Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Geniş Bant Tutarlı Anti-Stokes Raman ve İki Fotonlu Floresan Ömür Boyu Mikroskopi ile Ultra Yüksek Bilgi İçerikli Kimyasal Görüntüleme

1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68845

⸱

7 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, geniş bant tutarlı anti-Stokes Raman saçılımını (BCARS), iki fotonlu uyarma floresansını (TPEF) ve iki fotonlu floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobunu (2p-FLIM) birleştirerek ultra yüksek bilgi içerikli kimyasal biyogörüntülemeyi mümkün kılan çok modlu bir görüntüleme platformunu göstermektedir.

Özet

Raman parmak izi spektroskopisi ve floresan ömür boyu görüntüleme, biyolojik örneklerin metabolik profillerini incelemek için yeni ortaya çıkan araçlardır. Raman parmak izi spektroskopisi, bir numunenin moleküler bileşimini ve kimyasal ortamını yansıtan içsel moleküler titreşimleri tespit ederken, floresan ömür boyu görüntüleme, mikro ortamlarına duyarlı floroforların uyarılmış durum ömründeki değişiklikleri ölçer. Burada, biyolojik olarak ilgili Raman parmak izi spektrumlarını ve floresan ömrü sinyallerini in vivo ve aynı anda elde edebilen geniş bant tutarlı anti-Stokes Raman saçılımı (BCARS) ve iki fotonlu floresan ömür boyu görüntüleme (2p-FLIM) mikroskobunu birleştiren çok modlu bir görüntüleme platformu sunuyoruz. Uzamsal olarak birlikte kaydedilmiş BCARS ve 2p-FLIM görüntülerinden elde edilen muazzam kimyasal bilgiler, hücre altı bölmeler arasındaki ince farkları karakterize etmemize ve yalnızca floresan görüntüleme tarafından üretilen potansiyel yanlış pozitif sonuçları doğrulamamıza olanak tanır. Bu, yeşil bir floresan protein (GFP) belirteci eksprese eden canlı, bozulmamış C. elegans'taki aynı boya lekeli organelden aynı anda elde edilen BCARS, 2p-FLIM ve iki foton uyarma floresan (TPEF) sinyallerinin doğrudan karşılaştırılmasıyla gösterilmiştir. Bu çalışmada, BCARS/2p-FLIM/TPEF kurulum şemasını, görüntü elde etme adımlarını, veri işlemeyi ve çapraz modalite görüntüleme yönteminin hücre altı çözünürlükte titiz karakterizasyon ve in vivo algılama sağladığını gösteren temsili sonuçları tanıtıyoruz. Bu protokol, karmaşık canlı sistemlerde biyolojik yorumlamanın doğruluğunu artırmak için eşzamanlı kimyasal ve floresan ömür boyu görüntüleme için bir çerçeve sağlar.

Giriş

Biyolojik çalışmalardaki zorluklardan biri, biyolojik yapı malzemelerini doğal hallerinde ve hücre ve dokuların bozulmamış mimarisi içinde doğru bir şekilde tespit etmektir. Raman spektroskopisi, biyolojik numuneler içindeki içsel metabolitleri ve kimyasal türleri tespit etmek için benzeri görülmemiş bir potansiyel göstermektedir ve son zamanlarda biyolojik numunelerin metabolik profilinin çıkarılması için yeni ortaya çıkan bir araç olarak kabul edilmiştir1. Raman parmak izi spektrumlarında gösterilen çeşitli metabolik grupların zirvelerini analiz ederek, artan kanıtlar, parmak izi özelliklerinin kanser 2,3,4, kalp bozuklukları 5,6 ve nörodejeneratif hastalıklar 7,8 gibi hastalıkların erken evrelerini tespit etmek için kullanılabileceğini ve özellikle temel biyolojik sorunları ele almak için yararlı olduğunu göstermektedir 9,10 herhangi bir etiketleme pertürbasyonu11 olmadan hücre içi yapıların görüntülenmesi, çeşitli hücre durumlarının ayırt edilmesi 12,13 ve hücre tipi sınıflandırması14,15,16 dahil. Raman spektrumlarında kodlanan kimyasal bilgilerin çoğu (> %90) parmak izi bölgesindedir (500 ila 1800 cm-1), bu da bu bölgeyi biyolojik numunelerdeki kimyasal bileşimleri ayırt etmek için açık ara en yararlı bölge haline getirir17. Bununla birlikte, bu frekans aralığındaki zayıf Raman sinyali, Raman parmak izi spektroskopisinin biyolojik çalışmalara uygulanmasını, özellikle canlı, bozulmamış biyolojik örnekler için zorlaştırmaktadır1.

Tutarlı Raman görüntüleme (CRI) yaklaşımları, Raman sinyallerinin alınma süresini önemli ölçüde kısaltır, ancak bunların çoğu nispeten dar spektral segmentler elde eder ve 2800 - 3100 cm-1 arasındaki güçlü CH gerilme sinyalleri için optimize edilmiştir. Dar bant CARS ve uyarılmış Raman saçılması (SRS) (Şekil 1A,B), genellikle güçlü CH sinyali 18,19,20,21,22,23'ün dar bir bölümünü elde etmek için iki pikosaniye darbesi kullanır. Multipleks CARS (Şekil 1C) gibi multipleks CRI yaklaşımları, genellikle CH bölgesi 24,25,26,27,28,29,30'da orta derecede bir spektral aralık (genellikle ≤ 400 cm-1) elde etmek için bir pikosaniye ve ~ 100 fs darbelerinin bir kombinasyonunu kullanır. Bu görüntüleme yaklaşımlarını kullanarak piksel başına biyolojik olarak ilgili tüm Raman spektrumunu (600 - 3200 cm-1 arası) elde etmek genellikle engelleyicidir çünkü çoğu parmak izi sinyali CH-gerilme sinyallerinden 10-100 kat daha zayıftır31. Çoğu CRI yaklaşımından farklı olarak, geniş bant tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (BCARS), parmak izi ve CH-streç bölgelerini 31,32,33 kapsayan tek atışlı geniş bant edinimi için optimize edilmiştir. BCARS, düşük frekanslı (parmak izi) titreşimleri verimli bir şekilde uyarmak için ~ 10 fs darbesinin darbe içi etkileşimlerini kullanır (Şekil 1D) ve CH gerilme bölgesinde titreşimsel tutarlılık oluşturmak için fs darbesinin bir ps darbesi ile kombinasyonu olan multipleks CARS ile aynı mekanizmayı kullanır (Şekil 1C)32,33. Ayrıca, BCARS sinyalleri, rezonans olmayan arka plan (NRB) ile etkileşimleri nedeniyle özünde kalibre edilir, bu da hücrelerden, bozulmamış dokulardan ve canlı biyolojik organizmalardan hızlı bir şekilde yüksek bilgi içerikli veriler elde etme kabiliyeti ile her piksel31'de lazer darbesi başına nicel ve aletle değişmeyen tam Raman spektrumu ile sonuçlanır 32,34,35,36,37,38,39.

