Method Article

Mezoskopik Tüm Hücreli Beyin Haritalama İçin Taramalı Elektron Mikroskopi Uyumlu Optik Görüntüleme Yöntemi

DOI:

10.3791/68814

⸱

February 20th, 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Engineering (Suzhou), Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Province Key Laboratory of Biomedical Imaging and Intelligent Processing, Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, City University of Hong Kong, 4Institute for Brain and Intelligence, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin örneklerindeki tüm hücrelerin mezoscale olarak tarafsız görüntülenmesini sağlayan ve aynı örnekte bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopisinin görüntüleme iş akışına sorunsuz entegre edilebilen Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı yeni bir görüntüleme tekniği tanıttık.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyindeki karmaşık sinir ağları içindeki yapısal ve fonksiyonel ilişkileri anlamak, hem geniş bir görüş alanına hem de hücrealtı çözünürlüğe sahip beyin atlaslarının oluşturulmasını gerektirir. Ancak, mevcut optik ve elektron mikroskopi görüntüleme yöntemlerinin her biri sınırlamalara sahiptir ve bu da tek bir örnek içindeki tüm hücrelerin görüntülenmesini zorlaştırır. Bu protokol, elektron mikroskopi örnek hazırlanması sonrası beyin örneklerindeki tüm hücrelerin gözetim ayrım gözetmeden görüntülenmesini mümkün kılan Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı görüntüleme tekniğini tanıtır ve böylece tüm sinir hücrelerinin tam bir beyin atlasını yeniden oluşturur. Buna ek olarak, OMLIT görüntüleme, otomatik bant toplama ultramikrotomi taramalı elektron mikroskopisi (ATUM-SEM) görüntüleme iş akışıyla sorunsuz entegre edilebilir. Bu sayede araştırmacılar elektron mikroskopi görüntülemeden önce hücrelerin mezoscale yapısal bilgilerini elde etmelerine olanak tanır; bu da ilgi alanlarının hassas seçimini kolaylaştırır ve yüksek çözünürlüklü elektron mikroskopi (EM) görüntüleme için gereken alan ve veri hacmini önemli ölçüde azaltır. Bu yöntemin doğruluğunu ve uyumluluğunu yetişkin fare beyin korteksinden alınan gerçek örneklerde doğruladık ve çok ölçekli beyin atlası yapımında geniş uygulama olanaklarını gösterdik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin yapısını ve işlevini ortaya çıkarmak için sinir devrelerinin hücresel ve alt hücresel çözünürlükte kapsamlı haritalanması gereklidir. İki fotonmikroskopisi 1, floresans mikro-optik kesitli tomografi (fMOST)2,3,4 ve VISoR sistemi5 gibi geleneksel optik görüntüleme yöntemleri, mezoscale nöron görüntüleme ve in vivo fonksiyonel görüntülemeyi mümkün kılmıştır. Ancak, seyrek etiketlemeye bağımlılıkları nedeniyle, tüm hücresel popülasyonu yakalayamıyorlar. Öte yandan, fonksiyonel fotoakustik mikroskopi (fPAM)6,7, optik koherens tomografi (OCT)8 ve nicel fazmikroskopisi 9 gibi etiketsiz optik görüntüleme teknikleri, görüş alanındaki tüm nöronları aynı anda görselleştirme potansiyeline sahiptir. Buna rağmen, bu yöntemler genellikle düşük eksenel çözünürlük ve sığ görüntüleme derinliği nedeniyle sınırlıdır ve donanım karmaşıklığı beyin atlası yapımında yaygın uygulanmasını engeller. Buna karşılık, seri kesitli elektron mikroskopi (ssEM) teknikleri; bunlar arasında seri blok yüzlü SEM (SBF-SEM)10,11, odaklı iyon ışını SEM (FIB-SEM)12,13,14 ve otomatik bant toplama ultramikrotomi SEM (ATUM-SEM)15,16,17 yer alır , nanometre çözünürlükte yoğun sinaptik bağlantı ağlarını ortaya çıkarabilir ve yüksek çözünürlüklü konnektomikler için gerekli araçlar sağlar. Ancak, bu teknikler düşük veri aktarım kapasitesi, uzun alım süreleri, sınırlı görüş alanları ve yüksek veri işleme ile donanım maliyetleri nedeniyle18.

