Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri gibi sentetik biyoloji araçları biyolojik araştırmalara önemli katkılar sağlamıştır. Gen ekspresyonunu ayarlanabilir, geri dönüşümlü ve kesin bir şekilde düzenleme yetenekleri, protein üretiminin^{kontrolünü iyileştirebilir} 1,2,3,4,5,6, hücre morfolojisi 7,8,9,10,11,12, metabolik yollar 13,14,15^,16,17,18 ve biyoimalat ve terapötik uygulamalar için diğer hedefler. Kimyasal olarak indüklenebilir sistemler, artık^19,20 veya hedef dışı etkilere sahip olabilir. Kimyasal katkı maddeleri ayrıca çok pahalı olabilir ve ek aşağı akış saflaştırma işlemleri 21,22,23 nedeniyle endüstriyel olarak ölçeklendirilmesi zor olabilir. Işıkla indüklenebilir gen ekspresyon sistemleri, biyo-üretim uygulamaları ^24,25,26,27 için ölçeklenebilir ve kesin bir yöntem sunabilir.

Işıkla indüklenebilir birçok gen ekspresyon sistemi, çeşitli uygulamalarda 28,29,30,31,32,33,34,35,36 ve mavi 35,37,38, kırmızı/uzak kırmızı ^12,39 dalga boylarında yararlı sentetik biyoloji araçları olarak geliştirilmiştir.⁴⁰ veya yeşil⁴¹ ışık. CRISPR tabanlı optogenetik gen regülasyonu durumunda, iletilen bireysel kılavuz RNA'ların (gRNA'lar) miktarının değiştirilmesi, endojen genlerin⁴² mRNA ekspresyonunu etkileyebilir ve farklı hücre hatları için optimize edilmesi gerekecektir. VP64 ^37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65⁴⁴ gibi transaktivasyon proteinleri veya bunların füzyonları⁴⁷ de optogenetik sistemlerin modülerliğini artırarak kullanılabilir. Karmaşık ve iç içe geçmiş biyolojik yolakları^{araştırmak için} 12,40,48,49,50,51,52,53, bilinen bu bileşenlerin farklı kombinasyonları test edilebilir. Ek olarak, farklı hücre hatları, aynı sistem⁵² ile indüksiyonda farklılıklar gösterebilir. Farklı indüksiyon seviyeleri, gen ekspresyonunun hassas kontrolünde yetersiz gen ekspresyonuna veya duyarlılığa yol açabilir ve yeni veya biyolojik olarak daha ilgili hücre dizilerinde optimal bir optogenetik sistem bulmak için titiz testler gerektirir. Optogenetik gen düzenlemesinin artan hızı ve genişleyen uygulanabilirliği ile bu farklı sistemleri hızlı bir şekilde karakterize etmek zorunludur.

Optogenetik araçları karakterize etmedeki mevcut yöntemler, genlerin^12,54 kararlı veya geçici ekspresyonunu kullanır. Kararlı bir şekilde ifade eden hücre hatları oluşturmak ve maksimum ekspresyon için sistem dinamiklerini optimize etmek zaman alıcı ve dolayısıyla maliyetli olabilir. Geçici ifade, özellikle çok bileşenli optogenetik sistemleri test ederken hızlı ve değerli bilgiler sağlar. Burada, kriptokrom 2 (CRY2) ve kriptokrom etkileşimli temel-sarmal-döngü-sarmal N-terminalinden (CIBN) oluşan mavi ışıkla etkinleştirilen CRISPR-dCas9 efektörü (LACE)³⁷ sistemini kullandık. HEK293T (insan embriyonik böbrek hücreleri)^37,38, CHO-DG44 (Çin hamsteri yumurtalık hücreleri)⁵⁵ ve C2C12 (fare miyoblast hücreleri)³⁸ gibi memeli hücrelerinde gen ekspresyonunu kontrol etmek için kullanılmıştır. Modüler yapısı, geçici ifade ve yüksek verimli yöntemler aracılığıyla sistem performansını hızlı bir şekilde karakterize etmek için idealdir. Örneğin, LACE gibi çok bileşenli sistemler, optogenetik sistem karakterizasyonunda tipik olarak kullanılmayan bir adım olan indüksiyonu iyileştirmek için kütle oranlarının optimizasyonuna ihtiyaç duyabilir.

