Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Murin Kan Alımı için Yüz Ven Damar Delme

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68776

⸱

26 Eylül 2025

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Dartmouth Geisel School of Medicine

Bu makalede

Özet

Burada, bir neşter kullanarak yüz ven damar delinmesi yoluyla murin deneklerinde optimize edilmiş bir kan alma tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu tekniği, transgenik, konjenik ve raportör suşların hücresel fenotiplerini karakterize etmek için akış sitometrik değerlendirmenin yanında kullanıyoruz. Ayrıca serum sitokin analizi ve diyabet çalışmaları için de uygundur.

Özet

Bu makale, bir neşter kullanarak yüz ven damar delinmesi yoluyla murin kanı toplanması için optimize edilmiş bir protokol sunmakta ve kuyruk damarı ve retro-orbital örnekleme gibi diğer yaygın tekniklere hızlı, minimal invaziv ve uygun maliyetli bir alternatif sunmaktadır. Bu teknik, fare fenotiplemesi, serum sitokin analizi ve diyabet araştırması gibi tekrarlanan örnekleme gerektiren çalışmalar için özellikle avantajlıdır. Protokol verimlidir, minimum düzeyde özel ekipman gerektirir ve farelerde yüksek verimli hücresel analiz için çok uygundur. Birincil uygulamamız, burada antikor boyama ve tdTomato raportör fareler ile gösterilen akış sitometrisi kullanılarak transgenik, konjenik ve raportör farelerin fenotiplenmesidir. Makale, hayvan hazırlamadan numune analizine kadar tüm prosedürü özetlemektedir. Temel adımlar arasında 3 mm'lik neşterle kan alınması, hücre lizizi, boyama ve akış sitometrik profili oluşturma yer alır. Fasiyal damar damar delinmesi, etik araştırma uygulamalarını desteklerken toplama verimliliğini artırır. Bu pratik ve uyarlanabilir yöntem, murin kan örneklemesi ve hücresel analizi içeren çok çeşitli deneysel protokoller için uygundur.

Giriş

Verimli, tekrarlanabilir ve minimal invaziv kan alımı, özellikle tekrarlanan örnekleme gerektiren birçok fare çalışması için gereklidir. Bu protokol, fasiyal ven damar delinmesi kullanılarak küçük hacimlerde kan toplanması, ardından kırmızı kan hücresi lizizi, antikor boyama ve akış sitometrik analizi için kolaylaştırılmış bir yöntem sağlar. Bu iş akışı, teknik karmaşıklıkları en aza indirirken yüksek verimli uygulamalar için çok uygundur.

Retro-orbital kanama veya kuyruk damarı kesisi gibi birçok kan alma yöntemi, ısı, anestezi1 ve uzun kullanım süreleri içeren prosedürler gerektirebilir ve bu da hayvanda önemli sıkıntıya neden olabilir2. Buna karşılık, neşter ile yüz damar damar delinmesi, etik ve tekrarlanabilir deneysel tasarımı destekleyen basit ve hızlı bir alternatif sunar. Bu yöntem, farelerde küçük hacimli kan örneklemesi için insancıl bir alternatif olarak önceki çalışmalarda doğrulanmıştır3.

Bu yöntemi, TdTomato raportör fareler ve MD4-IgHEL fareler dahil olmak üzere transgenik ve raportör farelerden alınan bağışıklık hücrelerini fenotipleyerek gösteriyoruz. İkincisi, bir IgM allotipi olan CD19 ve IgMa'ya karşı antikorlarla boyama gerektirir.

Bu protokol kan hücresel profili oluşturmak için geliştirilmiş olsa da, kırmızı kan hücresi lizis adımı atlanarak serum sitokin analizi, spesifik antikor tespiti veya glikoz ölçümleri dahil olmak üzere diğer kullanımlar için kolayca uyarlanabilir. Genel olarak, bu teknik veri kalitesini ve deneysel verimliliği artırırken minimum hayvan sıkıntısına neden olur, bu da onu çeşitli araştırma uygulamalarında geniş çapta kullanışlı hale getirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Fareler, AAALAC tarafından akredite edilmiş bir kurum olan Dartmouth Hitchcock Tıp Fakültesi'nde patojen içermeyen belirli bir ortamda barındırıldı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi kapsamında onaylanmış bir protokole uygun olarak kullanıldı.

