R Kullanarak MiRNA-Seq Veri İşleme ve Biyoinformatik Analizi için Doğrulanmış Bir İş Akışı

Summary

Burada, R kullanarak miRNA-Seq verilerini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. İş akışı, araştırmacılara miRNA tarafından düzenlenen ağları ve bunların çeşitli biyolojik ve klinik sorulardaki önemini keşfetme gücü verir. Bu çalışma, miRNA biyoinformatiği alanında hem acemi hem de deneyimli araştırmacılar için pratik bir rehber görevi görmeyi amaçlamaktadır.

Abstract

MikroRNA'lar (miRNA'lar), çok çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçleri etkileyen kritik transkripsiyon sonrası düzenleyicilerdir. Yüksek verimli dizileme teknolojilerinin gelişmesiyle birlikte miRNA-Seq, miRNA ekspresyon modellerinin profilini çıkarmak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Ancak bu tür verilerin güvenilir bir şekilde yorumlanması, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir analiz hattı gerektirir. Burada, R kullanarak miRNA-Seq veri işleme ve biyoinformatik analizi için doğrulanmış bir iş akışı sunuyoruz. Bu protokol, ham veri ön işleme, kalite kontrol, hizalama, niceleme, normalleştirme, diferansiyel ifade analizi, hedef tahmini, işlevsel zenginleştirme ve düzenleyici ağ oluşturma dahil olmak üzere tüm temel adımları kapsar. Esneklik ve şeffaflık için tasarlanan iş akışı, yaygın olarak benimsenen R paketlerini entegre eder ve türe özgü açıklamaları ve modüler özelleştirmeyi destekler. Ek olarak kullanıcılar, seçilmiş veritabanlarından ve Cytoscape gibi görselleştirme araçlarından yararlanarak aşağı yönlü biyolojik yorumlama yapmaya yönlendirilir. Bu protokol yalnızca sağlam istatistiksel analizleri desteklemekle kalmaz, aynı zamanda miRNA-mRNA etkileşimleri ve bunların hastalık mekanizmalarındaki rolleri hakkında anlamlı bilgiler sağlar. Özellikle miRNA biyobelirteç keşfi, hastalık modellemesi veya bütünleştirici multi-omik çalışmaları yürüten hem acemi hem de deneyimli araştırmacılar için çok uygundur.

Introduction

MikroRNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyon sonrası aşama^1'de hareket ederek gen ekspresyonunu önemli ölçüde etkileyen kısa, kodlamayan RNA molekülleridir. Tipik olarak, hedef haberci RNA'ların (mRNA'lar) 3' çevrilmemiş bölgelerindeki (UTR'ler) tamamlayıcı dizilere bağlanarak işlev görürler ve mRNA bozulmasına veya translasyonel baskılamaya yol açarlar¹. Son yirmi yılda, miRNA'lar, hücre proliferasyonu, farklılaşması, apoptoz, bağışıklık tepkileri ve organ gelişimi dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerin merkezi düzenleyicileri olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir². Ayrıca, miRNA ekspresyonunun düzensizliği, kanser, kardiyovasküler hastalık, nörolojik bozukluklar ve böbrek hastalığı gibi çok sayıda hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır³. Bu bulgular, miRNA'ların yalnızca terapötik hedefler olarak değil, aynı zamanda klinik teşhiste minimal invaziv biyobelirteçler olarak potansiyelini vurgulamaktadır.

Yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla birlikte miRNA'ların incelenmesi yeni bir döneme girdi. Bilinen miRNA'larla sınırlı olan mikrodizi tabanlı yöntemlerin aksine, miRNA dizilimi (miRNA-Seq), farklı numune türleri ve koşullarında hem bilinen hem de yeni miRNA'ların kapsamlı, yüksek verimli ve tarafsız profilinin çıkarılmasını sağlar⁴. miRNA-Seq, üstün hassasiyet, doğruluk ve dinamik aralık sağlayarak, miRNA ekspresyon modellerini araştırmak ve fizyolojik ve patolojik ortamlarda düzenleyici mekanizmaları keşfetmek için tercih edilen bir yöntem haline getirir⁵. Bununla birlikte, miRNA-Seq verilerinin analizi, kısa okuma uzunluklarının işlenmesi, adaptör dizilerinin çıkarılması, yakından ilişkili miRNA ailesi üyeleri arasında ayrım yapılması ve okuma sayılarında yüksek fazlalığın yönetilmesi dahil olmak üzere belirli hesaplama zorlukları sunar⁶. Bu özellikler, dikkatle tasarlanmış ve standartlaştırılmış bir analitik iş akışını gerektirir.