Bu protokol, iki plazmit LACE (2pLACE)³⁸ sisteminin hızlı optimizasyonunu ve karakterizasyonunu detaylandırır. Bu kurulumda 2pLACE, HEK293T hücrelerde bir floresan raportör olan eGFP'nin (geliştirilmiş yeşil floresan proteini) ekspresyonunu kontrol eder. Aktivasyon, Lukasz Bugaj ve meslektaşları ^56,57,58,59 tarafından tasarlanan ve inşa edilen 3D baskılı bir LED dizisi olan OptoPlate-96 kullanılarak siyah cam tabanlı ⁹⁶ oyuklu plakalarda ^{gerçekleştirilir.} Bu protokol, iki plazmit sisteminin farklı kütle oranları ile maksimum ekspresyonu spesifik olarak optimize eder. Ayrıca, sistemin ayarlanabilirliğini ve tam dinamik aralığını araştırmak için farklı ışık yoğunluklarını kontrol etmek için kullanıcı dostu kod içerir. Akış sitometrisi, veri toplama ve analiz için kullanılır. LED dizisi için plazmit yapıları ve 3D baskı malzemeleri oluşturmaya yönelik protokoller önceki yayınlarda^54,56 bulunabilir. Bu yöntemler, ışıkla indüklenebilir gen ekspresyon sistemlerini karakterize etmek için hızlı, yüksek verimli bir boru hattını vurgulamaktadır.

1. HEK293T hücrelerinin 96 oyuklu formatta kaplanması

1. Bir biyogüvenlik kabininde, bir çamaşır suyu atık kabı, serolojik pipetler, pipet yardımı, Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS), %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco ile modifiye edilmiş Eagle's Medium (DMEM) ve birleşik HEK293T hücrelerine sahip bir T-75 hücre kültürü şişesi toplayın. Ortamı 37 °C'ye ısıtın.
2. Bir T-75 şişesinde, ters çevrilmiş bir mikroskopla birleşmenin yaklaşık %80-%100 birleştiğini kontrol edin.
3. Biyogüvenlik kabininde, kullanılmış ortamı hücre kültürü şişesinden aspire etmek için serolojik bir pipet kullanın. Şişenin yüzeyine veya plastiğine dokunmaktan kaçının. Kullanılmış ortamı ve aspiratörü kir kabına atın.
4. Hücreleri, şişenin bir köşesine aspire ederek ve yüzeyin etrafında hafifçe döndürerek yaklaşık 10 mL DPBS ile nazikçe yıkayın. DPBS'yi şişeden aspire edin ve yıkamayı ve aspiratörü kir kabına atın.
5. Şişenin yüzeyini kaplamak için 1.5 mL %0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. Hücreleri yüzeyden gevşetmek için şişeye hafifçe vurun.
6. Şişeye 8,5 mL taze DMEM ekleyin. Tüm agregalar yukarı ve aşağı aspire edilerek parçalanana kadar hücreleri serolojik bir pipetle yeniden süspanse edin ve karıştırın.
7. 9 mL hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
   1. Şişeye 9 mL taze DMEM ekleyin ve 37 °C ve% 5_CO2'de bir inkübatöre yerleştirin
8. Bir hemositometre kullanarak, hücre konsantrasyonunu hesaplamak için 10 μL asılı hücreyi 10 μL Tripan mavisi boyası ile 1:1 oranında karıştırın. Plakaya tohum atmak için yeterli hücre hazırlamak için bu değeri kullanın.
9. Yüksek performanslı #1.5 siyah 96 oyuklu cam alt plakanın her bir oyuğu için 100 μL'de ~35.000 hücre tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de bir inkübatöre yerleştirin.

2. 2pLACE transfeksiyon optimizasyonu

1. Bir kuyucuk ve %10 fazlalık için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 11 μL ılık serumsuz DMEM (SFM) ayırın.
2. Bir CRY2-eGFP kullanarak: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7: 3, 8:2 ve 9:1'e eşit CIBN-gRNA plazmit kütle oranları, toplam DNA'nın her bir kuyucuğu için SFM'nin alikotlarına 110 ng alikot (Tablo 1).
3. Pozitif bir kontrol olarak, aynı CMV-eGFP plazmit kütlesini SFM'nin farklı alikotlarına ayırın.
4. Her kuyucuk için, transfeksiyon reaktifi seyreltmesi için 11 μL SFM bölün.
5. Transfeksiyon reaktifini, DNA ve transfeksiyon reaktifinin 1:3 kütle (μg) / hacim (μL) oranında hazırlayın.
6. Seyreltilmiş DNA'ya seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ekleyin ve transfeksiyon komplekslerini oluşturmak için oda sıcaklığında 12 dakika inkübe edin.
7. Her kuyucuğa ~20 μL transfeksiyon kompleksi ekleyin. Kuyu duvarlarına temas etmemesine dikkat edin.
8. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve 24 saat boyunca 37 °C ve% 5_CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.

