Yöntem makalesi

Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 Kasım 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu optimize etmek için 3D baskılı bir LED dizisi kullanan yüksek verimli deneyler için bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenebilir gen ekspresyon araçları, insan sağlığı ve biyoteknolojide yeni uygulamalar açabilir, ancak mevcut seçenekler genellikle pahalıdır, tersine çevrilmesi zordur ve istenmeyen hedef dışı etkilere sahiptir. Optogenetik sistemler, düzenleyicilerin aktivitesini kontrol etmek için ışığa duyarlı proteinler kullanır, böylece ekspresyon "bir anahtarın çevrilmesi" ile kontrol edilir. Bu çalışma, memeli gen ekspresyonunun ayarlanabilir, tersine çevrilebilir ve hassas kontrolünü sağlayan basitleştirilmiş bir ışıkla etkinleştirilen CRISPR efektörü (2pLACE) sistemini optimize eder. OptoPlate-96, tek hücre analizi ve 2pLACE'in hızlı optimizasyonu için akış sitometrisi yoluyla yüksek verimli tarama sağlar. Bu çalışma, dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için en uygun bileşen oranlarını belirlemek ve mavi ışık yoğunluğu yanıt eğrisini bulmak için 2pLACE sisteminin HEK293T hücrelerde OptoPlate-96 ile nasıl kullanılacağını göstermektedir. Diğer memeli hücreleri ve diğer optogenetik sistemler ve ışığın dalga boyları için benzer iş akışları geliştirilebilir. Bu gelişmeler, biyoüretim uygulamalarına yönelik optogenetik araçların hassasiyetini, ölçeklenebilirliğini ve uyarlanabilirliğini artırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri gibi sentetik biyoloji araçları biyolojik araştırmalara önemli katkılar sağlamıştır. Gen ekspresyonunu ayarlanabilir, geri dönüşümlü ve kesin bir şekilde düzenleme yetenekleri, protein üretimininkontrolünü iyileştirebilir 1,2,3,4,5,6, hücre morfolojisi 7,8,9,10,11,12, metabolik yollar 13,14,15,16,17,18 ve biyoimalat ve terapötik uygulamalar için diğer hedefler. Kimyasal olarak indüklenebilir sistemler, artık19,20 veya hedef dışı etkilere sahip olabilir. Kimyasal katkı maddeleri ayrıca çok pahalı olabilir ve ek aşağı akış saflaştırma işlemleri 21,22,23 nedeniyle endüstriyel olarak ölçeklendirilmesi zor olabilir. Işıkla indüklenebilir gen ekspresyon sistemleri, biyo-üretim uygulamaları 24,25,26,27 için ölçeklenebilir ve kesin bir yöntem sunabilir.

Işıkla indüklenebilir birçok gen ekspresyon sistemi, çeşitli uygulamalarda 28,29,30,31,32,33,34,35,36 ve mavi 35,37,38, kırmızı/uzak kırmızı 12,39 dalga boylarında yararlı sentetik biyoloji araçları olarak geliştirilmiştir.40 veya yeşil41 ışık. CRISPR tabanlı optogenetik gen regülasyonu durumunda, iletilen bireysel kılavuz RNA'ların (gRNA'lar) miktarının değiştirilmesi, endojen genlerin42 mRNA ekspresyonunu etkileyebilir ve farklı hücre hatları için optimize edilmesi gerekecektir. VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544 gibi transaktivasyon proteinleri veya bunların füzyonları47 de optogenetik sistemlerin modülerliğini artırarak kullanılabilir. Karmaşık ve iç içe geçmiş biyolojik yolaklarıaraştırmak için 12,40,48,49,50,51,52,53, bilinen bu bileşenlerin farklı kombinasyonları test edilebilir. Ek olarak, farklı hücre hatları, aynı sistem52 ile indüksiyonda farklılıklar gösterebilir. Farklı indüksiyon seviyeleri, gen ekspresyonunun hassas kontrolünde yetersiz gen ekspresyonuna veya duyarlılığa yol açabilir ve yeni veya biyolojik olarak daha ilgili hücre dizilerinde optimal bir optogenetik sistem bulmak için titiz testler gerektirir. Optogenetik gen düzenlemesinin artan hızı ve genişleyen uygulanabilirliği ile bu farklı sistemleri hızlı bir şekilde karakterize etmek zorunludur.

