Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tekrarlanabilir Hücresiz Protein Sentezi için OnePot PURE ve Ham Ribozom Üretiminin İyileştirilmesi

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

22 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

Bu makalede

Özet

OnePot 'Rekombinant Elementler Kullanarak Protein Sentezi' (PURE) sisteminin ve hücresiz protein sentezi için ham ribozomların üretimi için güncellenmiş bir protokol sunuyoruz ve partiden partiye varyasyonları en aza indirmek için hücre büyümesini kontrol etmeye odaklanıyoruz.

Özet

Son gelişmeler, Rekombinant Elementler Kullanılarak Protein Sentezi (PURE) hücresiz sisteminin bireysel laboratuvarlarda ekonomik ve daha az iş gücü ile üretilmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, PURE'u oluşturan 36 protein bileşeninin ve ribozomun hazırlanması, varyasyon ve hata için çok fazla kapsama sahip karmaşık bir girişimdir. Yakın zamanda yayınlanan OnePot protokolüne dayalı olarak PURE üretmek için ayrıntılı ve güncellenmiş bir prosedür sunuyoruz, bu da özellikle optik yoğunluk (OD) ile normalize edilmiş gliserol stokları kullanılarak kültürlerin aşılanmasını, hücre büyümesinin dikkatli bir şekilde izlenmesini ve nihai gliserol konsantrasyonlarının kontrol edilmesini içeren bir dizi önemli adımın düzenlenmesini içerir. Bu yaklaşımı kullanarak, birden fazla biyolojik kopya ve kullanıcıdan tekrarlanabilir PURE preparatlarını rapor ediyoruz. Bu protokol, diğer laboratuvarların kendi PURE sistemlerini üretmeleri ve sorunlarını gidermeleri için bir referans ve başlangıç noktası görevi görür, böylece biyomoleküler sistemlerin aşağıdan yukarıya inşası ve sentetik hücrelerin geliştirilmesi gibi PURE'un mümkün kıldığı birçok uygulamanın demokratikleşmesini artırır.

Giriş

Hücresiz protein sentezi (CFPS), biyoüretim, biyoalgılama ve teşhis, genetik ve metabolik parçaların ve yolların prototiplenmesi, hızlı protein mühendisliği ve eğitim dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için bir teknoloji olarak olgunlaşmıştır 1,2. Başlangıçta 'Rekombinant Elementler Kullanarak Protein Sentezi' (PURE) sistem3 olarak geliştirilen saflaştırılmış bileşenleri kullanan CFPS sistemleri, lizat bazlı alternatiflerine göre bir dizi avantaj sunar. PURE sistemleri, 36 protein faktörü, 70S E. coli ribozomu ve nükleosit trifosfatlar (NTP'ler), amino asitler ve tRNA'lar dahil olmak üzere tanımlanmış bir kimyasal substrat karışımından oluşan ve gerekli uygulamaya göre isteğe göre uyarlanabilen tanımlanmış bir bileşime sahiptir. Bu nedenle, kanonik olmayan amino asit birleştirme, mekanik modelleme ve biyomoleküler sistemlerin ve sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya inşası gibi çalışmalar için oldukça uygundurlar1. PURE ticari tedarikçilerden temin edilebilirken, maliyeti (1 μL reaksiyon başına 0,34-1,63 ABD doları) büyük ölçekli deneyler için engelleyicidir; ve PURE'u şirket içinde üretmenin alternatif stratejisi, şimdiye kadar, özellikle deneyimsiz kullanıcılar için sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirilmesi zor olan 36 protein ve ribozomun4 paralel saflaştırılmasını içeren emek yoğun protokoller tarafından engellendi.

Son gelişmeler, PURE'un ev yapımı üretimine yardımcı oldu. Örneğin, Wang ve ark. E. coli suşlarını, translasyon makinesine genomik olarak entegre edilmiş hekza-histidin etiketlerini içerecek şekilde tasarladılar ve tek aşamalı bir saflaştırmayı kolaylaştırdılar5. Tüm SAF proteinleri kodlayan genler, benzer şekilde saflaştırma işini azaltmak için kullanılan az sayıda plazmide birleştirilmiştir6. Villareal ve ark. proteinleri doğru oranda üretmek için ekspresyonu dengeleyen ve aynı zamanda tek aşamalı saflaştırmaya izin veren zarif PURE suşları konsorsiyumu tasarladılar7.

Lavickova ve arkadaşları tarafından geliştirilen yenilikçi OnePot PURE sistemi, kullanım kolaylığı açısından büyük umut vaat ediyor 8,9. Bu sistemde, orijinal PURE suşları tek bir kromatografi aşaması ile birlikte kültürlenir ve saflaştırılır. Elde edilen PURE sisteminin bileşimini kesin olarak tanımlamak mümkün olmasa da, yazarlar sistemin çoklu partilerinin büyük ölçüde tekrarlanabilir olduğunu ve her bir suşun aşılama hacmini değiştirerek kaba bir kontrol seviyesi elde edilebileceğini gösterdiler. Üretim kolaylığı için hassas bileşim kontrolünün ödünleşimi, OnePot sisteminden elde edilen genel protein sentezi veriminin ticari olarak elde edilene benzer olduğu göz önüne alındığında, birçok kullanıcı için kabul edilebilir bir durumdur. Bununla birlikte, OnePot sistemi için ayrıntılı protokoller mevcut olsa da, Lavickova ve ark. sonuçları diğer laboratuvarlarda tamamen yeniden üretmek zor olmuştur. Örneğin, ekspresyon vektörü kararsızlığı, yavaş büyüyen suşlar ve proteoliz gözlenmiştir10.

Bu çalışmada, standartlaştırılmış gliserol stokları ve ortam ayarlamaları kullanarak hücre büyümesini kontrol eden, büyümenin izlenmesi ve OD hasadı konusunda rehberlik eden ve son saflaştırmada gliserol miktarını normalleştiren ayrıntılı ve rafine bir OnePot PURE protokolü sunuyoruz. İkinci olarak, ribozom aktivitesi ile daha karmaşık yöntemlerin maliyeti ve karmaşıklığı arasındaki dengeyi dengeleyen, yalnızca diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanarak optimize edilmiş bir ham ribozom saflaştırma prosedürü sunuyoruz.

Bu, OnePot protokolüne daha fazla adım getirse de, kullanıcıya gerektiğinde prosedürü daha kapsamlı bir şekilde sorun giderme ve kendi ihtiyaçlarına göre değiştirme fırsatı verir. Aynı laboratuvarda birden fazla kullanıcı tarafından gerçekleştirilen birden fazla biyolojik kopyayı göstererek sürecin tekrarlanabilirliğini gösteriyoruz. Hem PURE bileşenleri hem de ribozom hazırlığı üzerindeki kontrolün, sistemin yüksek CFPS performansını sağlamak için çok önemli olduğunu görüyoruz.

PURE ve ribozom preparatının her biri sırasıyla 4 veya 5 gün sürer ve bir kullanıcı tarafından sırayla veya iki kullanıcı tarafından aynı anda gerçekleştirilebilir. PURE preparatı, her biri ~15 mg / mL konsantrasyonda ~ 2 g hücre peleti ve ~ 1 mL PURE protein veren 4x500 mL sıvı kültür içerir. Ribozom hazırlığı 4 × 500 mL = 2 L sıvı kültür içerir, bu da toplam ~3 g hücre peletine yol açar ve ~17 μM konsantrasyonda ~1 mL ham ribozom verir. Mevcut protokol, 2 saatlik kesikli reaksiyon11 boyunca ~100 μg/mL GFP'ye veya ~130 μg/mL mCherry'ye kadar sentez verimine sahip PURE sistemleri üretir ve bu da orijinal OnePot'un yanı sıra ticari sistemlerle (~140-160 μg/mL) olumlu bir şekilde karşılaştırılır8,12. Bu nedenle, tuzlar, kalabalıklaştırıcı ajanlar ve bireysel protein faktörleri gibi hassas bileşenlerin takviyesi veya modülasyonu yoluyla daha fazla optimizasyon için uygun bir başlangıç noktasıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol üç bölüme ayrılmıştır. Özlülük ve açıklık adına, bu çalışmaya özgü önemli değişiklikleri vurguluyoruz ve bu nedenle, diğer yayınlarda bulunanlarla aynı olan ayrıntılara atıfta bulunuluyor.