3. 2pLACE aktivasyonu

1. Bu ayarları kullanarak istenen kuyucukları aydınlatmak için mikrodenetleyici giriş kodunu değiştirin (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 147 - 158).
   1. LED Yoğunluğu: 9,27 mW/^cm2 (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 200 - 215).
   2. Darbe Uzunluğu: 1 s (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 280 - 290).
   3. Darbe Frekansı: 0,067 Hz (her 15 saniyede bir) (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 264 - 278).
      NOT: Dalga boyu ayarları, takılan LED türlerine göre belirlenir.
2. OptoPlate'in 3D baskılı kapağına %70 etanol püskürtün ve bir biyogüvenlik kabininde kurumaya bırakın.
3. Karanlık oda kırmızı ışık lambasını açın ve 96 oyuklu plakayı bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve kapağı kurutulmuş 3D baskılı kapakla değiştirin.
   NOT: Transfeksiyon verimliliğini tahmin etmek için isteğe bağlı olarak floresan mikroskobu kullanılarak CMV-eGFP hücreleri görüntülenebilir.
4. 96 oyuklu plakayı alın ve LED dizisi aparatını oluşturmak için LED dizisinin üzerine yerleştirin. Plakanın yerine oturduğundan emin olun.
5. Mikrodenetleyiciyi, LED'i ve fan bağlantı noktalarını bir güç kaynağına bağlayın.
6. Kabloları dikkatlice %70 etanol ile püskürtün ve kurulayın.
7. LED dizisi aparatını 37 °C ve% 5_CO2'de 24 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. LED'lerin amaçlandığı gibi yandığından ve inkübatör kapatıldığında kabloların gergin olmadığından emin olun.

4. Akış sitometrisi hazırlığı

1. Kırmızı ışıklı bir ortamdayken, OptoPlate'i çıkarın ve plakayı bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin
   NOT: Işık indüksiyonunu görsel olarak doğrulamak için isteğe bağlı olarak hücreler floresan mikroskobu ile görüntülenebilir.
2. Her kuyudan tüm ortamı dikkatlice aspire edin.
3. Hücreleri 30 μL %0.05 Tripsin-EDTA kullanarak ayırın ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
4. Her bir kuyucuğu tek hücreli olana kadar 100 μL soğuk FACS tamponu (PBS'de %1 FBS) ile karıştırın.
5. Her numuneyi V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
6. V-tabanlı 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 164 x g'da santrifüjleyin.
7. Peleti bozmadan 80 μL süpernatant aspire edin.
8. Peleti yeniden süspanse etmek için 200 μL soğuk FACS tamponu ekleyin.
9. Işık yalıtımı için V tabanlı 96 oyuklu plakayı alüminyum folyoya sarın.
10. Plakayı taşıma için buzlu bir strafor kutuya yerleştirin.

