Doğal öldürücü hücre aktivasyonunun hızlı, etiketsiz analizi için sahada konuşlandırılabilir lenssiz görüntüleme platformu

Özet

Bu protokol, lenssiz gölge görüntüleme teknolojisini kullanarak doğal öldürücü (NK) hücre sayısı ve aktivitesinin hızlı tek hücreli analizi için etiketsiz bir yöntemi tanımlar. Bu yöntem, kırınım modellerinin bilgisayarlı analizi ile tek tek NK hücrelerindeki morfolojik değişiklikleri ölçer.

Özet

Doğal öldürücü (NK) hücreler, virüsle enfekte olmuş ve kötü huylu hücreleri ortadan kaldıran doğuştan gelen bağışıklığın önemli efektörleridir. NK hücre aktivitesinin izlenmesi, bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için gereklidir. Bununla birlikte, akış sitometrisi gibi geleneksel yöntemler emek yoğun ve zaman alıcıdır. Bu protokol, lenssiz gölge görüntüleme teknolojisi (LSIT) kullanılarak doğal öldürücü (NK) hücre aktivitesinin hızlı analizi için etiketsiz bir tekniği tanımlar. Periferik kandan izole edilen ve tescilli bir aktivatör ile uyarılan NK hücreleri, LSIT platformu kullanılarak 5 dakika içinde analiz edildi. LSIT platformu, ışığın NK hücrelerine müdahalesiyle oluşan, gölge görüntüleri olarak bilinen holografik görüntüleri yakalar ve gölge parametrelerindeki değişiklikleri analiz ederek aktivasyon durumlarını izler. Tepeden tepeye mesafe (PPD) ve ikincil maksimum genişliğin standart sapması (WSM-SD) dahil olmak üzere gölge görüntülerden türetilen temel parametreler, hücre morfolojisini ve iç karmaşıklığı nicel olarak yansıtıyordu. Bu parametreler, hücrelerdeki morfolojik değişikliklere dayalı olarak NK hücre aktivitesinin kapsamlı bir değerlendirmesini ve niceliğini sağlamak için birleşik gölge parametresine (CSP) ve doğuştan gelen bağışıklık indeksine (^I3) entegre edildi. Aktivasyondan sonra CSP'deki yüzde değişim olarak hesaplanan I³, NK hücre aktivitesinin doğrudan bir ölçüsü olarak görev yaptı. Sağlıklı bireylerden alınan NK hücreleri, bağışıklığı baskılanmış bireylerden sürekli olarak önemli ölçüde daha^{yüksek I3} değerleri göstermiştir. LSIT platformu, hasta başı teşhisi için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bağışıklık profili oluşturma sağlar.

Giriş

Hücre morfolojisi, moleküler mekanizmaların önemli bir göstergesi olarak ortaya çıkmaktadır. Sadece hücre yapısının görsel bir temsilini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda tek tek hücrelerin altında yatan süreçler ve işlevler hakkında değerli bilgiler sunar¹. Bağışıklık hücrelerinin şeklini, boyutunu ve aktivitesini tek hücre düzeyinde analiz etmek, davranışları, heterojenlikleri ve sağlık ve hastalıktaki rolleri hakkında önemli bilgiler sağlar 2,3,4,5,6.

Protokol

Tüm araştırmalar kurumsal yönergeleri takip etti ve Kore Üniversitesi Anam Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı (onay numarası: 2021AN0040). Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Numune toplama ve işleme

NOT: Tüm insan kan örneklerini standart biyogüvenlik önlemleri ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak kullanın.

1. Hastadan periferik tam kanı aseptik olarak steril bir heparin tüpünde toplayın.
2. Antikoagülanı kanla karıştırmak için tüpü 8-10 kez hafifçe ters çevirin.

Sonuçlar

Bu protokolü takiben, LSIT platformu, hücrelerdeki morfolojik değişikliklere dayalı olarak NK hücre aktivasyonunun kantitatif, etiketsiz bir değerlendirmesini sağlar. Şekil 2A , ASC ile veya ASC olmadan 2 saatlik inkübasyondan sonra sağlıklı donörlerden alınan birincil NK hücrelerinin Hema-3 ile boyanmış sitospin preparatlarını göstermektedir. ASC ile aktivasyon, araç (uyarılmamış) kontrollere kıyasla, öncelikle hücre büyümesi ve artan iç karmaşıklık veya taneciklik gibi belirgin değişiklikl.......

Tartışma

Bu protokol, NK Hazırlık Kiti kullanılarak hücre izolasyonu ve aktivasyonunu LSIT platformu üzerinden yapılan analizle birleştiren NK hücre aktivasyonunu ölçmek için standartlaştırılmış, etiketsiz bir yöntem sunar. ⁵¹Cr salınımı, akış sitometrisi ve ELISA gibi geleneksel tahlillere hızlı ve kantitatif bir alternatif sunar. Protokol, LSIT platformu ile donatılmış laboratuvarlar için geliştirilmiştir ve NK hücrelerinin sayısının ve I^3'ün gölge görüntü analizi.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.7 mL Mikrosantrifüj Tüpleri	AXYGEN	MCT-175-C	Steril, DNase/RNase içermez
Test Slaytı	Metaimmunetech	AS050-G	Cellytics sistemi için özel slayt Bir kutuda 50 slayt
Yazılımlı Cellytics sistemi	Metaimmunetech	CS001 Serisi	Lenssiz gölge görüntüleme platformu
Santrifüj (döner kepçe rotoru)	LABOGEN	1580R Serisi	300– 500 &kez; G aralığı
CMOS Görüntü Sensörü	Cellytics Cihazına dahildir	Tümleşik	Kırınım görüntüleme için kullanılır
Cytospin Santrifüj	Nasco Kore	TXT3 Sito Santrifüj	Sitospin boyama için
Dijital Isıtma Bloğu (37 ° C)	Daihan Bilimsel	DH. WHB00349	Hücre inkübasyonu için
ELISA Kiti (IFN-γ)	R& D sistemi	DIF50C	İnsan IFN-γ ELISA kiti
Guava easyCyte Akış Sitometresi	Kırlangıç	0500-5005	CD107a ifade analizi için
Hema 3 İstatistik Paketi	Termo Fisher	122-911	Sitospin boyama için
IL-12 (Rekombinant İnsan)	R& D sistemi		ASC'nin Bileşeni
IL-2 (Rekombinant İnsan)	Peprotech	200-02	ASC'nin Bileşeni
Manyetik Ayırma Rafı	Metaimmunetech	M13R8 Serisi	Boncuk ayırma için
Mikroskop Slaytları	Marienfeld'in	1000612	Sitospin preparatları için
NK aktivasyon kiti	Metaimmunetech	MIT2301V, MIT2301A	NK hücre aktivasyonu için
NK Eylül Kiti	Metaimmunetech	MIT2301-500	NK hücre izolasyonu için
PE Fare Anti-İnsan CD107a, 100test	BD biyolojik bilimleri	555801	CD107a ifade analizi için
İğne Deliği Açıklığı	Cellytics Cihazına dahildir	Tümleşik	LSIT aydınlatma yolunda kullanılır
Pipetler (2– 20 &mikro; L, 20– 200 &mikro; L)	AXYGEN	T-200-Y	Ayarlanabilir ses seviyesi
Gölge Kalibrasyon Slaydı	Metaimmunetech	AS050-G	Cihaz kalibrasyonu için. 1 Test slayt kutusunda 1 Kalibrasyon slaydı
Vorteks Karıştırıcı	Merck	SI-0246A	Yeniden süspansiyon için