Method Article

Tam Montajlı Doku Görüntüleme Kullanılarak Bağırsak Mukusunun Üç Boyutlu Miktar Tayini

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, salgılanan mukusu ölçmek için tam montajlı bağırsak dokuları ve çoklu foton mikroskobu kullanan bir 3D görüntüleme yöntemi sunarak, karbamoilkolin klorür gibi uyaranlara yanıt olarak mukus dinamiklerinin hassas hacimsel analizini ve görselleştirilmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukus, sindirimi kolaylaştırarak, mikroplara karşı bir bariyer oluşturarak ve bağırsaktaki bağışıklık tepkilerini düzenleyerek bağırsak homeostazisinin korunmasında kritik bir rol oynar. Salgılanması, mikrobiyal enfeksiyonlar ve iltihaplanma dahil olmak üzere çeşitli içsel ve dışsal faktörler tarafından modüle edilir. Mukus analizi için geleneksel yöntemler, histolojik kesitlerde mukus kalınlığının ölçülmesi gibi nispi nicelemeye dayanırken, bu yaklaşımlar, bağırsak lümeni içinde salgılanan mukusun gerçek hacmi ve uzamsal dağılımı hakkında sınırlı bilgi sağlar. Burada, tam montajlı bağırsak dokuları ve çoklu foton mikroskobu kullanılarak mukusun mutlak, üç boyutlu miktar tayini için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, bağlanmış bağırsak halkalarının hazırlanmasını, goblet hücresi aktivasyonu için bir uyarıcı olarak karbamoilkolin klorür ile tedaviyi, doku fiksasyonunu ve görüntüleme için boyamayı içerir. Çoklu foton mikroskobu kullanarak, lümen yüzeyinin Z-yığılmış görüntülerini elde ederiz. Bunlar, salgılanan mukusun hacmini ve uzamsal dağılımını ölçmek için Imaris yazılımında işlenir. Karbamoilkolin klorürün hem ileal hem de kolonik dokularda 30 dakika içinde mukus salgılanmasını güçlü bir şekilde indüklediğini gösterdik. Salgılanan mukus, lümen boyunca düzensiz ve süreksiz bir şekilde ortaya çıkar ve geleneksel iki boyutlu yaklaşımlara göre hacimsel analizin öneminin altını çizer. Bu protokol, araştırmacıların mutlak nicel veriler elde etmelerini ve mukus dağılımını yerinde görselleştirmelerini sağlayarak, fizyolojik ve patolojik koşullar altında bağırsak mukus dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli gastrointestinal sisteminin mukozal ortamı oldukça dinamiktir ve çeşitli mikrobiyal toplulukların kolonizasyonunu destekler. Bağırsak epiteli, besinleri emmek, bariyer bütünlüğünü korumak ve bağışıklık sistemi ile iletişim kurmak için işbirliği yapan çeşitli özel hücrelerden oluşur1. Bunlar arasında kadeh hücreleri, müsin granüllerini depolar ve kararlı durum koşulları altında lümene mukus salgılar. Bu mukus, epitel tabakası ile doğrudan mikrobiyal teması önleyen, doku iltihabını modüle eden ve bağırsak homeostazını koruyan kritik bir fiziksel bariyer oluşturur 2,3. Mukus sekresyonunun düzensizliği bariyer fonksiyonunu tehlikeye atar ve inflamasyon ve tümör oluşumu ile ilişkilendirilmiştir 4,5,6,7.

Bağırsak mukus salgısı, nörotransmiter asetilkolin gibi içsel faktörler ve kommensallerden mikrobiyal bileşenler tarafından tetiklenebilir 8,9. Bağırsak ortamının karmaşıklığı göz önüne alındığında, goblet hücresi mukus salgısını etkileyen birçok faktör keşfedilmemiştir. Bu nedenle, farklı uyaranların salgı dinamiklerini nasıl etkilediğini araştırmak için lümen mukusunu ölçmek için kesin bir yöntem gereklidir. Geleneksel yaklaşımlar temel olarak nispi nicelemeye dayanır: örneğin, ex vivo bağırsak eksplant sistemlerinde10,11 floresan veya odun kömürü partikülleri kullanarak mukus kalınlığının ölçülmesi veya lekeli doku kesitlerinde 12,13 lümen mikropları ile epitel arasındaki mesafenin değerlendirilmesi. Bu yöntemler göreceli karşılaştırmalar için uygun olsa da, özellikle salgılanan mukus epiteli her zaman düzgün bir şekilde kaplamadığından, salgılanan mukusun tam dağılımını veya üç boyutlu yapısını yakalayamayabilirler.