5. Akış sitometrisi geçitleme ve veri toplama

1. Arkadaki anahtarı kullanarak akış sitometresini açın ve bilgisayardaki ilgili akış sitometrisi yazılımını açın.
2. Sistem başlatma programını çalıştırın ve numune yükleyiciye 2 mL DI su yükleyin (Ek Şekil 1A).
3. Sağlanan QC boncuklarını kullanarak kalite kontrolünü (QC) çalıştırın (Ek Şekil 1B).
4. Akış sitometresinin plaka örnekleme modunda olduğundan emin olun (Ek Şekil 1C).
5. Numune kuyularını kurun ve belirtin (Ek Şekil 1D).
6. Aşağıdaki dağılım grafiklerini ve tablolarını oluşturun (Ek Şekil 2A).
   1. Yan Dağılım (SSC-A) ve İleri Dağılım (FSC-A).
   2. SSC-H'ye karşı SSC-A.
   3. SSC-A'ya karşı FITC-A.
   4. FITC-A istatistik tablosu (Ek Şekil 2B).
7. V-alt plakayı sitometrenin plaka yükleyicisine oturtun.
8. Transfekte edilmemiş bir kuyu seçin ve Başlat'a tıklayın ve ardından Çalıştır'a tıklayın.
9. İlgilenilen popülasyonu SSC-A ve FSC-A grafiğinde ortalamak için SSC ve FITC voltajlarını ayarlayın (Ek Şekil 2C).
   1. İlgilenilen sağlıklı hücre popülasyonunu geçmek için bir çokgen oluşturun (Ek Şekil 2D).
   2. SSC-H ve SSC-A grafiğinde ikili ayrım için geçit oluşturmak üzere bir çokgen oluşturun.
   3. Transfekte edilmemiş hücreleri SSC-A ve FITC-A grafiğinin soluna doğru yerleştirmek için FITC voltajını ayarlayın (Ek Şekil 2D).
10. Kalan transfekte edilmemiş kuyucuklar için tekrarlayın ve Ortalama FITC-A verilerini kaydedin.
11. İyi transfekte edilmiş bir CMV-eGFP seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
12. SSC-A ve FITC-A grafiğinde hem otofloresan hem de floresan hücreleri yakalamak için FITC voltajını ayarlayın.
    1. Transfekte edilmemiş hücrelerde ilk kapıya atıfta bulunurken, floresan hücreleri floresan olmayan hücrelere karşı geçmek için bir çokgen oluşturun (Ek Şekil 2E).
13. Numuneleri 200 saniyeye ulaşılana ve/veya olaylar 10.000'e ulaşana kadar 60 μL/dk'da otomatik olarak kaydedin (Ek Şekil 2F).
14. Ortalama FITC'yi CSV dosyası olarak dışa aktarın ve verileri analiz edin.
15. Akış sitometrisini Günlük Temizlik seçeneğiyle temizleyin (Ek Şekil 2G).

6. LED yoğunluğu optimizasyonu

1. İstenen LED yoğunluklarını test etmek için mikro denetleyici komut dosyasını düzenleyin (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 200-215).
   NOT: Mikrodenetleyici komut dosyasındaki değerlere göre eşdeğer LED yoğunlukları başka bir yerde^{rapor edilmiştir 38}. Farklı LED'ler kullanıldığında kendi kendine kalibrasyon gerekli olabilir.
2. Komut dosyasının Tablo 1'de tasarlandığı gibi (Ek Kodlama Dosyası 200, Satır 215-2) içinde aşağıdaki değerleri içerdiğinden emin olun ve kodu mikro denetleyiciye yükleyin.
3. 1-5 arasındaki adımları tekrarlayın.

Önceki literatür 37,38,55'ten iş akışı öğelerini benimseyerek, OptoPlate-96'dan yüksek verimli eşzamanlı aydınlatma ekledik ve memeli hücrelerinde ışıkla indüklenebilir bir gen ekspresyon sistemini hızla optimize etmek için bir boru hattı gösterdik (Şekil 1).

İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri için, yüksek dinamik aralıklar, mutlak açık ve kapalı (sızdıran) ekspresyona ek olarak kritik bir performans belirtecidir. Transfekte edilmiş hücrelerin floresan görüntülemesi ile, ışıkla aktive olan hücreler ile karanlıkta tutulan hücreler arasındaki eGFP ekspresyonundaki fark kalitatif olarak gözlemlenebilir (Şekil 2). 1:9'luk bir oran, 5:5'lik bir orana kıyasla gözle görülür şekilde daha az maksimum eGFP ekspresyonu ile sonuçlanır. Ayrıca 5:5 oranında sızdırmazlığın arttığı da gözlemlenebilir. Yapısal olarak eksprese eden bir eGFP (CMV-eGFP) transfekte edilmiş hücrelerin ve transfekte edilmemiş hücrelerin floresan görüntülemesi, sırasıyla transfeksiyon verimliliğini ve sistemin indüklenmiş ve sızdıran ekspresyonunu bağlamsallaştırmak için değerli pozitif ve negatif kontrollerdir. Floresan görüntülemenin kullanılması, kullanıcıların mavi ışıkla gen ekspresyonunun başarılı transfeksiyonunu ve aktivasyonunu hızlı bir şekilde görmesine ve doğrulamasına olanak tanıyarak akış sitometrisinden önce değerli bir kontrol noktası sağlar. Akış sitometrisi daha sonra ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) ve dinamik aralığı ölçmek için kullanılabilir.

Hücreler ışıkla aktive edildikten sonra FACS tamponu ile hazırlanır ve akış sitometrisi ile analiz edilir. HEK293T hücreler yaklaşık 11-15 μm'dir, bu da sağlıklı hücre popülasyonlarını merkezlemek için 500'lük bir FSC kazancı ve 125'lik bir SSC kazancı (Ek Şekil 2C) ile sonuçlanır. Daha yüksek voltajlar, sağlıklı hücre popülasyonları yerine kalıntıların analizine neden olur. Çalışmalarımız sürekli olarak ilk popülasyon kapısındaki (P1) olayların ~%60'ından fazlasına sahiptir (Şekil 3A-D). Sağlıklı hücre popülasyonları, SSC-A ve FSC-A grafiğindeki olayların çoğunu oluşturduğunda, popülasyonun çoğunluğunu belirlemek için olayların yoğunluğu da kontrol edilebilir (Ek Şekil 3A). Daha sonra, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar için çok önemli olan SSC-H ve SSC-A grafiği aracılığıyla ikili ayrım yapılabilir60,61. Bu sistemde, genellikle P1'de kapılı olayların %95'inden fazlasının tekli olduğunu bulduk (Şekil 3A-D). SSC-A ve FITC-A grafiğinde, transfekte edilmemiş hücreler genellikle grafiğin merkezinin soluna doğru olacak ve %<0.1'lik bir popülasyona sahip olacak şekilde kapılanacaktır (Şekil 3A). Daha sonra, eGFP-pozitif hücreler, transfekte edilmemiş numunede boş olan kapıyı dolduracak ve MFI'nin tek hücreli analiz ölçümleri ile sonuçlanacaktır (Şekil 3B). Uygun kapıları ve voltajları ayarlamak için negatif ve pozitif kontroller toplandıktan sonra, otofloresan hücreleri güvenilir bir şekilde dışlamak için 2pLACE'li numuneler aynı kapılar kullanılarak analiz edilebilir (Şekil 3C, D). Burada, eGFP-pozitif hücreler için popülasyon yüzdesi, CMV-eGFP için ~%99 ve 2pLACE ile transfekte edilmiş hücreler için ~%57 idi. Yüksek floresan hücrelerin yakalanmasını sağlamak için PE-A kanalında son bir kapı da kullanılabilir (Ek Şekil 3B).

Test etmek için seçilen bir diğer oran ise 3:7 idi. Bir doğrulama adımı olarak, akış sitometrisinden önce floresan mikroskobu görüntüleri alındı ve CMV-eGFP'den beklendiği gibi daha az olan 2pLACE ile eGFP ekspresyonunun indüksiyonu için başarılı transfeksiyon gözlemlendi (Şekil 4A). 2pLACE'nin akış sitometrisi verileri toplandıktan sonra, mavi ışıkla aktive olan gen ekspresyonu, sızdıran gen ekspresyonu ile karşılaştırılabilir (Şekil 4B). Adım 3.1'de listelenen ayarları kullanarak, mavi ışık aktivasyonunu takiben, mikroskopi ile niteliksel olarak görülen artan floresan sinyaliyle eşleşen ifadede ~3 katlık bir artış gözlemleyebildik. Ek olarak, transfeksiyon verimlilikleri, sağlıklı tek hücrelerin ~%60'ında eGFP-pozitif popülasyon yüzdesi veya ebeveyn yüzdesi ölçülerek dolaylı olarak görülebilir (Şekil 4C).