Elde edilen ham BCARS spektrumları, güçlü bir sözde "rezonans olmayan arka plan" (NRB) içerir. NRB, kimyasal olarak spesifik olmayan lazer darbelerine elektronik yanıtın katkısıdır. NRB, bir heterodin amplifikatör32 olarak hareket ederek titreşimsel olarak rezonans sinyaline tutarli bir sekilde müdahale eder. NRB ayrıca altta yatan Raman spektrumunu da bozar (Şekil 2A), ancak önemli bitişik spektral kesitler elde edildiği sürece Raman spektrumu alınabilir. Şu anda, dar bantlı bir CARS yaklaşımı kullanarak rezonans CARS sinyalini rezonans olmayan bileşenden ayırmak için herhangi bir son işleme yöntemi mevcut değildir. Geniş bant CARS sinyalinden Raman sinyali alımı, zaman alanı Kramers-Kronig ilişkisi (veya Hilbert dönüşümü) 33,40 (Şekil 2B), maksimum entropi 41,42 veya makine öğrenimi43,44,45,46,47,48 kullanılarak elde edilebilir Yaklaşım. İlk iki yöntemin ham BCARS spektrumlarından fazı (rezonans Raman sinyali) analitik olarak aldığını, makine öğrenimi yaklaşımlarının enstrümantasyona ve eğitim modellerine büyük ölçüde bağımlı olabileceğini unutmayın.

BCARS mikroskobu, biyolojik örneklerin metabolik profilinin etiketsiz karakterizasyonuna izin verirken, BCARS sinyal üretimi için kullanılan aynı süper süreklilik lazeri (bu çalışmada sunulan BCARS kurulumu için 950 - 1200 nm), Rodamin bazlı, Bodipy bazlı, Alexa Flor bazlı ve siyanin bazlı boyalar ve GFP ve mCherry49 dahil olmak üzere çeşitli floresan proteinler gibi çok çeşitli boyaları da uyarabilir. 50. Görünür sürekli dalga (CW) lazerler kullanılarak yapılan tek fotonlu uyarımla karşılaştırıldığında, iki fotonlu floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (2p-FLIM) ve iki fotonlu uyarma floresan mikroskobu (TPEF) gibi çok fotonlu floresan mikroskobu, yakın kızılötesi (NIR) ışık kullanarak daha derin bir numune penetrasyon derinliği, içsel 3D kesit alma yeteneği, yüksek kontrastlı görüntüler ve son teknoloji konfokal mikroskopi ile karşılaştırılabilir iyi çözünürlük sunarak biyolojik uygulamalar için çekici bir araç haline gelir. Araştırma 51,52. Zamanla ilişkili tek foton sayma (TCSPC) yaklaşımını kullanan floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), zaman modülasyonlu bir lazer kaynağı53,54 tarafından tekrar tekrar uyarılan floresan bozunma sinyallerini tespit eder. Belirli bir floroforun floresan spektrumu, çözücü polaritesi gibi çevresel faktörlerle değişebilir, ancak bu değişiklikler genellikle belirsizdir. Öte yandan, floresan ömürleri genellikle pH değerleri55, viskozite56, polarite57 ve iyonik türlerin konsantrasyonu 58,59, bağlanma etkileşimleri, söndürücülerin varlığı veya yapısal değişiklikler53,54 gibi çevresel değişikliklerle birlikte iki veya daha fazla faktöre göre değişir. Floresan ömrünün bu benzersiz özelliği, floresan görüntülemede ek bir sinyal kontrastı sağlar ve hücre ve doku görüntülemede60 otofloresan interferansı sorunlarını başarıyla ele almıştır, spektral olarak çözülmüş bir FLIM yaklaşımı61, kanser teşhisi ve tedavisi izleme62, hücresel heterojenliğin etiketsiz tespiti63 ve metabolik değişiklikler64,65.

Bu çalışmada, BCARS, 2p-FLIM ve TPEF'i birleştiren çok modlu bir görüntüleme platformunu tanıtıyoruz. Bildiğimiz kadarıyla, ilk kez eş zamanlı BCARS ve 2p-FLIM/TPEF görüntülemeye izin veren bir görüntüleme platformu sunuyoruz. Yaygın olarak kullanılan genetik olarak izlenebilir bir model organizma olan Caenorhabditis elegans (C. elegans) kullanarak bu cihazın in vivo görüntüleme yeteneklerini gösteriyoruz. BCARS spektrumlarının, Nil Kırmızısının (hayati bir lipid boyası) 2p-FLIM bozunmalarının ve rapor edilen bir lipid belirtecinin (DHS-3::GFP) iki fotonlu floresan GFP sinyallerinin aynı anda elde edilebileceğini gösterdik. Burada sunulan görüntüleme yaklaşımı için pratik bir kılavuz şunları içerir: (i) numune optik olarak şeffaf olmalı ve kalınlığı tipik olarak 100 μm'den az olmalıdır; (ii) boyama durumu, boyalara ve numunelere bağlı olarak farklı olabilir. Nil-Kırmızı boyamada C. elegans burada gösterilen sonuçlar, Nil Kırmızısı konsantrasyonu ~μM seviyesindedir ve boyama süresi birkaç saatten gece boyuncadeğişebilir 66; (iii) 2p-FLIM/TPEF dedektörlerine görünür ışık sızıntısını önlemek için karanlık bir numune ortamı gereklidir. Bu görüntüleme koşulları, çoğu doğrusal olmayan optik ve floresan mikroskobunun görüntüleme koşullarıyla aynıdır. Ek olarak, burada gösterilen sistemimiz, iki fotonlu floresan uyarımı için 700-950 nm aralığını kapsayan ek bir Ti:Sapphire fs lazer sunarak Nil Kırmızısı ve GFP'ye ek olarak diğer boyaları ve floresan raportörleri tespit etmek için daha fazla uygulanabilir. Bu nedenle, bu protokolde açıklanan temsili sonuçlar, GFP'yi eksprese eden boya lekeli C. elegans'ın in vivo görüntülemesi iken, ultra yüksek bilgi içerikli kimyasal biyogörüntüleme platformunun geniş ve geniş kapsamlı uygulamaları vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. C . elegans numune hazırlama ve Nil Red Vital boyama