Ön çalışmanın sadece bir kez yapılması gerekir. Dört bölüm, PURE proteinleri için gliserol stoklarının ve başlangıç plakalarının hazırlanmasının yanı sıra suşların ekspresyon sürelerinin doğrulanmasını ve ölçülmesini içerir. Başlangıç plakalarının kullanılması, kazınmış gliserol stoklarından doğrudan aşılama ile ilişkili değişkenliği ortadan kaldırır. İmalat aşamasına geçmeden önce bu işin eksiksiz bir şekilde yapıldığından emin olmak çok önemlidir. PURE'un hazırlanmasında yer alan çok sayıda farklı gliserol stoğu nedeniyle, sistemi üretmeye çalışmadan önce her suşun plazmit bütünlüğünü ve ekspresyonunu doğrulamak önemlidir.

İş akışının bir şeması Şekil 1'de ve Tablo 1'de önerilen bir zaman çizelgesi verilmiştir. Gerekli malzemeler ve bunların kullanıldığı adımlar, Malzeme Tablosunda verilmiştir ve her aşamada gerekli olan tamponların ve ortamların ana hatları Ek Şekil S1'de özetlenmiştir.

1. Ön çalışma

  1. Gliserol stoklarının oluşturulması
    NOT: Tüm plazmitler Addgene'den temin edilebilir.
    1. Standart prosedürler9'u izleyerek Tablo 2'de listelenen tüm suşların %25 w / v gliserol stoklarını oluşturun ve -80 ° C'de kriyoviyallerde saklayın.
  2. PURE başlangıç plakalarının hazırlanması (gece boyunca)
    1. 100 μg/mL ampisilin (LB+AMP) ile desteklenmiş 20 mL LB ortamı hazırlayın.
    2. 36x steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerini # 1-# 36 arasında etiketleyin.
    3. Her tüpe 500 μL LB+AMP ekleyin. Orijinal gliserol stoğundan küçük bir miktar kazımak için bir pipet ucu kullanarak her tüpü karşılık gelen suşla aşılayın. Gliserol stoklarının çözülmediğinden emin olun. İyice karıştırmak için girdap.
    4. Her bir aşılanmış tüpten 300 μL'yi, Şekil 2'de gösterilen düzeni izleyerek steril 1 mL 96 derin kuyu plakasının karşılık gelen kuyucuğuna alikot edin.
      NOT: Plakaları içeren sonraki tüm adımlarda, baştan sona aynı plaka düzenini koruyun.
    5. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de, 1,000 RPM'de 15 saat boyunca bir plaka çalkalayıcıda inkübe edin.
    6. Ertesi gün, 100 μg/mL ampisilin (LB+AMP) ve 15 mL steril %50 (h/h) gliserol ile desteklenmiş 25 mL LB ortamı hazırlayın.
    7. Çok kanallı bir pipet kullanarak her kültürün 30 μL'sini derin kuyucuklu plakadan optik 96 oyuklu bir plakanın dibine aktarın. Her kültürün 10 kat seyreltilmesini sağlamak için her bir kuyucuk içeren kültüre 270 μL LB+AMP ortamı ekleyin.
    8. Bir plaka okuyucu kullanarak her kültürün OD600'ünü ölçün. 650 μL taze LB+AMP'yi 0.2'lik bir başlangıç OD600'e aşılamak için gereken her kültürün hacmini hesaplayın. Hesaplamalara yardımcı olacak bir elektronik tablo, Ek Tablo S1 olarak sağlanmıştır.
    9. Üç yeni steril 1 mL 96 derin kuyu plakası hazırlayın. Bir plakada, 36 oyuğa 650 μL LB + AMP ekleyin ve OD600 = 0.2 elde etmek için her bir oyuğu hesaplanan gece boyunca kültür hacmi ile aşılayın.
    10. 300 μL aşılanmış kültürü diğer iki plakanın her birine aktarın. Bir plaka kültür olacak ve diğeri OD'yi izlemek için kullanılacaktır. İki plakayı, kültürler OD600 ~ 1'e (~ 1.5-2 saat) ulaşana kadar 37 ° C, 1000 RPM'de bir plaka çalkalayıcıda inkübe edin. OD'yi 1 saatte izleyin ve ardından ikinci plakadan 30 μL numune çıkararak ve 270x seyreltme için 10 μL LB+AMP'ye ekleyerek gerektiği gibi tekrar izleyin.
    11. Bireysel kuyular OD600 ~ 1'e ulaştığında, bunları çalkalayıcıdan çıkarın. % 25 gliserolde OD600 = 0.5'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her kültüre eşit hacimde steril% 50 (h / h) gliserol ekleyin. İyice karıştırın ve bu tüpleri buz üzerinde saklayın. Bunlar ana çalışma stoklarıdır.
    12. Orijinal kuyu modelini koruyarak 96 oyuklu PCR plakalarına her bir ana stoktan maksimum 40 μL'yi alikot edin. Depolama kapasitesine bağlı olarak mümkün olduğunca çok plakaya dağıtın. Folyo plaka contaları ile kapatın ve bu PURE başlangıç plakalarını -80 °C'de saklayın.
      NOT: Bu başlangıç plakaları en fazla 3 kez çözülmelidir. Gerinim bütünlüğünü ve tekrarlanabilirliği korumak için bu sınırı aşarsa yeni plakalarla değiştirin.
  3. Starter kültürün büyüme sürelerinin belirlenmesi (bir gecede)
    1. PURE başlangıç plakasını buz üzerinde çözdürün.
    2. Steril bir konik tüpte (LB+AMP) 50 mL steril LB ortamına 50 μL 100 mg/mL ampisilin ekleyin.
    3. 36 x 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerini # 1-# 36 arasında etiketleyin ve her tüpe 1 mL LB + AMP ekleyin.
    4. İlgili etiketli tüpe gliserol stoklarının her birinden 10 μL ekleyin ve girdaplama ile iyice karıştırın.
    5. Her tüpten 300 μL aşılanmış kültür, steril 1 mL 96 derin kuyu plakasının karşılık gelen kuyucuğuna ekleyin. Plakaları nefes alabilen bir plaka contası ile kapatın ve kültür plakasını 1000 RPM, 37 °C'de bir plaka çalkalayıcıda inkübe edin. OD600 = 3'ü aşmadan kültürlerin OD600 ~ 2-3'e ulaşması için geçen süreyi belirleyin ve kaydedin. Devam etmeden önce bu parametreyi oluşturun.
      NOT: Laboratuvarımızda bu işlem 15 saat sürer.
  4. PURE suşlarının ekspresyon denemesi
    1. 100 μg/mL ampisilin (LB+AMP), 10 mM IPTG stoğu ve 1x protein ekstraksiyon reaktifi ile desteklenmiş 38 mL LB ortamı hazırlayın.
    2. PURE başlangıç plakasını buz üzerinde çözdürün.
    3. Steril 2 mL 96 derin kuyu plakasının 36 oyuğunun her birine 1 mL LB + AMP ekleyin. Her bir kuyucuğu karşılık gelen 20 μL başlangıç kültürü ile aşılayın. Plakayı 1000 RPM, 37 °C'de yaklaşık 1 saat veya OD600 = 2'ye ulaşılana kadar bir plaka çalkalayıcıda inkübe edin.
    4. 0.1 mM'lik bir nihai IPTG konsantrasyonu için her bir oyuğa 10 μL 10 mM IPTG ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. 1000 RPM, 37 °C'de 3 saat inkübasyona devam edin.
    5. 3 saatlik ekspresyon periyodunun sonunda, her kültürün 700 μL'sini 36 x 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 20.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın.
    6. Her peleti 70 μL 1x protein ekstraksiyon reaktifi içinde yeniden süspanse edin. Hücre lizizine izin vermek için hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    7. Çözünmeyen fraksiyonu peletlemek için lizatları 20.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    8. Üreticinin talimatlarına göre Ni-NTA manyetik boncuklar kullanarak her proteinin küçük ölçekli His-tag saflaştırmasını gerçekleştirin.
    9. Her bir proteinin ekspresyonunu ve / veya suşlar arasındaki çapraz kontaminasyonu doğrulamak için SDS-PAGE kullanarak saflaştırılmış proteinleri analiz edin9.
      NOT: Proteini eksprese eden suşlar, hedef proteinin beklenen moleküler ağırlığına karşılık gelen SDS-PAGE üzerinde farklı bantlar sergileyecektir. Herhangi bir bant tespit edilmezse, suş proteini eksprese etmiyor olabilir. Bu gibi durumlarda, dizi kimliğini ve bütünlüğünü doğrulamak için plazmiti izole edin ve sıralayın ve gerekirse plazmiti değiştirin.