Bu protokolün bütünüyle uygulanması, maksimum dinamik aralık ve ayarlanabilir ifade için optimal kütle oranlarını (Şekil 5A) ve ışık yoğunluklarını (Şekil 5B) tanımlayabilir. 6:4'ten düşük kütle oranları daha geniş dinamik aralık (3.5-4.5) sergilerken, 6:4'ün üzerindeki kütle oranları, artan arka plan ve azalan maksimum eGFP ekspresyonu nedeniyle azalmış dinamik aralık gösterdi. Hem maksimum ifade hem de yüksek dinamik aralık için 3:7 oranı tercih edilir. 3:7'nin altındaki oranlar benzer kat indüksiyonları gösterdi ancak genel olarak daha az maksimal ifadeye sahipti. Daha önce kalibre edilmiş ışık yoğunluğu değerlerimizi38 (Tablo 2) kullanarak, farklı ışık yoğunluklarına göre gen ekspresyon seviyesi karakterize edilebilir. Işık yoğunlukları ayrıca, MFI'nin ~3 mW/cm2'de doyduğu eGFP'nin ekspresyon seviyelerini de kontrol etti. Bunun ötesindeki ışık yoğunlukları, muhtemelen ~9 ve 11 mW/cm2'de görüldüğü gibi bazı numunelerde ışıkla ağartma nedeniyle değişen MFI değerlerine sahip olabilir.

