Method Article

Aspergillus Türleri, Cryptococcus neoformans ve Pneumocystis jirovecii'nin PCR floresan prob tabanlı tespiti

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Aspergillus türleri, Cryptococcus neoformans ve Pneumocystis jirovecii'nin eşzamanlı tespiti için PCR floresan prob yöntemine dayalı bir klinik test protokolü sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, PCR floresan prob tabanlı nükleik asit tespit kiti kullanılarak klinik balgam örneklerinde Aspergillus türleri, Cryptococcus neoformans ve Pneumocystis jirovecii'nin niteliksel tespiti için standartlaştırılmış bir prosedürü tanımlar. Bu işlem, klinik örnek toplama, alkali sıvılaştırma ön işlem, otomatik nükleik asit ekstraksiyonu ve çoklu gerçek zamanlı PCR tespitini içermektedir. Aspergillus türleri, C. neoformans ve P. jirovecii , hedefe özgü floresan problar (sırasıyla FAM, VIC ve CY5 kanalları) kullanılarak tespit edilir ve kalite güvencesi için entegre edilen dahili kontrol (ROX kanalı) bulunur. Analiz geçerliliği ve örnek sonuç yorumu, tanımlanmış döngü eşik (Ct) kesme değerlerine dayanır. Pozitif kontrol, tüm kanallarda Ct ≤ 33.7 olan S şeklinde amplifikasyon eğrileri göstermelidir, negatif kontrol ise hiç amplifikasyon göstermemelidir. Klinik örneklerde, FAM kanalında 33.7 ≤ Ct değeri Aspergillus türleri için pozitiflik, VIC veya CY5 kanalında ise C . neoformans veya P. jirovecii için pozitiflik ≤ VIC veya CY5 kanalında 36 olan CT değeri sırasıyla C. neoformans veya P. jirovecii için pozitifliği gösterir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus türleri, Cryptococcus neoformans ve Pneumocystis jirovecii gibi invaziv mantar enfeksiyonları, bağışıklık sistemi zayıf hastalar için önemli bir tehdit oluşturur ve yüksek morbidite ile ölüme yol açar. Uygun antifungal tedaviye başlamak ve klinik sonuçların iyileştirilmesi için zamanında ve doğru tanı çok önemlidir1. Kültür, mikroskopi ve antijen tespiti gibi geleneksel tanı yöntemlerinin belirgin sınırlamaları vardır. Kültür zaman alıcıdır ve düşük hassasiyet gösterir, mikroskopi tür düzeyinde tanımlamaya sahip değildir ve operatöre bağlıdır; antijen testleri (örneğin, galaktomannan, β-D-glukan) çapraz reaktivite ve tutarsız performans gösterebilir. Moleküler tanılar, özellikle gerçek zamanlı PCR, daha hızlı teslim süreleri ve yüksek hassasiyet ile özgüllük potansiyeli sunarak bu boşlukların bir kısmını kapatabilir. Çoklu PCR'deki gelişmeler, tek bir örnekten birden fazla patojenin eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlayarak tanı verimliliğini artırır.

Bu protokol, insan balgam örneklerinde Aspergillus türleri, C. neoformans ve P. jirovecii'den DNA'nın niteliksel olarak tespit edilmesi için çoklu floresan prob PCR testini tanımlar; böylece 18S rRNA geninin korunan bölgeleri (Aspergillus türleri), ITS geni (C. neoformans) ve mtLSU rRNA geninin (P. jirovecii) korunan bölgeleri hedef alınır. Bu yöntemin temel özellikleri tanımlanmış analitik duyarlılık içerir: Aspergillus türleri, C. neoformans ve P. jirovecii için tespit sınırı 1.500 kopya/mL'dir; primer/prob özgüllüğü: hedefe özgü primerler ve problar insan DNA'sı veya diğer yaygın flora ile çapraz reaktiviteyi en aza indirir; sağlam kontaminasyon kontrolü: dUTP-UDG (urasil-DNA glikozilaz) sistemlerinin dahil edilmesi, önceki PCR amplikonlardan gelen kalıcı kontaminasyonu etkili bir şekilde önler; bu, klinik laboratuvar ortamında test güvenilirliğini korumak için kritik bir özellik2; entegre süreç kontrolü: insan RP (Ribozomal Protein) genini hedefleyen endogen iç kontrol, ROX florofor ile işaretlenmiş, nükleik asit ekstraksiyon bütünlüğünü izlemek ve potansiyel PCR inhibisyonunu belirlemek için birlikte amplifikasyon edilir; böylece yanlış negatif sonuçları azaltır3. Bu yaklaşım, moleküler tanıda kalite güvencesi için yerleşik yönergeler 4,5 ile desteklenmektedir. Protokol öncelikle yüksek riskli popülasyonlardan, örneğin hematoloji-onkoloji hastaları veya nakil alıcılarından alınan solunum örnekleri (balgam/BALF) için geçerlidir. Çevresel kirlenmeden kaynaklanan yanlış pozitifler veya aşırı örnek seyreltmesi nedeniyle azalan hassasiyet gibi potansiyel sınırlamalar ve azaltma stratejileri de tartışılmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik örneklerin kullanımı ilgili etik komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: ZYS-GCP-2025006). Tüm katılımcılar, verilerinin ve örneklerinin araştırmada kullanılmasına dair geniş ve bilgilendirilmiş onay sağladı. Bu protokolte kullanılan tüm reaktifler ve tüketim malzemeleriMateryallerin Table (T able of Materials) listelenmiştir.

1. Örnek koleksiyonu

  1. 3–5 ml balgam veya bronkoalveolar lavaj sıvısını steril kaplarda topla ve derhal test için gönderin.