Yukarıdaki sınırlamaları aşmak için, ultraince kesitlerde tüm hücrelerin seçilmeden, yüksek kontrastlı, geniş alan görüntülemesi için düşük maliyetli ve yüksek verimliliğe sahip bir görüntüleme yöntemi olan Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı bir görüntüleme yöntemi geliştirdik ve bu yöntem, ultraince kesitlerde tüm hücrelerin ayırt edilmeden, yüksek kontrastlı, geniş alan görüntülemesi için büyük doku alanlarında submikron çözünürlük elde eder. Aynı zamanda, OMLIT seri kesitli SEM iş akışlarıyla doğası gereği uyumludur: yüksek çözünürlüklü elektron mikroskopiden önce, OMLIT aynı bölümlerde yapısal bilgi sağlar; böylece hassas yatırım getirisi (ROI) seyregine ulaşır ve sonraki EM görüntüleme için gereken alan ve veri hacmini önemli ölçüde azaltır. OMLIT, mezoskal görüntüleme düzeyinde benzersiz avantajlar sunar ve farklı mekansal ölçeklerde sinirsel yapısal haritaları birbirine bağlayan kritik bir köprü görevi görür. Yıkıcı olmayan yapısı, örnek hazırlama ve görüntüleme için osmiyum dirençli floresanproteinler 19 gibi belirli etiketleme stratejileriyle gelecekteki entegrasyon potansiyelini korur. Bu yöntem, seçilmiş beyin bölgelerinin mezoscale görüntülemesini sağlar ve bölgelerdeki nöronal morfoloji, miktar, dağılım ve yoğunluğun hızlı edinilmesini sağlar. Ayrıca, farklı beyin bölgelerindeki nöronlar arasında aksonal projeksiyonların ve dendrit dağılımının nicel olarak karakterizasyonunu kolaylaştırır. Görüntüleme sonuçlarında ilgi duyan belirli bölgeler için, in situ ultrastruktural detaylar elektron mikroskopi kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

OMLIT'in görüntüleme prensibi, Hao Fan20'nin çalışmasında tanımlanmıştır. Kısa bir süreliğine, görüntüleme sırasında ultra ince kesit, kaplama tabakası, toplama bantı, iletken bant ve wafer çok katmanlı ince film yapısı oluşturur. Bir düzlem dalga bu yapıyla etkileşime girdiğinde, yansıtılan dalgalar çeşitli arayüzlerde üretilir ve algılama alanında üst üste biner; bu da malzemeler arasındaki yansıtma, kırılma indeksi ve soğurma farklılıkları nedeniyle optik girişimle sonuçlanır. Bu ilke temelinde geliştirilen MATLAB tabanlı bir simülasyon programı, deneysel sonuçlarla makul bir uyum sağladı.

OMLIT görüntüleme şeması, bant işleme stratejisine göre iki tipe ayrılabilir. İlki, Cr, Cu, Al veya Ag gibi metallerin bant yüzeyini kaplamak için kullanıldığı yüksek yansıtıcılık stratejisidir; bu da çevredeki alanlara kıyasla sitoplazmik bölgelerde ve reçine dolu damar lümenlerinde daha yüksek optik yoğunluklar elde eder. İkincisi ise kaplamasız Kapton bant, D-50 bant veya CNT kaplı PET bant kullanan düşük yansıtıcılık stratejisidir. Bu durumda, optik görüntüleme sonucu birincinin tersidir: reçine açısından zengin membransız bölgeler (örneğin, sitoplazma ve damar lümenleri) daha düşük yoğunlukta ortaya çıkar.

İki farklı görüntüleme stratejisine uyarlanmış standartlaştırılmış protokolleri sistematik olarak özetleyip kuruyoruz. Burada sunulan protokoller kapsamlı ve detaylı deneysel prosedürler sunar. Ayrıca, deneyler sırasında karşılaşılan yaygın sorunlar özetlenmiş ve önerilen çözümler sunulmaktadır. Düşük yansıtıcılık stratejisi (805 × 857,5 × 11,66 μm³) kullanılarak elde edilen fare korteksinin veri setini sunmaya odaklanıyoruz; bu da OMLIT görüntüleme yaklaşımının ayırt edici özelliklerini ve avantajlarını göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan işlemleri, Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine ve ilgili ulusal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. OMLIT görüntüleme için örnek hazırlama, geleneksel EM'de kullanılan protokolle aynı protokolü takip eder ve kullandığımız özel prosedür başkabir yerde 21 açıklanmıştır. Kısaca, anestezi sonrası fareler sodyum kakodilat tamponu, yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ve son olarak glutaraldehit ve paraformaldehit içeren fiksatif ile ardışık olarak transkardiyal perfüzyon edildi. Beyin dikkatlice çıkarıldı ve yaklaşık 1× 1 × 1 mm³ blok beyin dokusu kesitlendi. Örnekler kimyasal olarak sabitlendi, seri ağır metal boyalarına maruz kaldı, kurutuldu ve reçine içine gömüldü. Protokolün genel iş akışı Şekil 1'de sunulmaktadır.