Şekil 1: Optogenetik sistemleri test eden yüksek verimli deneylerin genel boru hattı. Hücreler, 24 saat boyunca 96 oyuklu siyah bir plakaya ekilir. Daha sonra hücreler, 12 dakikalık bir DNA inkübasyon süresi ve transfeksiyon reaktifi ile transfekte edilir. Transfeksiyondan 24 saat sonra plaka, mavi ışık aktivasyonu için OptoPlate-96 üzerine yerleştirilir. İstenilen mavi ışık aktivasyonu süresinden sonra, hücreler akış sitometrisi için kırmızı ışık ortamında hazırlanır. Akış sitometrisi verileri, karanlıkta veya mavi ışıkla muamele edilmiş eGFP-pozitif hücrelerin ortalama floresan yoğunluk grafikleri olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: HEK293T hücrelerde açık ve kapalı durumda 2pLACE'nin temsili floresan mikroskobu görüntüleri. CRY2-eGFP'nin farklı kütle oranları: CIBN-gRNA, eGFP ekspresyonu seviyeleri için test edildi. Hücreler mavi ışığa (AÇIK) maruz bırakıldı veya 24 saat boyunca karanlıkta (KAPALI) tutuldu. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Transfekte edilmemiş (UT), CMV-eGFP ve 2pLACE HEK293T hücrelerinin temsili akış sitometrisi dağılım grafikleri. Akış sitometrisi, plaka yükleyici işlevi kullanılarak gerçekleştirildi. (A) HEK293T hücreler, ileri saçılma (FSC-A) ve yan saçılma (SSC-A) temelinde kapılıydı. SSC-A ve FSC-A grafikleri üzerindeki olayların konsantrasyonu, sağlıklı popülasyonların geçitlenmesine yardımcı olmak için bir kontur grafiği (Ek Şekil 3A) kullanılarak görselleştirilebilir. Doğrusal bir kapı kullanılarak bir SSC-H ve SSC-A grafiğinde ikili ayrım yapıldı. Son grafik, transfekte edilmemiş numuneye atıfta bulunarak floresan hücreleri kapıladı. (B) Hücreler, istatistik tablosunda floresan popülasyonunu ve floresan yoğunluğunu gösteren (A)'daki gibi kapılıydı (Ek Şekil 2B). (C,D) 2pLACE ile transfekte edilmiş hücreler, P3 kapısından ayrı ayrı kapılandı. Macenta popülasyonu, tüm eGFP-pozitif hücreleri temsil eder (Ek Şekil 3B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HEK293T hücrelerde ışık kaynaklı eGFP ekspresyonunun kalitatif ve kantitatif analizi. (A) 2pLACE veya CMV-eGFP plazmitleri ile transfekte edilmiş HEK293T hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüleri. (B) Mavi ışık veya karanlık koşullar altında tutulan hücrelerde eGFP'nin ortalama floresan yoğunluğunun (MFI) ölçülmesi. (C) Akış sitometrisi geçit analizi ile ölçülen eGFP-pozitif hücrelerin yüzdesi. Geçitleme, transfekte edilmemiş hücrelerin %<0.1'inin eGFP-pozitif eşiğine düşmesiyle sonuçlandı. Akış sitometrisi verileri ortalama değerleri temsil eder ve hata çubukları dört teknik kopyadan standart sapmaları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 2pLACE ve mavi ışık yoğunluklarının temsili kütle oranlarının akış sitometrisi. (A) CRY2-eGFP'nin çeşitli kütle oranları: CIBN-gRNA, daha sonra mavi ışığa maruz bırakılan veya protokolün 3. adımında bildirilenlerle aynı ayarlar kullanılarak karanlıkta tutulan HEK293T hücrelerine transfekte edildi. Her koşul, 3 biyolojik kopyanın ortalamasıdır. (B) Mavi ışık yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak gen ekspresyonunun temsili eğilimi. Her koşul, 6 teknik kopyanın ortalamasıdır. Ortalama floresan yoğunlukları, eGFP eksprese eden hücrelerin akış sitometresi geçitlemesi yoluyla ölçülür. Tüm hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Plazmit oranları için, MFI istatistiksel anlamlılığı, bir plazmit oranının aydınlık ve koyuluğunu karşılaştıran tek yönlü bir t-testi kullanılarak hesaplandı. Işık yoğunlukları için, karanlık (KAPALI) duruma kıyasla tek yönlü ANOVA ve Tamhane'nin T2 post-hoc testi ile istatistiksel anlamlılık hesaplandı. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p <0.0001, *****p < 0.00001 ve ns anlamlı değildir. Bu rakam Garimella ve ark.'dan38 uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Örnek konsantrasyonlar kullanılarak kuyu başına CRY2-eGFP ve CIBN-gRNA plazmitlerinin miktarı. Hacim miktarları kuyu başınadır ve bir deneydeki numune veya kopya sayısına göre değiştirilebilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Mavi ışık yoğunlukları için önerilen değerler. Kod, Ek Kodlama Dosyası 1'de (Satır 215-228) bulunur. Eşdeğer yoğunluk değerleri, daha önce bir optik güç ölçer kullanılarak bildirilen kalibrasyon verileri kullanılarak hesaplanır. Her yoğunluk seviyesinin 6 teknik kopyası vardır. G ve H sıralarının CMV-eGFP ve transfekte edilmemiş kontrol kuyuları için olması amaçlanmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Protokolün 5.1-5.5 Adımları. (A) Sistem başlatma programını çalıştırma. (B) Florofor boncukları kullanılarak kalite kontrol standardizasyonu. (C) Tüp örneklemesinden plaka yükleyici moduna geçiş. (D) Örnek kuyular olarak etiketlenecek kuyuların seçimi; Bu örnek için 35 kuyu seçilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Protokolün 5.6-5.14 Adımları. (A) Işık saçılım grafiklerinin ayarlanması: Sağlıklı hücre popülasyonu geçişi için FSC-A'ya karşı SSC-A, ikili ayrım için SSC-A'ya karşı SSC-H ve otofloresan ve eGFP-pozitif hücrelerin geçitlenmesi için SSC-A'ya karşı FITC-A. (B) Ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için FITC-A verilerini elde etmek için istatistik tablosunun kurulması. (C) Görüntülenecek Olaylar sekmesinde durdurma kurallarının vurgulanması. Yavaş bir numune akış hızı sağlayın, plakayı çıkarın ve yükleyin, akış sitometresi probunu başlatın ve alım voltajlarını ayarlayın. (D) Gösterildiği gibi her popülasyonu geçmek için çokgenler oluşturmak. (E) Uygun sayıda kuyu eklemek. (F) Ayarlar ve kapılar tamamlandıktan sonra Otomatik kaydet'e tıklamak. (G) Tüm numuneler toplandıktan ve istatistikler dışa aktarıldıktan sonra Günlük Temizlik'e tıklamak. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: P4'teki (macenta) yeşil olaylarla görselleştirilen, yakalanan kapı içindeki tüm hücrelerin doğrulanması. (A) eGFP-pozitif popülasyon kapısı (P3) içindeki sağlıklı popülasyonun kontur grafiği. Hücreler esas olarak kırmızı bölgelerde yoğunlaşır ve dışa doğru azalır. (B) P4'ün geçitlenmesi için SSC-A'ya karşı PE-A grafiği, tüm floresan olaylarının FITC-A grafiğinde hesaba katıldığından emin olmak için ek bir kontrol sağlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 1: Yukarıdaki protokolde açıklanan tüm özellikleri uygulayan örnek Arduino kodu. Bu dosya, Tablo 2'de önerilen LED yoğunluk değerlerini kullanarak tüm LED konumlarını etkinleştirir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.