Bu çalışmada, tam montajlı bağırsak dokuları kullanılarak lümen mukusunun üç boyutlu görselleştirilmesi ve mutlak miktarının belirlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, yapısal bütünlüğü ve morfolojiyi korumak için uygun bir fiksatif ile taze doku fiksasyonunu, ardından konfokal veya multifoton mikroskop kullanılarak floresan boyama ve görüntüleme gerektirir. Test ajanlarını doğrudan derin anestezi uygulanmış farelerin bağlanmış bağırsak halkalarına uygulayarak ve ardından anında fiksasyonla, yöntem doğal mukus mimarisini korur ve salgı kinetiğinin analizine izin verir. Görüntüleme derinliğinin öncelikle doku kalınlığı ile sınırlı olduğu kesitli dokularla karşılaştırıldığında, tüm montajlı dokuların (delipidasyon olmadan) görüntüleme derinliği, ışık saçılımı ve doku opaklığı ile sınırlandırılarak yaklaşık 200-300 μm'ye ulaşır. Bu tekniği kullanarak, reseptörleri goblet hücrelerinde14 eksprese edilen bir asetilkolin analoğu olan karbamoilkolin klorürün (CCh) hızlı mukus salgılanmasını güçlü bir şekilde indüklediğini gösterdik. Özellikle, salgılanan mukus, hem epitel boyunca sürekli bir tabaka hem de lümen içinde süreksiz yapılar oluşturur, bu özellikler geleneksel doku kesitlerinde tespit edilmesi zordur. Bu protokol, bağırsak mukusunun üç boyutlu dağılımını ölçmek ve çeşitli uyaranların mukus indükleme potansiyelini karşılaştırmak için sağlam bir platform sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Chang Gung Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Chang Gung Üniversitesi'nin hayvan tesisi, Laboratuvar Hayvanları Bakımını Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir. Bu çalışmalarda hayvan sağlığı açısından herhangi bir endişe gözlenmemiştir.

1. Fiksasyon tabanının hazırlanması

  1. Agaroz tozunu ddH2O ile mikrodalgaya uygun bir şişede %4 (a/h) konsantrasyona kadar karıştırın. Küçük kabarcıklar olmadan kaynayana kadar 2-3 dakika mikrodalgada pişirin.
    NOT: Hacim, numune sayısına bağlıdır; 6 cm'lik bir tabak için yaklaşık 10 mL.
  2. Agaroz çözeltisinin ~3 dakika içinde ~60 °C'ye soğumasını bekleyin. Agarozu, sıvı yüksekliği kabın yarısına ulaşana kadar (6 cm'lik bir tabak için yaklaşık 10 mL) dikkatlice 6 cm'lik bir kaba dökün.
  3. Agaroz tamamen katılaşana kadar kapaklı tabağı 20-30 dakika kapalı bir alana koyun.