2. OnePot PURE protein saflaştırması (4 gün)

NOT: Tek bir PURE sistem hazırlığı, 500 mL sıvı kültürün işlenmesini gerektirir. Tek bir çalışmada dört bağımsız PURE partisi üretmek için aynı anda 4 x 500 mL müstahzar üretilmesi tavsiye edilir. Bu partiler daha sonra bağımsız olarak ölçülebilir veya uygunsa birleştirilebilir. 4 günlük protokol, reçine inkübasyon adımını gece boyunca gerçekleştirerek 3 güne kısaltılabilir, ancak bu uzun bir üçüncü günü içerir. Her iki seçenek de aşağıda detaylandırılmıştır.

  1. 1. Gün: Malzemelerin hazırlanması ve starter kültürlerin yetiştirilmesi
    1. Ek Tablo S2 ve Ek Şekil S1'de açıklandığı gibi PURE hazırlığı için stok çözeltileri ve tamponlar hazırlayın.
      NOT: Protokolün her bir parçasının yürütülmesinden hemen önce gerekli olan ilgili ortamı ve arabellekleri hazırlayın ve yalnızca belirtildiği gibi kullanımdan önceki maksimum gün sayısı boyunca saklayın.
    2. PURE başlangıç plakasını buz üzerinde çözdürün.
    3. Steril 50 mL konik tüpte (LB+AMP) 50 mL steril LB ortamına 50 μL 100 mg/mL ampisilin ekleyin.
    4. 36 x 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerini # 1- # 36 arasında etiketleyin ve her tüpe 1 mL LB + AMP ekleyin.
    5. İlgili etiketli tüpe gliserol stoklarının her birinden 10 μL ekleyin ve girdaplama ile iyice karıştırın.
      NOT: Her bir suşun aşılanmasını kolayca takip etmek için, suşu her bir tüpe ekledikten sonra, pipet ucunu PURE başlangıç plakasının ilgili kuyusuna çıkarın. Bu işlemi tüm suşlar için tekrarlayın. Tamamlandığında, folyo ve otoklav bandı ile yeniden kapatmadan ve -80°C'de saklamadan önce pipet uçlarını plakadan dikkatlice çıkarın.
    6. Her tüpten 300 μL aşılanmış kültür, suş #25 (EF-Tu) hariç, steril 1 mL 96 derin kuyu plakasının karşılık gelen kuyucuğuna ekleyin. Plakaları nefes alabilen bir plaka contası ile kapatın. Kültür plakasını 1.000 RPM, 37 °C'de 14 saat boyunca bir plaka çalkalayıcıda inkübe edin.
    7. EF-Tu başlangıç kültürünü hazırlamak için 50 mL'lik konik bir tüpte tüp #25'ten 10 mL LB'ye 1 mL aşılanmış kültür ekleyin. Tüpü bir inkübatörde 260 RPM'de, 37 ° C'de 14 saat inkübe edin.
      NOT: Suş #25, EF-Tu, diğer bileşenlerden çok daha yüksek bir konsantrasyonda gereklidir ve bu nedenle orijinal protokol8'de açıklandığı gibi ayrı olarak işlenir.
    8. 2 L steril 2x YTP ortamını 2 L'lik bir cam şişeye koyun ve gece boyunca ön ısıtmak için 37°C'de statik inkübatöre koyun.
  2. 2. Gün: büyüme ve peletleme
    1. Gerekli reaktifleri hazırlayın:
      1. 2 L steril önceden ısıtılmış 2x YTP besiyeri (1. günden itibaren)
      2. 2 mL 100 mg / mL ampisilin
      3. 100 mM IPTG, steril
      4. 100 mL PBS, steril, buz gibi
      5. 10 mL LB ortam
    2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, başlatıcı derin kuyu plakasından ve EF-Tu başlangıç tüpünden her bir başlatıcı kültürün 30 μL'sini optik 96 kuyulu bir plakanın dibine aktarın.
    3. Her kültürün 10 kat seyreltilmesini sağlamak için kültürleri içeren her bir oyuğa 270 μL LB ortamı ekleyin.
    4. Bir plaka okuyucu kullanarak her kültürün OD600'ünü ölçün. Tüm suşlar OD600 = 2-3'te olmalıdır.
      NOT: Bir kültür OD600 = 3'ün üzerine çıkmışsa, 2x YTP + AMP (Ek Tablo S1) kullanarak OD600 = 3'e seyreltin. Aşırı büyümüş başlangıçların seyreltilmesi zaman alıcı ve hataya açık olabilir. Bu nedenle, Ön çalışma Bölüm 1.3'te açıklandığı gibi OD600 2-3'e ulaşmak için gereken tam inkübasyon süresinin belirlenmesi tavsiye edilir.
    5. 500 mL önceden ısıtılmış 2x YTP ortamı ve 500 μL 100 mg/mL ampisilin'i steril 2,5 L'lik şaşkın bir şişeye (2x YTP+AMP) aktarın.
    6. Tek bir steril 15 mL konik tüpe, başlangıç kültür plakasından her kültürden 55 μL ve EF-Tu kültüründen 1675 μL ekleyin. Girdap yaparak iyice karıştırın.
      NOT: Bu, tüm PURE türlerini bir araya getiren OnePot kültürüdür. Bu aşamada, bazı suşlar dışarıda bırakılarak nakavt (ΔPURE) sistemler oluşturulabilir veya birlikte saflaştırma gerektiren diğer bileşenler eklenebilir.
    7. Bu tüpün içeriğini 500 mL 2x YTP + AMP içeren 2,5 L'lik şaşkın şişeye ekleyin. 4x bağımsız kültür elde etmek için 5-7 arasındaki adımları tekrarlayın.
    8. Şişeleri 260 RPM, 37 °C'de 1.5-2 saat, OD600 = 0.2-0.3'e kadar inkübe edin.
    9. OD600 = 0.2-0.3'e ulaşıldığında, 0.1 mM IPTG'lik bir nihai indüksiyon konsantrasyonu için her bir şişeyi 500 μL 100 mM IPTG ile aşılayın.
    10. Kültürleri 260 RPM, 37 °C'de 3 saat daha inkübe edin.
    11. İnkübasyon sırasında, dört adet steril 50 mL konik tüpü tartın ve etiketleyin.
    12. Santrifüjleri gerektiği gibi 4 °C'ye kadar önceden soğutun ve dört polipropilen kopolimer santrifüj şişesini etiketleyin ve ön soğutun.
    13. Dört adet etiketli 500 mL cam şişeyi buzlu su banyosuna yerleştirin.
    14. 3 saatlik inkübasyonun sonunda, büyümeyi sonlandırmak için her kültürü dikkatlice buz üzerinde bir cam şişeye boşaltın.
      NOT: Kültürlerin soğutulmuş şişelere aktarılması, büyümeyi hızlı bir şekilde durdurmak için çok önemlidir: sıcak şişelerin doğrudan buzlu su banyosuna yerleştirilmesi, büyümenin verimli bir şekilde sonlandırılmasına neden olmaz. Aksi belirtilmedikçe sonraki tüm adımlar buz üzerinde yapılır.
    15. Her kültürden 250 mL'yi ilgili santrifüj şişelerine ekleyin ve diğer 250 mL'yi buzlu su banyosunda tutarken 3.220 × g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    16. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve kağıt havlularla kurulayın.
    17. Her kültürün kalan 250 mL'sini ilgili santrifüj şişelerine ekleyin ve 3.220 × g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    18. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve kağıt havlularla kurulayın.
    19. Her santrifüj şişesine 20 mL steril buz gibi PBS ekleyin ve hücre peletini iyice yeniden süspanse edin.
    20. Her bir yeniden süspansiyonu hazırlanan 50 mL'lik konik tüplere aktarın.
    21. Tüpleri 2.000 × g, 4 °C'de 8 dakika santrifüjleyin.
    22. Süpernatanı dikkatlice boşaltarak çıkarın.
    23. Tüpleri tekrar 2.000 × g, 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
    24. Artık süpernatanı pipetleyerek çıkarın ve hücre peletlerini buz üzerinde tutun.
    25. Her tüp şimdi tek bir 500 mL kültürden hücre peletini içerir. Her tüpü tartın, her tüpün boş ağırlığını çıkararak hücre pelet kütlesini (tipik olarak ~ 2 g) hesaplayın ve kaydedin.
    26. Hücre peletlerini dondurun ve parçalanana kadar -80 ° C'de saklayın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, bu noktada doğrudan lizis adımına geçilerek protokol 3 gün içinde tamamlanabilir.
  3. 3. Gün: liziz, saflaştırma ve diyaliz
    1. Gerekli reaktifleri hazırlayın:
      1. 50 mL yeniden süspansiyon tamponu hazırlayın.
      2. 0,5 m TCEP hazırlayın.
    2. Hücre peletlerini buz üzerinde çözdürün.
    3. 50 mL'lik konik bir tüpe 50 mL Yeniden Süspansiyon Tamponu ekleyin ve 100 μL 0,5 M TCEP ekleyin. Girdap yaparak iyice karıştırın.
    4. Hücre peletlerini Resüspansiyon Tamponu + TCEP'de 1 g hücre peleti başına 2 mL oranında yeniden süspanse edin. Yeniden askıya almak için iyice girdap.
    5. Hücre yeniden süspansiyonunu, her tüpün 5 mL süspansiyonu olacak şekilde 50 mL konik tüplere dağıtın. 4 bağımsız kültürü takip etmek için tüpleri gerektiği gibi etiketleyin. Buz üzerinde saklayın.
    6. Soğutulmuş bir sonikasyon probu kullanarak bir buzlu su banyosunda 10 döngü boyunca% 30 genlikte, 20 s açık, 20 s kapalı sonikasyon yoluyla hücreleri lyse (Şekil 3A, B).
      NOT: Sonikasyon sırasında her tüpe yaklaşık 1000 J enerji aktarılmalıdır. Enerji transferinin tutarlılığını sağlamak için sonikasyon sırasında tüpü yerinde tutmak için güvenli bir stand kullanın.