NOT: C. elegans, tüm vücut şeffaflığı nedeniyle çoklu görüntüleme teknikleri için yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Sağlam hayvanda iç organlar ve dokular diseksiyon yapılmadan kolayca görüntülenebilir. Ayrıca, omurgalı olarak kabul edilmedikleri ve kemirgenler gibi daha yüksek hayvanlarla aynı etik düzenlemelere tabi olmadıkları için C. elegans'ı içeren araştırmalar için etik onayı gerekli değildir. Bu bölüm, C. elegans solucanlarının senkronizasyonunu ve floresan görüntüleme için Nil Kırmızısı lekeli numunelerin hazırlanmasını açıklar. Senkronize bir günlük yetişkin solucanlar, iki nesil yumurtlama protokolü ile elde edilir ve taze hazırlanmış Nil Red-OP50 plakaları kullanılarak boyanır.

  1. C. elegans suşlarını (örneğin, N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) 20 °C'de OP50 bakterileri ile tohumlanmış standart Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları üzerinde tutun.
  2. Solucanları senkronize edin
    1. Taze yapılmış OP50 tohumlu NGM plakasına 10-20 gravid yetişkin solucan seçin.
    2. Yumurtlamaya izin vermek için plakayı 20 °C'de 1-3 saat inkübe edin.
    3. Tüm yetişkin solucanları çıkarın, tabakta sadece taze bırakılmış yumurtaları bırakın.
    4. Solucanlar bir günlük yetişkin aşamasına ulaşana kadar plakayı 20 °C'de inkübe edin.
    5. Senkronizasyon hassasiyetini artırmak için ek bir nesil için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
  3. Nil Kırmızısı stok çözeltisini hazırlayın
    1. 15.92 mg Nil Kırmızısını 10 mL DMSO içinde 5 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözün.
    2. Çözünmeye yardımcı olmak için gerekirse 10-30 dakika sonikasyon yapın.
  4. Nil Kırmızısı-OP50 boyama plakalarını hazırlayın.
    1. NGM plakası başına 5 μM'lik nihai Nil Kırmızısı konsantrasyonu elde etmek için OP50 bakteri bulamacını Nil Kırmızısı stoğu ile iyice karıştırın. Örneğin, 10 μL Nil Kırmızısı stoğunu 20 μL OP50 bakteri bulamacı ile karıştırın ve ardından NGM plakası başına 5 μM'lik nihai bir Nil Kırmızısı konsantrasyonu elde etmek için tüm karışımı hemen tohumlanmamış 6 cm'lik (~10 mL hacimli) bir NGM agar plakasına uygulayın.
    2. Karışımı çekirdeksiz 6 cm'lik NGM plakalara eşit şekilde yayın.
    3. Bakteri üremesine ve boya emilimine izin vermek için plakaları gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
  5. Senkronize solucanları lekeleyin
    1. Hazırlanan her Nil Kırmızısı-OP50 plakasına 30-50 senkronize bir günlük yetişkin solucan aktarın.
    2. Görüntülemeden önce solucanları karanlıkta 20 °C'de 1-2 saat inkübe edin.
  6. Görüntüleme için solucanları hareketsiz hale getirin
    1. Bir mikroskop lamı üzerinde% 2'lik bir agaroz pedi üzerine bir damla 100 mM sodyum azid uygulayın (20 solucan için yaklaşık 10-15 μL)
    2. Lekeli solucanları anestezik maddeye (sodyum azid) aktarın, mikroskopiden önce solucanları bir lamel ile damlatın ve örtün.
      NOT: Yumurtlama senkronizasyonunun ilk adımında taze yapılmış bir NGM OP50 plakasına 10-20 yerçekimi yetişkini toplarken, yalnızca yetişkinleri seçin, başıboş yumurta veya larvaları değil. Bu, plakalarda kalan tüm yumurtaların, 1-3 saatlik yumurtlama süresi içinde toplanan solucanlar tarafından üretildiğinden emin olmak içindir. Ayrıca sodyum azid, nematod anestezisi için çok az miktarda gerektirmesine rağmen tehlikeli madde olarak sınıflandırılır. Sodyum azid atıklarının kullanımı ve bertarafı, kurumsal Çevre Sağlığı ve Güvenliği departmanının yönergelerine uygun olmalıdır.

2. Prob ışını üretimi

NOT: Bu protokol, ev yapımı bir optik parametrik osilatör (OPO) kullanılarak pikosaniye (ps) prob ışınının üretilmesini ve ardından prob ışınının çıkış gücünü stabilize etmek için ev yapımı bir sinyal geri besleme döngü sistemi ile ikinci harmonik üretimi (SHG) açıklar.