2. Fiksasyon malzemesinin hazırlanması

  1. Yeni bakır teller hazırlayın ve bunları 5 mm uzunluklarda kesin. Her doku parçası 6-8 parça tel gerektirir.

3. CCh çözeltisinin hazırlanması

  1. Kristalin CCh'yi steril PBS tamponunda 10 μM'lik bir nihai konsantrasyona (bir bağırsak döngüsü için 200 μL) çözün.

4. Enjekte edilebilir anesteziklerin hazırlanması

  1. Stok çözeltiyi anesteziye hazırlamak için 2,2,2-tribromoetanolü 2-metil-2-bütanol içinde çözün.
  2. Stok çözeltisini seyreltmek için steril PBS kullanın, böylece nihai çalışma çözeltisi 30 mg/mL 2,2,2-tribromoetanol ve %3 (h/h) 2-metil-2-bütanol içerir.
  3. Çözeltide pelet kalmayana kadar ~1 dakika boyunca iyice vorteksleyin (maksimum oran: 8).
  4. Bozulmayı önlemek için stok çözeltisini karanlıkta 4 °C'de saklayın; Stokları hazırlandıktan 1 ay sonra atın.
  5. Anesteziden önce, stok çözeltisini steril PBS'ye çekin ve eşit dağılım sağlamak için iyice karıştırın ve fare başına 250 mg/kg'lık bir son doz elde edin.
    DİKKAT: 2,2,2-Tribromoetanol nörotoksisiteye sahiptir ve 2-metil-2-bütanol uçucudur ve tahriş edici bir kokuya sahiptir. Uygun koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Bertaraf için atıkları kapalı bir kapta toplayın ve kurumun tehlikeli kimyasal atık bertaraf prosedürlerini izleyin.

5. Döngü enjeksiyonu yoluyla bağırsak aşılaması

  1. 6-8 haftalık bir fareyi intraperitoneal 200 μL 2,2,2-tribromoetanol (fare başına 250 mg/kg) enjeksiyonu ile uyuşturun ve vücut ısısını korumak için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
  2. Cilt yüzeyini alkolle sterilize ettikten sonra, ameliyat makası kullanarak farenin sol alt karnında bir kesi yapın ve çekumu anestezi altında ortaya çıkarın.
  3. İleumu veya proksimal kolonu tanımlayın, bağırsak halkasını steril bir gazlı bez üzerine yerleştirin ve her iki ucu sabitlemek için arteriyel kelepçeler kullanarak 3 cm uzunluğunda kapalı bir halka oluşturun.
  4. Gazlı bez üzerindeki organı steril PBS ile durulayın.
  5. Anestezi altında bağlanmış bağırsak halkasına 200 μL'den fazla olmayan bir hacimde steril PBS veya CCh reaktifi enjekte edin.

6. Doku toplama, sabitleme ve boyama

  1. 30 dakikalık tedaviden sonra, fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın ve bağırsak halkasını toplayın.
  2. Bağırsak halkasını tutmak için forseps kullanın ve steril PBS'de nazikçe durulayın.
  3. Bağırsak halkasını uzunlamasına yavaşça kesin ve dokuyu steril PBS'de durulayın.
  4. Dokuyu düzleştirin ve 6 cm'lik bir tabakta agaroz üzerine sabitlemek için bakır tel parçaları kullanın.
  5. Dokuyu 10 mL% 4 paraformaldehit çözeltisi ile 12-24 saat boyunca tabakta sabitleyin.
  6. Artık paraformaldehiti çıkarmak için dokuyu PBS ile en az 3 kez yıkayın.
  7. Dokuyu 10 mL bloke edici tampona (PBS% 0.4 Triton X-100 ve% 3 sığır serum albümini [BSA] ile desteklenmiş) 4 ° C'de 12-24 saat boyunca daldırın.
  8. Dosayı, bloke edici tamponda Buğday Tohumu Aglütininin (WGA, 1:200) ve Phalloidin (1:500) ile boyayın, tabakta 12-24 saat boyunca 4 °C'de 120 rpm'de çalkalayın.
    NOT: Boya tüketimini en aza indirmek için doku, boyama için 2 mL boya tamponuna daldırılmış 3 cm'lik bir tabakta katılaşmış agaroz üzerine sabitlenebilir.
    DİKKAT: Paraformaldehit soluma tehlikesi oluşturur. Çeker ocakta çalıştırma gibi taşıma sırasında uygun koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Bertaraf için atıkları kapalı bir kapta toplayın ve kurumun tehlikeli kimyasal atık bertaraf prosedürlerini izleyin.