2. Reaktif hazırlığı

NOT: Bu adımlar reaktif hazırlama odasında gerçekleştirildi.

  1. Tespit kitini -28 °C dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında (25–30 °C) 30 dakika boyunca tamamen eritin.
  2. Toplam reaksiyon sayısını hesaplayın (N): N = test örnekleri sayısı (n) + pozitif/negatif kontroller (2) + 1
  3. Reaksiyon karışımını steril bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. Tek bir reaksiyon için: 35 μL Nüklein Asit Amplifikasyon Karışımı + 5 μL Primer-Prob Karışımı, iyice girdab ve kısa bir süre santrifüj yapın.
  4. Reaksiyon karışımının 40 μL'si her PCR tüpüne (kit üreticisinin protokolüne göre) Aliquot ile numune işleme odasının geçiş penceresine aktarılır.

3. Örnek işleme

NOT: Bu adımlar Numune İşleme Odası'nda gerçekleştirilmiştir. Atık Bertarafı: 3.2.2. adımdan alınan üst atıkları ve NaOH içeren diğer sıvı atıkları belirlenmiş bir kimyasal atık konteynerine atmak.

  1. Sıvılaştırma
    1. 50 mL'lik vida kapaklı tüpe balgam/bronkoalveolar lavaj sıvısı (BALF) ekleyin.
    2. %4 NaOH sindirim çözeltisi (balgam viskozitesine göre) 1–2 hacim ekleyin.
      DIKKAT: NaOH aşındırıcıdır. Cilt ve gözlerle temas kurmaktan kaçının.
    3. Kapağı sıkın, 1 dakika girdabında durdu ve oda sıcaklığında biyogüvenlik dolabında 15–20 dakika kuluçka yapın.
  2. Zenginleştirme
    1. Santrifüjle örnekleri 3.000 rpm'de 5 dakika boyunca sıvılaştırdı.
    2. Üst malzemeyi pipet kullanarak atarak 1.000 μL tortu tutulur.
    3. Tortu iyice girdabla karıştırın.
  3. Liz
    1. 500 μL tortunu bir lizin tüpüne aktarın. 10 dakika girdabında ve kısa bir süre santrifüj yapın.
  4. Çıkarım
    NOT: Atık Bertarafı: Biyolojik örneklerle temas eden kullanılmış ekstraksiyon plakaları, uçları ve tüpler, onaylı biyotehlike atık konteynerine atılmalıdır.
    1. Tüm lizat süpernatantını ve 100 μL negatif/pozitif kontrol ekstraksiyon plakasının 2. sütununa aktarın.
    2. Belirlenen programla otomatik bir nüklein asit çıkarma sistemi kullanarak nüklein asit ekstraksiyonugerçekleştirin 6.
  5. Örnek yüklemesi
    1. Ekstraksiyon edilmiş nükleik asit (Sütun 6) ve kontrollerden 10 μL PCR tüplerine aktarın. Kısa bir süreliğine santrifüj yapın ve amplifikasyon odasının geçiş penceresine aktarın.

4. Nüklein asit amplifikasyonu

NOT: Bu adımlar Amplifikasyon Odası'nda gerçekleştirildi.

  1. PCR tüplerini otomatik nükleik amplifikasyon cihazına yükleyin ve uygun amplifikasyon şablonunu seçin.
  2. Tespit kanallarını ata: Aspergillus türleri: FAM kanalı; C. neoformans: VIC kanalı; P. jirovecii: CY5 kanalı; İç kontrol: ROX kanal 7,8,9.
  3. Örnek isimler belirleyin ve programı çalıştırın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çoklu floresan prob PCR testi kullanılarak elde edilen temsil amplifikasyon eğrileri Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Test geçerliliği önceden belirlenmiş kontrol kriterlerine dayanarak belirlendi. Geçerli bir çalışmada, pozitif kontrol FAM, VIC, CY5 ve ROX kanallarında karakteristik S-şekilli amplifikasyon eğrileri üretirken, tüm algılama kanallarında döngü eşik (Ct) değerleri 33.7 ≤ (Şekil 1A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada oluşturulan çoklu gerçek zamanlı PCR protokolü, klinik balgam örneklerinde üç önemli invaziv mantar patojeninin (Aspergillus türleri, Cryptococcus neoformans ve Pneumocystis jirovecii) eşzamanlı ve hızlı tespiti için standartlaştırılmış bir prosedür sağlar. Bu yöntem, klinik örneklerden patojenik DNA'nın doğrudan tespit edilmesini sağlar. Kültür, mikroskopi veya serolojik antijen testi gibi geleneksel tanı yaklaşımlarının aksine, bu moleküler yöntem kültürle ilişkili uzun iş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foshan'daki Shanshui İlçe Halk Hastanesi Klinik Laboratuvar Departmanı'na ekipman ve teknik destek sağladıkları için teşekkür etmek isteriz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μ L Filtre Uçlu Steril Genişletilmiş Pipet Uçları (Raflı)Xiaorui BiyoteknolojisiS20221126
1000 μ L Steril Pipet UçlarıJiangsu Xinkang Tıbbi Aletler Şirketi, Ltd241101
200 μ L Extended Filter Steril Pipet UçlarıXiaorui Biyoteknolojisi241001
Liz TüpleriPekin ZC Biyo-Bilim & Teknoloji ŞirketiF1040
Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans ve Pneumocystis jiroveciiPekin ZC Biyo-Bilim & Technology Co.CT8143-48T
Nükleik Asit Ekstraksiyon ReaktifiPekin ZC Biyo-Bilim & Teknoloji ŞirketiCN8053-B40T
Örnek Sulandırma TamponuPekin ZC Biyo-Bilim & Teknoloji ŞirketiSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles