Method Article

Mezoskopik Tüm Hücreli Beyin Haritalama İçin Taramalı Elektron Mikroskopi Uyumlu Optik Görüntüleme Yöntemi

DOI:

10.3791/68814

⸱

February 20th, 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Engineering (Suzhou), Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Province Key Laboratory of Biomedical Imaging and Intelligent Processing, Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, City University of Hong Kong, 4Institute for Brain and Intelligence, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin örneklerindeki tüm hücrelerin mezoscale olarak tarafsız görüntülenmesini sağlayan ve aynı örnekte bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopisinin görüntüleme iş akışına sorunsuz entegre edilebilen Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı yeni bir görüntüleme tekniği tanıttık.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyindeki karmaşık sinir ağları içindeki yapısal ve fonksiyonel ilişkileri anlamak, hem geniş bir görüş alanına hem de hücrealtı çözünürlüğe sahip beyin atlaslarının oluşturulmasını gerektirir. Ancak, mevcut optik ve elektron mikroskopi görüntüleme yöntemlerinin her biri sınırlamalara sahiptir ve bu da tek bir örnek içindeki tüm hücrelerin görüntülenmesini zorlaştırır. Bu protokol, elektron mikroskopi örnek hazırlanması sonrası beyin örneklerindeki tüm hücrelerin gözetim ayrım gözetmeden görüntülenmesini mümkün kılan Optik Çok Katmanlı Girişim Tomografisi (OMLIT) adlı görüntüleme tekniğini tanıtır ve böylece tüm sinir hücrelerinin tam bir beyin atlasını yeniden oluşturur. Buna ek olarak, OMLIT görüntüleme, otomatik bant toplama ultramikrotomi taramalı elektron mikroskopisi (ATUM-SEM) görüntüleme iş akışıyla sorunsuz entegre edilebilir. Bu sayede araştırmacılar elektron mikroskopi görüntülemeden önce hücrelerin mezoscale yapısal bilgilerini elde etmelerine olanak tanır; bu da ilgi alanlarının hassas seçimini kolaylaştırır ve yüksek çözünürlüklü elektron mikroskopi (EM) görüntüleme için gereken alan ve veri hacmini önemli ölçüde azaltır. Bu yöntemin doğruluğunu ve uyumluluğunu yetişkin fare beyin korteksinden alınan gerçek örneklerde doğruladık ve çok ölçekli beyin atlası yapımında geniş uygulama olanaklarını gösterdik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin yapısını ve işlevini ortaya çıkarmak için sinir devrelerinin hücresel ve alt hücresel çözünürlükte kapsamlı haritalanması gereklidir. İki fotonmikroskopisi 1, floresans mikro-optik kesitli tomografi (fMOST)2,3,4 ve VISoR sistemi5 gibi geleneksel optik görüntüleme yöntemleri, mezoscale nöron görüntüleme ve in vivo fonksiyonel görüntülemeyi mümkün kılmıştır. Ancak, seyrek etiketlemeye bağımlılıkları nedeniyle, tüm hücresel popülasyonu yakalayamıyorlar. Öte yandan, fonksiyonel fotoa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan işlemleri, Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine ve ilgili ulusal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. OMLIT görüntüleme için örnek hazırlama, geleneksel EM'de kullanılan protokolle aynı protokolü takip eder ve kullandığımız özel prosedür başkabir yerde 21 açıklanmıştır. Kısaca, anestezi sonrası fareler sodyum kakodilat tamponu, yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ve son olarak glutaraldehit ve paraformaldehit içeren fiksatif ile ardışık olarak transkardiyal perfüzyon edildi. Beyin dikkatlice çıkarıldı ve yaklaşık 1× 1 × 1 mm³ blok beyin dokusu kesitlendi. Örnekler....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün genel iş akışı (Şekil 1) farklı koleksiyon bantlarının hazırlanmasıyla başlar. Şekil 1, protokolde bahsedilen üç tür bant (soldan sağa: Kapton, D-50 ve CNT kaplamalı PET) göstermektedir; bu bantlar, aynı arka plan altına yerleştirildiğinde belirgin optik özellikler sergiler. Numune hazırlama ve blok kırpımından sonra, hazırlıkların beklentilere uygun olduğundan emin olmak için önce elektron mikroskopi görüntüleme için.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mezoskopik görüntülemeyi mümkün kılan ve bant tabanlı seri taramalı elektron mikroskopi iş akışlarıyla uyumlu olan OMLIT adlı optik görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. OMLIT yöntemi kullanılarak, optik mikroskopi beyin örneklerinden mezoskopik yapısal özellikleri yakalamak için kullanılabilir; bunlar arasında kan damarları, hücre gövdeleri, çekirdekler, ana dendritik dallar ve bazı büyük miyelinli aksonlar bulunur. Ayrıca, OMLIT seri SEM boru hattına sorunsuz entegre edilebilir; e.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan edilmedi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (32271430, 62361166631) ve Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2023YFF0715904) tarafından desteklenmiştir. Suzhou Biyomedikal Mühendislik ve Teknoloji Enstitüsü'nün Kamu Teknik Merkezi ile Yapay Zeka Enstitüsü Beyin Görüntüleme Tesisi, Hefei Kapsamlı Ulusal Bilim Merkezi'ne OMLIT ve seri elektromanyetik görüntüleme alanındaki destekleri için teşekkür ediyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Yapışkan bant3MB5005094008Çift taraflı yapıştırıcı
Atomik Kuvvet MikroskobuBrukerBoyut İkonu
Otomatik ultra ince kesitli toplama sistemi LehuaAutoCUTS II
İletken yapışkan bantTed PellaFP16084-8
Dektak Stylus ProfilersBrukerDektakXT
Kesitleme için elmas bıçakDiatomDUJ3530Diatome Jumbo bıçağı
Kırpma için elmas bıçakDiatomDTB90Cam bıçak
Elektron mikroskobuZeissMultiSEM505Alternatif: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-bit) Açık kaynakhttps://fiji.sc
Cam kesme bıçağıKendi Yapımı
Kurşun SitratLeicaT534/2
Işık mikroskobuOlympus VS200Alternatif: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Işık mikroskobu Zeiss  Axio Imager.A2 Vario
Plazma temizleyiciYidon TeknolojileriHydro-S4Alternatifler: Ted Pella Pelco veya diğer tezgah üstü plazma temizleyici
Polimer bantMeltonKaptonŞirketin web sitesi artık erişilebilir değildir. Araştırmacıların yerel olarak bulunan KAPTON kasetlerini denemelerini öneriyoruz.
Polimer bantTeijinPEThttps://www.teijin.com/
Polimer bantTeijinD-50https://www.teijin.com/
Silikon waferSaichi912303Waferin bir tarafı parlatılmış.
Sputter Coater LeicaACE600Alternatif: Çift kafalı Sputter, Yujie
UltramikrotomLeicaUC7Alternatif: RMC PT-PC
UranylasetatEMS22400
VAST (v1.5.0, 64-bit)Howard Hughes Tıp Enstitüsühttps://software.dvid.io/vast/VAST A1:D32Lite, büyük 3D mikroskopik veri setlerinin manuel notasyonu ve segmentasyonu için ücretsiz bir araçtır.
ZEN yazılımı (v3.2, 64-bit)Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Economo, M. N., et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. eLife. 5, e10566(2016).
  2. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical Multilayer Interference TomographyScanning Electron MicroscopyBrain Atlas MappingConnectomics ImagingAutomated Tape UltramicrotomyMesoscopic Brain MappingElectron Microscopy ImagingMouse Cerebral CortexManual SegmentationThree Dimensional Visualization

Related Articles