figure-protocol-1
Şekil 1: İş akışına genel bakışı. (A) Protokolde bahsedilen toplama bantları (soldan sağa: poliimid, D-50 ve CNT kaplamalı PET). (B) Kesilen örneklerin seri kesimlenmesi ve toplanması. (C) Toplanan parçaları içeren kurdelelerin dairesel bir silikon levhaya monte edilmesi. (D) Işık mikroskopisi görüntüleme, ölçek çubuğu 100 μm. (E) Karbon kaplama. (F) Elektron mikroskopi görüntüleme, Şekil 1D'de belirtilen bölgeye karşılık gelir, ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Bant hazırlığı

NOT: Tozdan kaynaklanan bant kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki prosedürler temiz odada yapılmalıdır.

  1. Yüksek yansıtıcılık stratejisi
    1. Kapton (bundan sonra poliimid bant olarak adlandırılır, 50 μm kalınlığında) veya Panlite filmi (bundan sonra D-50 olarak adlandırılır, kalınlığı 50 μm) ve motorlu sarma sistemine monte edilir. Burada poliimid bant örnek olarak kullanılır.
      NOT: Bu çalışmada, bir Arduino kartı üzerinden kontrol edilen step motor tarafından sürülecek şekilde tasarlanmış motorlu bir sargıç cihazı kullanılmıştır; bu cihaz, bandı bir makaradan diğerine sputter plazma konisi üzerinden geçirmektedir. Bantın tahrik makarasında birikmesiyle kaynaklanan çizgi çevirisinin artan çizgi hızını telafi etmek ve tutma makarası çapını artırmak için, her 360° dönüşten sonra alım makaranının açısal hızını seri olarak düşürmek için bir program yazıldı.
    2. Manyetik sputter sistemi (çift başlı sputter) kullanılarak bant yüzeyine düz ince bir Cr (veya Al, Ag veya Cu gibi diğer metaller) tabakası bırakın. En iyi biriktirme için bantı, sputtering hedefinden 80 mm mesafeye konumlandırın. Süreç, DC gücüyle ve %99,99 argon gazıyla düzenlenen 1,0 Pa basınçta gerçekleştirilir.
    3. Bant sarma hızını 0,6 mm/s olarak ayarlayarak 50 nm metal kaplama kalınlığı elde edin. Biriktirildikten sonra, kaplama stresini en aza indirmek için odayı yüksek vakum altında oda sıcaklığına (RT) yavaşça soğutun.
      NOT: Aynı bant için optimal kaplama kalınlığı, kullanılan metal türüne bağlı olarak değişebilir. Bandın çeviri hızını ayarlayarak 50, 70, 100, 150 ve 200 nm gibi çeşitli kaplama kalınlıklarına ulaşın.
    4. Kaplamanın kalınlığını ve düzenliliğini stylus profilleyici, atomik kuvvet mikroskobu veya taramalı elektron mikroskopisi kullanarak değerlendirin.
    5. Bandı 80 W güçte plazma temizleyici ile hidrofilik hale getirin ve 7 mm/s hareket hızıyla bant hareketini yapın. İşlemden sonra, bant yüzeyine yerleştirilen su damlaları hızla ince bir film haline yayılmalıdır (Şekil 2A).
  2. Düşük yansıtıcılık stratejisi
    NOT: Bu protokol, D-50 bantının veya ticari karbon nanotüp (CNT) kaplı polietilen tereftalat (PET) bantın kullanılmasına izin verir. Sonuncusu, elektron mikroskopi görüntüleme sırasında biraz arka plan gürültüsü oluşturabileceğinden - ancak güçlü olmasa da - elektromanyetik görüntülerin segmentasyonunu potansiyel olarak etkileyebilir. Bu nedenle, aşağıdaki açıklama yine de D-50 bantını örnek olarak kullanacaktır.
    1. D-50 filmlerini hazırlayın ve tüm sayfayı yaklaşık 7 mm genişliğinde bantlara kesin. Bölümleri toplamak için bantın bir açık tarafını kullanın, diğer tarafını ise çizikleri ve kirlenmeleri önlemek için mat film tabakasıyla koruyun. Bir sonraki silikon wafer montaj aşamasında mat filmi çıkarın.
    2. Daha fazla bölüm için, D-50 bantının farklı bölümlerini birleştirin. Bant segmentleri arasındaki bağlantıları çift taraflı yapışkan bant ile sabitleyin.
      NOT: Bant segmentlerini yapıştırırken, öndeki bantın üst kısmıyla üstten aşağıya çift taraflı bant aracılığıyla örtüşmesini sağlayın. Yapışkan alanını en aza indirin ve bant sarma sırasında yapıştırıcının sıkışmasını önlemek için bant kenarlarında bir kenar bırakın; bu da bandı kirletebilir (Şekil 2B).
    3. Bantı plazma temizleyici kullanarak hidrofilik hale getirin; aynı prosedürü izleyerek ve daha önce tarif edilen aynı etkiyi elde edin.
      NOT: Metal kaplama ve karbon sıçrama adımları dışında, her iki stratejide de diğer adımlar aynıdır.