  1. 1030 nm OPO pompa lazerini açın (Şekil 3A veya Şekil 1'te gösterilen yakın 3ps, ~ 4 W OPO pompa lazeri) ve termal dengeleme için en az 2 saat bekleyin. OPO çalışması için kararlı çıkış kritik öneme sahiptir.
  2. Çıkışı OPO boşluğuna yönlendirin
    1. Hedef sinyal dalga boyuna uyması için OPO PPLN (Şekil 3A) kristalinde uygun kutuplama periyodunu seçin.
    2. Işını, doğrusal bir boşluğun parçasını oluşturan ilk kavisli aynaya (CM) (Şekil 3A) yönlendirin.
    3. Optik parametrik aşağı dönüşümü kolaylaştırmak için ışının OPO periyodik olarak kutuplu Lityum Niobat (PPLN) kristalinden (Şekil 3A) geçtiğinden emin olun (Şekil 3B).
    4. Işının ikinci bir kavisli aynadan (CM) ve ardından boşluk döngüsünü oluşturmak için uç aynadan (EM) (Şekil 3A) yansıdığından emin olun.
    5. Üretilen sinyal ışınını boşluktan çıkarmak için çıkış kuplörünü (OC) (Şekil 3A) yapılandırın.
  3. Sinyal dalga boyunu seçmek için sıcaklık kontrol cihazını (TC) (Şekil 3A) kullanarak OPO PPLN kristalinin sıcaklığını ayarlayın. Tipik bir sinyal dalga boyu 1530 nm'dir ve 0.8 nm'de 3 W ile pompalandığında yaklaşık 1064 W'lık bir çıkış gücüne karşılık gelir.
  4. OPO hizalamasını optimize edin
    1. Çıkış gücünü ve ışın kalitesini en üst düzeye çıkarmak için iki CM ve EM'nin konumunu ve eğimini ayarlayın.
    2. Sinyal spektrumunu istenen frekansa kaydırmak için boşluk uzunluğunu ayarlayın.
  5. OPO sinyal ışınını bir dizi yönlendirme ve odaklama optiği aracılığıyla yönlendirin ve onu SHG aşamasına yönlendirin.
    1. Hedef sinyal dalga boyuna uyması için SHG PPLN kristalinde (Şekil 3A) uygun kutuplama periyodunu seçin.
    2. SHG verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için bir sıcaklık kontrol cihazı kullanarak kristal sıcaklığını hassas bir şekilde kontrol edin.
    3. 1530 nm OPO sinyalini 765 nm'ye dönüştürerek ikinci harmonik üretimi için ışını SHG PPLN kristaline yönlendirin (Şekil 3C). Tipik SHG dönüşüm verimliliği, optimum hizalama koşulları altında yaklaşık %30'dur.
    4. Kalan 1300 nm temel ışığı çıkarmak için SHG PPLN'den sonra 3 nm'lik bir kısa geçiş filtresi ( Şekil 1530A'daki SPF, Malzeme Tablosundaki özellikler) yerleştirin.
    5. Elde edilen 765 nm ışını uygun bir mercek kullanarak ( Şekil 3A'da L gibi) paralelleştirin.
  6. Güç stabilizasyonu uygulayın
    1. SHG ışınını örneklemek ve onu bir fotodiyota (PD) yönlendirmek için bir kama penceresi (WW) kullanın.
    2. Bir geri besleme döngüsünün fotodiyot sinyalini ( Şekil 3A'daki PD) bir referans değerle karşılaştırdığından ve OPO boşluk uzunluğunu gerçek zamanlı olarak ayarlamak için uç aynadaki (EM) Pikomotoru çalıştırdığından ve böylece SHG çıkış gücünü stabilize ettiğinden emin olun.
      NOT: Referans değerini belirlemek için, önce SHG çıkış gücünü kaydederken Pikomotor kullanarak EM konumunu tarayın. Bu profildeki tepe yoğunluğunu belirleyin, ardından referans değerini tepe noktasının %90'ına ayarlayın. Bu seçim, sistemin güçteki hem artan hem de azalan eğilimleri telafi etmesini sağlayarak net bir geri besleme düzeltme yönü sağlar ve zaman içinde çıkış gücünü etkili bir şekilde dengeler.

3. BCARS için süper süreklilik (SC) üretimi

NOT: BCARS tabanlı multimodal sistemin basitleştirilmiş şeması Şekil 4'te gösterilmektedir. Bu protokol, SC ışınının oluşumunu açıklar.

