Yöntem makalesi

Mikroakışkan Akış Odaklama Cihazı Kullanılarak Oda Sıcaklığında Stabil Monodispers Fosfolipid Kaplı Mikro Kabarcıkların Üretimi

DOI:

10.3791/68796

⸱

10 Ekim 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, fosfolipid kaplama formülasyonunun nasıl hazırlanacağı da dahil olmak üzere, oda sıcaklığında bir mikroakışkan akış odaklama cihazı kullanarak monodispers fosfolipid kaplı mikro kabarcıklar üretme yöntemini açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monodispers mikro kabarcıklar, hem görüntüleme hem de terapötik uygulamalar için ultrason kontrast maddelerinin etkinliğini arttırmada önemli bir potansiyel göstermiştir. Bu mikro kabarcıklar, boyutları üzerinde hassas kontrol sağlayan mikroakışkan akış odaklama yöntemi kullanılarak doğrudan üretilebilir. Ancak üretim sırasında birleşmenin önlenmesi kritik bir zorluk olmaya devam ediyor. Yüksek üretim sıcaklıkları (örneğin 55 °C) birleşmeyi baskılayabilirken, bu tür koşullar mikroakışkan cihaz tasarımını karmaşıklaştırır ve hedefleme ajanları ve ilaç konjugatları ile uyumsuz olabilir. Bu protokol, mikro kabarcıkların stabilitesi ve monodispersitesi en az 7 gün boyunca korunarak, oda sıcaklığında monodispers fosfolipid kaplı mikro kabarcıklar üretmek için bir yöntemin ana hatlarını çizer. Protokol ayrıca yeniden kullanılabilir PDMS mikroakışkan çiplerinin üretimini ve yüzey aktif madde Pluronic F68'i içeren fosfolipid kaplama formülasyonunun hazırlanmasını da açıklamaktadır. Bulgularımız, bu yöntem kullanılarak üretilen mikro kabarcıkların boyutlarını ve stabilitelerini 7 gün boyunca koruduğunu, stabil ve kontrol edilebilir ultrason kontrast maddelerinin gerekli olduğu klinik ortamlarda gelecekte uygulanabilirliklerini desteklediğini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultrason kontrast maddeleri (UCA) klinik ekografi ve terapötik uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3. İntravenöz olarak uygulanan bu mikro kabarcıklar, kan havuzu ajanları 4,5 olarak işlev görerek vasküler sistemde sınırlı kalır. Stabilize edici bir kabuk mikro kabarcıkları kaplar ve Laplace basıncı tarafından tahrik edilen gaz difüzyonunu azaltır, böylece mikro kabarcığın ömrünü uzatır 3,6. Ultrasona maruz kaldığında, mikro kabarcıklar salınmaya başlar ve gaz çekirdeğinin 7,8 sıkıştırılabilirliği nedeniyle güçlü yankılar üretir. Salınım en çok, mikro kabarcık boyutundan ve kabuk özelliklerinden 9,10,11 etkilenen mikro kabarcığın rezonans frekansında belirgindir. Klinik olarak onaylanmış UCA genellikle, tipik olarak çapı yaklaşık 0.5-10 μm arasında değişen, geniş bir boyut dağılımına sahip polidispers mikro kabarcıklardan oluşur 12,13,14. Bu geniş boyut dağılımı, bu mikro kabarcıkların rezonansa girdiği geniş bir frekans aralığına yol açar. Klinik ultrason problarının tipik olarak dar bir frekans bant genişliğinde çalıştığı göz önüne alındığında, UCA popülasyonunun yalnızca bir alt kümesi etkili bir şekilde rezonansa girer15. Dar bir boyut dağılımına sahip olan monodispers mikro kabarcıkların (örneğin, PDI %3~1016,17), polidispers mikro kabarcıklara kıyasla tanı ve tedaviyi arttırdığı gösterilmiştir. Kontrastlı ultrason görüntüleme için, yoğunluk18 büyüklüğünde iki ila üç sıra artarken, harmonik altı sinyaller yoluyla noninvaziv basınç algılama duyarlılığı neredeyse iki katına çıktı 19,20,21 ve ilaç dağıtım verimliliği yaklaşık bir büyüklük sırası22 arttı. Sonuç olarak, dar boyut dağılımına ve dolayısıyla akustik tepkiye sahip monodispers mikro kabarcıklar üretmek, kontrollü mikro kabarcık salınımlarının kritik olduğu ultrason görüntüleme ve terapötik uygulamalar için potansiyellerini en üst düzeye çıkarmanın anahtarıdır.

Monodispers mikro kabarcıklar, dekantasyon23, mekanik filtrasyon24 ve bir polidispers mikro kabarcık maddesinin25 santrifüjlenmesi gibi çeşitli yöntemlerle üretilebilir. Bununla birlikte, hassas boyut kontrolü ve yüksek monodispersite elde etmek bu tekniklerle zor olmaya devam etmektedir26. Alternatif ve daha kontrollü bir yaklaşım, mikroakışkan akış odaklama cihazı kullanılarak monodispers mikro kabarcıkların doğrudan üretilmesidir. Bu işlemde, bir gaz ipliği, bir mikroakışkan çip üzerindeki iki sulu lipozom akışı arasına odaklanır, bu da gaz ipliğinin tekrarlanabilir bir şekilde sıkıştırılmasına yol açar, bu da istenen boyutta27 monodispers mikro kabarcıkların yüksek hızda üretilmesine izin verir. Akış odaklama yöntemleri, monodispers damlacıklar28,29 üretmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, monodispers mikro kabarcık üretimindeki uygulamaları, birleşmeyi önlemenin ve boyut, monodispersite ve konsantrasyon30 açısından uzun vadeli stabiliteyi uygun şekilde korumanın zorluğu nedeniyle daha az yaygındır. Birden fazla mikro kabarcıkların daha büyük kabarcıklarla birleştiği birleşme, monodispersiteyi etkiler. Yüksek üretim sıcaklıklarının birleşmeyi31 azalttığı gösterilmiştir, ancak bu mikroakışkan sistem tasarımını karmaşıklaştırır ve hedefleme ajanları veya ilaç konjugatları içeren formülasyonlar için uygun olmayabilir. Bu nedenle oda sıcaklığında monodispers mikro kabarcıklar üretmek avantajlı olacaktır. Fosfolipid kaplı mikro kabarcıklar zamanla büzülme, çökme ve monodispersitelerini kaybetme eğiliminde olduklarından, bu monodispers mikro kabarcıkları saklama yöntemi de aynı derecede önemlidir32. Depolama sırasında birkaç gün boyunca uzun vadeli stabilitenin sağlanması, monodispers mikro kabarcık teknolojisinin klinik uygulamalara dönüştürülmesi açısından kritik öneme sahiptir.