2. Seri ultra ince kesitleme ve bant tabanlı koleksiyon

  1. Küçük bir öğütücü veya benzeri bir kesme aleti kullanarak, numunenin bulunduğu taraftaki reçineyi kaba kesimle düzeltin, çevresindeki boş reçineni çıkararak numune alanını açığa çıkarın.
  2. Reçine gömülü bloğu örnek tutucuya yerleştirin ve tutucunun düğmesini sıkıca sıkarak bloğu sıkıca sabitleyin.
  3. Örnek tutucuyu mikrotomun hareketli koluna monte edin. Bıçak tutucuya 45° açı ile cam bıçak veya elmas kesme bıçağı takın. Mikroskop altında, örnek yüzeyini piramit şekline getirin ve yüzeyi düzleştirin.
    NOT: Kesilen örnek bloğunun ön ve arka kenarları mümkün olduğunca paralel olmalıdır (bkz. Şekil 2C).
  4. Örnek bloğunun dört tarafını kırpıp düzleştirerek kenarlarındaki fazla reçineyi çıkararak elmas bıçakla olası çarpışmaları önleyin. Kesilen bloğun ön ve arka kenarlarının yatay konumda hizalı olduğundan emin olmak için düğmeyi döndürün.
  5. Kesme bıçağını çıkarın ve yerine 45° açıyla yerleştirilmiş elmas bir bıçak takın. Mikrotom tabanının eğim açısını 6°'ye ayarlayın. Bıçak tutucusunu düğmeyle yavaşça hareket ettirin, elmas bıçağın ön kenarı numune yüzeyinden 1-2 mm uzakta olsun.
  6. Örnek yüzeyi ile bıçak kenarı arasındaki parlak bandı gözlemleyin ve eğim açısını bantın üstten aşağıya ve yandan yana eşit şekilde ayarlamasını yapın. Bu, ilk bölümün sadece bir köşeyi değil, tüm örnek yüzeyini içermesini sağlar.
  7. Elmas bıçağın yuvasına damıtılmış su enjekte edin, böylece sıvı seviyesi yükselir ve bıçağın ıslak kalmasını sağlar. Sonra, sıvı seviyesi düşene kadar bir şırınga kullanarak suyu alıp yansımanın gümüşi rengi görünmesini sağlar.
  8. Kontrol ünitesinde kesit kalınlığını (besleme), kesme hızını ve kesme penceresini ayarlayın. Kesitleme hızını 0,6 mm/s'ye ayarlayın ve kesit kalınlığını 60 nm'e ayarlayın (özgün hız ve kalınlık numune kalitesine bağlıdır).
  9. Bölümlere başla. Mikrotom sabit çalıştığında ve tekiz kesitler üretildiğinde, kesitleme sürecini duraklatın. Kesilmiş parçaları ve kalıntıları ince bir fırça ile temizleyin.
  10. Hem kaplamalı bant makarını hem de boş bir tutma makaranını otomatik ultra ince kesit toplama sistemine takın. Kilitleme mekanizmasını sabitleyin ve bantın sabit hızda sorunsuz hareket etmesini ve boş makaraya doğru şekilde toplanmasını sağlamak için deneme yapmayı unutmayın.
  11. Bant toplama cihazının toplama başını elmas bıçağın su banyosuna daldırın. Toplama başının konumunu, bıçak kenarına paralel olacak şekilde, örnek dilim uzunluğunun 1,5 katı mesafede ayarlayın; böylece kesilen parçalar banda düzgün bir şekilde toplanmasını sağlar. Toplama cihazını güvence altına alın ve aynı anda bant toplama cihazını çalıştırırken bölümlere devam edin.
  12. Yeterli sayıda sürekli kesit toplandıktan sonra, kesitleme sürecini durdurun. Bantı, hiç bölüm toplanmadığı bölüm alanında kesin ve kalan tüm bant makaraya toplanana kadar bant toplama cihazını çalıştırmaya devam edin.
  13. Toplanan parçaları içeren makarayı çıkarın ve elektronik kurutma fırınına yerleştirin. Bant toplama cihazını ve mikrotomu temizleyin, tüm aksesuarları doğru yerlerine geri koyun.