Optogenetik araçları karakterize etmedeki mevcut yöntemler, genlerin12,54 kararlı veya geçici ekspresyonunu kullanır. Kararlı bir şekilde ifade eden hücre hatları oluşturmak ve maksimum ekspresyon için sistem dinamiklerini optimize etmek zaman alıcı ve dolayısıyla maliyetli olabilir. Geçici ifade, özellikle çok bileşenli optogenetik sistemleri test ederken hızlı ve değerli bilgiler sağlar. Burada, kriptokrom 2 (CRY2) ve kriptokrom etkileşimli temel-sarmal-döngü-sarmal N-terminalinden (CIBN) oluşan mavi ışıkla etkinleştirilen CRISPR-dCas9 efektörü (LACE)37 sistemini kullandık. HEK293T (insan embriyonik böbrek hücreleri)37,38, CHO-DG44 (Çin hamsteri yumurtalık hücreleri)55 ve C2C12 (fare miyoblast hücreleri)38 gibi memeli hücrelerinde gen ekspresyonunu kontrol etmek için kullanılmıştır. Modüler yapısı, geçici ifade ve yüksek verimli yöntemler aracılığıyla sistem performansını hızlı bir şekilde karakterize etmek için idealdir. Örneğin, LACE gibi çok bileşenli sistemler, optogenetik sistem karakterizasyonunda tipik olarak kullanılmayan bir adım olan indüksiyonu iyileştirmek için kütle oranlarının optimizasyonuna ihtiyaç duyabilir.

Bu protokol, iki plazmit LACE (2pLACE)38 sisteminin hızlı optimizasyonunu ve karakterizasyonunu detaylandırır. Bu kurulumda 2pLACE, HEK293T hücrelerde bir floresan raportör olan eGFP'nin (geliştirilmiş yeşil floresan proteini) ekspresyonunu kontrol eder. Aktivasyon, Lukasz Bugaj ve meslektaşları 56,57,58,59 tarafından tasarlanan ve inşa edilen 3D baskılı bir LED dizisi olan OptoPlate-96 kullanılarak siyah cam tabanlı 96 oyuklu plakalarda gerçekleştirilir. Bu protokol, iki plazmit sisteminin farklı kütle oranları ile maksimum ekspresyonu spesifik olarak optimize eder. Ayrıca, sistemin ayarlanabilirliğini ve tam dinamik aralığını araştırmak için farklı ışık yoğunluklarını kontrol etmek için kullanıcı dostu kod içerir. Akış sitometrisi, veri toplama ve analiz için kullanılır. LED dizisi için plazmit yapıları ve 3D baskı malzemeleri oluşturmaya yönelik protokoller önceki yayınlarda54,56 bulunabilir. Bu yöntemler, ışıkla indüklenebilir gen ekspresyon sistemlerini karakterize etmek için hızlı, yüksek verimli bir boru hattını vurgulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HEK293T hücrelerinin 96 oyuklu formatta kaplanması

  1. Bir biyogüvenlik kabininde, bir çamaşır suyu atık kabı, serolojik pipetler, pipet yardımı, Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS), %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco ile modifiye edilmiş Eagle's Medium (DMEM) ve birleşik HEK293T hücrelerine sahip bir T-75 hücre kültürü şişesi toplayın. Ortamı 37 °C'ye ısıtın.
  2. Bir T-75 şişesinde, ters çevrilmiş bir mikroskopla birleşmenin yaklaşık %80-%100 birleştiğini kontrol edin.
  3. Biyogüvenlik kabininde, kullanılmış ortamı hücre kültürü şişesinden aspire etmek için serolojik bir pipet kullanın. Şişenin yüzeyine veya plastiğine dokunmaktan kaçının. Kullanılmış ortamı ve aspiratörü kir kabına atın.
  4. Hücreleri, şişenin bir köşesine aspire ederek ve yüzeyin etrafında hafifçe döndürerek yaklaşık 10 mL DPBS ile nazikçe yıkayın. DPBS'yi şişeden aspire edin ve yıkamayı ve aspiratörü kir kabına atın.
  5. Şişenin yüzeyini kaplamak için 1.5 mL %0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. Hücreleri yüzeyden gevşetmek için şişeye hafifçe vurun.
  6. Şişeye 8,5 mL taze DMEM ekleyin. Tüm agregalar yukarı ve aşağı aspire edilerek parçalanana kadar hücreleri serolojik bir pipetle yeniden süspanse edin ve karıştırın.
  7. 9 mL hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
    1. Şişeye 9 mL taze DMEM ekleyin ve 37 °C ve% 5CO2'de bir inkübatöre yerleştirin
  8. Bir hemositometre kullanarak, hücre konsantrasyonunu hesaplamak için 10 μL asılı hücreyi 10 μL Tripan mavisi boyası ile 1:1 oranında karıştırın. Plakaya tohum atmak için yeterli hücre hazırlamak için bu değeri kullanın.
  9. Yüksek performanslı #1.5 siyah 96 oyuklu cam alt plakanın her bir oyuğu için 100 μL'de ~35.000 hücre tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.