    7. Lizatı, her tüp 1 mL lizat içerecek şekilde 2 mL steril mikrosantrifüj tüplerine dağıtın. Dört kültürü de parçalamak için 2.3.6 ve 2.3.7 adımlarını tekrarlayın. Aşağıdaki adımlar paralel olarak 4 lizat için gerçekleştirilir.
    8. 15.923 × g'da, 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
    9. Santrifüjleme sırasında, 5 mL protein saflaştırma reçinesini yıkayın ve dengeleyin (dört lizat için dört sütun hazırlayın):
      1. Yerçekimi akış kromatografisi kolonuna 2 mL taze protein saflaştırma reçinesi ekleyin.
      2. Depolama etanolünü çıkarmak için sütunu 30 mL steril damıtılmış su ile iki kez yıkayın.
      3. 30 mL Resüspansiyon Tamponunu 60 μL 0,5 M TCEP ile 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
      4. Kolon 30 mL'lik bir hacme sahip olduğundan, doldurmak için tamponları doğrudan kolona dökün. Valfin kapalı olduğundan emin olarak, 30 mL Yeniden Süspansiyon tamponu + TCEP ekleyerek kolonu dengeleyin.
      5. Kolon vanasını kapatmadan önce ~25 mL tamponun akmasına izin vermek için vanayı açın ve kurumayı önlemek için reçine yatağının üzerinde ~5 mL tampon bırakın. Sütun artık kullanıma hazırdır.
    10. Santrifüjlemeyi takiben, her kültürden arıtılmış pelet içermeyen tüm süpernatanı buz üzerinde 4 adet taze 50 mL konik tüplerde birleştirin.
    11. Reçineyi her bir kolonda kalan 5 mL Yeniden Süspansiyon Tamponu + TCEP'de yeniden süspanse edin ve lizat süpernatantını içeren konik tüplerin her birine tampon ve reçine ekleyin.
    12. Kapağı kapatın ve Parafilm ile kapatın ve 4 ° C'de 5 saat boyunca bir döner çalkalayıcıda inkübe edin.
      NOT: Lizis, büyümeden hemen sonra yapıldıysa, bu lizat gece boyunca reçine ile inkübe edilebilir.
    13. Gerekli reaktifleri hazırlayın:
      1. Yıkama ve Elüsyon Tamponlarına 1 mM'lik son konsantrasyonda TCEP ekleyin ve kullanana kadar 4 ° C'de saklayın.
      2. % 20 (h / h) etanolü hazır bulundurun.
    14. İnkübasyondan sonra, reçineyi tüpün dibine toplamak için tüpleri bir santrifüjde kısaca vurun.
    15. Reçineyi bir pipet kullanarak yeniden süspanse edin ve reçineyi protein saflaştırma kolonuna geri ekleyin.
    16. Reçine kolonun altındaki bir yatağa yerleştikten sonra, tamponun geçmesine izin verin.
      NOT: Saflaştırma prosedüründe sorun gidermek için SDS-PAGE aracılığıyla analiz için protein saflaştırması sırasında isteğe bağlı olarak akışı toplayın ve yıkayın
    17. Bir sütun hacminde Yıkama Tamponu + TCEP ile sütunu yıkayın.
    18. Kolona 5 mL Elüsyon Tamponu + TCEP ekleyin, reçineyi bir pipetle birkaç kez yeniden süspanse edin ve 10 dakika inkübe edin.
    19. İnkübasyonun ardından, elüsyonu etiketli 5 mL'lik bir bijuteri tüpüne toplayın ve buz üzerinde saklayın.
    20. Protein saflaştırma reçinesini temizleyin ve saklayın:
      1. Elüsyon tamamlandıktan sonra, kalan bağlı proteinleri çıkarmak için sütunu 30 mL Elüsyon Tamponu ile yıkayın.
      2. Reçineyi 30 mL steril damıtılmış su ile durulayın, 3 kez tekrarlayın.
      3. 30 mL %20 (h/h) etanolü kolondan bir kez geçirin.
      4. Sütunu% 20 etanol ile doldurun ve bir kapak veya parafilm ile kapatın. Bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
        NOT: Sadece temizlik gereklidir - nikeli reçineden çıkarmaya çalışmayın. Temizlenmiş reçine, standart PURE sistem preparatlarında yeniden kullanım için uygundur; bununla birlikte, ΔPURE sistem varyantları için, çapraz kontaminasyonu önlemek için her zaman taze reçine kullanın.
    21. 15 mL 2 kDa'lık bir diyaliz kasetini Buffer HT'de (TCEP olmadan) 10 dakika bekletin.
    22. Diyaliz kasetine 5 mL ayrıştırılmış protein çözeltisi ekleyin.
    23. Kapağı tekrar takmadan önce kasetten mümkün olduğunca fazla havayı alın.
    24. 5 mL ayrıştırılmış proteini 1 L Tampon HT'ye (TCEP olmadan) karşı 2 saat boyunca diyalize edin, ardından 1 L taze Tampon HT'yi gece boyunca 4 ° C'de hafifçe karıştırarak diyalize edin.
      NOT: Birden fazla saflaştırmadan elde edilen elüsyonlar birleştirilirse, 2 saat boyunca 2 L Tampon HT'ye karşı 10 mL'ye kadar elüsyon diyalize edilebilir, ardından gece boyunca 4 ° C'de 2 L Tampon HT daha uygulanabilir. Reçine inkübasyonu gece boyunca yapıldıysa, diyaliz gün boyunca 2 saatlik bir protokol ve ardından 4 saatlik bir protokol ve hemen ardından aşağıdaki protein konsantrasyonu adımları kullanılarak gerçekleştirilebilir.
  4. 4. Gün: konsantrasyon ve depolama
    1. Gerekli reaktiflerin hazırlanması:
      1. Buffer HT Refresh + TCEP'i hazırlayın.
      2. Stok-60 + TCEP'i hazırlayın.
    2. Diyalizin tamamlanmasının ardından, diyalize edilmiş numunenin 5 mL'sini kasetten çıkarın ve 500 μL'lik alikotları 5 x 2 mL'lik steril mikrosantrifüj tüplerine dağıtın.
    3. Çökelmiş proteinleri 14.000 × g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca peletlemek için döndürün.
    4. Pelet içermeyen süpernatanı yeniden birleştirin ve 3 kDa MWCO santrifüj filtre ünitesine ekleyin ve hacmi 10 mL Buffer HT Refresh + TCEP ile doldurun.
    5. 3.220 × g, 4 °C'de 30 dakika VEYA numune hacmi 1,5 mL'ye düşene kadar santrifüjleyin.
      NOT: Konsantrasyon adımları sırasında protein çökelmesi, genel CFPS performansını önemli ölçüde azaltabilir. Her 30 dakikalık santrifüj döngüsünden sonra, filtrenin altındaki çökelmiş proteinleri çıkarmak için santrifüj filtre tüpündeki numuneyi yeniden süspanse etmek için 1 mL'lik bir pipet kullanın.
    6. Numuneyi santrifüj ünitesinden çıkarın ve 500 μL'lik alikotları 3 x 2 mL steril mikrosantrifüj tüplerine dağıtın.
    7. Çökelmiş proteinleri 14.000 × g, 4 °C'de 10 dakika boyunca peletlemek için döndürün.
    8. Pelet içermeyen süpernatanı buz üzerinde taze steril bir mikrosantrifüj tüpünde yeniden birleştirin.
    9. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir Bradford Testi kullanarak çözeltideki proteinlerin konsantrasyonunu belirleyin.
    10. Protein çözeltisini taze bir 3 kDa MWCO filtreye ekleyerek ve 14.862 × g, 4 ° C'de 15 dakika VEYA 25-30 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için numune hacmine ulaşılana kadar santrifüjleyerek konsantre edin.
    11. Numuneyi santrifüj ünitesinden çıkarın ve 500 μL'lik alikotları 2 mL steril mikrosantrifüj tüplerine dağıtın.
    12. Çökelmiş proteinleri 14.000 × g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca peletlemek için döndürün.
    13. Bir Bradford Testi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Sadece konsantrasyon 25 ila 30 mg / mL arasındaysa bir sonraki adıma geçin.
    14. Pelet içermeyen süpernatanı buz üzerinde yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yeniden birleştirin.
    15. Konsantre protein çözeltisine eşit miktarda Stock-60 + TCEP ekleyin ve hafifçe pipetleyerek karıştırın.
    16. Bir Bradford Testi kullanarak nihai protein konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Protein şimdi Tampon HT +% 30 gliserol içindedir ve Stock-30 ile herhangi bir ek seyreltme, gliserol konsantrasyonunu değiştirmez.
    17. Gerekirse, yaklaşık 12,5 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için numuneyi Stock-30 + TCEP ile seyreltin.
    18. PURE protein çözeltisini 20 μL'lik PCR tüplerine alikot edin, sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: Stock-60 eklemeden önce protein konsantrasyonunun doğru bir şekilde belirlenmesi çok önemlidir, çünkü gliserol içeren protein çözeltilerinin konsantre edilmesi, son CFPS reaksiyonundaki değişken miktarlarda gliserol nedeniyle tutarsız CFPS performansına neden olabilir. Bu nedenle Stock-60, yalnızca protein konsantrasyonunun 25-30 mg/mL'lik optimum aralıkta olduğu doğrulandıktan sonra eklenmelidir.

