt, P. A. Simultaneous analysis of chromosomes and chromosome-associated proteins in mammalian oocytes and embryos. Chromosoma. 111, 165-169 (2002).
  63. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome Spreads with Centromere Staining in Mouse Oocytes. Mammal Oocyte Regul Method Protoc. , 203-212 (2013).
  64. Yun, Y., Ito, M., Sandhu, S., Hunter, N. Cytological Monitoring of Meiotic Crossovers in Spermatocytes and Oocytes. Homologous Recomb Method Protoc. , 267-286 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sinaptonemal KompleksMayotik Rekombinasyonmm nofloresan BoyamaKromozom SinapsisiKrossing over Olu umuOosit MaturasyonuAneuploidi De erlendirmesiKromozom Dinamikleri
Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.