Bu protokolde, oda sıcaklığında akış odaklı bir mikroakışkan platform kullanarak fosfolipid kaplı monodispers mikro kabarcıkların üretimi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, 13-42 μL/dak arasında değişen lipit akış hızlarıyla uyumludur ve oda sıcaklığında kullanılmak üzere tasarlanmıştır, bu da onu mikroakışkan sistemlerinde sıcaklık kontrolü olmayan laboratuvarlar için uygun hale getirir. Protokol, 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[karbonil-metoksipolietilen glikol] (DPPE-PEG5000) ve stabilite ve tekrarlanabilirlik sağlayan Pluronic F68'den oluşan bir fosfolipid formülasyonu kullanır. Protokol, yeniden kullanılabilir PDMS mikroakışkan çiplerinin üretilmesi, fosfolipid kaplama çözeltilerinin hazırlanması ve oda sıcaklığında üretim sırasında mikro kabarcık birleşmesini önlemek için yüzey aktif madde Pluronic F68'in dahil edilmesi hakkında adım adım talimatlar sağlar. Ayrıca, nozülün tıkanmasını önlemek için mikroakışkan sistemin temizlenmesi, mikro kabarcık boyutunu kontrol etmek için gaz basıncının ve sıvı akış hızının ayarlanması ve üretilen mikro kabarcıkların uzun vadeli stabilite için toplanması ve depolanmasına ilişkin prosedürlerin ayrıntılarını da vermektedir. Bu yöntem, oda sıcaklığında hassas boyut kontrolü ile stabil monodispers mikro kabarcıklar oluşturmak için pratik bir yaklaşım sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lipid filmleri yapmak

NOT: Monodispers mikro kabarcık üretimi için lipit karışımı, 90: 10 molar oranında ikili bir DSPC ve DPPE-PEG5000 karışımı ile formüle edilir. DSPC, hem polidispers 33,34 hem de monodispers mikro kabarcıklar31'de gaz çözünmesine karşı üstün stabilite sağladığı gösterildiğinden ana lipid olarak seçilmiştir. Bu gelişmiş stabilitenin, DPPC (~ 41 °C)35 gibi yaygın olarak kullanılan diğer lipitlerden daha yüksek olan 55 ° C'lik nispeten yüksek jel-sıvı kristal faz geçiş sıcaklığından kaynaklandığı varsayılmaktadır35, böylece oda sıcaklığında 36 daha sert ve geçirimsiz bir lipit kabuğuna yol açar. Burada, 3 mL'lik bir fosfolipid kaplama çözeltisi hazırlamanın bir örneği gösterilmektedir. Monodispers mikro kabarcıklar16,17 üretmek için tipik bir konsantrasyon olan 20 mg/mL'lik nihai bir fosfolipid konsantrasyonu elde etmek için 60 mg fosfolipid gereklidir. Her bir fosfolipid bileşeninin istenen miktarı Tablo 1'de verilmiştir.

  1. Fosfolipid tozunu -20 °C'lik dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saat çözülmeye bırakın.
  2. Gerekli lipit tozunu ayrı 2 mL'lik hacimsel şişelerde tartın.
  3. 100 mL'lik bir cam ölçüm silindiri kullanarak 90 mL kloroformu ölçerek ve ardından bunu 250 mL'lik bir cam Erlenmeyer'e aktararak bir çeker ocakta 100 mL 90:10 v/v kloroform:metanol çözücü karışımı hazırlayın. Daha sonra 100 mL'lik cam ölçüm silindirini kullanarak 10 mL metanol ölçün ve bunu zaten kloroform içeren 250 mL'lik cam Erlenmeyer'e dökün. Cam Erlenmeyer'i bir cam tıpa ile kapatın ve çözelti berraklaşana kadar Erlenmeyer'i hafifçe döndürerek iki çözücüyü karıştırın.
    DİKKAT: Kloroform ve metanol toksik kimyasallardır. Kloroform potansiyel bir kanserojendir ve solunum, cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Metanol son derece yanıcıdır, solunması, yutulması veya deri yoluyla emilmesi halinde toksiktir ve yutulması halinde körlüğe neden olabilir. Dumanların solunmasını önlemek için her zaman iyi havalandırılan bir çeker ocakta kloroform/metanol karışımlarıyla çalışın. Eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü dahil uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Metanolle çalışırken açık alev veya tutuşturucu kaynak bulunmadığından emin olun. Solvent atıklarını kurumun tehlikeli atık protokollerine göre bertaraf edin.
  4. Adım 1.2'de tartılan lipit tozlarını tamamen çözmek için, her 2 mL'lik hacimsel cam şişeye mL kloroform/metanol karışımı ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için cam kapağı hızla kapatın.
    NOT: Lipid tozunun tamamen çözüldüğünden emin olun. Gerekirse, çözünmeyi kolaylaştırmak için şişeyi hafifçe döndürün.
  5. Çözünmüş lipid çözeltilerini, her bir çözeltiyi sırayla dökerek 30 mL'lik bir cam şişeye karıştırın.
  6. Lipid filminin cam yüzey üzerinde eşit dağılımını sağlamak için şişeyi döndürerek çözücüyü sabit bir argon gazı akışı altında buharlaştırın.
    NOT: Çözücünün son izlerinin tek başına argon gazı kullanılarak buharlaştırılması zor olabilir. Daha fazla kurumasını sağlamak için şişeyi çeker ocakta 2 saat bekletin. Argon gazı mevcut değilse, kloroform/metanol çözücüyü buharlaştırmak için nitrojen gazı37 veya 6 °C 31,38'de (yani, DSPC'nin 55 °C35 faz geçiş sıcaklığının üzerinde) çalıştırılan bir vakumlu döner buharlaştırıcı kullanılabilir.
  7. Çözücü buharlaştırıldıktan sonra, kalan organik çözücü kalıntılarını ortadan kaldırmak için lipit karışımını vakuma tabi tutun. Cam şişeyi bir parafilm tabakasıyla kapatın ve vakum sırasında hava akışını sağlamak için bir iğne ile birkaç delik açın.
    NOT: Parafilm kullanmanın amacı, dondurarak kurutma işlemi sırasında lipidin cam şişeden dışarı dağılmasını önlemektir.
  8. Kalan organik çözücüyü çıkarmak için şişeleri gece boyunca vakum altında bir dondurarak kurutucuya yerleştirin.
  9. Bir sonraki adıma geçin veya lipit filmini ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: Bu bölümde veya protokolün başka bir yerinde santrifüjleme adımı kullanılmaz.