3. Ham ribozom hazırlığı (5 gün)

NOT: Ribozom saflaştırma protokolü, 2 L (4 x 500 mL şişe) sıvı kültürün işlenmesi için optimize edilmiştir, bu da toplam ~3 g hücre peletine yol açar ve 15-24 μM konsantrasyonda ~1 mL ham ribozom verir.

  1. 1. Gün: Starter kültürlerin hazırlanması ve büyümesi
    1. Ek Tablo S2 ve Ek Şekil S1'de açıklandığı gibi ribozom hazırlığı için stok çözeltileri ve tamponlar hazırlayın.
      NOT: protokolün her bir parçasının yürütülmesinden hemen önce gerekli olan ilgili ortamı ve tamponları hazırlayın ve yalnızca belirtildiği gibi kullanımdan önceki maksimum gün sayısı boyunca saklayın.
    2. İki adet 50 mL konik tüp hazırlayın: bir tüpe 10 mL LB ortamı ve diğerine 5 mL LB ortamı ekleyin.
    3. BL21(DE3)'ün gliserol stoğunu -80 °C dondurucudan çıkarın ve buzun üzerine koyun, stok çözülmeden önce sonraki adımların tamamlandığından emin olun.
    4. Bir LB 'mini kültürü' oluşturmak için 10 mL LB ortamını gliserol stoğundan hücrelerin kazınmasıyla aşılayın. 37 ° C, 220 RPM'de, diğer (aşılanmamış) tüple birlikte inkübe edin, çünkü tüm büyümeler antibiyotik olmadan yapıldığından, ortam kontaminasyonunu kontrol edin.
    5. Gliserol stoğunu -80 °C dondurucuda değiştirin.
    6. 2,2 L steril Müthiş Et Suyunu (TB) steril cam şişelere koyun ve gece boyunca önceden ısıtmak için 37 °C'de statik bir inkübatörde saklayın.
  2. 2. Gün: büyüme ve peletleme
    1. Kültürleri inkübatörden çıkarın ve devam etmeden önce aşılanmamış tüpte veya önceden ısıtılmış ortam şişesinde kontaminasyon olmadığından emin olun.
    2. 1 cm'lik bir küvette 900 μL LB'ye 100 μL mini kültür kültürü ekleyerek 10x'lik bir seyreltme hazırlayın ve OD600'ü bir spektrofotometre kullanarak ölçün (~4-6 olduğunu kontrol edin).
    3. Steril bir 500 mL konik şişeye 200 mL önceden ısıtılmış TB ekleyin ve bir başlangıç OD600 = 0.05 elde etmek için uygun hacimde mini kültür ile aşılayın (Ek Tablo S1). İşte 'midi kültürü' budur.
    4. Midi kültürünü 37 ° C, 220 RPM'de OD600 = 1'e kadar inkübe edin, bu yaklaşık 1.5-2 saat sürmelidir.
    5. 4 steril 2,5 L şaşkın şişenin her birine 500 mL TB ekleyin. Başlangıç OD600 = 0.05 elde etmek için her birini uygun hacimde midi-kültür ile aşılayın (Ek Tablo S1). Bunlar 4 'maxi-kültür'.
    6. Maxi kültürleri 37 ° C, 220 RPM'de OD600 = 0.7-0.8'e kadar inkübe edin, bu yaklaşık 1.5-2 saat sürmelidir.
    7. Bu arada, dört temiz polipropilen kopolimer santrifüj şişesini ve 4 temiz 500 mL cam şişeyi etiketleyin ve soğuması için buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: OD600 = 0.7'yi aşmamak için 1 saatlik büyümeden sonra her 15 dakikada bir maksi kültür yoğunluğunu ölçün.
    8. OD600 = 0.7'ye ulaşıldığında, kültürleri hızlı bir şekilde soğutulmuş cam şişelere aktarın ve büyümeyi sonlandırmak için 20 dakika buzlu su banyosuna koyun.
      NOT: Kültürlerin soğutulmuş şişelere aktarılması, büyümeyi hızlı bir şekilde durdurmak için çok önemlidir: şişelerin doğrudan buzlu su banyosuna yerleştirilmesi, büyümenin verimli bir şekilde sonlandırılmasına neden olmayacaktır. Aksi belirtilmedikçe sonraki tüm adımlar buz üzerinde yapılır.
    9. Kültürler buzlu su banyosunda soğurken, hücre peletlemesi için santrifüjü önceden soğutun ve soğuması için 500 mL PBS çözeltisini buzun üzerine yerleştirin.
    10. 20 dakika sonra, her kültürün 250 mL'sini karşılık gelen önceden soğutulmuş santrifüj şişesine aktarın ve diğer 250 mL'yi buz üzerinde tutarken 3.220 × g, 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    11. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve kağıt havlularla kurulayın.
    12. Her kültürün kalan 250 mL'sini ilgili santrifüj şişesine ekleyin ve 3.220 × g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    13. Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve hücre peletlerini tekrar buzun üzerine yerleştirmeden önce şişeleri kağıt havlu üzerinde kurulayın.
    14. Her santrifüj şişesine 30 mL steril buz gibi PBS ekleyin ve hücre peletini iyice yeniden süspanse edin.
    15. 4 kez temiz 50 mL konik tüpleri tartın ve etiketleyin.
    16. Hücre süspansiyonunu 4 x 50 mL'lik konik tüplere aktarın.
    17. 3.220 × g'da, 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    18. Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve hücre peletlerini tekrar buzun üzerine yerleştirmeden önce tüpleri kağıt havlu üzerinde kurulayın.
    19. Her konik tüpe 30 mL steril buz gibi soğuk PBS ekleyin ve girdaplama ile hücre peletini iyice yeniden süspanse edin.
    20. 3.220 × g'da, 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    21. Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve hücre peletlerini tekrar buzun üzerine yerleştirmeden önce tüpleri kağıt havlu üzerinde kurulayın.
    22. Her konik tüpe 30 mL steril buz gibi soğuk PBS ekleyin ve girdaplama ile hücre peletini iyice yeniden süspanse edin.
    23. 3.220 × g'da, 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    24. Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve hücre peletlerini tekrar buza yerleştirmeden önce şişeleri kağıt havlu üzerinde kurulayın.
    25. 3.220 × g, 4 °C'de 2 dakika boyunca son bir kez santrifüjleyin.
    26. Pipetleme ile fazla süpernatanı çıkarın.
    27. Her bir konik borunun kütlesini tartın ve kaydedin. Hücre pelet kütlesi, bu değerler ile tüplerin boş ağırlığı arasındaki farktır (~1 g olmalıdır).
    28. Sıvı nitrojen kullanarak hücre peletlerini dondurun ve -80 °C'de saklayın.
  3. 3. Gün: lizis, ultrasantrifüj ve Tampon B ıslatma
    1. Hücre peletlerini buz üzerinde çözdürün.
    2. Temiz bir konik tüpe 50 mL Ribozom Tamponu A ekleyin.
    3. Konik tüpten 100 μL Ribozom Tamponu A alın ve Ağırlıksız bir DTT şişesine ekleyin. 0.5 M DTT stoğu elde etmek için DTT peletini tamamen çözün.
      NOT: Sonraki 0.5 M DTT stoklarını burada açıklandığı gibi hazırlayın, ancak her adım için uygun tamponu kullanın.
    4. 50 mL Ribozom Tamponu A'da 1 mM DTT'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 50 mL konik tüpe 100 μL 0,5 M DTT ekleyin. Çözeltiyi buz üzerinde tutun.