miRNA-Seq veri analizi için çeşitli boru hatları ve yazılım araçları geliştirilmiş olsa da, bunların çoğu esnekliği ve tekrarlanabilirliği sınırlayan grafik kullanıcı arayüzlerine veya sabit iş akışlarına dayanır⁷. Buna karşılık, R programlama ortamı, biyoinformatik analiz için güçlü ve özelleştirilebilir bir platform sağlar⁸. R, istatistiksel modelleme, veri görselleştirme ve biyolojik veritabanlarıyla entegrasyon için zengin bir paket ekosistemi sunar. Bu, kullanıcıların şeffaf ve komut dosyası tabanlı bir şekilde kapsamlı ve tekrarlanabilir analizler gerçekleştirmesine olanak tanır. Dahası, R iş akışlarının modüler yapısı, araştırmacıların ham veri ön işlemeden işlevsel yorumlamaya kadar her adımı belirli deneysel gereksinimlere göre uyarlamasına olanak tanır.

Bu protokolde, miRNA ekspresyon verileriyle çalışan araştırmacılar için tekrarlanabilir ve kullanıcı tarafından uyarlanabilir bir çözüm sağlamak amacıyla tamamen R'de uygulanan doğrulanmış ve eksiksiz bir miRNA-Seq analiz iş akışı sunuyoruz. İş akışı, ham dizileme okumalarının kalite kontrolü ve adaptör kırpılmasıyla başlar, ardından bir referans genoma veya bilinen miRNA dizilerine hizalama yapılır. Sonraki adımlar arasında okuma sayılarının ölçülmesi, normalleştirme, diferansiyel ekspresyon analizi, hedef gen tahmini, fonksiyonel zenginleştirme ve ağ görselleştirme yer alır. İş akışı, yaygın olarak kullanılan ve bakımı iyi yapılan birkaç R paketini içerir ve gelecekteki güncellemeler ve uzantılarla hem güvenilirlik hem de uyumluluk sağlar.

Bu protokolün temel güçlü yönlerinden biri, diferansiyel ekspresyon sonuçlarının ötesine geçme ve anlamlı biyolojik yorumlama sağlama yeteneğinde yatmaktadır. İş akışı, doğrulanmış ve tahmin edilmiş miRNA-mRNA etkileşimlerinin seçilmiş veritabanlarını entegre ederek, kullanıcıların biyolojik olarak ilgili hedef genleri tanımlamasına olanak tanır. Bu hedefler daha sonra etkilenen biyolojik süreçleri ve moleküler yolları ortaya çıkarmak için Gen Ontolojisi ve yol zenginleştirme analizlerine tabi tutulabilir. Son adımda, miRNA-mRNA etkileşim ağları, Cytoscape⁹ gibi harici araçlar kullanılarak görselleştirilebilir, düzenleyici ortam hakkında bilgi sağlar ve potansiyel işlevsel öneme sahip anahtar hub miRNA'ları belirlenir.

Bu yöntem, dolaşımdaki miRNA'ların tanı ve prognoz için umut verici biyobelirteçler olarak hizmet ettiği böbrek hastalığı çalışmaları da dahil olmak üzere klinik araştırma bağlamlarında başarıyla uygulanmıştır¹⁰. Ancak iş akışının modüler ve esnek tasarımı, onu hastalık modelleme, ilaç yanıt çalışmaları, gelişimsel biyoloji ve karşılaştırmalı genomik dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için uygun hale getirir. Araştırmacılar, türe özgü açıklamalara, deneysel koşullara veya ek omik veri katmanlarına uyum sağlamak için iş akışını kolayca uyarlayabilir.