2. Akış odaklı mikroakışkan çiplerin imalatı

NOT: Monodispers mikro kabarcıklar, Şekil 1A'da gösterildiği gibi akış odaklı bir mikroakışkan çip kullanılarak üretilir. Nozul ve çıkış boyutları dahil olmak üzere mikroakışkan kanal geometrisinin bir şeması Ek Şekil S1'de verilmiştir. Bu kalıpları hazırlamak için kullanılan SU-8 tabanlı fotolitografi için ayrıntılı bir üretim protokolü daha önce37 açıklanmıştır ve bu protokole Ek Bilgi olarak bulunabilir. PDMS çipinin üretim süreci aşağıdaki adımlarda özetlenmiştir.

  1. Toplam 25,5 g PDMS elde etmek için PDMS bazını (23. g) ve kürleme maddesini (2,3 g) 10:1 ağırlık oranında karıştırın.
  2. Ana kalıbı bir petri kabına yerleştirin ve üzerine PDMS karışımını dökün.
  3. Sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için karışımı vakum altında (2~7 mbar) 40 dakika boyunca gazdan arındırın.
    NOT: Daha büyük hacimlerde, kabarcığın tamamen giderilmesini sağlamak için daha uzun bir gaz giderme süresi gerekebilir.
  4. Kalıbı 1 saat boyunca 75 °C'lik bir sıcak plakaya yerleştirin.
    NOT: Daha büyük hacimler için daha uzun bir kürlenme süresi gerekebilir.
  5. PDMS'nin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bir neşter kullanarak, kürlenmiş PDMS'nin etrafını dikkatlice kesin ve çipi serbest bırakmak için soyun.
  6. PDMS çipini istenen boyutta kesin ve 1 mm'lik bir zımba kullanarak giriş/çıkış deliklerini delin.
  7. Toz parçacıklarını gidermek için PDMS çipini yapışkan bantla temizleyin.
  8. Hem PDMS çipini hem de cam slaytı izopropanol ve ardından deiyonize su ile temizleyin.
  9. PDMS'yi, %1 güçte (60 W) 60 dakika boyunca bir hava plazma temizleyicisinde işlemden geçirerek cam slayta yapıştırın.
  10. Bağlanmayı arttırmak için yapıştırılan çipi 95 °C'lik bir sıcak plakaya 3 dakika yerleştirin.
  11. PDMS çipinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Tamamen üretilmiş çip Şekil 1C'de gösterilmektedir ve nozülün mikroskobik parlak alan resmi Şekil 1D'de gösterilmektedir.
  12. Mikroakışkan kanalın yüzey hidrofilikliğini eski haline getirmek için yapıştırılan çipi %80 güçte (80 W) 5 dakika boyunca plazma temizleyiciye yerleştirin.
  13. Hidrofilikliği korumak için çipi hemen Milli-Q suyla doldurun.
  14. Cipsleri kullanıma kadar oda sıcaklığında Milli-Q suda saklayın.

3. Fosfolipid kaplama çözeltisinin hazırlanması

  1. Hazırlanan lipit filmi -20 °C'lik dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saat çözdürün.
  2. 20 mg / mL'lik bir nihai lipid konsantrasyonuna ulaşmak için lipid filmine (60 mg) 3 mL önceden ısıtılmış (55 °C) fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Şişeleri 40 dakika boyunca 55 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve her 15 dakikada bir orta hızda vorteksleyin (vorteks karıştırıcıda seviye 3/5).
    NOT: Bu adım, adım 3.5'teki sonikasyondan önce PBS'deki lipid bileşenlerini önceden çözmeye ve düzgün bir şekilde dağıtmaya hizmet eder. Bu sıcaklık, DSPC39'un faz geçiş sıcaklığıdır ve kısmi çözünmeyi destekler ve lipit agregasyonunu azaltır. Tam optik netlik elde etmek için adım 3.6'daki sonikasyon gerekli olmasına rağmen, ön termal inkübasyon, büyük lipid agregatlarının oluşumunu en aza indirerek ve dispersiyonun homojenliğini artırarak daha verimli ve tekrarlanabilir sonikasyonu kolaylaştırır.
  3. %10'luk bir molar konsantrasyona ulaşmak için lipid karışımına 0,43 mL Pluronic F68 çözeltisi ekleyin, yani DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81: 9: %10 mol. Daha sonra numune, bulanık bir çözelti olan Şekil 2A'ya görsel olarak benzemelidir.
    NOT: Pluronic F68, monodispers mikro kabarcık üretimi16,40 sırasında birleşmeyi önlemek için kullanılan bir yüzey aktif maddedir. Pluronic F68'in yokluğunda, Horizon mikroakışkan cihaz37ve bu protokolde16 açıklanan lipid formülasyonu kullanılarak monodispers mikro kabarcıklar oluşturulamaz. Lipid formülasyonunda propilen glikol kullanılmamıştır, çünkü bu bileşiğin, elde edilen monodispers mikro kabarcık süspansiyonunun38 hem monodispersitesini hem de stabilitesini tehlikeye attığı bildirilmiştir.
  4. Floresan etiketli monodispers mikro kabarcıkların hazırlanması için, bu aşamada karışıma lipofilik karbosiyanin boyası gibi bir lipit boyası ekleyin.
  5. Lipid karışımını bir su banyosunda 20 dakika boyunca% 100 güçte sonikasyon yapın ve su sıcaklığını 55 ° C'de tutun. Lipid çözeltisi, 20 dakika sonra Şekil 2B'ye benzemelidir, bu da adım 3.4'ten daha az bulanık bir çözeltidir. Şekil 2C'de gösterildiği gibi, çözelti berraklaşana kadar 10 dakikalık aralıklarla sonikasyona devam edin.
    NOT: Şekil 2C'deki çözelti için, berrak bir çözüm elde etmek için 30 dakikalık sonikasyon gerekliydi. Lipid çözeltisinin karakterizasyonu, örneğin dinamik bir ışık dağıtıcı kullanılarak lipozom boyutunun ölçülmesiyle gerçekleştirilebilir.
  6. Daha fazla işlemden önce lipit çözeltisinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

4. Mikro kabarcık toplama şişesinin hazırlanması

NOT: Monodispers mikro kabarcıkların uzun süreli depolanmasını sağlamak için, toplama şişesi olarak gaz geçirmez bir tıbbi şişeye ihtiyaç vardır.

  1. 5 mL'lik bir cam tıbbi şişeyi lastik bir tıpa ile kapatın ve şişeyi C4F10 gazı ile doldurun. Daha sonra, gaz sızdırmazlığını sağlamak için şişenin etrafına alüminyum bir kapak kıvırın. Toplama şişesi artık kullanıma hazırdır.

5. Mikroakışkan platformun hazırlanması

NOT: Şekil 3A'da gösterildiği gibi, sistem Horizon mikroakışkan platformu37 (bundan sonra 'mikroakışkan platform' olarak anılacaktır), kontrol için bir bilgisayar, üretim sürecini izlemek için yüksek hızlı bir kamera, yüksek hızlı görüntüleme sırasında aydınlatma için harici bir ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı ve üretim sırasında belirli aralıklarla yüksek hızlı görüntülemeyi tetiklemek için bir fonksiyon dalga biçimi üreteci içerir. Mikro kabarcık üretimine başlamadan önce, nozulun tıkanma olasılığını azaltmak için cihaz temizlenmelidir. Temizleme prosedürü hem boruyu hem de mikroakışkan çipi içerir.

  1. Boru temizleme prosedürü
    1. Sağ tarafta bulunan mikroakışkan platformun güç anahtarını açın (Şekil 3A).
      NOT: "Güç anahtarı", sistemin dahili mikro denetleyicisini, pompalarını ve sensörlerini etkinleştiren Horizon platformunun ana güç kontrol ünitesini ifade eder.
    2. Mikroakışkan platformun P-pompa odasının sol tarafına %70 etanol ile doldurulmuş 4 mL'lik bir cam şişe yerleştirin (Şekil 3). Sıvı akışını 100 μL/dk'da başlatın, böylece sıvı giriş borusu şişedeki %70 etanol ile yıkanacaktır. 5 dakika sonra sıvı akışını durdurarak yıkamayı durdurun.
      NOT: P-pompası, mikroakışkan sisteme entegre edilmiş basınç kontrollü gaz dağıtım ünitesini ifade eder. Bu adım yalnızca boruyu temizlemek için tasarlanmıştır; Bu aşamada boru mikroakışkan çipe bağlanmamalıdır. Bu işlem, etanolde çözünebilen toz ve kirletici maddeleri akışkan sistemden uzaklaştırır.
    3. Etanol dolu şişeyi Milli-Q su dolu bir şişe ile değiştirin.
    4. Sistemden kalan etanolü çıkarmak için boruyu 100 μL/dk'da Milli-Q suyla 5 dakika yıkayın.
  2. Talaş temizleme prosedürü
    1. Mikroakışkan platformun dahili LED ışık anahtarını açın.
    2. PDMS çipini tutucuya yerleştirin.
    3. Manifoldu çipin üzerine konumlandırın ve ayarlanabilir tekerleği kullanarak sabitleyin.
    4. Gaz, sıvı ve çıkış borusunu cımbız kullanarak PDMS çipine takın. Bağlantı konfigürasyonu Şekil 3B'de gösterilmektedir. Temizleme işleminden kaynaklanan atık çözeltiyi toplamak için çıkış borusunun bir şişeye gittiğinden emin olun.
    5. Çipin nozulunu objektifin görüş alanı içinde konumlandırmak için platformu ayarlayın.
    6. Çipi 1000 mbar gaz basıncı ve 100 μL/dk sıvı akış hızı kullanarak 5 dakika boyunca Milli-Q su ile temizleyin. Önce gaz akışını başlatın, ardından sıvı akışını takip edin.
      NOT: Bu adım, nozülün yukarısındaki mikroakışkan çipi temizlemek içindir.
    7. Sıvı akışını ve ardından gaz akışını durdurun.
    8. Gaz ve çıkış borularını (Şekil 3C)'de gösterildiği gibi yeniden bağlayın.
    9. Yıkama prosedürünü 1000 mbar gaz basıncı ve 50 μL/dak sıvı akış hızı kullanarak Milli-Q su ile 5 dakika daha tekrarlayın. Önce gaz akışını başlatın, ardından sıvı akışını takip edin.
      NOT: Bu kurulum, nozülün aşağısındaki mikroakışkan çipi temizler.
    10. Sıvı akışını ve ardından gaz akışını durdurun. PDMS çipi artık mikro kabarcık üretimi için hazır.

6. Yüksek hızlı görüntüleme kurulumu

NOT: Monodispers mikro kabarcıkların üretimini izlemek ve kontrol etmek için, mikro kabarcık 105 mikro kabarcık / s'den daha yüksek bir üretim hızında üretileceğinden, mikroakışkan platformla yüksek hızlı bir kameranın entegre edilmesi önerilir. Yüksek hızlı kamera, çip üzerindeki mikro kabarcık boyutunun ve üretim hızının ölçülmesinin yanı sıra çip üzerindeki mikro kabarcık birleşmesinin izlenmesine olanak tanır.

  1. Yüksek hızlı görüntüleme sırasında mikroakışkan çipi aydınlatmak için montaj platformunun üzerine bir LED ışık kaynağı monte edin (Şekil 3A).
  2. Yüksek hızlı kamerayı mikroakışkan platformun yan görüntüleme bağlantı noktasına bağlayın.
  3. Mikro kabarcık üretiminin tüm süresi boyunca 10 sn aralıklarla yüksek hızlı kayıtları tetiklemek için harici bir fonksiyon dalga biçimi üreteci kullanın. Senkronize alım sağlamak için dalga biçimi üretecinin TTL tetikleme çıkışını standart bir BNC kablosu kullanarak yüksek hızlı kameranın harici tetikleme girişine bağlayın. Bu izleme, üretim sırasında gaz ipliğinin şeklini ve mikro kabarcıkların boyut stabilitesini değerlendirmek için gereklidir.
    NOT: Üretim sırasında tıkanma meydana gelebileceğinden sürekli izleme önemlidir. Ek olarak, yüksek hızlı görüntü dizileri, çip üzerinde zamanla çözülen mikro kabarcık boyutu dağılımlarını çıkarmak için kullanılır. Bu 10 saniyelik aralık, kullanıcı gereksinimlerine bağlı olarak ayarlanabilir.'