1. Malzeme toplama

  1. Her biri 1.5 mL 1x Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lizis Tamponu (steril su ile seyreltilmiş 10X RBC Lizis) içeren 5 mL kültür tüpü hazırlayın. Fare başına bir tüp kullanın.
  2. 3 mm'lik bir neşter kutusu toplayın (fare başına bir neşter).
  3. Bir kutu gazlı bez süngeri toplayın (fare başına bir gazlı bez süngeri).
  4. Transfer pipetlerini ve 0,5 mM EDTA'lı (20 fareye kadar yeterli) 1x HBSS içeren 50 mL'lik konik bir tüp toplayın.
    NOT: Bu tampon lizis reaksiyonunu durdurmak için kullanılır. Tampon sadece fenotipleme için gerekliyse ve daha fazla aşağı akış analizi için gerekli değilse, HBSS yerine pH 7.2-7.4 olan çoğu nötr tampon kullanılabilir.
  5. Bir buz kovası, ek 1x RBC lizis tamponu, ekstra 5 mL tüpler ve transfer pipetleri getirin.

2. Fare ve tüp etiketleme

  1. Hangi sonuçların hangi fareyle ilişkili olduğunu ayırt etmeye yardımcı olmak için her kafes kartını ve fareyi her tüpteki etiketlere karşılık gelen bir fenotip tanımlayıcıyla etiketleyin. Yaygın olarak kullanılan tanımlayıcılar, farelerin kuyruklarında, tüp üzerindeki işaretlere karşılık gelen farklı kalıcı işaretleyici renkleri (örneğin, kırmızı, mavi, yeşil, siyah) içerir.
    NOT: Fenotipleme için her zaman bir kontrol faresi ekleyin. Muhabir fareler için, negatif bir muhabir kontrolüne sahip olduğunuzdan emin olun. Transgenik fareler için, kontrol olarak vahşi tip bir fare ekleyin.
  2. Kan alındıktan hemen sonra tüpleri saklamak için etiketli tüpleri yakınlarda bir buz kovası bulunan bir rafa yerleştirin.
  3. İşlem için gereken tüm lansetleri açın.
  4. İşlem için gerekli tüm gazlı bez süngerlerini açın.

3. Fare kullanımı ve numune toplama

  1. Fareyi kuyruğundan tutmak için baskın elinizi kullanın ve bir tel besleme rafına veya herhangi bir düz yüzeye yerleştirin.
  2. Kuyruktan servikal bölgeye doğru manevra yaparak fareyi tırmak için baskın olmayan işaret parmağını ve başparmağı kullanın.
  3. Kuyruğu sabitlemek için kalan parmaklarınızı kullanın ve fare hareketini en aza indirin.
  4. Açılmış 3 mm'lik bir lanseti almak için baskın elinizi kullanın.
  5. Ağzın hemen ötesindeki küçük tüysüz noktayı bulun ve kulağa doğru düz bir çizgi çizin. Çizginin gözün dış köşesiyle kesiştiği yerde durun (Şekil 1).
  6. Bol miktarda kan akışı sağlamak için lanseti bu kesişme noktasına yerleştirin.
  7. Tek bir damla kan toplamak için neşterin düz yan kenarını kullanın.
  8. Tüm neşteri kan örneğiyle birlikte RBC lizis tamponu içeren etiketli tüpe koyun.
  9. Numunenin tamamının tampona karıştığından emin olmak için tüpü yavaşça çalkalayın. Eksik karıştırma pıhtılaşmaya ve düşük veri kalitesine neden olabilir.
  10. Delinme bölgesine 5-10 saniye boyunca hafif bir baskı uygulamak için bir Gazlı Bez süngeri kullanın.
  11. Fareyi kafesine geri koyun.
  12. Kan-lizis tampon oranını 1:10'dan büyük tutun.
  13. Her ek fare için bu bölümdeki adımları tekrarlayın.