Açık kaynaklı, komut dosyası tabanlı bir çözüm sunan bu R merkezli işlem hattı, sınırlı özelleştirme, şeffaf olmayan grafik arayüzlere güvenme, model olmayan organizmalar için destek eksikliği, sürüm kontrolünün olmaması nedeniyle zayıf tekrarlanabilirlik ve aşağı akış istatistiksel ve işlevsel analiz çerçeveleriyle entegrasyon zorluğu dahil olmak üzere mevcut miRNA-Seq araçlarıyla ilişkili önemli sınırlamaların birçoğunu ele alır. Veri işleme parametreleri üzerinde tam kontrol sağlar, sürüm kontrollü kod aracılığıyla tekrarlanabilirliği teşvik eder ve biyoinformatik araştırmalarında şeffaflığı destekler. Sistem biyolojisi ve translasyonel tıp bağlamında miRNA'ların önemi artmaya devam ettikçe, güvenilir ve uyarlanabilir bir analiz çerçevesine erişim giderek daha önemli hale geliyor.

Protocol

NOT: Yazılım bağlantıları olan malzemeler, Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. RNA örneklerini ve dizi kütüphanelerini hazırlayın

NOT: Bu hesaplama iş akışının dışında RNA ekstraksiyonu ve dizilimi gerçekleştirin. miRNA dizileme verilerini analiz etmenin birden fazla yolu vardır. Bu bölüm bir pratiğin bağlamını sağlar.

1. Toplam RNA'yı çıkarın: Küçük RNA izolasyonu için optimize edilmiş bir kit (örneğin, miRNA izolasyon kiti) kullanarak biyolojik örneklerden toplam RNA'yı çıkarın. Üreticinin protokolünü dikkatle izleyin. Bozulmayı en aza indirmek için RNaz içermeyen sarf malzemeleri kullandığınızdan ve numuneleri buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.
2. RNA bütünlüğünü ve miktarını değerlendirin: Ekstrakte edilen RNA'nın 1-2 μL'sini bir Biyoanalizör veya eşdeğer cihazda çalıştırın. RNA bütünlük numarasını (RIN) kontrol edin ve güvenilir dizileme için 7.0≥ olduğundan emin olun. Bir spektrofotometre veya florometre kullanarak konsantrasyonu kaydedin.
3. Küçük RNA kitaplıkları oluşturun: Ticari bir küçük RNA-seq kitaplık hazırlama kiti kullanarak 1 μg toplam RNA'dan dizileme kitaplıkları hazırlayın. Adaptörleri bağlamak, ters transkripsiyon yapmak ve cDNA'yı çoğaltmak için kit protokolünü izleyin. miRNA fragmanlarını zenginleştirmek için PCR ürünlerini boyut seçimi (örneğin, 18-30 nt ek) ile saflaştırın.
4. Dizi kitaplıkları: Kitaplıkları yüksek verimli bir sıralama platformuna yükleyin. ~50 bp okuma uzunluğuna sahip tek uçlu sıralama için çalıştırma yapılandırmasını ayarlayın. Yeterli derinliğe ulaşmak için her numunenin yaklaşık 10 milyon ham okuma ürettiğinden emin olun.
5. Sıralama çıktısını dışa aktarın: Sıralamadan sonra, enstrümanın veri çıkış yazılımını kullanarak ham verileri FASTQ dosyaları olarak dışa aktarın. Çıkış dizininin hem sıra okumalarını hem de ilişkili kalite puanı dosyalarını içerdiğini doğrulayın. Aşağı akış analizi için FASTQ dosyalarını yapılandırılmış bir dizinde saklayın.

2. Ham okumaları önceden işleyin ve kalite kontrolü gerçekleştirin

1. Bağdaştırıcı sıralarını kırp
   1. Cutadapt veya fastp'yi kurun ve yapılandırın.
   2. Aşağıdaki komutu kullanarak her FASTQ dosyasında bağdaştırıcı kırpmayı çalıştırın:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      NOT: '-a'dan sonra takip edilen adaptör dizisi, spesifik sRNA kitaplığı hazırlama kiti ile uygulanmalıdır. '-o', takip edilen girdi dosyasıyla birlikte çıktı dosya adını tanımlar.
2. Okuma kalitesini değerlendirin
   1. Kalite kontrol raporları oluşturmak için FastQC'yi kullanın:
      fastqc trimmed_reads.fastq
   2. Temel başına kalite puanlarını, okuma uzunluğu dağılımını ve bağdaştırıcı kirliliğini gözden geçirin: Her FASTQ dosyası için oluşturulan FastQC HTML raporunu bir web tarayıcısında açın. Aşağıdaki modülleri adım adım inceleyin:
      1. Temel başına dizi kalitesi: Çoğu bazın yeşil bölge içinde olduğundan emin olun (Phred puanı ≥30). 3' ucunda sıralama hatalarını gösterebilecek herhangi bir kalite düşüşü olup olmadığına bakın.
      2. Okuma uzunluğu dağılımı: Dağılımın beklenen ek boyutuna karşılık geldiğini onaylayın (örneğin, miRNA'lar için 18-30 nt). Beklenmeyen tepe noktalarının bulunmadığını kontrol edin.
      3. Bağdaştırıcı içeriği: Bağdaştırıcı dizilerinin etkili bir şekilde kırpıldığını doğrulayın. Kırpma işleminden sonra adaptör kirlenme yüzdesinin sıfıra yakın olduğunu doğrulayın.
   3. FastQC özet raporunu kaydedin ve düşük kaliteli metriklere sahip numuneleri yeniden kırpmak veya daha fazla analizden hariç tutmak için işaretleyin.