7. Monodispers mikro kabarcıkların üretimi ve karakterizasyonu

  1. Üretime başlamadan önce, toplama şişesini Şekil 4A'da gösterildiği gibi kurun. Toplama iğnesi olarak hizmet etmek için bir iğneyi lastik tıpadan ve iğnenin ucu şişenin dibine yakın olacak şekilde havalandırma iğnesi olarak başka bir iğneyi tıpadan delin. Üretim sırasında toplama şişesini bir kelepçe kullanarak ters çevirin.
    NOT: Havalandırma iğnesi, toplama sırasında flakon içinde sabit basınç sağlar. C4F10 havadan ağır olduğu için şişeden kendiliğinden çıkmaz.
  2. Hazırlanan fosfolipid çözeltisini mikroakışkan platformun P-pompasına yükleyin.
  3. Çipin meme kısmını objektifin görüş alanına getirin.
    NOT: Mikroakışkan platform, ayarlanabilir yakınlaştırma ve odaklamaya sahip dahili bir optik modül ve yüksek hızlı bir kamera takmak için harici bir F montajlı kuplör içerir.
  4. Mikro kabarcık üretimini başlatmak için gaz basıncını 800 mbar'a ve sıvı akış hızını 40 μL/dk'ya ayarlayın.
    NOT: Mikroakışkan platform, solda 1-5 μL/dak ve sağda 1-100 μL/dak olmak üzere iki akış kontrollü sıvı kanalını ve bir basınç kontrollü gaz kanalını entegre eder. Bu protokolde 1-100 μL/dk sıvı kanalı ve basınç kontrollü gaz kanalı kullanılmıştır.
  5. Sıvı nozüle ulaştığında, gaz ipliği sıkışır ve çıkıştan monodispers mikro kabarcıklar çıkarır (Şekil 4A).
  6. Yüksek hızlı kaydı ≥ 200.000 fps kare hızına ayarlayın ve MATLAB'daki imfindcircles işlevi aracılığıyla üretilen mikro kabarcıkların boyutunu ölçmek için yüksek hızlı kayıtları kullanın.
  7. Mikro kabarcık boyutunu kontrol etmek için gaz basıncını ve sıvı akış hızını ayarlayın.
    NOT: Akış hızını ve/veya gaz basıncını ayarladıktan sonra, yüksek hızlı kayıttan çip üzerindeki boyut dağılımını çizmek için MATLAB komut dosyasını kullanın. Boyut dağılımını bir Gauss dağılımına uydurarak, ortalama μ ve standart sapma σ türetilebilir. μ, üretilen monodispers mikro kabarcıkların çip üzerindeki boyutunu temsil eder. Mikro kabarcık birleşmesi, lipit konsantrasyonunu seyrelten boruda kalan Milli-Q suyu nedeniyle üretimin ilk aşamasında meydana gelebilir. Bu sorun genellikle seyreltilmemiş lipit çözeltisi nozüle ulaştığında çözülür. Tablo 2, 800 mbar'lık sabit bir gaz basıncında uygulanan birkaç akış hızı için elde edilen mikro kabarcık çaplarını özetlemektedir; Gaz basıncı ve sıvı akış hızının çeşitli kombinasyonları benzer mikro kabarcık boyutları üretebilir, ancak farklı parametre kombinasyonları da üretim hızını etkiler. Sabit bir gaz akış hızında, üretim hızının sıvı akış hızları41 ile pozitif korelasyon gösterdiği bilinmektedir. Bu protokoldeki mikro kabarcık üretim hızı, benzer akış odaklama geometrileri37 için daha önce bildirilen değerlerle tutarlı olan yüksek hızlı kayıtların kare kare analizine dayalı olarak saniyede ~105 mikro kabarcık mertebesindedir.
  8. İstenilen mikro kabarcık boyutuna ulaşıldığında, çıkış borusunu toplama şişesine bağlayarak üretilen mikro kabarcıkları toplayın.
  9. Toplama sırasında, üretim sürecini izlemek için yüksek hızlı kaydı her 10 saniyede bir tetiklenecek şekilde ayarlayın.
    NOT: Kayıtlar arasındaki aralık, özel gereksinimlere göre ayarlanabilir.
  10. Yeterli mikro kabarcık süspansiyonu toplandıktan sonra, hem havalandırma iğnesini hem de toplama iğnesini toplama şişesinden çıkarın.
  11. Sıvı akışını ve ardından gaz akışını durdurun.
  12. Toplanan mikro kabarcıkları oda sıcaklığında dik olarak saklayın ve şişenin mekanik olarak minimum düzeyde çalkalanmasını sağlayın.
    NOT: Mikro kabarcık çözeltisi, Şekil 5A'da gösterildiği gibi üç katmana sahip olacaktır: bir köpük katmanı, bir monodispers mikro kabarcık katmanı ve bir subnatant. Önceki çalışmalar, köpükle ilişkili kabarcıkların kademeli olarak monodispers boyut 16,38'e küçülebileceğini bildirdiğinden, köpük tabakasını şişede bırakmak en iyisidir. Bu protokol kullanılarak üretilen mikro kabarcıklar, düzenleyici güvenlik değerlendirmesinden geçmemiştir. Bununla birlikte, kurucu lipidler (DSPC, DPPE-PEG5000) ve yüzey aktif madde (Pluronic F68), FDA onaylı enjekte edilebilir formülasyonlarda yaygın olarak kullanılır ve biyouyumlu olarak kabul edilir42,43. Tıbbi kullanım için güvenliği sağlamak için daha fazla klinik öncesi değerlendirme gereklidir.
  13. Üretim sonrası 2 saat (yani, monodispers mikro kabarcıkların üretiminden 2 saat sonra), bir partikül karakterizasyon makinesi kullanarak mikro kabarcıkların nihai boyutunu ve konsantrasyonunu karakterize eder.
    NOT: Akış odaklama yöntemiyle üretilen monodispers mikro kabarcıkların nihai boyutlarına44 stabilize olmaları için yaklaşık 90 dakika gerekir. Bu nedenle, mikro kabarcıkları kullanmadan önce en az 2 saat stabilizasyona izin verilmesi önerilir.
  14. Bundan sonra 'ekstraksiyon şırıngası' olarak anılacak olan mL'lik bir şırıngaya 19 G'lik bir iğne takın.
  15. Mikro kabarcık şişesine havalandırma iğnesi olarak ayrı bir 19 G iğne yerleştirin. Mikro kabarcık ekstraksiyonu sırasında hava girişine izin vermek ve iç basıncı korumak için iğnenin ucunun şişenin üst kısmına yakın kaldığından emin olun.
  16. Süspansiyonu homojen hale getirmek için şişeyi hafifçe döndürün. Süspansiyon üç katmana ayrılacaktır: bir üst köpük katmanı, monodispers mikro kabarcıklar içeren bir orta katman ve bir alt sulu katman.
  17. Ekstraksiyon şırıngasını hızlı bir şekilde yerleştirin ve iğne ucunu, köpükten ve alt sulu subnatant tabakadan kaçınarak monodispers mikro kabarcık tabakasının ortasına dikkatlice yerleştirin. İstenilen hacimde mikro kabarcık süspansiyonunu geri çekin ve ekstraksiyon şırıngasını şişeden çıkarın. Mikro kabarcık ekstraksiyonu tamamlandığında havalandırma iğnesini çıkarın.

