Yöntem makalesi

Zebra balığı görüntüleme ve kardiyak gelişim için özel 3D baskılı kalıplar

773 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68768

⸱

15 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

Bu makalede

Özet

Burada, görüntüleme çalışmaları için zebra balığı embriyolarının tekrarlanabilir montajını kolaylaştırmak için kalıplar oluşturmak için ucuz bir stereolitografik 3D yazıcı kullanan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntemi kullanarak, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfogenezi görüntülemek için kalıplar oluşturduk.

Özet

Embriyo montajı, araştırmacıların bir görüntüleme projesi üstlenirken karşılaştıkları teknik zorluklardan biridir. Embriyoların, ilgilenilen dokunun tüm görüntüleme süresi boyunca bir mikroskop objektifi tarafından erişilebilir olacak şekilde tekrarlanabilir bir şekilde yönlendirilmesi gerekir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, araştırmacılar embriyoları viskoz ortama gömebilir veya görüntüleme sırasında embriyoları istenen bir yönde tutmak için özel tabaklar ve kalıplar oluşturabilirler. Burada, embriyoların görüntüleme için monte edilebileceği agaroz kuyuları oluşturan yeniden kullanılabilir kalıplar üretmek için ucuz bir stereolitografik (SLA) 3D yazıcı kullanmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu agaroz kuyuları, görüntüleme için birden fazla embriyoyu yönlendirmek için güvenilir bir araç sağlar. Bu yöntem, çeşitli dokular, organizmalar ve görüntüleme zorlukları için kolayca özelleştirilebilen bir tasarım çerçevesi içerir. Bu yöntemi kullanarak, hem dik hem de ters mikroskoplar için zebra balıklarında kardiyak gelişimi görüntülemek için kalıplar oluşturduk. Bu yöntem, erişilebilir malzeme ve ekipmanları kullanarak, araştırmacıların montaj ihtiyaçlarına özel kalıpları kolayca oluşturmalarını sağlar.

Giriş

Bozulmamış bir hayvandaki hücresel dinamikleri görselleştirmek, konjenital hastalıkların patolojilerini ve temel gelişim ve homeostaz süreçlerini anlamak için çok önemlidir. Bu görselleştirme, tüm organizmanın yanı sıra doku, hücresel ve hücre altı düzeylerde fizyolojik dinamikleri tanımlamak için çoklu uzamsal ölçeklerde görüntülemeyi kapsar. Hücresel dinamikleri görselleştirmek için kullanılan görüntüleme yöntemleri, sabit örneklerin immünofloresan çalışmalarından canlı örneklerin hızlandırılmış görüntülemesine kadar uzanır. Bu görüntüleme yöntemleri, bozulmamış örneklerin, mikroskop objektifi tarafından ilgilenilen bir bölgeye erişilebilecek şekilde belirli yönelimlerde tutulmasını gerektirir.

Zebra balığı embriyoları, optik saydamlıkları, genetik izlenebilirlikleri, dış döllenmeleri ve omurgalı kökenli olmaları nedeniyle görüntüleme çalışmaları için ideal bir model organizmadır. Bununla birlikte, zebra balığı embriyolarının tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde belirli bir oryantasyonda monte edilmesi, sürekli bir zorluğu temsil etmiştir. Montaj, zebra balığı embriyolarında kalp gelişiminin görselleştirilmesi için özellikle zordur, çünkü kardiyak morfogenez farklı düzlemlerde meydana gelir1.