  1. Parmak izi bölgesi sinyallerini kapsayan yeterince geniş bir SC bant genişliği elde etmek için ön cıvıltıyı (Grup Gecikme Dağılımı, GDD) femtosaniye (fs) darbe çıkışına (1030 nm, 150 fs, ~1 W) ayarlayın (SC bant genişliği ≥ 1800 cm-1). Bunu, bir ızgara çiftinin ayrımını ayarlayarak (bkz. Şekil 4) ve dağılım üzerinde hassas kontrol sağlayarak elde edin.
    NOT: Önceden kompanzasyonlu GDD'nin uygulanması, istenen darbeyi üretmek ve SC üretimini optimize etmek için çok önemlidir. Gerekli GDD değeri, kullanılan lazer sisteminin spesifik özelliklerine bağlı olarak değişebilir.
  2. Pompa ışınının sapmasını ayarlamak için aynı odak uzunluklarına sahip iki mercekten oluşan bir ışın teleskopu kullanın.
    NOT: Işın, genişleyen fibere girmeden önce metrelerce yol aldığında, ışın sapmasının hassas kontrolü gerekli hale gelir. Bu mesafe boyunca paralelleştirilmiş bir ışının korunması, verimli SC üretimini sağlamak için kritik öneme sahiptir.
  3. Işın yönlendirmesi için piezo aktüatörlerle donatılmış kinematik ayna bağlantılarını kullanarak otomatik hizalayıcıyı (Şekil 4) kurun. Işın hizalamasını aktif olarak izlemek ve düzeltmek için bunları optik takozlar ve Konum Algılama Dedektörü (PSD) ile birleştirin.
  4. Bileşenleri, kamadan ilk aynaya olan mesafe, kamadan ilk PSD'ye olan mesafeye eşit olacak şekilde konumlandırın. Bu simetrik konfigürasyon, genişleyen fibere ışın işaretleme stabilitesi sağlar.
    NOT: Aktif hizalama, spektral genişletme verimliliğini en üst düzeye çıkarmak ve fiber giriş hasarı riskini en aza indirmek için gereklidir.
  5. Fibere bağlanmadan önce lazer gücünü kontrol etmek için yarım dalga plakası (HWP) ve polarize ışın ayırıcı (PBS) kullanın. PBS'ye göre polarizasyon açısını ayarlamak için HWP'yi döndürün, böylece iletilen gücü ayarlayın. Bu bileşenler Şekil 4'te gösterilmese de güvenli hizalama ve güç kontrolü açısından kritik öneme sahiptir.
  6. Bir fiber kuplör kullanarak yaklaşık 1 W lazer gücünü 10 cm Geniş Mod Alan Polarizasyon Bakımı (LMA-PM-5) fotonik kristal fibere (PCF) bağlayın. Bağlantı prosedürü aşağıdaki gibidir:
    1. İlk olarak, fiberin zarar görmesini önlemek için ilk hizalama sırasında lazer gücünü ~20-50 mW'a düşürün.
    2. Paralelleştirilmiş ışını fiberin içine yönlendirin ve diğer taraftan bir miktar ışığın çıkmasını sağlayın. Çıkış gücünü en üst düzeye çıkarmak için konumunu ayarlayarak ışın yolunu optimize edin.
    3. Asferik merceği takın (Şekil 4), çıkış gücünü en üst düzeye çıkarmak için ışına tekrar ince ayar yapın.
    4. Fiber yüzeye hassas odaklanmayı sağlamak için küresel olmayan merceğin z konumunu ayarlayın.
    5. Kaplin verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için hizalama ve odak ayarlarını yinelemeli olarak tekrarlayın.
    6. Çalıştırmak için lazer gücünü 1 W'a yükseltin.
  7. Şekil 15'te gösterildiği gibi, odak uzaklığı f = 4 mm olan eksen dışı bir parabolik (OAP) ayna kullanarak PCF'den elde edilen geniş bant süper süreklilik (SC) çıkışını paralelleştirin.
    NOT: Kırılma elemanlarının neden olduğu renk sapmasını en aza indirmek için geniş bant ışınlar için OAP aynası gibi yansıtıcı optikler tercih edilir.
  8. Paralelleştirilmiş geniş bant süper süreklilik (SC) çıkışını, bir çift Schott Flint (SF4) prizmasından oluşan bir prizma kompresörüne (Şekil 10) yönlendirin.
    1. Spektral dağılımı başlatmak için SC ışınını birinci prizmanın tepesine yönlendirin.
    2. İkinci prizmayı, dağılmış ışın tepesinden girecek şekilde konumlandırın.
    3. Prizma ayrımının kaba ayarını sağlamak için her iki prizmayı da bir ray sistemine monte edin. Optik yol uzunluğunu ve genel sıkıştırmayı ayarlamak için ikinci prizmayı ray boyunca çevirin. Bu sistem için ayırma 44 cm'dir.
    4. İlk prizmayı hassas bir doğrusal öteleme aşamasına monte edin. Dağılım telafisine ince ayar yapmak için birinci prizmanın yerleştirme derinliğini ayarlayın.
    5. SC darbesinin optimum zamansal sıkıştırmasını elde etmek için hem prizma ayrımını hem de ikinci prizmanın yerleştirme uzunluğunu yinelemeli olarak ayarlayın. Deneysel olarak gözlemlenen dejenere dört dalga karıştırma (DFWM) sinyalini, grup gecikme dağılımını (GDD) ve üçüncü dereceden dağılımı (TOD) hesaba katan simüle edilmiş sonuçlarla eşleştirerek optimum zamansal sıkıştırmayı belirleyin. Bu yaklaşım, optimal olarak sıkıştırılmış SC darbelerinin beklenen zamansal ve spektral özellikleri için bir referans sağlayan GDD ve TOD'nin etkilerini içeren süper süreklilik oluşturma sürecinin bir simülasyonunun gerçekleştirilmesini içerir. Ardından, deneysel DFWM sinyali simülasyon tahminleriyle eşleşene kadar sistemde bulunan GDD ve TOD'yi telafi etmek için prizma kompresör parametrelerini yinelemeli olarak ayarlayın. SC'nin spektral profilinin tipik bir sonucu Şekil 5'te gösterilmektedir.
      NOT: Uygun dağılım telafisi, SC'nin spektral tutarlılığını arttırır. Optimum hizalama altında, SC çıkışı yaklaşık 150 mW'lık bir güce, 1060 nm civarında bir merkez dalga boyuna sahiptir ve 950 ila 1200 nm (1800 cm-1'e karşılık gelir) arasında bir spektral aralığı kapsar. Bu değerler hizalama ve fiber bağlantı verimliliğine bağlı olarak biraz değişebilir.
  9. Dikroik bir ayna kullanarak prob ve süper süreklilik ışınlarını birleştirin ( Şekil 4'teki DM'ye bakın). Her iki kirişin de doğrusal olduğundan emin olmak için bunları bir çift iğne deliğiyle hizalayın. Birleştirilmiş ışınları yüksek frekanslı bir fotodiyota (1 GHz bant genişliği) odaklayın. Optimum sinyal kalitesi için, her iki ışının da hem uzamsal hem de zamansal alanlarda üst üste binmesi gerekir. Süreç aşağıdaki gibidir:
    1. Fotodiyottan gelen çıkışı yüksek frekanslı bir osiloskopa (500 MHz bant genişliği) yönlendirin. Lazer tetiği referans saati olarak kullanın.
    2. Prob ışınını bloke edin ve SC darbelerini ölçün. SC darbeleri ile lazer referansı arasındaki zamansal farkları kaydedin.
    3. SC ışınını bloke edin ve prob darbelerini ölçün. Mekanik gecikme hattını ( Şekil 4'te gösterildiği gibi), prob darbeleri SC darbeleriyle zaman içinde çakışacak şekilde ayarlayın. İki ışının aynı anda maksimuma ulaştığından emin olun.
    4. Fotodiyotu çıkarın ve ışının mikroskoba girmesine izin verin.
      NOT: Yukarıdaki adımlar, kiriş örtüşmesi için kaba bir ayarı açıklar. Daha hassas hizalama için daha fazla optimizasyon 6.1 ila 6.9 adımlarında ele alınmıştır.