8. Temizleme ve kapatma prosedürü

NOT: Mikro kabarcık üretiminden sonra, düzgün çalışmasını sağlamak ve çipin yeniden kullanılmasına izin vermek için mikroakışkan platform ve çip iyice temizlenmelidir. Aşağıdaki adımlar temizleme işlemini özetlemektedir.

  1. Çip için aşağıdakileri yapın:
    1. Lipid şişesini bir Milli-Q su şişesi ile değiştirin.
    2. Mikroakışkan çipi 800 mbar gaz basıncı ve 40 μL/dak sıvı akış hızı kullanarak 5 dakika boyunca yıkayın.
    3. Önce sıvı akışını durdurun, ardından gaz akışını durdurun.
    4. Mikroakışkan çipten yalnızca gaz giriş borusunu ayırın.
    5. İç yüzeylerin hidrofilikliğini korumak için mikroakışkan çipi Milli-Q suyla doldurun.
    6. Sıvı akışını durdurun ve kalan tüm boruları çipten ayırın.
    7. Çipi ileride kullanmak üzere ihtiyaç duyulana kadar Milli-Q suda saklayın.
  2. Mikroakışkan sistem için aşağıdakileri yapın:
    1. Mili-Q su şişesini mikroakışkan platformda% 70 etanol şişesi ile değiştirin.
    2. Lipid kalıntılarını gidermek için sıvı giriş borusunu 5 dakika boyunca 100 μL/dak akış hızında %70 etanol ile yıkayın.
    3. Etanol şişesini P-Pump1'de bir Milli-Q su şişesi ile değiştirin.
    4. Sistemden kalan etanolü çıkarmak için boruyu 100 μL/dk'da Milli-Q suyla 5 dakika yıkayın. Sistem artık temiz.
    5. Mikroakışkan platformu ve yüksek hızlı kamera sistemini kapatın.

9. Sorun giderme adımları

  1. Meme tıkanıklığı
    NOT: Nozulun küçük boyutu (5 μm) göz önüne alındığında, üretim sürecinde tıkanmalar meydana gelebilir. Tıkanıklığı gidermek için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Derhal sıvı akışını ve ardından gaz akışını durdurun.
    2. Boruyu Şekil 3B'de gösterilen kuruluma göre yeniden bağlayın.
    3. Fosfolipid dolu şişeyi P-Pump1'de Milli-Q su dolu bir şişe ile değiştirin.
    4. 1000 mbar'lık bir gaz basıncı uygulayın ve nozulu yıkamak için sıvı akış hızını 5 dakika boyunca 100 μL/dk'ya ayarlayın.
      NOT: Çoğu durumda, tıkanıklıklar 5 dakikalık bir durulamadan sonra giderilir. Ancak tıkanma devam ederse PDMS çipinin yenisiyle değiştirilmesi gerekebilir.
    5. Tıkanıklık giderildikten sonra, boruyu Şekil 3C'de gösterildiği gibi yeniden bağlayın.
    6. Tam açıklık sağlamak için çipi 1000 mbar'lık bir gaz basıncı ve 50 μL/dak'lık bir sıvı akış hızı kullanarak 5 dakika boyunca Milli-Q suyla tekrar yıkayın.
    7. Milli-Q su dolu şişeyi P-Pump1'deki fosfolipid dolu şişe ile değiştirin ve mikro kabarcık üretimine devam edin.
      NOT: Üretim sırasında tıkanmalar devam ederse, bu, borunun veya mikroakışkan çipin yetersiz temizlendiğini gösterebilir. Bu durumda, boruyu çipten ayırın ve 5. adımda özetlenen temizleme prosedürünü izleyin. Tüm sistem iyice temizlendikten sonra tıkanmalar meydana gelmeye devam ederse, bu durum mikroakışkan platformdaki iç filtrede bir arıza olduğunu gösterebilir. Filtreyi yenisiyle değiştirmek sorunu çözebilir.
  2. İstenirse mikroakışkan çipi yeniden kullanın.
    NOT: Çip uygun şekilde saklanmazsa hidrofilikliğini kaybedebilir. Bu meydana gelirse, gaz ipliğinin sıkışması Şekil 5E'de gösterilen modele benzeyebilir. Bu gibi durumlarda tutarlı ve güvenilir mikro kabarcık üretimi sağlamak için hidrofilik yeni bir çipe geçilmesi önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, akış odaklı bir mikroakışkan çip kullanarak oda sıcaklığında kararlı, monodispers mikro kabarcıklar üretmek için bir yöntem sunuyoruz. PDMS çipi, Şekil 1'de gösterildiği gibi bir ana kalıptan dökülerek üretilir. PDMS çipini bir cam slayta bağlamak için plazma işlemi kullanılır. Plazma işlemi, PDMS yüzeyini hidrofobikten hidrofilik hale getirdiği için çok önemlidir. Bu hidrofiliklik, mikro kabarcık üretimi sırasında gaz ipliğinin şeklini ve konumunu korumak için gereklidir ve t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bir mikroakışkan akış odaklama çipi kullanılarak oda sıcaklığında stabil monodispers mikro kabarcıkların nasıl üretileceğini ve saklanacağını ayrıntılı olarak açıklar. Monodispers mikro kabarcık, hem in vitro hem de in vivo olarak kontrastlı ultrason görüntüleme18, non-invaziv basınç algılama19 ve mikro kabarcık aracılı ilaç dağıtımı22 için kullanılabilir.