Görüntüleme için embriyoların monte edilmesinin zorluklarını ele almak için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. En basit yöntemlerden biri, zebra balığı embriyolarının ezilmeyi önlemek için lameller arasına bant katmanları ile iki lamel arasına monte edilmesini içerir. Bu yöntem hem ters hem de dik mikroskoplardagörüntülemeye izin verir 2. Zebra balığı embriyoları, embriyoları belirli yönelimlerdetutmak için metilselüloz veya% 0.1-0.8 düşük erime noktalı sıcaklık agarozu gibi oldukça viskoz bir ortama veya jele de monte edilebilir 2,3,4. Bu düşük verimli yaklaşımlar birçok görüntüleme projesi için iyi çalışır; Bununla birlikte, embriyo bütünlüğünün sağlanması ve tekrarlanabilir bir şekilde spesifik yönelimlerin elde edilmesi zahmetli olabilir. Görüntüleme verimini artırmak ve montajı kolaylaştırmak için, bir görüntüleme kabında 5,6,7,8 katılaşmış agarozdan düzenli aralıklı kuyucuklar oluşturulabilir. Bu agaroz kuyularının oluşturulmasını kolaylaştırmak için plastik kalıplar oluşturulmuştur 9,10,11. Bu kalıplar standart dorsal-ventral-lateral eksenler10,12 boyunca görüntülemeye uygulanabilirken, genellikle 96 oyuklu plakalarda13 kullanım veya ilk kalp atışınıntespiti 14 gibi belirli görüntüleme zorlukları için yapılırlar. Özel durumlarda, tüm görüntüleme çanakları oluşturulmuştur 5,15,16. Örneğin, PDMS'den yapılmış bir mikroakışkan oda (ZEBRA olarak adlandırılır), embriyoların hem görüntülenmesini hem de kimyasallara maruz kalmasını kolaylaştırır17. Bu kalıplar genellikle silikondan yapılır veya lucite10,18,19'dan işlenir. Bununla birlikte, nispeten ucuz üç boyutlu (3D) yazıcıların ortaya çıkışı, agaroz görüntüleme kuyuları oluşturmak için kullanılan özelleştirilmiş kalıpların oluşturulmasını demokratikleştirdi.

Eklemeli veya katmanlı üretim olarak da adlandırılan 3D baskı, tek tek katmanların20,21 sıralı olarak eklenmesi ve birleştirilmesiyle dijital bir tasarımdan bir 3D nesne üretmeyi içerir. Stereolitografi (SLA), ışığa duyarlı bir sıvı reçineyi sıralı katmanlarda22 sertleştirmek için ultraviyole (UV) ışık kullanır. SLA yazıcılar uygun maliyetli, hızlı ve son derece hassastır ve pürüzsüz bir yüzey sağlayanlar da dahil olmak üzere çeşitli reçinelerle kullanılabilir16. Süreç, nesnenin dijital modellerinin önceden var olan tasarımlardan de novo olarak tasarlanabildiği veya değiştirilebildiği bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı ile başlar. Dijital model daha sonra sanal olarak yazdırılabilir katmanlar halinde dilimlenir. Bu dijital katmanları kullanarak, bir 3D yazıcı nesneyi katman katman oluşturur. Burada, düşük maliyetli, ticari olarak temin edilebilen bir SLA 3D yazıcı kullanarak görüntüleme kalıplarının özel tasarımı ve oluşturulması için bir yöntem ve çerçeve sunuyoruz. Ek olarak, bu çerçeveyi, zebra balığı kardiyak gelişiminin farklı aşamalarını ters veya dik mikroskoplarda görüntülemek ve zebra balığı embriyolarını yanal, dorsal veya ventral eksenleri boyunca görüntülemek için kalıplar oluşturmak için kullanıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan protokoller, deneyler ve bulgular, hayvan refahı yönetmelikleri ve yönergelerine ve Mississippi Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (protokol #24-008) uygun olarak yürütülmüştür.

Embriyoların görüntüleme için yönlendirilebileceği farklı şekillerde agaroz kuyuları oluşturmak için, mandallara bağlı bir taban kullanan bir tasarım geliştirdik (Şekil 1A). Bu mandalların şekli ( Şekil 1A'da mor renkli mandalları gösteren oka bakınız), farklı gelişim aşamalarındaki embriyoları yönlendirmek ve farklı dokulara odaklanmak için özelleştirilebilir. Aşağıda, bu mandalları özelleştirmek ve bu sistemi agaroz kuyuları oluşturmak için kullanmak için bir protokol açıklıyoruz.