4. 2p-FLIM ve TPEF için floresan algılamanın ayarlanması ve ek bir Ti:Sapphire fs lazerin tanıtılması

  1. Ti:Sapphire lazeri açın ve termal dengeye ulaşmasını bekleyin. Kararlı çıkış gücü ve ışın işaretlemesi sağlamak için yaklaşık 2 saat bekleyin.
    NOT: Bu çalışmada, TPEF ve FLIM görüntüleme, GFP ve Nil Kırmızısı gibi floroforlar için geniş spektral kapsama alanı ve yeterli güç sağlayan SC kaynağı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ti:Sapphire lazer, SC tarafından verimli bir şekilde uyarılamayabilecek 950 nm'nin altında iki foton absorpsiyon tepe noktasına sahip floroforlar için isteğe bağlı bir uyarma kaynağı olarak sisteme dahil edilmiştir.
  2. Ti:Sapphire lazerdeki mod kilitleme mekanizmasını etkinleştirin. Dahili monitör aracılığıyla kararlı mod kilitlemeyi onaylayın.
  3. Bir prizma kompresörü kullanarak numunede optimum zamansal sıkıştırma için Ti:Sapphire darbelerini önceden cıvıldatın. Prizmaları adım 3.8'de açıklanana benzer bir konfigürasyonda düzenleyin ve darbe süresine ince ayar yapmak için ikinci prizmanın yerleştirme uzunluğunu ayarlayın.
    NOT: Uygun zamansal sıkıştırma, numune düzleminde tepe yoğunluğu ve verimli iki foton uyarımı sağlar.
  4. (İsteğe bağlı) Lazer ayrı bir optik tablaya yerleştirilmişse, Ti:Sapphire ışınını polarizasyonu koruyan tek modlu bir fibere bağlayın. Bağlantı kayıplarını en aza indirmek için giriş bağlantı optiklerini ayarlayın ve fiber çıkışını izleyin.
  5. Ti:Sapphire ışınını süper süreklilik (SC) ve prob ışınlarıyla dikroik bir ayna kullanarak birleştirin ( Şekil 3'te gösterilen PBS'deki birleştirme noktasına bakın). Dikroikte uzamsal örtüşmeyi ve mikroskoba doğru birlikte yayılmayı sağlamak için ışınları dikkatlice hizalayın.
  6. Birleştirilmiş ışınları mikroskoba yönlendirin ve uzamsal örtüşmelerine ince ayar yapın. Ti:Sapphire ışınının BCARS uyarma yoluna göre hizalanmasını doğrulamak için bir floresan numunesi (örneğin, 1 μm floresan polistiren boncuklu bir slayt) kullanın. Floresan emisyonunun aynı görüntüleme alanı içinde BCARS odak noktasıyla birlikte lokalize olmasını sağlamak için Ti:Sapphire hizalama aynalarını ayarlayın. Uzamsal ofsetin bir pikselden az olması gereken, aynı anda elde edilen BCARS ve TPEF görüntüleri arasındaki örtüşmeyi görselleştirerek ortak yerelleştirmeyi onaylayın.
    NOT: Floresan ve BCARS sinyalleri arasında uzamsal örtüşme elde etmek, çok modlu görüntü kaydı için çok önemlidir.
  7. Geri saçılan floresansı algılama yoluna yansıtmak için mikroskop girişinden önce bir dikroik ayna yerleştirin. Floresansı uyarma ışınlarından verimli bir şekilde ayırmak için uygun kesme dalga boyuna sahip bir dikroik seçin.
  8. Floresan sinyalini iki algılama dalına bölmek için emisyon yoluna aşağı yönde ikinci bir dikroik ayna yerleştirin:
    1. 550 nm≥ dalga boylarını FLIM dedektörüne iletin.
    2. Analog iki foton uyarımlı floresan (TPEF) tespiti için 550 nm'≤ dalga boylarını bir fotoçoğaltıcı tüpe (PMT) doğru yansıtın.
      NOT: Artık uyarma ışığını engellemek ve belirli emisyon bantlarını izole etmek için her algılama dalına bant geçiren filtreler takın.
  9. PMT çıkışını bir ön amplifikatöre bağlayın ve güçlendirilmiş analog sinyali bir veri toplama (DAQ) cihazına besleyin. Görüntüleme yöntemleri arasında zamansal hizalamayı sağlamak için sahada programlanabilir kapı dizisinden (FPGA) gelen küresel senkronizasyon tetikleyicisini DAQ ile paylaşın (Şekil 7).
  10. FLIM dedektör çıkışını zamanla ilişkili tek foton sayma (TCSPC) modülüne bağlayın.
    1. FLIM dedektör sinyalini TCSPC modülünün başlatma girişine bağlayın.
    2. Ti:Sapphire lazerin (veya BCARS SC'nin) senkronizasyon çıkışını TCSPC modülünün referans girişine bağlayın.
    3. Satır taramalı görüntü alımıyla senkronize etmek için global kamera tetikleyicisini (FPGA tarafından oluşturulan) TCSPC modülünün kare senkronizasyon girişine bağlayın.

5. BCARS algılama yolunu ayarlama

NOT: Bu protokol, çizgi taramalı hiperspektral görüntüleme için taranmış bir algılama yolunun ayarlanmasını açıklar. 1D galvo aynası, yeterli sinyal entegrasyonu için uyarma ışınını piksel başına 2-4 ms bekleme süresiyle y ekseni boyunca tarar. Her çizgi taramasından sonra, numune aşaması x ekseni boyunca bir adım ilerler. Senkronize bir ikincil galvo aynası kullanarak taramanın açılması, hızlı ışın taraması sırasında kameradaki spektral sinyalin tutarlı uzamsal kaydını sürdürmek, bitişik pikseller arasındaki sinyal karışmasını ortadan kaldırmak ve uzamsal-spektral doğruluğukorumak için gereklidir 39.