Mo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve Yenilik Programı (Hibe Anlaşması 805308) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) ve kısmen de NWO'nun bir parçası olan Uygulamalı ve Mühendislik Bilimleri TTW (VIDI-proje 17543) tarafından finanse edildi. Horizon Mikroakışkan Platformu, EPSRC hibelerinden (Hibe No. EP/I000623 ve EP/K023845) sağlanan fonla geliştirilmiştir. Yazarlar, yararlı tartışmalar için Leeds Üniversitesi'ndeki Microbubble Konsorsiyumu'na (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) ve Horizon Microfluidic Platform için enstrüman ve parça üretiminin kavramsallaştırılmasındaki yardımları için Stuart Weston ve Andrew Price'a teşekkür eder. PDMS çiplerini üretmek için ana kalıp, Leeds Üniversitesi tarafından sağlandı. Yazarlar, deneyler sırasında teknik yardım için her ikisi de Erasmus MC, Hollanda'dan Biyomedikal Mühendisliği, Kardiyoloji Bölümü'nden Robert Beurskens ve Deneysel Tıbbi Enstrümantasyon Bölümü'nden Geert Springeling'e teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mm biyopsi deliği Kai Medikal143831
1,1'-Dioktadesil-3,3,3',3'-Tetrametilindodikarbosiyanin (DiD)Thermo Fisher BilimselD307 Serisilipofilik bir karbosiyanin boyası
1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[karbonil-metoksipolietilen glikol] (DPPE-PEG5000)LipoidCAS-Hayır. 384835-61-4
1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC)LipoidCAS-Hayır. 816-94-4
100 mL cam ölçüm silindiriBLAUBRAND
2 mL hacimsel cam şişelerBLAUBRAND
250 mL cam ErlenmeyerBLAUBRAND
30 mL cam şişe DWK Yaşam BilimleriSCERC40752700D0C2
%70 etanol
75 &derece; C sıcak plaka 
Yapışkan bant
Alüminyum kapak Sigma-aldrich27016
Argon gazı  Linde Gaz Benelüks
C4F10 gazıF2 Kimyasalları
KloroformMerck KGaA67-66-3
Klinik olarak mevcut  Ultrason kontrast maddesi (yani mikro kabarcık)Bracco,
Plan-LesOuates, İsviçre		SonoVueŞekil 6A.
Toplama ve havalandırma 19G iğne100 Sterik4657799
Coulter Sayaç Multisizer 3Beckman CoulterPartikül karakterizasyon makinesi
Özel yapım ultrason kontrast maddesi (yani monodispers mikro kabarcık)NAF1-10PF SerisiŞekil 6A. Tarafından açıklandığı gibi üretilmiştir: Wang, Y. ve diğerleri. Pluronic F68'in Oda Sıcaklığında Üretilen Monodispers Fosfolipid Kaplı Mikro Kabarcıkların Boyut Kararlılığı ve Akustik Davranışı Üzerindeki Etkisi. ACS Uygulama Mater. Arayüzler 2025, 17, 8976&eksi;8986. (2025).
Özel yapım ultrason kontrast maddesi (yani monodispers mikro kabarcık)NAF2-10 PFŞekil 6A. Tarafından açıklandığı gibi üretilmiştir: Wang, Y. ve diğerleri. Pluronic F68'in Oda Sıcaklığında Üretilen Monodispers Fosfolipid Kaplı Mikro Kabarcıkların Boyut Kararlılığı ve Akustik Davranışı Üzerindeki Etkisi. ACS Uygulama Mater. Arayüzler 2025, 17, 8976&eksi;8986. (2025).
yarı su
Harici LED ışıkGSVITECGS02370
Dondurarak kurutucuMertin Christ GmbHAlfa 1– 2 LD artı
Fonksiyon dalga formu üreteci Gilent33220A Serisi
Gaz geçirmez cam şişeSigma-aldrichZ113964-288EA
Cam slaytVWR631-1552
Yüksek hızlı kameraPhotronNova S16
Horizon mikroakışkan platformuLeeds Üniversitesi, İngilterePlatform ticari olarak mevcuttur ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır: Abou-Saleh, R. H. ve ark. Horizon: Terapötik mikro kabarcıkların ve nanokabarcıkların üretimi için mikroakışkan platform. Bilimsel Araçların Gözden Geçirilmesi. 92 (7), 074105 (2021).
MatlabMatematik İşleriR2023a
MetanolMerck KGaA67-56-1
Milli-Q su
PDMS jeliSYLGARDSYLGARD®   184
Fosfat tamponlu salin (PBS 1x) Gibco10010023
Plazma temizleyiciHenniker BilimselHPT-100 Serisi
Pluronic F68Thermo Fisher Bilimsel24040032
Kauçuk tıpaSigmaZ166065-100 EA
BoruYüksek EsnekMFLX06407-41PTFE, 1/32" İç Çap x 1/16 " Dış Çap; 25 ft
Cımbız
Vortex Sigma-aldrichZ654779
Su banyosu sonikatörüEMAGEMMI 30HC