4. Numunenin parçalanması, hazırlanması ve analizi

  1. Lizis başladıktan sonra 7-10 dakika bekleyin, 0,5 mM EDTA (veya başka bir ortam) ile yaklaşık 2 mL 1x HBSS ekleyin.
  2. Tüpleri 400 g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bu süre zarfında antikor kokteylleri hazırlayın.
  3. Süpernatanı atın.
  4. Forseps kullanarak neşterleri tüplerden çıkarın.
  5. İstenen hücresel popülasyonları tanımlamak için tasarlanmış 30 μL antikor kokteyli ekleyin.
    NOT: MD4 IgHEL farelerini fenotip olarak kullanmak için kokteylimiz 1 mL HBSS, 25 μL IgMa PerCP cy-5.5 ve 25 μL CD19 APC'den oluşuyordu.
  6. Hücreleri 2-3 saniye vorteksleyerek yeniden süspanse edin ve 4 °C'de 25-30 dakika inkübe edin.
  7. Akış sitometresini açın ve akış grafiklerini deneyin ihtiyaçlarına göre yapılandırın.
    NOT: Amaç fenotipleme ise, boyama sonrası hücreleri döndürmeye gerek yoktur.
  8. Bir transfer pipeti kullanarak her numuneye 150-25 μL HBSS veya başka bir ortam ekleyin. Gerekirse, DAPI 1. μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda eklenebilir (10 μL DAPI içeren ortam kullanın).
  9. Her numuneyi almadan hemen önce 2-3 saniye vorteksleyin.
  10. Lizis etkiliyse 100.000 hücreyi hedefleyerek 8.000-10.000 olay/s veri elde edin.
  11. Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilen elde edilen verileri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Akış sitometrisi kullanılarak, Şekil 2 , yukarıda açıklanan protokol kullanılarak hazırlanan, vahşi tip (WT) ve PF4-Cre TdTomato raportör farelerden alınan parçalanmış kanı göstermektedir. İlk akış grafikleri seti, hücre boyutunu gösteren ileri saçılıma (FSC) karşı hücre tanecikliğini yansıtan yan saçılımı (SSC) gösterir. Hücresel kalıntılar ve trombositler, eksenlerin orijininin yakınında gözlenirken, lenfositler daha granül...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu optimize edilmiş yüz ven kan alma protokolü, kuyruk veni veya retro-orbital kanama gibi yaygın olarak kullanılan diğer yöntemlere etkili ve basit bir alternatif sağlar. Protokol basit ve anlaşılır olsa da, birkaç kritik adımın dikkatle takip edilmesi gerekir. Düzgün bir şekilde yürütmek için en önemli adım, delinme bölgesinin4 doğru yerleştirilmesidir. Yanakta uygun yeri hedeflemek, fareye minimum sıkıntı vererek yeterli kan akışını sağlar. Kan örneğinin derhal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibesi: R35 HL155458 (CVJ) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
APC anti-fare CD19 AntikorBiolegend152410CD19 APC
Santrifüj 5810 R, rotorsuz, 120 V, 50/60 HzEppendorf22625501Santrifüj
Dermacea Gazlı Bez süngerleri 8 katlı 2" x 2"Covidien441211Guaze Ponges
Tek Kullanımlık Dereceli Transfer PipetleriFisherbrand13-711-91amTransfer pipeti
ErgoOne Tek Kanallı Pipet (200 µ L)USA Scientific7100-2200Pipet
Etilenidiamintetraasetik Asit (0,5 M Çözeltisi/pH 8,0)FisherbrandBP2482-100EDTA 5 M   
FACSymphony A3 Hücre AnalizörüBD Biosciences660937Akış Sitometresi
Fisherbrand  Analog Vortex MikserFisherbrand02-215-414Vortex
Altın Kuş Hayvan Lancet 3 mm Steril 5 tepsi 200Altın KayakGR 3MMLancet 3 mm
Graefe pensepsiGüzel Bilim Araçları11051-10Forseps
Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi, kalsiyum ve magnezyum olmadan 1XCorning21-021-CVRHBSS
PerCP/Cyanine5.5 fare karşıtı IgMa  AntikorBiolegend408612IgMa PerCP cy-5.5
RBC Lizis Tamponu (10x)Biolegend420301RBC Lizis Tamponu
Kapapasız Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test TüpleriFisherbrandFB1496110Kültür tüpleri
Sharpie Kalıcı Markerler, Keski UcuSharpie38254PPSharpies 
USP Steril Su  için test edildi;Corning25-055-CIHücre kültürü kalitesinde su
TipOne Pipet Uç Doldurma Yeniden Doldurma Cihazları (200 & mikro; L Doğal Eğimli)USA Scientific1111-1730Pipet uçları

Kaynaklar

  1. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
  2. Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
  3. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  4. Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
  5. Ng, M. S., Ng, A. S., Chan, J., Tung, J. P., Fraser, J. F. Effects of packed red blood cell storage duration on post-transfusion clinical outcomes: a meta-analysis and systematic review. Intensive Care Med. 41 (12), 2087-2097 (2015).
  6. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Exp Hematol. 44 (2), 132-137.e1 (2016).
  7. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  8. Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
  9. Lavin, E. S., Feldman, E. R., Soprano, S. M., Moore, E. S. Venipuncture site influences blood-drop volume in C57BL/6 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 63 (3), 325-332 (2024).
  10. Forbes, N., et al. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab Anim (NY). 39 (8), 236-240 (2010).
  11. Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
  12. Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kan Toplama YöntemiMinimal İnvaziv ÖrneklemeAkış SitometrisiAntikor BoyamaEritrosit LizisiTransgenik FarelerTrombosit AnaliziHücresel Fenotipleme
Murin Kan Alımı için Yüz Ven Damar Delme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.