Method Article

Tam Montajlı Doku Görüntüleme Kullanılarak Bağırsak Mukusunun Üç Boyutlu Miktar Tayini

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, salgılanan mukusu ölçmek için tam montajlı bağırsak dokuları ve çoklu foton mikroskobu kullanan bir 3D görüntüleme yöntemi sunarak, karbamoilkolin klorür gibi uyaranlara yanıt olarak mukus dinamiklerinin hassas hacimsel analizini ve görselleştirilmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mukus, sindirimi kolaylaştırarak, mikroplara karşı bir bariyer oluşturarak ve bağırsaktaki bağışıklık tepkilerini düzenleyerek bağırsak homeostazisinin korunmasında kritik bir rol oynar. Salgılanması, mikrobiyal enfeksiyonlar ve iltihaplanma dahil olmak üzere çeşitli içsel ve dışsal faktörler tarafından modüle edilir. Mukus analizi için geleneksel yöntemler, histolojik kesitlerde mukus kalınlığının ölçülmesi gibi nispi nicelemeye dayanırken, bu yaklaşımlar, bağırsak lümeni içinde salgılanan mukusun gerçek hacmi ve uzamsal dağılımı hakkında sınırlı bilgi sağlar. Burada, tam montajlı bağırsak dokuları ve çoklu foton mikroskobu kullanılarak mukusun mutlak, üç boyutlu miktar tayini için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, bağlanmış bağırsak halkalarının hazırlanmasını, goblet hücresi aktivasyonu için bir uyarıcı olarak karbamoilkolin klorür ile tedaviyi, doku fiksasyonunu ve görüntüleme için boyamayı içerir. Çoklu foton mikroskobu kullanarak, lümen yüzeyinin Z-yığılmış görüntülerini elde ederiz. Bunlar, salgılanan mukusun hacmini ve uzamsal dağılımını ölçmek için Imaris yazılımında işlenir. Karbamoilkolin klorürün hem ileal hem de kolonik dokularda 30 dakika içinde mukus salgılanmasını güçlü bir şekilde indüklediğini gösterdik. Salgılanan mukus, lümen boyunca düzensiz ve süreksiz bir şekilde ortaya çıkar ve geleneksel iki boyutlu yaklaşımlara göre hacimsel analizin öneminin altını çizer. Bu protokol, araştırmacıların mutlak nicel veriler elde etmelerini ve mukus dağılımını yerinde görselleştirmelerini sağlayarak, fizyolojik ve patolojik koşullar altında bağırsak mukus dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli gastrointestinal sisteminin mukozal ortamı oldukça dinamiktir ve çeşitli mikrobiyal toplulukların kolonizasyonunu destekler. Bağırsak epiteli, besinleri emmek, bariyer bütünlüğünü korumak ve bağışıklık sistemi ile iletişim kurmak için işbirliği yapan çeşitli özel hücrelerden oluşur1. Bunlar arasında kadeh hücreleri, müsin granüllerini depolar ve kararlı durum koşulları altında lümene mukus salgılar. Bu mukus, epitel tabakası ile doğrudan mikrobiyal teması önleyen, doku iltihabını modüle eden ve bağırsak homeostazını koruyan kritik bir fiziksel bariyer oluşturur 2,3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Chang Gung Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Chang Gung Üniversitesi'nin hayvan tesisi, Laboratuvar Hayvanları Bakımını Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir. Bu çalışmalarda hayvan sağlığı açısından herhangi bir endişe gözlenmemiştir.

1. Fiksasyon tabanının hazırlanması

  1. Agaroz tozunu ddH2O ile mikrodalgaya uygun bir şişede %4 (a/h) konsantrasyona kadar karıştırın. Küçük kabarcıklar olmadan kaynayana kadar 2-3 dakika mikrodalgada pişirin.
    NOT: Hacim....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde, multifoton mikroskobu ile elde edilen tam montajlı dokuların yığılmış görüntülerinden bağırsak mukusunun hacmini ölçtük. Bağırsak dokuları, sırasıyla hücresel F-aktin ve mukusu görselleştirmek için floresan phalloidin ve buğday tohumu aglütinini (WGA) ile boyandı15,16. PBS ile tedavi edilen hem ileal hem de kolonik dokularda, WGA+ mukusu esas olarak epitel yüzeyindeki goblet hücrelerinde tespit edildi. Karbamoilkolin klorür (CCh) uygulamas.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tam montajlı doku boyama, çoklu foton mikroskobu ve Imaris yazılımı ile analiz kullanarak bağırsak mukusunun üç boyutlu ölçümü için bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, mukusun bağırsak lümeni içindeki süreksiz dağılımının gözlemlenmesine izin verir ve mukus hacminin mutlak bir ölçümünü sağlar.

Stimülasyon üzerine süreksiz mukus dağılımı eksplant doku kültürü sistemlerinde de gözlenmiştir8. Ex vivo eksplant kültürlerini k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik yardım için Linkou'daki Chang Gung Memorial Hastanesi Mikroskopi Çekirdek Laboratuvarı'na teşekkür ederiz. Ayrıca, Zeiss LSM 7 MP Çoklu Foton Mikroskobu hizmeti için Ulusal Yang Ming Chiao Tung Üniversitesi Görüntüleme Çekirdek Tesisi'ne, özellikle teknik destekleri için Bayan Pei-jun Chen ve Yung-yu Lu'ya teşekkür ederiz. Yazarlar, NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 ve 113-2628-B-182-002-MY3'ün (YHT'ye) desteğini kabul etmek isterler.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402
2-metil-2-butanolSigma-Aldrich240486
6 cm çanak Alpha Plus16021-1
Agarose HispanagarA02599
BSABioShopALB001
Karbamoylkolin klorür ≥ %98 (titrasyon), kristalSİGMASI-C4382-1G
Bakır tel (yeni)EN ÜST TEKNOLOJI KABLOSU & KABLO ENDÜSTRIYELIW00125İzolasyon katmanı olmayan bakır tel
ForsepsShinetehST-M110
Gazlı bez, sterilGMTHMayıs-40
GraphPad Prism 8 GraphPad Yazılımı
Isıtma pediCONFORTSY-666
IMARIS 10.0.0OXFORD ENSTRÜMANLARI
ParaformaldehitBIOVOVASBL0415-1000
PBSGENESTARBL0180-1000
Phalloidin Etiketleme ProblarıInvitrogenA12379
MakasShineteh02-1250.18
Triton X-100Merck1.08603.1000
Buğday Tohumu Agglutinin (WGA) KonjugatlarıBiyotyum29027
Zeiss 7MP W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III su daldırma objektif (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti safir femtosaniye lazer (DeepSee modülü olmadan) BP500 nm-550 nm ve BP565 nm-610 nm dedektörler ile ve 750 nm lazer dalga boyuna sahipderin doku görüntüleme için yüksek NA objektif lensli 3D yığınlar elde etmek amacıyla kullanılan görüntüleme platformu; 750 nm dalga boyuna ayarlanmış çoklu foton mikroskopisi için uyarma kaynağı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  2. Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (651....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal MucusThree Dimensional QuantificationWhole Mount ImagingMulti Photon MicroscopyGoblet Cell SecretionMucus VolumeCarbamoylcholine ChlorideIntestinal Loop PreparationMucus DistributionTissue Staining

Related Articles