figure-protocol-2
Şekil 2: Kesitlenmeden önce hazırlıklar. (A) D-50 bantının yüzeyinde su damlaları, üstten ve (altta) hidrofilik işlemden önce. (B) D-50 bantının birleşim alanının üst ve yan şematik görünümleri. Mavi: D-50 bant; turuncu: çift taraflı yapıştırıcı; Yeşil Ok: Bant hareket yönü. (C) Kesme sonrası numunenin ön görünümü, üst ve alt kenarların paralel gösterilmesi. (D) Otomatik bant toplama cihazı. a: D-50 bant beslemesi için bant makarası; b: Bant toplama için bant makarası; Kırmızı ok: Bant hareketinin yönü. (E) Toplama başlığının otomatik bant toplama cihazındaki konumu. Sağdaki alttaki sarı kutu, cihaz tarafından toplanmak üzere olan yeni kesilmiş bir bölümü gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Silikon wafer üzerine montaj

NOT: Aşağıdaki adımlarda bantın tozla kirlenmesini önlemek için çalışma alanının temiz olduğundan emin olun.

  1. Plazma işlem sisteminde önceden temizlenmiş ve hidrofilize edilmiş 4 inçlik yuvarlak silikon wafer kullanın (80 W güç, 3 dakika).
  2. Temiz eldiven takın, silikon levhayı düz bir yüzeye koyun ve iki taraflı iletken karbon bandı uygun uzunlukta (her iki ucunda 2-3 cm çıkıntı ile) kesin. İki taraflı iletken bantın bir yanındaki beyaz koruyucu tabakayı soyup silikon levhaya yukarıdan aşağıya uygulayın.
    NOT: İletken bantın iki tarafı yaklaşık 2 mm aralıklı olmalı ve bandın kenarları silikon levhada görünür olmalıdır. 25 mm genişliğinde çift taraflı iletken bant için, bir 4 inçlik silikon levhaya üç segment bant uygulanabilir.
  3. Çalışma tezgahındaki 4 inçlik silikon levhanın bir hatını çizin ve wafere uygulanacak her bant parçasının yaklaşık uzunluğunu işaretleyin. Bölümleri toplayan bantı, önceden işaretlenen uzunluklara göre kesin.
    NOT: Kesilen bant, silikon levhanın kenarını aşmamalı ve bölümlere kesim yapmamalıdır.
  4. Çift taraflı iletken banttan şeffaf koruyucu filmi soyun, D-50 bant için ise bu noktada bandın arkasındaki koruyucu filmi çıkarın. Bandı çift taraflı iletken banda paralel olarak uygulayın. Her çift taraflı iletken bant parçasına en fazla üç parça bant uygulayın.
    NOT: D-50 bantının yanlış hizalanma veya tozla kontamine olma riskini azaltmak için, iletken bantın bir kısmını daha önce soyulmuş şeffaf film ile kaplayın, iletken bantın sadece küçük bir kısmı D-50 bandının ucuna bağlanmak için açıkta bırakılır. Bu, bantın yönünün daha kolay ayarlanmasını sağlar. Daha sonra, kalan şeffaf filmi yavaşça soyarak D-50 bantının geri kalanının nazikçe düşmesini ve iletken banda yapışmasını sağlayın.
  5. Bant monte edildikten sonra, bant ile iletken bant arasında hava kabarcıkları oluşabilir ve bu da sonraki görüntüleme sürecini engelleyebilir. Silikon waferi bir vakum odasına (veya başka bir vakum ekipmanına) yerleştirin ve vakum uygulayın. Vakum işlemi tamamlandıktan sonra, hava kabarcıklarının ortadan kalktığından emin olun.

4. Boyama sonrası

  1. %4 uranil asetat ve %3 kurşun sitrat hazırlayın ve bunları su banyosu tenceresiyle 50°C'ye kadar önceden ısıtın.
    DIKKAT: Uranyl asetat radyoaktiftir ve karaciğer ile böbreklerde önemli toksisite içerir. Kurşun sitrat, sinir sistemi, böbrekler ve hematopoietik sistemi etkileyen kurşun zehirlenmesine neden olabilir. Bu reaktiflerle yapılan çalışmalar bir duman davlumbastonunda yapılmalı ve laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler, maske ve güvenlik gözlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlar (PPE) takılmalıdır. Cilt veya göz teması durumunda, hemen bol miktarda suyla yıkayın, laboratuvar güvenlik personeline rapor verin ve tıbbi yardım alın.
  2. Vakumlanmış ve baloncuklardan arınmış silikon waferi, hidrofilizasyon ve temizlik için plazma hidrofilizasyon sistemine yerleştirin.
  3. İğne çıkarılmış 10 mL bir şırınga kullanarak, 0.22 μm bir şırınge filtresi takın ve %4 uranyl asetatı filtreleyin. Çözeltiyi bölümün üzerine bırakın, silikon levhanın tüm yüzeyi kaplanana kadar ve ardından 3 dakika bekleyin.
  4. 3 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın, 3 kez tekrarlayın ve ardından numune yüzeyini azotla fönle kurutun.
  5. İğne çıkarılmış 10 mL bir şırınga kullanarak, 0,22 μm bir şırınga filtresi takın ve %3 kurşun sitratı filtreleyin. Çözeltiyi bölümün üzerine bırakın, silikon levhanın tüm yüzeyi kaplanana kadar ve ardından 5 dakika bekleyin.
  6. 3 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın, 3 kez tekrarlayın ve ardından numune yüzeyini azotla fönle kurutun.

5. Veri toplama

  1. Optik mikroskopi
    NOT: Bu bölümde, optik mikroskopi için örnek olarak bir Araştırma Slayt Tarayıcısı (VS200, Olympus) kullanılmaktadır. Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Almanya) gibi diğer mikroskoplar da burada tanımlanan optik görüntüleme için uygundur. Diğer optik mikroskoplar için adımlar genellikle aynıdır.
    1. Silikon waferi optik mikroskobin aşamasına yerleştirin ve kalıntısız yapışkan bantla sabitleyin.
    2. Silikon levha, bant ve örnek için genel bir görüntü almak için 5x objektif lens kullanın.
    3. Genel görüntüde her bölümü çizip sıralayın, ardından odak noktaları ve pozlama noktaları ekleyerek tüm silikon levhada tüm bölümlerle birlikte 20x veya 50x büyütme ile otomatik görüntüleme yapılabilir.
    4. Görüntüleme tamamlandıktan sonra görüntüleri kaydedin ve ardından görüntü kalitesini kontrol edin. Eğer odak dışı veya düşük kaliteli görüntü varsa, yeniden odaklanın ve yeniden görüntüleyin.
  2. Elektron mikroskopisi
    NOT: Birden fazla tip elektron mikroskobu, silikon levhalar üzerine yerleştirilen ultra ince kesitlerin sürekli görüntülemesini gerçekleştirebilir. Burada Multibeam 505 (Zeiss) örnek olarak kullanılmıştır.
    1. Numune yüzeyine yüksek vakumlu sputter kaplama ile karbon kaplaması yapılabilir, karbon kalınlığı 5,7 nm olsun.
      NOT: Bu adım, yüksek yansıtıcılık stratejisiyle metal kaplanmış veya düşük yansıtıcılıkta karbon nanotüplerle (CNT) kaplanmış bantlar için atlanabilir.
    2. Silikon waferin optik navigasyon haritasını yakalamak için optik bir mikroskop (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) kullanın.
    3. Silikon levhayı SEM'in örnek odasına yerleştirin. Optik navigasyon haritasını elektron mikroskob görüntüsüyle ilişkilendirerek örnek aşamasında iç içe iki L şeklinde işaretleyiciyi sıralı olarak tanımlayın.
    4. Mikroskopi yazılımındaki SAT modülünü (v3.2, 64-bit) kullanarak optik navigasyon haritasından bölüm konumlarını ve görüntüleme alanlarını yarı otomatik olarak tanımlayabilirsiniz.
    5. Görüntü piksel boyutunu 4 nm, bekleme süresini 0.8 μs, odak noktaları ve konumları ile depolama yerlerini ayarlayın.
    6. Sürekli görüntülemeye başlayın.

6. Veri işleme

NOT: OMLIT görüntülerinin 2D birleştirilmesi yazılım tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir. OMLIT görüntülerinin büyük ölçekli 3D kaydı ve segmentasyonu için daha güçlü yapay zeka algoritmaları mevcuttur. Burada, çoğu laboratuvarın süreci doğrulaması için kolaylık sağlamak için, Fiji (v1.54p, 64-bit) ve VAST (v1.5.0, 64-bit) kullanılarak dikiş, kayıt ve segmentasyon gösterilmektedir.

  1. Fiji'deki görüntü veri setini açın, tüm görüntü dosyalarını içeren klasörü Fiji arayüzüne sürükleyin ve istendiğinde Sanal Yığın'ı seçin.
  2. İlgileneceğiniz bölgeyi (ROI) seçmek için Dikdörtgen Aracı'nı kullanın, ardından veri setini Görüntü > Kırp ile kırpın.
  3. Register Virtual Stack Slices eklentisini kullanarak görüntü yığınını hizalayın (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
  4. Hizalanmış veri setini TIFF formatında kaydedin (Dosya > Save As > Tiff).
  5. TIFF görüntü yığınını VAST22'ye Import > Image volume from images ile aktarın. VSV dosyası.
    NOT: Daha ayrıntılı bir eğitim için lütfen web sitesine bakınız: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
  6. Harici bir tablet bağlayarak, Çizim Segment Modu'ndaki fırça aracıyla manuel segmentasyon ve izlemeye başlayabilirsiniz (görüntü dilimleri arasında hızlıca gezinmek için A ve Z kısayol tuşlarını kullanın).
  7. Pencere > 3D Görüntüleyici > View > Update ile segmentli yapıyı 3D olarak görselleştirin.
  8. Segmentasyon sonuçlarını File > Save Segmentation üzerinden kaydedin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün genel iş akışı (Şekil 1) farklı koleksiyon bantlarının hazırlanmasıyla başlar. Şekil 1, protokolde bahsedilen üç tür bant (soldan sağa: Kapton, D-50 ve CNT kaplamalı PET) göstermektedir; bu bantlar, aynı arka plan altına yerleştirildiğinde belirgin optik özellikler sergiler. Numune hazırlama ve blok kırpımından sonra, hazırlıkların beklentilere uygun olduğundan emin olmak için önce elektron mikroskopi görüntüleme için...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mezoskopik görüntülemeyi mümkün kılan ve bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopi iş akışlarıyla uyumlu olan OMLIT adlı optik görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. OMLIT yöntemi kullanılarak, optik mikroskopi beyin örneklerinden mezoskopik yapısal özellikleri yakalamak için kullanılabilir; bunlar arasında kan damarları, hücre gövdeleri, çekirdekler, ana dendritik dallar ve bazı büyük miyelinli aksonlar bulunur. Ayrıca, OMLIT seri SEM boru hattına sorunsuz entegre edilebilir; e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan edilmedi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (32271430, 62361166631) ve Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2023YFF0715904) tarafından desteklenmiştir. Suzhou Biyomedikal Mühendislik ve Teknoloji Enstitüsü'nün Kamu Teknik Merkezi ile Yapay Zeka Enstitüsü Beyin Görüntüleme Tesisi, Hefei Kapsamlı Ulusal Bilim Merkezi'ne OMLIT ve seri elektromanyetik görüntüleme alanındaki destekleri için teşekkür ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Yapışkan bant3MB5005094008Çift taraflı yapıştırıcı
Atomik Kuvvet MikroskobuBrukerBoyut İkonu
Otomatik ultra ince kesitli toplama sistemi LehuaAutoCUTS II
İletken yapışkan bantTed PellaFP16084-8
Dektak Stylus ProfilersBrukerDektakXT
Kesitleme için elmas bıçakDiatomDUJ3530Diatome Jumbo bıçağı
Kırpma için elmas bıçakDiatomDTB90Cam bıçak
Elektron mikroskobuZeissMultiSEM505Alternatif: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-bit) Açık kaynakhttps://fiji.sc
Cam kesme bıçağıKendi Yapımı
Kurşun SitratLeicaT534/2
Işık mikroskobuOlympus VS200Alternatif: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Işık mikroskobu Zeiss  Axio Imager.A2 Vario
Plazma temizleyiciYidon TeknolojileriHydro-S4Alternatifler: Ted Pella Pelco veya diğer tezgah üstü plazma temizleyici
Polimer bantMeltonKaptonŞirketin web sitesi artık erişilebilir değildir. Araştırmacıların yerel olarak bulunan KAPTON kasetlerini denemelerini öneriyoruz.
Polimer bantTeijinPEThttps://www.teijin.com/
Polimer bantTeijinD-50https://www.teijin.com/
Silikon waferSaichi912303Waferin bir tarafı parlatılmış.
Sputter Coater LeicaACE600Alternatif: Çift kafalı Sputter, Yujie