    5. Her bir hücre peletini Ribozom Tamponu A + DTT'de, 1 g hücre peleti başına 2 mL oranında, iyice girdaplama ile yeniden süspanse edin. 2 L kültürden 10 mL olması gereken toplam yeniden askıya alınmış bulamaç hacmini doğrulamak için tüm yeniden askıya alınmış hücreleri tek bir konik tüpte birleştirin. Gerekirse, ekstra Ribosome Buffer A + DTT ile hacmi 10 mL'ye yükseltin.
    6. Bulamacı ayrı konik tüplerde 2 x 5 mL numunelere bölün.
    7. Soğutulmuş bir sonikasyon probu kullanarak, bir buzlu su banyosunda% 30 genlikte, 20 s açık, 10 döngü için 20 s kapalı (3 dakika 20 s toplam program uzunluğu) sonikasyon yoluyla her tüpteki hücreleri parçalayın (Şekil 3A, 3C).
      NOT: Sonikasyon sırasında tüp başına yaklaşık 1.000 J enerji aktarılmalıdır. Enerji transferinin tutarlılığını sağlamak için sonikasyon sırasında tüpü yerinde tutmak için güvenli bir stand kullanın.
    8. Ribozom Tamponu A + DTT ile her parçalanmış numunenin hacmini 25 mL'ye kadar doldurun ve karıştırmak için kısaca girdaplayın.
    9. İçeriği 2x soğutulmuş S30 santrifüj tüplerine aktarın.
    10. 4 ° C'de 1 saat boyunca 30.000 × g'da santrifüjleyin (Şekil 3E).
    11. Her bir S30 tüpünden pelet içermeyen süpernatantın maksimum %75'ini (peletten membran kontaminasyonunu önlemek için) iki temiz, önceden soğutulmuş S30 tüpüne geri kazanın.
    12. 30.000 × g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
    13. Peletsiz süpernatantın maksimum% 75'ini iki temiz 50 mL konik tüpe geri kazanın ve her birinin hacmini Ribozom Tamponu A + DTT ile 25 mL'ye yükseltin.
    14. Numuneyi iki temiz, önceden soğutulmuş S100 tüpüne aktarın.
      NOT: Ultrasantrifüjlemeden önce tüplerin doğru bir şekilde dengelendiğinden (karşılıklı tüpler arasında maksimum 0.01 g fark) ve 25 mL'lik bir hacme (maksimum S100 tüpü kapasitesi) kadar doldurulduğundan emin olun.
    15. 4 ° C'de 4 saat boyunca 100.000 × g'da santrifüjleyin (Şekil 3F).
    16. S100 çalışmasının bitiminden otuz dakika önce, yukarıdaki talimatlara göre buz gibi Ribozom Tamponu B kullanarak 0,5 M'lik bir DTT stoğu hazırlayın ve 50 mL Ribozom Tamponu B'de 1 mM DTT'lik nihai bir çözelti oluşturun.
    17. Süpernatanı boşaltarak ultrasantrifüj tüplerinden çıkarın. Ribozomal pelet içeren her S100 tüpüne 5 mL buz gibi Ribozom Tamponu B + DTT ekleyin. Kalan Ribozom Tamponu B + DTT'yi ertesi gün kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
    18. Ribozom peletinin gece boyunca Ribozom Tamponu B + DTT'ye batırılmasına izin vermek için tüpleri soğuk bir odada buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: Ribozom peletinin Ribozom Tamponu B + DTT'ye tamamen daldırıldığından emin olun. Bu, tüpleri belirli bir açıyla buza yerleştirerek elde edilebilir (Şekil 3D).
  4. 4. Gün: ultrasantrifüj ve Tampon C ıslatma
    1. Ertesi gün, gece boyunca ıslatılmış ribozom peletini içeren her bir S5 tüpüne 100 mL buz gibi Ribozom Tamponu B + DTT daha ekleyin.
    2. Pipetleme ile peleti nazikçe yeniden süspansiyona uğratmayı deneyin. Peleti tüp duvarından sıyırmak için pipet ucunu kullanın ve bu şekilde yeniden süspanse edin. İçeriği önceden soğutulmuş iki temiz S30 tüpüne aktarın.
    3. Ribozom peletini içeren her bir S100 tüpüne 10 mL daha buz gibi Ribozom Tamponu B + DTT ekleyin ve yukarıdaki gibi yeniden süspansiyon adımlarını tekrarlayın.
    4. Yeniden süspansiyonu daha önce olduğu gibi aynı S30 tüpüne harmanlayın.
    5. 4 ° C'de 1 saat boyunca 30.000 × g'da santrifüjleyin (Şekil 3G).
    6. Peletsiz süpernatanın maksimum% 75'ini iki temiz 50 mL konik tüpe geri kazanın ve Ribozom Tamponu B + DTT ile hacmi 25 mL'ye kadar doldurun.
    7. Bu numuneyi iki temiz, önceden soğutulmuş S100 tüpüne aktarın.
      NOT: Ultrasantrifüjlemeden önce tüplerin doğru bir şekilde dengelendiğinden ve 25 mL'lik bir hacme kadar doldurulduğundan emin olun (maksimum S100 tüp kapasitesi).
    8. 4 ° C'de 4 saat boyunca 100.000 × g'da santrifüjleyin (Şekil 3H).
    9. S100 çalışmasının bitiminden otuz dakika önce, yukarıdaki talimatlara göre buz gibi Ribozom Tamponu C kullanarak 0,5 M DTT'lik bir stok hazırlayın ve 5 mL Ribozom Tamponu C'de 1 mM DTT'lik nihai bir çözelti oluşturun.
    10. Ultrasantrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın ve kalan tamponu pipetleme ile çıkarın. Peletin tampon tarafından çok uzun süre açıkta bırakılmasını önlemek için hızlı çalışın.
    11. Ribozomal pelet içeren her bir ultra santrifüj tüpüne 400 μL buz gibi Ribozom Tamponu C + DTT ekleyin.
    12. Ribozom peletinin gece boyunca Ribozom Tamponu C + DTT'ye batırılmasına izin vermek için tüpleri soğuk bir odada buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: Ribozom peletinin Ribozom Tamponu C + DTT'ye tamamen daldırıldığından emin olun. Bu, tüpleri belirli bir açıyla buza yerleştirerek elde edilebilir.
  5. 5. Gün: koleksiyon
    1. Ertesi gün, 1 mL'lik bir pipet kullanarak ribozom peletini nazikçe yeniden süspanse edin ve berrak halo ribozom peletini tamamen çözmek için hafifçe döndürün.
      NOT: Ribozom peleti bu aşamada tamponda tamamen çözünmelidir: bu noktada çözünmeyen pelet olmamalıdır, ancak sarı çözünmeyen bir pelet kalırsa, onu yeniden süspanse etmeye çalışmayın: sadece berrak halo ribozom peletini yeniden süspanse edin.
    2. Ribozom çözeltisini iki steril 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kalan çözünmeyen materyali peletlemek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.000 × g'da santrifüjleyin.
    3. Pelet içermeyen süpernatanı temiz bir tüpe toplayın ve buz üzerinde saklayın (Şekil 3I).
    4. Üçlü kopya halinde 198 μL Ribozom Tamponu C'ye 2 μL ekleyerek ribozom çözeltisinin 100x seyreltmesini oluşturun.
    5. RNA konsantrasyonunu 260 nm'de ölçün; Seyreltilmiş numunenin 10 absorbans birimi, 24 μM ribozoma13 eşittir.
    6. Alikot ribozom çözeltileri (örneğin, kullanıcı ihtiyaçlarına bağlı olarak 50 μL'lik alikotlarda), maksimum 24 μM konsantrasyonda sıvı nitrojen içinde dondurulur ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklanır.
      NOT: Protokol, 12-18 μM konsantrasyonda yaklaşık 1 mL ribozoma yol açmalıdır. Ribozomlar çok seyreltikse, 3 kDa MWCO filtresi8 kullanılarak konsantrasyon elde edilebilir.