1. Özel tasarlanmış bir görüntüleme kalıbı oluşturma

  1. İstenilen yönde konumlandırılmış numunenin veya embriyonun bir ön taslağını oluşturun. İstenen embriyo oryantasyonunu ve kullanılacak mikroskobun dik veya ters objektifler içerip içermediğini göz önünde bulundurun. Ayrıca yemeğin boyutunu, monte edilecek embriyo sayısını ve aralarındaki boşluğu da göz önünde bulundurun.
  2. FIJI23 gibi bir yazılım aracıyla birleştirilmiş bir mikroskop kullanarak embriyo boyutlarını (örn. uzunluk, genişlik ve yükseklik) ölçün. Embriyoların mandallar tarafından oluşturulan kuyucuklara sığmasını sağlamak için bu boyutları kullanın.
  3. Embriyonun geometrisine karşılık gelen bir şekil belirleyin. Adım 1.2'deki ölçümleri bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımıyla birlikte kullanarak, numunenin şekline ve boyutuna yaklaşan bir peg oluşturun.
    NOT: Bu şekil, önceden tasarlanmış farklı şekillerin birleştirilmesi ve üst üste binmesiyle temel bir CAD yazılım programında oluşturulabilir veya şekil, gelişmiş bir CAD yazılım programı kullanılarak de novo olarak oluşturulabilir. Ek olarak, önceden tasarlanmış mandallarımızdan birini değiştirebilirsiniz (Ek Dosya 1'e bakın). Şekil 1A'daki gibi peg'in sivriltilmesi, ilgilenilen dokunun hedefe en yakın olmasını sağlamak için embriyoların yönlendirilmesine yardımcı olabilir.
  4. Mandal tasarımını temel tasarımla birleştirin:
    1. Bir CAD yazılım programında, önceden tasarlanmış tabanlardan birine özel olarak tasarlanmış bir mandal ekleyin (Ek Dosya 1). Ardından, gelişmiş bir CAD programındaki araçları kullanarak yüksek verimli görüntüleme için mandalları tabana çoğaltın ve eşit şekilde yerleştirin. Tüm mandalların tabandan uzakta aynı yüksekliğe ulaştığından emin olmak için iki kez kontrol edin.
  5. Tasarımı 3D baskı için hazırlayın:
    1. Özelleştirilmiş kalıp tasarımını veya önceden tasarlanmış kalıplardan birini (Ek Dosya 2), tasarımı 3D yazıcı için komutlara dönüştüren bir dilimleyici yazılımına aktarın.
    2. Dilimleyici yazılımında, mandallar gibi kritik bileşenler yazıcı aşamasından uzağa yerleştirilecek şekilde tasarımı döndürdüğünüzden emin olun. Sigortalı biriktirme modelleme (FDM) yazıcısında yazdırılan lamel tutucu için, baskıyı yatay olarak konumlandırın.
      NOT: Tasarımın döndürülmesi, hassas parçalar baskı aşamasına yakın yerleştirildiğinde meydana gelebilecek bükülmeyi önleyecektir.
    3. Baskı sırasında kalıbın hassas yönlerinin kırılmamasını sağlamak için dilimleyici yazılımının içine destekler ekleyin. Yazılımdaki orta otomatik destek yerleştirme özelliği, manuel küratörlük ile birlikte, büyük boşluklar olmadan desteklerin iyi bir şekilde yayılmasını sağlar. Katı bir kalıp oluşturmak için %100 dolgu stratejisi kullanılır.
    4. Tüm kalıpları içeren tek bir STL dosyası kullanarak veya dilimleyici yazılımını kullanarak tek tek STL dosyalarını birlikte düzenleyerek birden fazla parçayı aynı anda yazdırın.
  6. Baskı
    NOT: SLA yazıcılar, fizibiliteleri, hassasiyetleri ve pürüzsüz yüzeyler oluşturmaları nedeniyle görüntüleme kalıpları için tercih ettiğimiz 3D yazıcı türüdür. SLA yazıcılardan daha hafif, daha sert baskılar oluşturduğu için lamel tutucuyu yapmak için bir FDM yazıcı kullanılır.
    1. Aşağıdaki baskı ayarlarıyla başlayın ve buradan optimize edin: 0,05 mm katman yüksekliği; 5 alt katman sayısı; 2,5 sn pozlama süresi; 35 sn alt pozlama süresi; 5 mm alt kaldırma ve kaldırma mesafesi; 60 mm/dak alt kaldırma hızı; 80 mm/dak kaldırma hızı; ve 210 mm/dak geri çekme hızı.
      NOT: Yazdırma ayarlarının reçine türüne, oda sıcaklığına ve yazıcının modeline bağlı olduğundan muhtemelen kullanıcı tarafından optimize edilmesi gerekecektir.
  7. Baskıdan sonra kalıpları suda yıkayın, destekleri çıkarın ve reçinenin katılaşmasını sağlamak için kalıpları UV ışığı altında bir doku kültürü başlığına yerleştirin.
    NOT: Kalıpların iyice yıkanması ve kürlenmesi, reçinenin pul pul dökülmesini önlemek ve kalıbın şekilsiz hale gelmesini önlemek için önemlidir.
    Kürlenmemiş reçine cildi tahriş edebileceğinden, kürlenmemiş reçineyi tutarken ve kalıpları temizlerken eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmelidir. SLA yazıcılar, reçineyi sertleştirmek için UV ışığı kullanır, bu da gözler ve cilt için zararlı olabilir. Baskı bölmesinin güvenli bir şekilde kapatıldığından emin olun ve doğrudan UV ışık kaynağına bakmaktan kaçının.

2. Agaroz kuyuları oluşturmak için 3D baskılı kalıpların kullanılması için bir prosedür

  1. Agaroz kuyuları yapmak
    1. E3 ortamında (1.578 mM NaCl, 0.169 mM KCl, 0.249 mM CaCl2*2H2O, 0.161 mM MgSO4*7H2O) %2 (g/mL) agarozu çözerek agaroz kuyuları yapın. Bir lamel alt tabağının ortasına, ok kuyuya doğru bakacak şekilde bir kalıp yerleştirin (bkz. Şekil 2A,B). Görüntüleme kalıbının çevresinin yarısı boyunca 750 μL %2 erimiş agaroz/E3 pipetleyin (bkz. Şekil 2C).
      NOT: Erimiş agaroz viskoz olmamalı, ancak kabarcık oluşturmadan pipetlenecek kadar soğuk olmalıdır. 30 mm lamel alt kuyusu olan 60 mm'lik tabaklar kullanıyoruz, dik mikroskoplar için tasarlanmış kalıplar için ise standart 60 mm'lik bir tabak kullanılabilir. Eleme kalıbı için biraz farklı bir protokol kullanılır (aşağıya bakınız).
    2. Görüntüleme kalıbının çevresinin diğer yarısı boyunca 750 μL %2 erimiş agaroz/E3 daha pipetleyin (bkz. Şekil 2D).
    3. Berrak bir sıvıdan opak mavi jele geçişi gözlemleyerek agarozun katılaşması için 5-7 dakika bekleyin (bkz. Şekil 2E).
    4. Katılaşmış merkezi agarozun çevresine ince bir erimiş agaroz tabakası ekleyin.
      NOT: Kesinlikle gerekli olmasa da, bu adım katılaşmış agarozun tabağa sabitlenmesine ve ortamın neden olduğu ayrılmanın önlenmesine yardımcı olur.
    5. Dış halkayı (Ek Şekil S1B), ok agaroza doğru bakacak şekilde agaroz kalıp tertibatının üzerine yerleştirin (bkz. Şekil 2F).
    6. Dış halkayı nazikçe basılı tutarken, agarozdan ayırmak için iç kalıbı dikkatlice düz bir şekilde yukarı çekin (bkz. Şekil 2G).
      NOT: Agaroz kuyularının kırılmasını veya zarar görmesini önlemek için, dış halkayı çok sert bastırmayın ve yukarı doğru çekerken iç kalıbı bükmeyin veya kaydırmayın.
    7. Lamel alt tabağındaki agaroz kuyularını ortaya çıkaracak şekilde dış halkayı çıkarın (Şekil 2H).
    8. Doğru boyutlandırma ve üretimi doğrulamak için agaroz kuyularını mikroskop altında inceleyin.
      NOT: Ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntüleme için, genellikle kuyunun dibinden ince bir agaroz tabakasının kaldırılması gerekir. Bu forseps ile yapılabilir.
  2. Eleme kalıbını kullanmak için değiştirilmiş protokol
    1. Erimiş %2 agaroz/E3'ü yaklaşık yarısı dolana kadar Petri kabına dökün.
    2. Kalıbı mandallar yukarı bakacak şekilde tutun ve erimiş %2 agaroz/E3'ü mandallar kaplanana kadar (~3 mL) mandalların üzerine pipetleyin.
      NOT: Pipete çekilen erimiş agarozun yalnızca %90'ını serbest bırakarak kabarcıkların oluşmadığından emin olun.
    3. Eğme hareketi kullanarak, erimiş agaroz içeren Petri kabına bir ucunu ve ardından tüm kalıbı mandalları aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Ek Şekil S2).
    4. Agarozun 5-7 dakika katılaşmasına izin verin.
    5. Bir ucunu ve ardından diğer ucunu kaldırmak için sapı kullanarak kalıbı dikkatlice çıkarın.

3. Embriyoların düşük erime sıcaklığına sahip agarozlu ve agaroz olmayan agaroz kuyularına monte edilmesi

  1. Montajdan önce embriyoları 200 μg / mL'lik bir tricaine solüsyonunda dekoryonat ve uyuşturun.
    NOT: Kalbin atmasını durdurmak için ~ 400 μg / mL trikat çözeltisi gereklidir.
    1. Düşük erime sıcaklığındaki agaroz kullanmadan: Görüntüleme kabını 1x E3 ve trikain (200 μg/mL) ile doldurun, görüntüleme kabına dekoryonlu anestezitize embriyolar ekleyin, embriyoları agaroz kuyucuklarına yerleştirmek ve yönlendirmek için forseps kullanın ve ardından görüntü (bkz. Şekil 2I, J).
      NOT: Forseps bir embriyoya kolayca zarar verebileceğinden, bunun yerine 0.41 mm çapında misinanın bir kılcal tüpe veya pipet ucuna yerleştirildiği ve süper yapıştırıcı ile sabitlendiği bir embriyo pokeri kullanılabilir24.
    2. Düşük erime sıcaklığına sahip agaroz kullanarak:
      NOT: Kalıplar embriyoları belirli yönlere yerleştirmek için tasarlanmış olsa da, embriyoları yerinde tutmak için düşük erime sıcaklığına sahip agaroz kullanmak, görüntüleme sırasında veya monte edilmiş embriyolarla görüntüleme çanağını mikroskoba taşırken embriyoların sürüklenmemesini sağlayabilir. Aşağıdaki adımlar önceki protokolümüz6'dan türetilmiştir.
      1. % 0.1-0.8 düşük erime sıcaklığına sahip agarozu 5 mL E3 ortamında çözerek ve bir su banyosunda 65-70 ° C'ye ısıtarak düşük erime sıcaklığına sahip agaroz tüpleri oluşturun. Bazen, düşük erime sıcaklığındaki agaroz çözülene kadar tüpü ters çevirin. Düşük erime sıcaklıktaki agaroz çözeltisini mikrofüj tüplerine alın ve bunları 42 °C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirin. Çözeltinin en az 1 saat boyunca 42 ° C'ye dengelenmesini bekleyin.
        NOT: Genellikle taze yapılmış düşük erime sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisinin kullanılması tavsiye edilir.
      2. Geniş delikli bir cam Pasteur pipeti kullanarak, tek bir embriyoyu düşük erime sıcaklığındaki agaroz solüsyonunu içeren bir tüpe aktarın. Düşük erime sıcaklığındaki agaroz çözeltisine fazla sıvı eklemekten kaçınmak için, sadece embriyoyu ve hemen etrafındaki sıvıyı aktarın. Şu anda düşük erime noktalı agarozda bulunan embriyoyu hemen agaroz kuyularından birine aktarın. Düşük erime sıcaklığına sahip agaroz çözeltisini yeniden kullanım için ısı bloğuna geri koyun.
      3. Forseps veya embriyo pokeri kullanarak (bkz. adım 3.1.1), embriyoyu görüntüleme için kuyuya yerleştirin.
      4. Diğer kuyucuklar için 3.1.2.2-3.1.2.3 adımlarını tekrarlayın. Önceki kuyucuklar kurumaya başlarsa, kuyunun üzerine az miktarda E3 (~50-100 μL) eklemek için bir p200 pipeti kullanın.
  2. Embriyolar tüm kuyucuklara monte edildikten ve düşük erime sıcaklığındaki agaroz katılaştıktan sonra, bir pipet kullanarak tricaine / E3 çözeltisini görüntüleme kabına yavaşça ekleyin.
  3. Görüntülemeden sonra, embriyoları forseps kullanarak kuyucuklardan dikkatlice çıkarın ve görüntülemenin gelişimsel kusurlara neden olmadığından emin olmak için daha fazla gelişmelerine izin verin.