7. Multifoton mikroskobu ile görüntü yakalama

  1. Kalan boyama tamponunu PBS ile en az 3 kez yıkayın.
  2. Dokuyu 10 mL PBS'de 6 cm'lik bir tabakta bakır tellerle agaroz üzerine sabitleyin.
  3. Derin doku görüntüleme için yüksek NA objektif lens ile donatılmış bir multifoton mikroskobu kullanarak bağırsak dokusunun 100 optik kesitini (99 μm derinliği kapsayan) ve ilişkili salgılanan mukusları elde edin. Multifoton mikroskobu için 750 nm dalga boyuna ayarlanmış bir uyarma kaynağı kullanın. BP500-550 nm ve BP565-610 nm bant geçiren filtreleri kullanarak emisyon sinyallerini toplayın. Tarama hızını 8 olarak ayarlayın.
    NOT: Multifoton mikroskobu için maksimum tarama hızı 9'dur ve daha yüksek değerler daha hızlı edinimi gösterir. Hız ayarı mikroskobun kapasitesine bağlıdır. 3D yığınları elde etmek için kullanılan görüntüleme platformunu kullanırken, çekim süresini ve görüntü kalitesini dengelemek için tarama hızının 8 olmasını öneririz.

8. Görüntü analizi ve mukus ölçümü (Şekil 1)

  1. Her bir mukus parçacığının hacmini ölçmek için (WGA kanalında), dosyayı Arena sayfasına sürükleyip bırakarak görüntü yığınını Imaris'te açın . Yüzey oluşturma iş akışını başlatmak için Yüzey simgesine tıklayın. Z yığını içindeki parçacık hacimlerini segmentlere ayırmak ve ölçmek için standart adımları izleyin. Spesifik parametreler ve işleme adımları Şekil 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
  2. Çoğunlukla kadeh hücreleri olan 1.000μm3'ten küçük mukus parçacıklarını hariç tutun (Şekil 2A,B).
  3. Her grup için salgılanan mukus hacmini toplayın.

9. İstatistiksel analiz

  1. Her grup için toplam hacmi analiz edin ve karşılaştırın. Mukus hacminin değerini girin Sütun ve parametrik olmayan bir Mann-Whitney testi kullanarak analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde, multifoton mikroskobu ile elde edilen tam montajlı dokuların yığılmış görüntülerinden bağırsak mukusunun hacmini ölçtük. Bağırsak dokuları, sırasıyla hücresel F-aktin ve mukusu görselleştirmek için floresan phalloidin ve buğday tohumu aglütinini (WGA) ile boyandı15,16. PBS ile tedavi edilen hem ileal hem de kolonik dokularda, WGA+ mukusu esas olarak epitel yüzeyindeki goblet hücrelerinde tespit edildi. Karbamoilkolin klorür (CCh) uygulamas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tam montajlı doku boyama, çoklu foton mikroskobu ve Imaris yazılımı ile analiz kullanarak bağırsak mukusunun üç boyutlu ölçümü için bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, mukusun bağırsak lümeni içindeki süreksiz dağılımının gözlemlenmesine izin verir ve mukus hacminin mutlak bir ölçümünü sağlar.