4. CFPS deneylerinin kurulması

  1. Ön çalışma
    1. DNA şablonunu (doğrusal veya plazmit) belirlenmiş protokollere göre hazırlayın9.
      NOT: Laboratuvarımızda, hücresiz ifade14 için optimize edilmiş T7p14 ekspresyon sistemine dayalı DNA şablonları kullanıyoruz. Saflaştırılmış PCR ürünleri doğrusal şablonlar olarak kullanılabilir. Plazmitlerin mini hazırlıktan sonra temizlenmesi gerektiğine ve farklı ticari kitlerin farklı sonuçlar verdiğine dikkat etmek önemlidir15.
    2. Tablo 3'te açıklandığı gibi 5x enerji çözeltisi hazırlayın.
    3. Tablo 6'te açıklandığı gibi 4x matris çözeltisini hazırlayın.
  2. PURE reaksiyonunun kurulması ve izlenmesi
    NOT: Bu protokol, bir ana karışım kullanılarak üçlü bir ölçümün kurulumunu açıklar. Reaksiyon sayısı, Ek Tablo S3'te verilen elektronik tablo kullanılarak gerektiği gibi büyütülebilir veya azaltılabilir, ancak tek bir deneysel koşul için en az üçlü tekrar öneririz.
    1. Çözülme, buz üzerinde PURE, ribozomlar, enerji çözeltisi ve matris çözeltisi alikotları gerektiriyordu.
    2. Bileşenleri aşağıdaki sırayla bir araya getirerek, Tablo 5'te gösterildiği gibi bir PCR tüpünde toplam 17 μL'lik tek bir üçlü reaksiyon seti için bir ana karışım hazırlayın: enerji çözeltisi, SAF proteinler, ribozomlar, matris çözeltisi, nükleaz içermeyen su 17 μL'ye.
    3. Pipeti 5,1 μL'ye ayarlayın ve homojenliği sağlamak için çözeltiyi 5-6 kez nazikçe aspire edin.
    4. Aynı pipet ayarını (5,1 μL) kullanarak, ana karışımı optik 384 oyuklu bir plakanın üç ayrı kuyucuğuna yükleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için pipeti ilk duraktan sonra itmekten kaçının. Floresan karışmasını en aza indirmek için her çoğaltma arasında bir kuyu boşluğu bırakın.
    5. Yapışkan bir plaka contası kullanarak plakayı kapatın.
    6. Gerektiği gibi aşağı akış inkübasyonu veya plaka okuyucu ölçümleri ile devam edin.
      NOT: Gliserol içeren ek bileşenler (örn. arttırıcı proteinler) eklerken, bu tür bileşenlerin nihai hacminin reaksiyon hacminin %10'unu aşmadığından emin olun. Örneğin, %30 gliserol içeren bir bileşen, 17 μL ana karışım başına 1,7 μL ile sınırlandırılmalıdır.
      Yüklemeden sonra 384 kuyulu plakayı santrifüjlemeyin. Santrifüjleme, gliserol açısından zengin bileşenlerin (örneğin, PURE sistemi) ayrılmasına neden olarak tutarsız ekspresyon seviyelerine neden olabilir. Plaka tasarımı küçük hacimli reaksiyonları destekler ve dikkatli pipetleme, santrifüjleme olmadan yeterli çökeltme sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PURE ve ribozom preparatları için iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir ve iş için önerilen bir zaman çizelgesi Tablo 1'de gösterilmiştir. Tipik olarak, reaksiyonlar GFP veya mCherry gibi floresan proteinlerin üretimi yoluyla izlenir ve RFU okumaları, kalibrasyon11 ile konsantrasyonlara dönüştürülebilir. Bununla birlikte, CFPS verimleri, üretilen spesifik proteine bağlıdır ve bu nedenle, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Aynı laboratuvarda birden fazla parti ve kullanıcı üzerinde tekrarlanabilir PURE sistemleri elde etmemizi sağlayan ayrıntılı bir prosedür sunduk. Bunu başarmak için gereken bir dizi kritik adım vardır.