    NOT: Agaroz kuyuları, durulanabilen ve tekrar kullanılabilen görüntüleme kabından çıkarılabilir. Piyasada bulunan cam temizleyici ile ve ardından ddH2O ile birden çok kez durulama, lameller üzerindeki tuz birikintilerinin giderilmesine yardımcı olur. Cam temizleyicinin kalıntı izleri nedeniyle toksisite yaşamamış olsak da, araştırmacının bu sonuçları kendi laboratuvar koşullarını kullanarak doğrulaması tavsiye edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokol, zebra balıklarında kardiyak füzyon, kalp tüpü oluşumu, kardiyak döngü ve oda oluşumu dahil olmak üzere kardiyak gelişimin farklı aşamalarını görüntülemek için kalıplar tasarlamak için kullanıldı. Kardiyak gelişim, embriyonun ana anatomik eksenleri boyunca gerçekleşmediğinden, embriyoları düzgün bir şekilde konumlandırmak için mandalların şekli farklı gelişim aşamaları için özelleştirilmiştir. Örneğin, zebra balığı kalbinin döllenmeden 48 saat sonra (hpf) küresel yumurta sarısına göre ön iç yerleşimi,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, görüntüleme çalışmaları için embriyoların veya dokuların montajını kolaylaştırabilecek agaroz kuyuları oluşturan 3D baskılı kalıpların tasarlanması için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu kalıplar, dik veya ters mikroskoplarla görüntüleme için yapılabilir ve bu özel kalıplar kullanılarak yapılan agaroz kuyuları, sabit embriyoların immünofloresan çalışmalarından canlı embriyoların timelapse görüntülemesine kadar değişen görüntüleme uygulamaları için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bloomekatz laboratuvarı üyelerine, özellikle Sasmitha Singh ve Allison Holmes'a, ayrıca GlyCORE görüntüleme çekirdeğine (P20GM130460 tarafından desteklenir), Mississippi Üniversitesi IDEA laboratuvarına, Dr. Yiwei Han'a ve Han laboratuvarına ve Mississippi Üniversitesi Glikobilim ve Gelişimsel Biyoloji topluluklarının üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH'den sağlanan fonlarla desteklenmektedir (R15HD108782, P20GM130460).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SLA 3D YazıcıElegooMARS 2 PRO
Agarose Apex Biyolojik Araştırma; Genesee Bilimsel 20-102QDHerhangi bir marka
Autodesk Fusion 360, AutodeskInc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ Bilgisayar destekli tasarım (CAD) Yazılımı - daha gelişmiş
Axio-Zoom dik mikroskopZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/Dilimleyici yazılımı
Lamel alt çanak (30 mm alt kuyulu 60 mm çanak)CellvisD60-30-1.5N
F59 Miyozin ağır zincir (tüm hızlı izoformlar)DHSBF591:50 seyreltme
FDM filamentleriBambuPLA filamentler
FDM yazıcıBambuBambu X1 Karbon FDM0.4mm ekstruder nozul
ForsepsFisher16-100-121Diğer markaların uygun olması muhtemeldir
Keçi anti-fare Alexa 488ThermoFisher#A281751:300 seyreltme
ImarisAndor10.2Yazılımı
Ters Konfokal MikroskopLeicaLeica SP8 X
Düşük erime sıcaklığında agarozAltın BiyoteknolojiKatalog No: A-204-25Diğer markaların uygun olması muhtemeldir
Pipet pompasıBel-ArtF37898
SLA yazıcı için reçineElegooElegoo P05BB028Suda yıkanabilir fotopolimer Reçine V2.0
Ricinus communis aglütininin (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (lektin kiti)1:300 seyreltme
TinkerCADAutodesk Inc.  https://www.tinkercad.com/Bilgisayar destekli tasarım (CAD) Yazılımı - temel
Tricaine S Batı Kimya A.Ş.  ANADA #200-226
Buğday tohumu aglütininin (WGA)Vektör laboratuvarları#RLK-2200 (lektin kiti)1:300 seyreltme
Geniş delikli cam Pasteur pipeti Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT
, ile değiştirilebilir.

Kaynaklar

  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B Yazd r lm Kal plarEmbriyo MontajAgaroz KuyucuklarStereolitografik Yazd rmaDik MikroskoplarTers MikroskoplarDoku OryantasyonuYeniden Kullan labilir Kal plar
Video yakında

İlgili makaleler