  1. Süper süreklilik (SC) ve prob ışınlarını tek boyutlu (1D) bir galvo tarayıcıya yerleştirin ( Şekil 4'te gösterildiği gibi ve referans39'da daha fazla ayrıntı). Görüş alanı boyunca doğru ışın taraması sağlamak için galvo ayna eşleniğini odaklama hedefinin arka açıklığına konumlandırın.
  2. Uyarma hedefinin arka açıklığına uyması için bir yansıtıcı ışın genişletici ( Şekil 4'te gösterildiği gibi) kullanarak her bir ışını genişletin. Bu, numune düzleminde optimum odaklama ve maksimum uzamsal çözünürlük sağlar.
    NOT: Renk sapmasını en aza indirmek ve SC ışınının geniş bant spektral içeriğini korumak için yansıtıcı optikler kullanın.
  3. Uyarma hedefinin arka açıklık düzlemine bir hizalama hedefi yerleştirin. SC ve prob ışınlarını, her ikisi de hedefin merkezinden geçecek ve optik eksen boyunca birlikte hizalamayı sağlayacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Hassas uzamsal örtüşme, BCARS sinyal gücünü en üst düzeye çıkarır ve odak noktasında maksimum uzamsal çözünürlük sağlar.
  4. Ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edilmiş yüksek NA'lı bir uyarma objektifi (örneğin, 1.2 NA, 60x suya daldırma objektifi) kullanarak ışınları numuneye odaklayın.
  5. Kapalı bir mikroskop lamı oluşturmak için iki lamel arasına bir damla su sıkıştırarak bir hizalama örneği hazırlayın. Hazırlanan slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve numuneyi görünür hale getirmek için odağı ayarlayın.
  6. Uyarma yolunun karşısına yerleştirilmiş bir toplama hedefi kullanarak iletim sırasında üretilen anti-Stokes sinyalini toplayın.
  7. Anti-Stokes sinyalinin dedektörün sabit sıralarına uzamsal eşlemesini korumak için bir 4f tarama giderme sistemi ( Şekil 4'te gösterildiği gibi) uygulayın.
    1. Toplama hedefinin arka odak düzlemini (BFP), bir 4f optik sistem kullanarak tarama giderme galvo aynasının eksenine aktarın. Bu, şu şekilde düzenlenmiş iki hassas tüp lensten oluşur (Malzeme Tablosuna bakınız):
      1. İlk lens, toplama objektifinin BFP'sinden bir odak uzaklığına (200 mm) yerleştirilir.
      2. İkinci lens, galvo aynanın bir odak uzaklığından önce yerleştirilir.
    2. FPGA kontrollü bir dalga biçimi üreteci kullanarak tarama giderme galvosunu tarama galvosu ile senkronize edin.
    3. Tarama çözme galvo genliğinin ayarlanmasına izin vermek için FPGA kontrol sistemine 7 bitlik bir dijital potansiyometre entegre edin.
      NOT: Tarama giderme galvo aynası, birincil tarama galvosu tarafından neden olunan açısal sapmaları telafi eder. Açısını senkronize olarak dinamik olarak ayarlayarak ışın hareketine karşı koyar ve anti-Stokes sinyalinin spektrometreye giden optik eksen boyunca hizalı kalmasını sağlar. Bu stabilizasyon, dedektör üzerinde uzamsal kaydı korumak ve tarama sırasında spektral görüntünün yanal yer değiştirmesini önlemek için gereklidir.
  8. Galvo taramayı ve kamera tetiklemeyi senkronize etmek için FPGA sistemini ( Malzeme Tablosuna bakın) yapılandırın.
    1. Tarama ve tarama galvoları için analog çıkışlar oluşturun.
    2. Her satır taramasının başlangıcını işaretlemek için bir giriş aşaması tetikleyicisini kabul edin.
    3. Çıkış çerçevesi yakalama, her tarama konumunda bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kameraya giden sinyalleri tetikler.
    4. Farklı toplama hedeflerine uyum sağlamak için tarama kaldırma genliğini bağımsız olarak kontrol edin.
      NOT: Tipik bir FPGA darbe dizisi, bir tarama galvo sürücü sinyali, bir tarama galvo sürücü sinyali, bir Stage tetikleme girişi ve senkronize çerçeve zamanlaması için bir piksel saati içerir.
  9. Artık pompayı ve SC uyarma ışığını engellemek için paralelleştirilmiş anti-Stokes sinyalini iki kısa geçiren filtreden geçirin.
  10. Filtrelenmiş anti-Stokes sinyalini spektrometre giriş yarığından sCMOS dedektörüne odaklayın. Işının yarığın uzun eksenine paralel olarak taranmasını sağlamak için hem tarama hem de tarama kaldırma galvolarının açılarını ayarlayın ve optik görüntü düzlemini yarıkla hizalayın. Bu hassas hizalama, spektral çözünürlüğü en üst düzeye çıkarır ve dedektör sıraları boyunca yanal sinyal karışmasını en aza indirir.
  11. Spektrometreyi, anti-Stokes spektrumunu kamera sıraları boyunca dikey olarak dağıtacak şekilde yapılandırın. Optimum spektral kapsama alanı için uygun bir ızgara seçin (örneğin, 300 çizgi/mm, 700 nm'de alevlenmiş).