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasound molecular imaging and therapy. Curr Opin Chem Biol. 63, 171-179 (2021).
  3. Frinking, P., et al. Three decades of ultrasound contrast agents: A review of the past, present and future improvements. Ultrasound Med Biol. 46 (4), 892-908 (2020).
  4. Greis, C. Ultrasound contrast agents as markers of vascularity and microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (1-2), 1-9 (2009).
  5. Correas, J. M., et al. Ultrasound contrast agents. Examples of blood pool agents. Acta Radiol Suppl. 412, 101-112 (1997).
  6. Kooiman, K., et al. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 72C, 28-48 (2014).
  7. de Jong, N., et al. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 861-873 (2009).
  8. Cosgrove, D., Harvey, C. Clinical uses of microbubbles in diagnosis and treatment. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 813-826 (2009).
  9. Langeveld, S. A. G., et al. The impact of lipid handling and phase distribution on the acoustic behavior of microbubbles. Pharmaceutics. 13 (1), 119(2021).
  10. Dicker, S., et al. Influence of shell composition on the resonance frequency of microbubble contrast agents. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1292-1302 (2013).
  11. Doinikov, A. A., Haac, J. F., Dayton, P. A. Resonance frequencies of lipid-shelled microbubbles in the regime of nonlinear oscillations. Ultrasonics. 49 (2), 263-268 (2009).
  12. Sennoga, C. A., et al. Evaluation of methods for sizing and counting of ultrasound contrast agents. Ultrasound Med Biol. 38 (5), 834-845 (2012).
  13. Schneider, M., et al. Br1: A new ultrasonographic contrast agent based on sulfur hexafluoride-filled microbubbles. Invest Radiol. 30 (8), 451-457 (1995).
  14. Wang, S., et al. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  15. Whittingham, T. A. Contrast-specific imaging techniques: Technical perspective. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2005).
  16. Wang, Y., et al. Influence of pluronic f68 on size stability and acoustic behavior of monodisperse phospholipid-coated microbubbles produced at room temperature. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2025).
  17. Segers, T., de Jong, N., Versluis, M. Uniform scattering and attenuation of acoustically sorted ultrasound contrast agents: Modeling and experiments. J Acoust Soc Am. 140 (4), 2506(2016).
  18. Segers, T., et al. Monodisperse versus polydisperse ultrasound contrast agents: Non-linear response, sensitivity, and deep tissue imaging potential. Ultrasound Med Biol. 44 (7), 1482-1492 (2018).
  19. van Hoeve, W., et al. Improved sensitivity of ultrasound-based subharmonic aided pressure estimation using monodisperse microbubbles. J Ultrasound Med. 41 (7), 1781-1789 (2022).
  20. Wang, P., et al. Sensitivity improvement of subharmonic-based pressure measurement using phospholipid-coated monodisperse microbubbles. Ultrason Sonochem. 104, 106830(2024).
  21. Spiekhout, S., et al. Ambient pressure sensitivity of subharmonic vibrating single microbubbles. Ultrasound Med Biol. 51 (6), 931-940 (2025).
  22. van Elburg, B., et al. Dependence of sonoporation efficiency on microbubble size: An in vitro monodisperse microbubble study. J Control Release. 363, 747-755 (2023).
  23. Goertz, D. E., et al. Attenuation and size distribution measurements of definity and manipulated definity populations. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1376-1388 (2007).
  24. Emmer, M., et al. Pressure-dependent attenuation and scattering of phospholipid-coated microbubbles at low acoustic pressures. Ultrasound Med Biol. 35 (1), 102-111 (2009).
  25. Feshitan, J. A., et al. Microbubble size isolation by differential centrifugation. J Colloid Interface Sci. 329 (2), 316-324 (2009).
  26. Pulsipher, K. W., et al. Engineering theranostic microbubbles using microfluidics for ultrasound imaging and therapy: A review. Ultrasound Med Biol. 44 (12), 2441-2460 (2018).
  27. Castro-Hernández, E., et al. Microbubble generation in a co-flow device operated in a new regime. Lab Chip. 11 (12), 2023(2011).
  28. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  29. Xu, S., et al. Generation of monodisperse particles by using microfluidics: Control over size, shape, and composition. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (5), 724-728 (2005).
  30. Stride, E., et al. Microbubble agents: New directions. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  31. Segers, T., et al. Improved coalescence stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at elevated temperatures. Lab Chip. 19 (1), 158-167 (2019).
  32. Dixon, A. J., et al. Enhanced intracellular delivery of a model drug using microbubbles produced by a microfluidic device. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1267-1276 (2013).
  33. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: Effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  34. Daeichin, V., et al. Microbubble composition and preparation for high-frequency contrast-enhanced ultrasound imaging: In vitro and in vivo evaluation. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 64 (3), 555-567 (2017).
  35. Chen, W., et al. Determination of the main phase transition temperature of phospholipids by nanoplasmonic sensing. Sci Rep. 8 (1), 14815(2018).
  36. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Adv Colloid Interface Sci. 183-184, 82-99 (2012).
  37. Abou-Saleh, R. H., et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Rev Sci Instrum. 92 (7), 074105(2021).
  38. Segers, T., et al. Universal equations for the coalescence probability and long-term size stability of phospholipid-coated monodisperse microbubbles formed by flow focusing. Langmuir. 33 (39), 10329-10339 (2017).
  39. Kaneshina, S., et al. Barotropic phase transitions of dioleoylphosphatidylcholine and stearoyl-oleoylphosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 1374 (1-2), 1-8 (1998).
  40. Shih, R., et al. Flow-focusing regimes for accelerated production of monodisperse drug-loadable microbubbles toward clinical-scale applications. Lab Chip. 13 (24), 4816(2013).
  41. Cleve, S., et al. Microbubble formation by flow focusing: Role of gas and liquid properties, and channel geometry. J Fluid Mech. 972, A27(2023).
  42. Rodeheaver, G. T., et al. Pluronic f-68: A promising new skin wound cleanser. Ann Emerg Med. 9 (11), 572-576 (1980).
  43. Moloughney, G., Weisleder, J. Poloxamer 188 (p188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications. Recent Pat Biotechnol. 6 (3), 200-211 (2012).
  44. Segers, T., et al. Stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at high production rates. Langmuir. 32 (16), 3937-3944 (2016).
  45. Izadiamoli, S., et al. A comprehensive experimental approach to understanding the effects of surface wettability on bubble formation at submerged orifices. Energy Equip Syst. 13 (2), 169-191 (2025).
  46. Dollet, B., et al. Role of the channel geometry on the bubble pinch-off in flow-focusing devices. Phys Rev Lett. 100 (3), 034504(2008).
  47. Shih, R., Lee, A. P. Post-formation shrinkage and stabilization of microfluidic bubbles in lipid solution. Langmuir. 32 (8), 1939-1946 (2016).
  48. Segers, T., et al. Foam-free monodisperse lipid-coated ultrasound contrast agent synthesis by flow-focusing through multi-gas-component microbubble stabilization. Appl Phys Lett. 116 (17), 173701(2020).
  49. Beekers, I., et al. Internalization of targeted microbubbles by endothelial cells and drug delivery by pores and tunnels. J Control Release. 347, 460-475 (2022).
  50. Beekers, I., et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 322, 426-438 (2020).
  51. Zhang, W. Q., et al. Influence of molecular weight of polydimethylsiloxane precursors and crosslinking content on degree of ethanol swelling of crosslinked networks. React Funct Polym. 86, 264-268 (2015).
  52. Ren, K., et al. Materials for microfluidic chip fabrication. Acc Chem Res. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  53. Segers, T., et al. High-precision acoustic measurements of the nonlinear dilatational elasticity of phospholipid coated monodisperse microbubbles. Soft Matter. 14 (47), 9550-9561 (2018).
  54. Jeong, H. H., et al. Liter-scale production of uniform gas bubbles via parallelization of flow-focusing generators. Lab Chip. 17 (15), 2667-2673 (2017).
  55. Jiang, C., et al. Microfluidic-assisted formation of multifunctional monodisperse microbubbles for diagnostics and therapeutics. Micro Nano Lett. 6 (6), 417(2011).
  56. Hashimoto, M., et al. Formation of bubbles and droplets in parallel, coupled flow-focusing geometries. Small. 4 (10), 1795-1805 (2008).
  57. Maskarinec, S. A., et al. Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J. 82 (3), 1453-1459 (2002).
  58. Frey, S. L., Lee, K. Y. C. Temperature dependence of poloxamer insertion into and squeeze-out from lipid monolayers. Langmuir. 23 (5), 2631-2637 (2007).
  59. Borden, M. A., et al. Lateral phase separation in lipid-coated microbubbles. Langmuir. 22 (9), 4291-4297 (2006).
  60. Borden, M. A., et al. Surface phase behavior and microstructure of lipid/peg-emulsifier monolayer-coated microbubbles. Colloids Surf B Biointerfaces. 35 (3-4), 209-223 (2004).
  61. van den Broek, M. R. P., et al. Functionalized monodisperse microbubble production: Microfluidic method for fast, controlled, and automated removal of excess coating material. Microsyst Nanoeng. 10 (1), 120(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Monodispers MikrobaloncuklarFosfolipid KaplamaUltrason Kontrast AjanlarOda S cakl nda retimMikrobaloncuk StabilitesiPDMS Mikroak kan iplerMikrobaloncuk Boyut KontrolS rfaktan Pluronic F68Mikrobaloncuk Terap tik Uygulamalar
Video yakında

İlgili makaleler