İlk önemli adım, 36 PURE suşunun bütünlüğünü sağlamaktır: tüm plazmitleri sıralamaya ek olarak, tek bir suşun kaybı CFPS aktivitesini ortadan kaldırabileceğinden, tüm suşların doğru şekilde aşırı eksprese olduğunu doğrulamak için bir ekspresyon denemesi yapmak ö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

SL, faj mühendisliği için hücresiz teknoloji geliştiren Biophoundry Inc.'in kurucu ortağı ve CTO'sudur.

Teşekkürler

NL, SL, AB ve NZ, NL'nin UKRI Geleceğin Liderleri Bursu (MR/V027107/1) tarafından desteklenmektedir. SL ayrıca Biophoundry Inc. tarafından desteklenmektedir. SY, Edinburgh Üniversitesi'nden Darwin Trust Doktora öğrencisi tarafından desteklenmektedir. CW, bir BBSRC Eastbio Doktora öğrenciliği tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, Gizli Hücre Biyolojisi için Wellcome Discovery Araştırma Platformu'ndan [226791] sağlanan fonla desteklenen ultrasantrifüjün kullanımındaki yardımı için A. Pompa'ya teşekkür eder. Ek olarak, orijinal OnePot protokolünün oluşturulmasındaki yardımları için B. Lavickova ve S. J. Maerkl'e teşekkür ederiz. Açık erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Tarafından Kabul Edilen Makale sürümüne bir Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır. Şekil 1 kısmen BioRender'da oluşturulmuştur. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2x YTSigmaY2377-250G
Amino AsitlerSigmaLAA21-1KT
Amonyum asetat RNAssızTermo BilimselAM9070G
Amonyum klorürSigma09718-1KG
AmpisilinSigmaA8351-5G
BL21(DE3) yetkin E. coliNEBC2527H
şişe, santrifüj (Nalgene)Termo Bilimsel3120-9500Polipropilen ko-polimer şişe
şişe, cam (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Bradford testi, Hızlı Başlatma 1x Boya ReaktifiBio-Rad5000205
merkezkaçTermo BilimselHeraeus Megafuge 16R
Santrifüj, mikroEppendorf5424R 
Kromatografi SütunuBio-Rad7321010
kreatin fosfatSigma27920
Yarı mikro 1.6 mL küvetlerFisherbrandFB55147
di-sodyum hidrojen ortofosfat dihidratFisher ChemicalS/4450/60
Diyaliz kaseti, Slide-A-Lyzer G3, 2 kDa MWCO, 15 mLTermo BilimselA52962
dipotasyum hidrojen ortofosfat susuzFisher ChemicalP/5240/60
DTT AğırlıksızTermo BilimselA39255
filtre ünitesi, santrifüj 3kDa MWCO Amicon Ultra 15EMD MilliporeUFC900324
Termo, 500 mLVWR214-1133
şişe, şaşırtılmış 2.5 L TunairSS-5013
folinik asitSigmaF7878-100MG
GliserolSigmaG5516-1L
HclFisherbrandH/1200/PB17
HEPES tamponu, 1 M çözelti pH 7.3Termo BilimselBP299
imidazoleSigmaI2399-500G
kuvözEppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGTermo BilimselR0392
KOH pelletleriTermo BilimselP1767-500G
L-Glutamik asit hemimagnezyum tuzu tetrahidratSigma49605-250G
L-Glutamik asit monopotasyum tuzu monohidratSigma49601-500G
magnezyum asetat tetrahidratSigmaM5661-50G
Magnezyum klorürFluka63020-1L
manyetik karıştırma sistemiStuartUS152
NanodropTermo BilimselNanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA Mag BoncuklarıNEBS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
pipet, çok kanallı Eppendorf Research Plus 30-300 & mikro; LEppendorf3125000052
Plaka okuyucu için plaka yapıştırıcı mühürüExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Steril)
plaka nefes alabilir mühürlemeStarlabE2796-3005
plaka folyo mühürüExcelScientificFCS-25
plaka okuyucuBioTekSynergy H1
Plaka sallayıcıAllshengMBI100-4A
plaka, 384 kuyuTermo Bilimsel242764
plaka, 96 derinlikte 1 mLTermo Bilimsel736-0601
plaka, 96 derinlikte 2 mLSarstedt82.1972.002
plaka, 96 iyi PCRSarstedt721,978
plaka, optik 96 kuyuTermo Bilimsel10057581
Potasyum klorürSigmaP5405-500G
potasyum dihidrojen ortofosfatFisher ChemicalP/4800/53
protein ekstraksiyonu (BugBuster) reaktifiEMD Millipore70584-3
Protein saflaştırma reçinesi (cOmplete)Roche5893682001
rotisserie shakerStarlabRM-Multi 1
Sodyum klorürFisher ChemicalS/3105/70
sonikasyon probu, FisherBrand 15-50 mLTermo Bilimsel12931181
SonicatorFisher ScientificFB120
SpektrofotometreJenwayGenova Plus
spermidinSigmaS2626-1G
TCEP 0.5 MSupelco646547
Thermo Fisher NTP, Tris tamponluTermo BilimselR1481
E. coli MRE600'den tRNARoche10109541001
TriptonFormediumTRP02
tüp, 0.2 mL PCR derecesiSarstedt72,737,002
tüp, bijoux Sterilin 7 mL polistirenTermo Bilimsel129A
tüp, konik (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
tüp, konik (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
tüp, mikrosantrifüj (Eppendorf) 1.5 mLSarstedt72.690.001
tüp, mikrosantrifüj (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
tüp, S100 santrifüjü Beckman-Coulter355619
tüp, S30 santrifüj/nbsp;Termo Bilimsel3118-0050
UltrasantrifüjBeckman-CoulterOptima XPN-100
Ultrasantrifüj rotorBeckman-Coulter70Ti sabit açılı rotor
UltraPure DNase/RNase-Free Distile SuTermo Bilimsel10977049
vortexerVWR444-2791
maya ekstraktıOksoidLP0021T

Kaynaklar

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

PURE SistemiRibozom HazırlamaSentetik BiyolojiUltrasantrifüjasyonGFP FloresanlığıOptik Yoğunluk NormalizasyonuGliserol KonsantrasyonuProtein Ekspresyonu
Tekrarlanabilir Hücresiz Protein Sentezi için OnePot PURE ve Ham Ribozom Üretiminin İyileştirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.