3. Harita okur ve sayım matrisleri oluşturur

1. Hizalama referansa okur
   1. Referans genomun veya olgun miRNA dizilerinin FASTA dosyasını indirin (örneğin, miRBase'den)¹¹. Örnek:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
   2. Bowtie kullanarak referans genomu indeksleyin.
      1. Bir terminal açın ve dizini oluşturmak için aşağıdaki komutu çalıştırın:
         bowtie-build reference.fa reference_index
      2. reference.fa'yı gerçek FASTA dosya adıyla değiştirin.
      3. reference_index dizin için istediğiniz ön ekle değiştirin.
      4. Bowtie'nin birden fazla dizin dosyası (örneğin, .ebwt) oluşturduğundan emin olun. Hizalama için gerekli olduklarından bu dosyaların çalışma dizininde mevcut olduğunu doğrulayın.
   3. Bowtie kullanarak okumaları kısa okumalar için uygun parametrelerle hizalayın. Örnek:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      NOT: Giriş dosyası trimmed_reads.fastq ve çıktı dosyası aligned_reads.sam'dir. '-v 0', tüm okumada hataya izin vermediğimiz anlamına gelir. '-a -en iyi -katmanlar', en iyiden daha fazla uyumsuzluğa sahip herhangi bir hizalamayı attığımız anlamına gelir.
2. miRNA ekspresyonunu ölçün
   1. SAM dosyalarını SAMtools'u kullanarak BAM formatına dönüştürün.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      NOT: aligned_reads.sam giriş dosyası, son komutun sonucudur. Çıkış dosyası aligned_reads.bam sonraki analiz için hazırlanır.
      1. Hizalama dosyasını sıkıştırmak ve sıralamak için SAMtools'u kullanın:
         samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. İlk komutun SAM dosyasını BAM formatına dönüştürdüğünden emin olun.
      3. İkinci komutun BAM dosyasını genomik koordinatlara göre sıraladığından emin olun.
      4. Üçüncü komutun, aşağı akış analizleri için gerekli olan bir dizin dosyası (.bai) oluşturduğundan emin olun.
      5. Nicelemeye geçmeden önce hem sıralanan BAM dosyasının hem de dizininin başarıyla oluşturulduğunu onaylayın.
   2. miRNA ek açıklaması GTF'yi kullanarak bir sayım matrisi oluşturmak için featureCounts veya HTSeq-count kullanın:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      NOT: featureCounts, miRNA.gtf'ye dayalı olarak aligned_reads.bam giriş dosyasındaki okumaları ölçer ve counts.txt çıktıları verir.

4. R'de Diferansiyel İfade Analizi Yapın

1. Yük Sayısı Verileri
   1. Sayı matrisini ve örnek meta verileri R'ye aktarın:
      library(DESeq2)
countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      NOT: Sayım verilerinin (counts.csv) ve örnek grubunun (metadata.csv) DESeq2'ye sağlanması gerekir. 'Durum' burada sağlanan numune grubunu açıklar. Bireysel gereksinimler için DESeq2¹² El Kitabına bakın.
2. Verileri normalleştirin ve dönüştürün
   1. DESeq2'nin varsayılan yöntemini kullanarak sayım verilerini normalleştirin:
      dds <- DESeq(dds)
   2. Varyans dengeleyici dönüşüm gerçekleştirin:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
   3. PCA kullanarak örnek kümelemeyi görselleştirin:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
3. Diferansiyel olarak eksprese edilen miRNA'ları tanımlayın
   1. Diferansiyel ifade sonuçlarını ayıklayın ve sıralayın:
      res <- results(dds)
resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      NOT: 'res' sonuç dosyasını pvalue değerine göre yeniden sıralıyoruz.
      summary(res)
   2. Önemli ölçüde diferansiyel olarak eksprese edilen miRNA'lar için filtre (p-değeri < 0.05, |log2FC| > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      NOT: Önemli ölçüde değiştirilmiş miRNA'ları filtrelemek için birden fazla eşik vardır. Gereksinimler 'p-değeri < 0.05, |log2FC| > 1' yaygın olarak uygulanmaktadır. Eşikler bireysel veriler için ayarlanabilir.
4. İfade değişikliklerini görselleştirme
   1. EnhancedVolcano paketini kurun ve yükleyin.
   2. Volkan grafiğini oluşturun:
      library(EnhancedVolcano)
EnhancedVolcano(res,
lab = rownames(res),
x = 'log2FoldChange',
y = 'pvalue',
title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. miRNA'ların hedef genlerini tahmin edin

1. Sorgu veritabanları
   1. Belirli mikroRNA'yı aramak ve hedef genleri almak için TargetScan, miRDB ve miRTarBase gibi çevrimiçi kaynakları kullanın.
   2. Daha fazla güven için deneysel olarak doğrulanmış hedeflere odaklanın.
2. R'de tahmini otomatikleştirin
   1. MultiMiR paketini yükleyin ve doğrulanmış hedefleri sorgulayın:
      library(multiMiR)
target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      NOT: Burada örneğin "has-miR-21-5p"yi alıyoruz ve doğrulanmış hedefler alıyoruz.
   2. Zenginleştirme analizi için benzersiz hedef gen sembollerini çıkarın:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. İşlevsel zenginleştirme analizi yapın

1. GO zenginleştirmesi gerçekleştirme
   1. Zenginleştirme araçlarını yükleyin:
      library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
      NOT: Burada, ortak gen tanımlayıcılarını dönüştürmek için yararlı olan insan genomu açıklamalarını içeren bir veritabanı yüklüyoruz.
   2. Biyolojik Prosesler için GO zenginleştirme analizini çalıştırın:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
keyType = "SYMBOL",
ont = "BP",
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(ego)
      NOT: EnrichGO'nun kullanımı için genlerin bir listesini sunuyoruz ve burada 'SEMBOL' olarak aday gösterildiklerini açıklığa kavuşturuyoruz. 'ont ="BP" ' parametresine karşılık gelen biyolojik süreç zenginleştirmesi gerçekleştirdik. Birden fazla test düzeltmesi gerçekleştiriyoruz, bu nedenle pAdjustMethod = "BH" olarak belirliyoruz. Önemli bir eşik için pvalueCutoff = 0.05'i seçiyoruz.dotplot görselleştirilmiş bir sonuç sunar. Daha fazla bireysel seçenek için clusterProfiler¹³ El Kitabı'na bakın.
2. KEGG yolu zenginleştirmesini gerçekleştirin
   1. KEGG zenginleştirmesini çalıştırın:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
dotplot(ekegg)
      NOT: EnrichKEGG'in kullanımı için bir gen listesi sunuyoruz ve organizmayı insan ("has") olarak netleştiriyoruz. dotplot görselleştirilmiş bir sonuç sunar. Daha fazla bireysel seçenek için clusterProfiler¹³ El Kitabı'na bakın.

7. miRNA - mRNA etkileşim ağını oluşturun ve görselleştirin

1. Ağ görselleştirmesi için verileri dışarı aktarma
2. TargetScan, miRDB veya miRTarBase'den oluşturulan hedeflere dayalı olarak miRNA-hedef gen çiftlerinden oluşan bir veri çerçevesi oluşturun.
3. Ağ tablosunu CSV'ye yazın:
   write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
4. Cytoscape'e aktarın
   1. Cytoscape'i açın ve ağ tablosunu içe aktarın.
   2. Zorla yönlendirilmiş veya dairesel düzen kullanarak ağı görselleştirin.
   3. Hub miRNA'larını tanımlamak için topolojik özellikleri (örneğin, derece merkeziliği) analiz edin.