UltramikrotomLeicaUC7Alternatif: RMC PT-PC
UranylasetatEMS22400
VAST (v1.5.0, 64-bit)Howard Hughes Tıp Enstitüsühttps://software.dvid.io/vast/VAST A1:D32Lite, büyük 3D mikroskopik veri setlerinin manuel notasyonu ve segmentasyonu için ücretsiz bir araçtır.
ZEN yazılımı (v3.2, 64-bit)Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Economo, M. N., et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. eLife. 5, e10566(2016).
  2. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
  3. Zheng, T., et al. Visualization of brain circuits using two-photon fluorescence micro-optical sectioning tomography. Opt Express. 21 (8), 9839(2013).
  4. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  5. Wang, H., et al. Scalable volumetric imaging for ultrahigh-speed brain mapping at synaptic resolution. Natl Sci Rev. 6 (5), 982-992 (2019).
  6. Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12 (5), 407-410 (2015).
  7. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Opt Lett. 45 (19), 5401(2020).
  8. Kut, C., et al. Detection of human brain cancer infiltration ex vivo and in vivo using quantitative optical coherence tomography. Sci Transl Med. 7 (292), (2015).
  9. Hu, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging (QPI) in neuroscience. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 25 (1), 1-9 (2019).
  10. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).
  11. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  12. Heymann, E. W. Scent marking strategies of new world primates. Am J Primatol. 68 (6), 650-661 (2006).
  13. Echlin, M. P., et al. Recent developments in femtosecond laser-enabled TriBeam systems. JOM. 73 (12), 4258-4269 (2021).
  14. Randolph, S., Geurts, R., Wang, J., Winiarski, B., Rue, C. Femtosecond laser-enabled TriBeam as a platform for analysis of thermally- and charge-sensitive materials. Microsc Microanal. 25 (S2), 352-353 (2019).
  15. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
  16. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: A multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
  17. Schalek, R., et al. Development of high-throughput, high-resolution 3D reconstruction of large-volume biological tissue using automated tape collection ultramicrotomy and scanning electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (S2), 966-967 (2011).
  18. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  19. Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  20. Fan, H., et al. Optical multilayer interference tomography compatible with tape-based serial SEM for mesoscale neuroanatomy. ACS Photonics. 9 (1), 25-33 (2022).
  21. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nat Commun. 6 (1), 7923(2015).
  22. Berger, D. R., Seung, H. S., Lichtman, J. W. VAST (volume annotation and segmentation tool): Efficient manual and semi-automatic labeling of large 3D image stacks. Front Neural Circuits. 12, 88(2018).
  23. Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Syst Tech J. 27 (3), 379-423 (1948).
  24. Tsai, D. -Y., Lee, Y., Matsuyama, E. Information entropy measure for evaluation of image quality. J Digit Imaging. 21 (3), 338-347 (2008).
  25. Wang, T., et al. A convenient all-cell optical imaging method compatible with serial SEM for brain mapping. Brain Sci. 13 (5), 711(2023).
  26. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  27. Kislinger, G., et al. ATUM-Tomo: A multi-scale approach to cellular ultrastructure by combined volume scanning electron microscopy and electron tomography. eLife. 13, e90565(2024).
  28. Böhm, T., Felfer, P., Thiele, S. A modular and automated serial section collection system for ultramicrotomy and subsequent imaging. Microsc Microanal. 29 (1), 212-218 (2023).
  29. Wacker, I. U., et al. Multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes. J Vis Exp. (133), e57059(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical Multilayer Interference TomographyScanning Electron MicroscopyBrain Atlas MappingConnectomics ImagingAutomated Tape UltramicrotomyMesoscopic Brain MappingElectron Microscopy ImagingMouse Cerebral CortexManual SegmentationThree Dimensional Visualization

Related Articles