2. 2pLACE transfeksiyon optimizasyonu

  1. Bir kuyucuk ve %10 fazlalık için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 11 μL ılık serumsuz DMEM (SFM) ayırın.
  2. Bir CRY2-eGFP kullanarak: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7: 3, 8:2 ve 9:1'e eşit CIBN-gRNA plazmit kütle oranları, toplam DNA'nın her bir kuyucuğu için SFM'nin alikotlarına 110 ng alikot (Tablo 1).
  3. Pozitif bir kontrol olarak, aynı CMV-eGFP plazmit kütlesini SFM'nin farklı alikotlarına ayırın.
  4. Her kuyucuk için, transfeksiyon reaktifi seyreltmesi için 11 μL SFM bölün.
  5. Transfeksiyon reaktifini, DNA ve transfeksiyon reaktifinin 1:3 kütle (μg) / hacim (μL) oranında hazırlayın.
  6. Seyreltilmiş DNA'ya seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ekleyin ve transfeksiyon komplekslerini oluşturmak için oda sıcaklığında 12 dakika inkübe edin.
  7. Her kuyucuğa ~20 μL transfeksiyon kompleksi ekleyin. Kuyu duvarlarına temas etmemesine dikkat edin.
  8. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve 24 saat boyunca 37 °C ve% 5CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.

3. 2pLACE aktivasyonu

  1. Bu ayarları kullanarak istenen kuyucukları aydınlatmak için mikrodenetleyici giriş kodunu değiştirin (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 147 - 158).
    1. LED Yoğunluğu: 9,27 mW/cm2 (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 200 - 215).
    2. Darbe Uzunluğu: 1 s (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 280 - 290).
    3. Darbe Frekansı: 0,067 Hz (her 15 saniyede bir) (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 264 - 278).
      NOT: Dalga boyu ayarları, takılan LED türlerine göre belirlenir.
  2. OptoPlate'in 3D baskılı kapağına %70 etanol püskürtün ve bir biyogüvenlik kabininde kurumaya bırakın.
  3. Karanlık oda kırmızı ışık lambasını açın ve 96 oyuklu plakayı bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve kapağı kurutulmuş 3D baskılı kapakla değiştirin.
    NOT: Transfeksiyon verimliliğini tahmin etmek için isteğe bağlı olarak floresan mikroskobu kullanılarak CMV-eGFP hücreleri görüntülenebilir.
  4. 96 oyuklu plakayı alın ve LED dizisi aparatını oluşturmak için LED dizisinin üzerine yerleştirin. Plakanın yerine oturduğundan emin olun.
  5. Mikrodenetleyiciyi, LED'i ve fan bağlantı noktalarını bir güç kaynağına bağlayın.
  6. Kabloları dikkatlice %70 etanol ile püskürtün ve kurulayın.
  7. LED dizisi aparatını 37 °C ve% 5CO2'de 24 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. LED'lerin amaçlandığı gibi yandığından ve inkübatör kapatıldığında kabloların gergin olmadığından emin olun.