Results

MikroRNA ekspresyon matrisini GSE133530'dan indirdik ve doğrudan diferansiyel ekspresyon analizi yaptık. Ek Dosya 1'deki veri kümesi için örnek bir analitik R betiği sağladık. Veri seti, farklı boyutlarda 16 böbrek kisti üzerinde global miRNA profili oluşturdu (minimal kistler: 1-5 mL'den az, n = 10; orta kistler: 10-25 mL arası, n = 4; büyük kistler: 50 mL'den büyük, n = 4) ve minimal kistik doku (MCT, n = 7, 1 kopya dahil) dört PKD1 polikistik böbrekten. Ayrıca izole re...

Discussion

miRNA-Seq verilerinin analizi, okumaların küçük boyutu ve fazlalığı nedeniyle farklı zorluklar ortaya çıkarır ve bu da sıkı kalite kontrolünü ve ön işlemeyi kritik hale getirir. İş akışındaki en önemli adımlardan biri adaptör düzeltmedir. miRNA'lar yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda olduğundan, adaptör dizileri, uygun şekilde çıkarılmazsa okumalara kolayca hakim olabilir. Doğru kırpma yapılmaması, yanlış hizalamaya ve yanlış pozitif okumaların şişmesine neden olabilir. Benzer şekilde, har...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 İnsan miRNA Mikrodizisi	Gilent	/	İnsan örneklerinin mikroRNA'larının profilini çıkarmak için ticari bir dizi
Papyon	Johns Hopkins Üniversitesi	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Sıralama okumalarını uzun referans dizilerine hizalamak için bir yazılım aracı
clusterProfiler (R paketi)	Biyoiletken	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	İşlevsel zenginleştirme analizi ve yüksek verimli biyolojik verilerin görselleştirilmesi için tasarlanmış bir R paketi.
Kesim uyarlaması	Açık Kaynak	https://cutadapt.readthedocs.io	Bağdaştırıcı dizilerini, primerleri, poli-A kuyruklarını ve diğer istenmeyen parçaları yüksek verimli sıralama okumalarından kaldıran bir komut satırı aracı.
Hücre manzarası	Cytoscape Konsorsiyumu	https://cytoscape.org/	Karmaşık biyolojik ağların görselleştirilmesi ve analizi için tasarlanmış açık kaynaklı bir yazılım platformu.
DESeq2 (R paketi)	Biyoiletken	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Sayım verilerinin diferansiyel gen ekspresyonu analizi için tasarlanmış bir R paketi
Geliştirilmiş Volkan (R paketi)	Biyoiletken	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Yayın kalitesinde yanardağ grafikleri oluşturmak için tasarlanmış bir R paketi.
Hızlı Kalite Kontrol	Babraham Biyoinformatik	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Yüksek verimli sıralama verileri için açık kaynaklı bir kalite kontrol aracı.
featureCounts	Alt Okuma / Kaynak Forge	http://subread.sourceforge.net/	Genomik özelliklerle eşlenen okumaları saymak için kullanılan bir program
HTSeq-count	Python Paketi	https://htseq.readthedocs.io	Kaç tane hizalanmış yüksek verimli dizileme okumasının genler veya ekzonlar gibi genomik özelliklerle örtüştüğünü sayan bir komut satırı aracı. Ben
Illumina Human v2 MicroRNA ekspresyon boncuk çipi	Illumina	/	İnsan örneklerinin mikroRNA'larının profilini çıkarmak için ticari bir dizi
multiMiR (R paketi)	Biyoiletken	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Tahmin edilen ve deneysel olarak doğrulanmış mikroRNA'nın en büyük entegre koleksiyonunu sağlayan bir R paketi– etkileşimleri, hastalıklar ve ilaçlarla olan ilişkileriyle birlikte hedefleyin.
Org. Hs.eg.db (R paketi)	Biyoiletken	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	İnsan (Homo sapiens) genomik araştırmaları için tasarlanmış bir açıklama paketi.
R Yazılım	R Projesi	https://www.r-project.org/	İstatistiksel Hesaplama için Açık Kaynaklı Bir Proje
Rstüdyo	PBC'yi Konumlandır	/	Entegre bir geliştirme ortamı, R ve Python ile daha üretken olmaya yardımcı olur
SAMtools	Açık Kaynak	http://www.htslib.org/	Yeni nesil dizileme (NGS) verilerini işlemek için bir yazılım paketi.