Stimülasyon üzerine süreksiz mukus dağılımı eksplant doku kültürü sistemlerinde de gözlenmiştir8. Ex vivo eksplant kültürlerini k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik yardım için Linkou'daki Chang Gung Memorial Hastanesi Mikroskopi Çekirdek Laboratuvarı'na teşekkür ederiz. Ayrıca, Zeiss LSM 7 MP Çoklu Foton Mikroskobu hizmeti için Ulusal Yang Ming Chiao Tung Üniversitesi Görüntüleme Çekirdek Tesisi'ne, özellikle teknik destekleri için Bayan Pei-jun Chen ve Yung-yu Lu'ya teşekkür ederiz. Yazarlar, NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 ve 113-2628-B-182-002-MY3'ün (YHT'ye) desteğini kabul etmek isterler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402
2-metil-2-butanolSigma-Aldrich240486
6 cm çanak Alpha Plus16021-1
Agarose HispanagarA02599
BSABioShopALB001
Karbamoylkolin klorür ≥ %98 (titrasyon), kristalSİGMASI-C4382-1G
Bakır tel (yeni)EN ÜST TEKNOLOJI KABLOSU & KABLO ENDÜSTRIYELIW00125İzolasyon katmanı olmayan bakır tel
ForsepsShinetehST-M110
Gazlı bez, sterilGMTHMayıs-40
GraphPad Prism 8 GraphPad Yazılımı
Isıtma pediCONFORTSY-666
IMARIS 10.0.0OXFORD ENSTRÜMANLARI
ParaformaldehitBIOVOVASBL0415-1000
PBSGENESTARBL0180-1000
Phalloidin Etiketleme ProblarıInvitrogenA12379
MakasShineteh02-1250.18
Triton X-100Merck1.08603.1000
Buğday Tohumu Agglutinin (WGA) KonjugatlarıBiyotyum29027
Zeiss 7MP W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III su daldırma objektif (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti safir femtosaniye lazer (DeepSee modülü olmadan) BP500 nm-550 nm ve BP565 nm-610 nm dedektörler ile ve 750 nm lazer dalga boyuna sahipderin doku görüntüleme için yüksek NA objektif lensli 3D yığınlar elde etmek amacıyla kullanılan görüntüleme platformu; 750 nm dalga boyuna ayarlanmış çoklu foton mikroskopisi için uyarma kaynağı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  2. Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
  3. Johansson, M. E., et al. The inner of the two muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (39), 15064-15069 (2008).
  4. Nyström, E. E., et al. An intercrypt subpopulation of goblet cells is essential for colonic mucus barrier function. Science. 372 (6539), eabb1590(2021).
  5. Van Der Post, S., et al. Structural weakening of the colonic mucus barrier is an early event in ulcerative colitis pathogenesis. Gut. 68 (12), 2142-2151 (2019).
  6. Van Der Sluis, M., et al. Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that muc2 is critical for colonic protection. Gastroenterology. 131 (1), 117-129 (2006).
  7. Velcich, A., et al. Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin muc2. Science. 295 (5560), 1726-1729 (2002).
  8. Birchenough, G. M., Nyström, E. E., Johansson, M. E., Hansson, G. C. A sentinel goblet cell guards the colonic crypt by triggering NLRP6-dependent Muc2 secretion. Science. 352 (6293), 1535-1542 (2016).
  9. Dolan, B., Ermund, A., Martinez-Abad, B., Johansson, M. E., Hansson, G. C. Clearance of small intestinal crypts involves goblet cell mucus secretion by intracellular granule rupture and enterocyte ion transport. Sci Signal. 15 (752), eabl5848(2022).
  10. Gustafsson, J. K., et al. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  11. Sawaed, J., et al. Antibiotics damage the colonic mucus barrier in a microbiota-independent manner. Sci Adv. 10 (37), eadp4119(2024).
  12. Bergstrom, K., et al. Core 1-and 3-derived o-glycans collectively maintain the colonic mucus barrier and protect against spontaneous colitis in mice. Mucosal Immunol. 10 (1), 91-103 (2017).
  13. Cortez, V., et al. Astrovirus infects actively secreting goblet cells and alters the gut mucus barrier. Nat Commun. 11 (1), 2097(2020).
  14. Knoop, K. A., Mcdonald, K. G., Mccrate, S., Mcdole, J. R., Newberry, R. D. Microbial sensing by goblet cells controls immune surveillance of luminal antigens in the colon. Mucosal Immunol. 8 (1), 198-210 (2015).
  15. Nikitas, G., et al. Transcytosis of Listeria monocytogenes across the intestinal barrier upon specific targeting of goblet cell accessible E-cadherin. J Exp Med. 208 (11), 2263-2277 (2011).
  16. Tsai, Y. H., Disson, O., Bierne, H., Lecuit, M. Murinization of internalin extends its receptor repertoire, altering Listeria monocytogenes cell tropism and host responses. PLoS Pathog. 9 (5), e1003381(2013).
  17. Birchenough, G. M., Johansson, M. E., Gustafsson, J. K., Bergstrom, J. H., Hansson, G. C. New developments in goblet cell mucus secretion and function. Mucosal Immunol. 8 (4), 712-719 (2015).
  18. Maheras, K. J., Gow, A. Increased anesthesia time using 2,2,2-tribromoethanol-chloral hydrate with low impact on mouse psychoacoustics. J Neurosci Methods. 219 (1), 61-69 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal MucusThree Dimensional QuantificationWhole Mount ImagingMulti Photon MicroscopyGoblet Cell SecretionMucus VolumeCarbamoylcholine ChlorideIntestinal Loop PreparationMucus DistributionTissue Staining

Related Articles