4. Akış sitometrisi hazırlığı

  1. Kırmızı ışıklı bir ortamdayken, OptoPlate'i çıkarın ve plakayı bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin
    NOT: Işık indüksiyonunu görsel olarak doğrulamak için isteğe bağlı olarak hücreler floresan mikroskobu ile görüntülenebilir.
  2. Her kuyudan tüm ortamı dikkatlice aspire edin.
  3. Hücreleri 30 μL %0.05 Tripsin-EDTA kullanarak ayırın ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
  4. Her bir kuyucuğu tek hücreli olana kadar 100 μL soğuk FACS tamponu (PBS'de %1 FBS) ile karıştırın.
  5. Her numuneyi V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
  6. V-tabanlı 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 164 x g'da santrifüjleyin.
  7. Peleti bozmadan 80 μL süpernatant aspire edin.
  8. Peleti yeniden süspanse etmek için 200 μL soğuk FACS tamponu ekleyin.
  9. Işık yalıtımı için V tabanlı 96 oyuklu plakayı alüminyum folyoya sarın.
  10. Plakayı taşıma için buzlu bir strafor kutuya yerleştirin.

5. Akış sitometrisi geçitleme ve veri toplama

  1. Arkadaki anahtarı kullanarak akış sitometresini açın ve bilgisayardaki ilgili akış sitometrisi yazılımını açın.
  2. Sistem başlatma programını çalıştırın ve numune yükleyiciye 2 mL DI su yükleyin (Ek Şekil 1A).
  3. Sağlanan QC boncuklarını kullanarak kalite kontrolünü (QC) çalıştırın (Ek Şekil 1B).
  4. Akış sitometresinin plaka örnekleme modunda olduğundan emin olun (Ek Şekil 1C).
  5. Numune kuyularını kurun ve belirtin (Ek Şekil 1D).
  6. Aşağıdaki dağılım grafiklerini ve tablolarını oluşturun (Ek Şekil 2A).
    1. Yan Dağılım (SSC-A) ve İleri Dağılım (FSC-A).
    2. SSC-H'ye karşı SSC-A.
    3. SSC-A'ya karşı FITC-A.
    4. FITC-A istatistik tablosu (Ek Şekil 2B).
  7. V-alt plakayı sitometrenin plaka yükleyicisine oturtun.
  8. Transfekte edilmemiş bir kuyu seçin ve Başlat'a tıklayın ve ardından Çalıştır'a tıklayın.
  9. İlgilenilen popülasyonu SSC-A ve FSC-A grafiğinde ortalamak için SSC ve FITC voltajlarını ayarlayın (Ek Şekil 2C).
    1. İlgilenilen sağlıklı hücre popülasyonunu geçmek için bir çokgen oluşturun (Ek Şekil 2D).
    2. SSC-H ve SSC-A grafiğinde ikili ayrım için geçit oluşturmak üzere bir çokgen oluşturun.
    3. Transfekte edilmemiş hücreleri SSC-A ve FITC-A grafiğinin soluna doğru yerleştirmek için FITC voltajını ayarlayın (Ek Şekil 2D).
  10. Kalan transfekte edilmemiş kuyucuklar için tekrarlayın ve Ortalama FITC-A verilerini kaydedin.
  11. İyi transfekte edilmiş bir CMV-eGFP seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
  12. SSC-A ve FITC-A grafiğinde hem otofloresan hem de floresan hücreleri yakalamak için FITC voltajını ayarlayın.
    1. Transfekte edilmemiş hücrelerde ilk kapıya atıfta bulunurken, floresan hücreleri floresan olmayan hücrelere karşı geçmek için bir çokgen oluşturun (Ek Şekil 2E).
  13. Numuneleri 200 saniyeye ulaşılana ve/veya olaylar 10.000'e ulaşana kadar 60 μL/dk'da otomatik olarak kaydedin (Ek Şekil 2F).
  14. Ortalama FITC'yi CSV dosyası olarak dışa aktarın ve verileri analiz edin.
  15. Akış sitometrisini Günlük Temizlik seçeneğiyle temizleyin (Ek Şekil 2G).

6. LED yoğunluğu optimizasyonu

  1. İstenen LED yoğunluklarını test etmek için mikro denetleyici komut dosyasını düzenleyin (Ek Kodlama Dosyası 1, Satır 200-215).
    NOT: Mikrodenetleyici komut dosyasındaki değerlere göre eşdeğer LED yoğunlukları başka bir yerderapor edilmiştir 38. Farklı LED'ler kullanıldığında kendi kendine kalibrasyon gerekli olabilir.
  2. Komut dosyasının Tablo 1'de tasarlandığı gibi (Ek Kodlama Dosyası 200, Satır 215-2) içinde aşağıdaki değerleri içerdiğinden emin olun ve kodu mikro denetleyiciye yükleyin.
  3. 1-5 arasındaki adımları tekrarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki literatür 37,38,55'ten iş akışı öğelerini benimseyerek, OptoPlate-96'dan yüksek verimli eşzamanlı aydınlatma ekledik ve memeli hücrelerinde ışıkla indüklenebilir bir gen ekspresyon sistemini hızla optimize etmek için bir boru hattı gösterdik (Şekil 1).

İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri için, yüksek dinamik aralıklar, mutlak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, memeli hücrelerinde çok bileşenli geçici bir gen ekspresyonunun optogenetik kontrolünü göstererek, diğer araştırmacıların modüler optogenetik sistemleri bir floresan raportör ile hızlı ve aynı anda karakterize etmelerine olanak tanır.

Bu durumda, iki plazmitli ışıkla indüklenebilir bir sistem, HEK293T hücrelerde eGFP'nin ekspresyonu için optimize edildi. Başarılı bir ko-transfeksiyon için, en yüksek transfeksiyon verimliliği için tohumlama yoğunlu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NASA İşbirliği Anlaşması NNX16AO69A aracılığıyla Translasyonel Araştırma Enstitüsü ve Good Foods Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. Bu proje, UC Davis Akış Sitometrisi Ortak Kaynak Laboratuvarı tarafından Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke ve Ashley Karajeh'in teknik yardımıyla, NCI P30 CA093373 (Kapsamlı Kanser Merkezi) ve S10OD018223'in (Beckman Coulter "Cytoflex" sitometre) finansmanıyla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriVWR10025-724
10 mL Reaktif RezervuarlarıVWR77395-252
10 mL serolojik pipetlerVWR75816-100
1000 μ L filtre uçlarıVWR76322-154
15 mL  Yüksek Performanslı Santrifüj Tüpleri, düz kapaklıVWR89039-664
1931-C Optik Güç ÖlçeriNewport1931-C
2 mL serolojik pipetlerVWR75816-104
20 μ L filtre uçlarıVWR76322-134
200 μ L filtre uçlarıVWR76322-150
50 mL Yüksek Performanslı Santrifüj Tüpleri, düz kapaklıVWR89039-656
96 kuyruklu v-alt plakalarBRANDplates781661
A21, LED Kırmızı ampulBluex AmpulleriYokKırmızı ışık kaynağı
Arduino IDE SoftwareArduinoYok
Biyogüvenlik Kabinası, Sınıf IINuAireYok
Parlak Çizgi HemositometresiHausser Scientific3110
Hücre sayma slaytlarıBioRad1450016
Hücre Kültürü Plakası 96-kuyuk, #1.5H cam alt plakaCellvisP96-1.5H-N
CytExpert YazılımıBeckman CoulterYok
CytoFLEX Günlük Kullanıma Hazır QC FluorosferlerBeckman CoulterC657194 derece ve derece; C
CytoFLEX-S Akış Sitometresi (4 menekşe, 2 mavi, 4 sarı yeşil, 3 kırmızı kanal)Beckman CoulterC09766
Dulbecco'nun Fosfatla Tamponlu Salin Tozu, kalikum yok, magnezyum yokFisher Scientific21600069Oda Sıcaklığı
Eppendorf Santrifüj 5804Eppendorf  022622501V-taban plaka santrifüj adımı
Eppendorf Santrifüj 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research plus, 8 kanallı, değişken hacimli, 30 - 300 μ LEppendorf3125000052
Eppendorf Research plus, tek kanallı, değişken hacimli, 100 - 1000 μ LEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus, tek kanallı, değişken hacimli, 2 - 20 μ LEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus, tek kanallı, değişken hacimli, 20 - 200 μ LEppendorf3123000055
Genel Amaçlı Laboratuvar Etiketleme BandıVWR89097-920
Gibco DMEM, toz, yüksek glikozFisher Scientific121000614 derece ve derece; C
Gibco Trypan Blue Çözeltisi, %0,4Fisher Scientific15-250-061Oda Sıcaklığı
Gibco Value Isı İnaktif Olmayan FBSFisher ScientificA5256901-20 derece ve derece; C
Gibco, Tripsin-EDTA (%0,05) ile EDTA, Hayvansal Kökenli, 1X, Fenol Kırmızı, 500 mLGibco25300062-20 derece ve derece; C
HEK293T HücreleriATCCCRL-11268-80 ve derece; C, Sıvı Azot
Laboratuvar işaretleyicileri, MicronovaVWR89205-944
Metal Masa LambasıBasit TasarımlarYokKırmızı ışık lambası
OptoPlate-96LABmakerYok
Pipet-aid XPDrummond4-000-101
Plazmid: CIBN-gRNAYokYok-20 derece ve derece; C
Plazmid: CMV-eGFPYokYok-20 derece ve derece; C
Plazmid: CRY2-eGFPYokYok-20 derece ve derece; C
PolyJet DNA In Vitro Transfeksiyon ReaktifiFisher ScientificNC15361174 derece ve derece; C
T-75 Hücre Kültürü TermosuVWR10062-860
Su Kaplamalı CO2 Kuluçka MakinesiVWR10810-884

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulain, A., Perret, S., Malenfant, F., Mullick, A., Massie, B., Durocher, Y. Rapid protein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and the cumate gene-switch. J Biotechnol. 255, 16-27 (2017).
  2. Li, Y., et al. A cross-species inducible system for enhanced protein expression and multiplexed metabolic pathway fine-tuning in bacteria. Nucleic Acids Res. 53 (2), gkae1315(2025).
  3. De Baets, J., De Paepe, B., De Mey, M. Delaying production with prokaryotic inducible expression systems. Microb Cell Fact. 23, 249(2024).
  4. Wang, J., et al. Design and characterization of allantoin-inducible expression systems in budding yeast. Biotechnol Biofuels Bioprod. 18 (1), 26(2025).
  5. De Carluccio, G., Fusco, V., di Bernardo, D. Engineering a synthetic gene circuit for high-performance inducible expression in mammalian systems. Nat Commun. 15 (1), 3311(2024).
  6. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  7. Bibek, G. C., Zhou, P., Naha, A., Gu, J., Wu, C. Development of a xylose-inducible promoter and riboswitch combination system for manipulating gene expression in Fusobacterium nucleatum. Appl Environ Microbiol. 89 (9), e00667-e00723 (2023).
  8. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  9. Villegas, L. D., et al. Generation of three isogenic gene-edited Huntington's disease human embryonic stem cell lines with DOX-inducible NGN2 expression cassette in the AAVS1 safe locus. Stem Cell Res. 77, 103408(2024).
  10. Lange, L., et al. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato-endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem Cell Rep. 14 (1), 122-137 (2020).
  11. Gupta, S., Schoer, R. A., Egan, J. E., Hannon, G. J., Mittal, V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (7), 1927-1932 (2004).
  12. Beyer, H. M., et al. Genetically-stable engineered optogenetic gene switches modulate spatial cell morphogenesis in two- and three-dimensional tissue cultures. Nat Commun. 15 (1), 10470(2024).
  13. Lee, S. H., Hu, Y., Chou, A., Chen, J., Gonzalez, R. Metabolic flux optimization of iterative pathways through orthogonal gene expression control: application to the β-oxidation reversal. Metab Eng. 82, 262-273 (2024).
  14. Lan, M. S., Wang, H. W., Chong, J., Breslin, M. B. Coupling of glucose response element from L-type pyruvate kinase and G6Pase promoter enhances glucose-responsive activity in hepatoma cells. Mol Cell Biochem. 300 (1), 191-196 (2007).
  15. Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., Cui, Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8 (1), 36(2015).
  16. Mukherjee, P., Sivaprakasam, S. Engineering the D-lactic acid responsive promoter/repressor system as dynamic metabolic engineering tool in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for controlled D-lactic acid biosynthesis. Enzyme Microb Technol. 185, 110606(2025).
  17. Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R., Kim, D., Lee, S. K. Inducible and tunable gene expression systems for Pseudomonas putida KT2440. Sci Rep. 11 (1), 18079(2021).
  18. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Appl Environ Microbiol. 80 (8), 2410-2416 (2014).
  19. Stout, A. J., et al. Engineered autocrine signaling eliminates muscle cell FGF2 requirements for cultured meat production. Cell Rep Sustain. 1 (1), 100009(2024).
  20. Shahini, A., et al. NANOG restores the impaired myogenic differentiation potential of skeletal myoblasts after multiple population doublings. Stem Cell Res. 26, 55-66 (2018).
  21. Torres, M., et al. Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metab Eng. 82, 89-99 (2024).
  22. Shupe, J., Zhang, A., Odenwelder, D. C., Dobrowsky, T. Gene therapy: Challenges in cell culture scale-up. Curr Opin Biotechnol. 75, 102721(2022).
  23. Siddiqui, M., Tous, C., Wong, W. W. Small molecule-inducible gene regulatory systems in mammalian cells: progress and design principles. Curr Opin Biotechnol. 78, 102823(2022).
  24. Minami, S. A., Garimella, S. S., Shah, P. S. Computational evaluation of light propagation in cylindrical bioreactors for optogenetic mammalian cell cultures. Biotechnol J. 19 (1), 2300071(2024).
  25. Das, M., Maiti, S. K. Employment of light-inducible promoter in genetically engineered cyanobacteria for photosynthetic isobutanol production with simulated diurnal sunlight and CO2. J Biotechnol. 393, 31-40 (2024).
  26. Borella, L., Sforza, E., Bertucco, A. An internally LED illuminated photobioreactor to increase energy conversion efficiency: design and operation. Energy Convers Manag. 270, 116224(2022).
  27. Choi, S. Y., et al. Scalable cultivation of engineered cyanobacteria for squalene production from industrial flue gas in a closed photobioreactor. J Agric Food Chem. 68 (37), 10050-10055 (2020).
  28. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  29. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  30. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  31. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 41 (7), e77(2013).
  32. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  33. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  34. Müller, K., Naumann, S., Weber, W., Zurbriggen, M. D. Optogenetics for gene expression in mammalian cells. Biol Chem. 396 (2), 145-152 (2015).
  35. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  36. Qiao, L., et al. A sensitive red/far-red photoswitch for controllable gene therapy in mouse models of metabolic diseases. Nat Commun. 15, 10310(2024).
  37. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol. 11 (3), 198-200 (2015).
  38. Garimella, S. S., et al. A simplified two-plasmid system for orthogonal control of mammalian gene expression using light-activated CRISPR effector. BMC Biotechnol. 25 (1), 58(2025).
  39. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nat Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  40. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nat Chem Biol. 13 (6), 633-639 (2017).
  41. Chatelle, C., et al. A green-light-responsive system for the control of transgene expression in mammalian and plant cells. ACS Synth Biol. 7 (5), 1349-1358 (2018).
  42. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  43. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  44. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  45. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).
  46. Kaberniuk, A. A., Baloban, M., Monakhov, M. V., Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Single-component near-infrared optogenetic systems for gene transcription regulation. Nat Commun. 12 (1), 3859(2021).
  47. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  48. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  49. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nat Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  50. Varma, S., Gulati, K. A., Sriramakrishnan, J., Ganla, R. K., Raval, R. Environment signal dependent biocontainment systems for engineered organisms: Leveraging triggered responses and combinatorial systems. Synth Syst Biotechnol. 10 (2), 356-364 (2025).
  51. Chen, X., Li, T., Wang, X., Yang, Y. A light-switchable bidirectional expression module allowing simultaneous regulation of multiple genes. Biochem Biophys Res Commun. 465 (4), 769-776 (2015).
  52. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  53. Muench, P., et al. A modular toolbox for the optogenetic deactivation of transcription. Nucleic Acids Res. 53 (3), gkae1237(2025).
  54. Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells. J Vis Exp. (173), e62109(2021).
  55. Minami, S. A., Shah, P. S. Transient light-activated gene expression in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 21 (1), 13(2021).
  56. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  57. Chen, S. Y., et al. Optogenetic control reveals differential promoter interpretation of transcription factor nuclear translocation dynamics. Cell Syst. 11 (4), 336-353.e24 (2020).
  58. Meyer, K., Lammers, N. C., Bugaj, L. J., Garcia, H. G., Weiner, O. D. Optogenetic control of YAP reveals a dynamic communication code for stem cell fate and proliferation. Nat Commun. 14 (1), 6929(2023).
  59. Benman, W., et al. A temperature-inducible protein module for control of mammalian cell fate. Nat Methods. 22 (3), 539-549 (2025).
  60. Stadinski, B. D., Huseby, E. S. How to prevent yourself from seeing double. Cytometry A. 97 (11), 1102-1104 (2020).
  61. Merah-Mourah, F., Cohen, S. O., Haziot, A. A two-stage flow cytometry strategy to distinguish single cells from doublets in heterogeneous cell mixtures and improve cell cluster identification: Application to human monocyte subpopulations. Curr Protoc. 1 (8), e229(2021).
  62. Cheng, Y. S., et al. A protocol for culture and characterization of human induced pluripotent stem cells after induction. Curr Protoc. 3 (8), e866(2023).
  63. Wu, S. H., Liao, Y. T., Huang, C. H., Chen, Y. C., Chiang, E. R., Wang, J. P. Comparison of the confluence-initiated neurogenic differentiation tendency of adipose-derived and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomedicines. 9 (11), 1503(2021).
  64. Yang, B., Cao, L., Liu, B., McCaig, C. D., Pu, J. The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1. PLoS One. 8 (4), e60861(2013).
  65. Chua, K. H., et al. Effects of serum reduction and VEGF supplementation on angiogenic potential of human adipose stromal cells in vitro. Cell Prolif. 46 (3), 300-311 (2013).
  66. Messmer, T., et al. A serum-free media formulation for cultured meat production supports bovine satellite cell differentiation in the absence of serum starvation. Nat Food. 3 (1), 74-85 (2022).
  67. Li, V. C., Kirschner, M. W. Molecular ties between the cell cycle and differentiation in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (26), 9503-9508 (2014).
  68. Binder, B. Y. K., Sagun, J. E., Leach, J. K. Reduced serum and hypoxic culture conditions enhance the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 11 (3), 387-393 (2015).
  69. Vincent, R. K., Odorico, J. S. Reduced serum concentration is permissive for increased in vitro endocrine differentiation from murine embryonic stem cells. Differentiation. 78 (1), 24-34 (2009).
  70. An-adirekkun, J., et al. A yeast optogenetic toolkit (yOTK) for gene expression control in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 117 (3), 886-893 (2020).
  71. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  72. Hashemi, A., et al. Optimization of transfection methods for Huh-7 and Vero cells: a comparative study. Cytol Genet. 46 (6), 347-353 (2012).
  73. Nihongaki, Y., Kawano, F., Nakajima, T., Sato, M. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol. 33 (7), 755-760 (2015).
  74. Jayaraman, P., Devarajan, K., Chua, T. K., Zhang, H., Gunawan, E., Poh, C. L. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6994-7005 (2016).
  75. Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F., Riccardi, C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods. 139 (2), 271-279 (1991).
  76. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  77. Choi, S., et al. Protective effect of melatonin against blue light-induced cell damage via the TRPV1-YAP pathway in cultured human epidermal keratinocytes. Biofactors. 51 (2), e70015(2025).
  78. Alghamdi, R. A., Exposito-Rodriguez, M., Mullineaux, P. M., Brooke, G. N., Laissue, P. P. Assessing phototoxicity in a mammalian cell line: How low levels of blue light affect motility in PC3 cells. Front Cell Dev Biol. 9, 738786(2021).
  79. Yokoi, Y., et al. Potential consequences of phototoxicity on cell function during live imaging of intestinal organoids. PLoS One. 19 (11), e0313213(2024).
  80. Flores-Ibarra, A., et al. Light-oxygen-voltage (LOV)-sensing domains: activation mechanism and optogenetic stimulation. J Mol Biol. 436 (5), 168356(2024).
  81. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  82. Lan, T. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends Genet. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  83. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Optogenetik Sistemlernd klenebilir Gen EkspresyonuCRISPR Efekt rAk SitometrisiY ksek Kapasiteli TaramaMavi I k AktivasyonuHEK293T H creleriFloresan G r nt leme

İlgili makaleler