6. Sinyal optimizasyonu ve spektral çözünürlük kalibrasyonu

  1. Ev yapımı alım yazılımını başlatın ve sCMOS kameradan gerçek zamanlı sinyal izlemeye başlayın. Edinme yazılımı, Hamamatsu DCAM-API ve Measurement Computing Universal Library sürücüleri dahil olmak üzere bağımlılıklarla Python 3.8+ (Windows 10) üzerinde evde oluşturulmuştur ve verileri HDF5 formatında çıkarır. Yazılım, ilgili yazarın makul talebi üzerine temin edilebilir.
  2. Kapalı bir slayt oluşturmak için iki lamel arasına bir damla benzonitril yerleştirerek bir spektral kalibrasyon numunesi hazırlayın. Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve uyarma objektifini kullanarak odak noktasına getirin.
  3. sCMOS kamerada BCARS sinyalini bulun. Anti-Stokes sinyal yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için toplama hedefinin z konumunu ayarlayın.
  4. Anti-Stokes ışığının spektrometrenin giriş yarığından doğru şekilde odaklandığından emin olmak için toplama hedefinin yanal konumunu ayarlayın. Bu hizalama, spektrometreye optimum bağlantı ve gelişmiş spektral doğruluk sağlar.
  5. Örnek düzlemde süper süreklilik (SC) ve prob ışınları arasındaki uzamsal örtüşmeyi optimize edin. Yanal konumunu ve geliş açısını hassas bir şekilde ayarlamak için prob ışını yolundaki aynaları kullanın.
  6. SC darbeleriyle zamansal örtüşmeyi sağlamak için prob ışın yolundaki optik gecikme hattını çevirin. Sinyal yoğunluğunu izleyin ve anti-Stokes sinyali maksimuma çıkana kadar ayarlayın, böylece uygun zamansal senkronizasyon onaylanır.
  7. sCMOS görüntüsünde benzonitrilde güçlü, keskin bir Raman tepe noktası (örneğin, 1002 cm-1) tanımlayın.
  8. Prob dalga boyunu ve buna karşılık gelen piksel konumunu kameraya kaydedin. sCMOS dedektörü boyunca doğrusal bir piksel-dalga sayısı eşlemesi oluşturmak için Rayleigh çizgisini (prob dalga boyunda 0 cm-1 ) ve 1002 cm-1 ve 3073 cm-1'de bilinen benzonitril Raman tepe noktalarını kullanın. Rayleigh çizgisi sıfır dalga sayısı referansını sağlarken, benzonitril tepe noktaları piksel başına dalga sayısı artışını belirler.
    NOT: Analiz yalnızca bağıl dalga sayısı bilgisi gerektirdiğinden (piksel konumu ile Raman kayması arasında eşleme), emisyon lambaları kullanılarak mutlak dalga boyu kalibrasyonu gerekli değildir.
  9. Piksel-dalga sayısı eşlemesini edinme yazılımına girin. Optik yolda, spektrometredeki ızgara ayarında veya hizalamada değişiklik yapılmadıkça bu kalibrasyon geçerli kalmalıdır.

7. Sinyal toplama

  1. Adım 1.1 ila 1.6'da hazırlanan C. elegans örneğini mikroskop aşamasına yükleyin. Bir ilgi alanı bulun ve uyarma hedefini kullanarak onu odak noktasına getirin.
  2. Rezonans olmayan arka plan (NRB) referansı olarak hizmet etmek için slaytta Raman-aktif sinyalin (su arka planı veya çıplak cam lamel ) bulunmadığı bir bölge belirleyin.
  3. sCMOS dedektöründe BCARS sinyalini bulun. Anti-Stokes sinyal yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için toplama hedefinin z konumuna ince ayar yapın.
  4. Anti-Stokes ışığının spektrometre giriş yarığından düzgün şekilde hizalandığından emin olmak için toplama hedefinin yanal konumunu ayarlayın.
  5. FPGA'yı kullanarak senkronize tarama ve tarama galvo aynalarını başlatın. Birincil taramadan açısal sapma tamamen telafi edilene kadar dijital potansiyometreyi kullanarak tarama giderme galvosunun genliğini ayarlayın. Anti-Stokes sinyali, tüm tarama aralığı boyunca kamerada ~12 sıra içinde sınırlı kalmalıdır.
  6. Zamansal bir alım sırası tanımlayın
    1. Prob darbesini geciktirerek SC ve prob darbeleri arasında bir çapraz korelasyon sinyali elde edin. Bunu elde etmek için, entegre üç renkli BCARS sinyalini prob darbesinin zaman gecikmesine karşı çizin. En güçlü sinyal, SC ve prob darbeleri geçici olarak örtüştüğünde 0 zamanında görünecektir.
      NOT: FLIM ve TPEF algılama sistemleri BCARS ile aynı tetikleyiciyi paylaştığından, sinyalleri bu zaman noktasında aynı anda alınır.
    2. BCARS için prob ışınının daha sonraki bir gecikmesinde (örneğin, 1-2 ps) ve rezonans olmayan arka plan için SC ışınının daha sonraki bir gecikmesinde ( Şekil 6A'daki NRB spektrumları) kaydedin. Dar bant darbesine (prob) bir zaman gecikmesi uygulandığında, üç renkli CARS sinyalindeki NRB etkili bir şekilde bastırılabilir ve böylece sinyal-gürültü oranı geliştirilebilir67.
    3. Temel dedektör gürültüsünü (karanlık referans) yakalamak için SC ile prob arasında zamansal çakışma olmayan karanlık bir görüntü elde edin.
    4. Meta veriler de dahil olmak üzere tüm BCARS, NRB ve karanlık görüntüleri tek bir h5 dosyasına kaydedin.
  7. BCARS Sinyal İşleme Protokolü
    1. CRIkit2 yazılımını68 açın.
    2. Şekil 6B'de gösterildiği gibi Açık HDF aracını kullanarak gerekli tüm veri kümelerini yükleyin: BCARS hiperspektral verilerini, NRB referansını ve karanlık referansı yükleyin. Frekans Penceresi aracını kullanarak BCARS sinyal oluşturma bant genişliği içindeki frekans bölgesini seçin (burada gösterilen BCARS sistemi için 400 cm-1'den ≥ 3200 cm-1'e).
    3. Ön işleme adımlarını gerçekleştirin:
      1. BCARS ve NRB veri kümelerini varyansı stabilize etmek için Anscombe aracını ( Şekil 6B'de gösterildiği gibi) kullanın.
      2. Tekil Değer Ayrıştırması (SVD) gerçekleştirmek için Gürültü Giderme aracını kullanın: Görsel incelemeye dayalı olarak temel bileşenleri koruyun. Numunenin morfolojisine uyan uzamsal dağılımlar sergileyen bileşenleri koruyun ve yapılandırılmamış veya benek benzeri gürültünün hakim olduğu bileşenleri atın. Bu gürültü giderme adımı, özellikle düşük yoğunluklu spektral özellikler için sinyal-gürültü oranını (SNR) iyileştirir.
      3. Verileri orijinal etki alanına geri yüklemek için Ters Anscombe aracını kullanın.
        NOT: Alım sırasında gerçek zamanlı işleme yapılırken bu adımlar atlanabilir.
    4. Kramers-Kronig (KK) dönüşümünü kullanarak Raman benzeri spektrumları alın:
      1. KK aracını açın (Şekil 6B'de gösterildiği gibi).
      2. Uygun spektral referans normalleştirmesini sağlamak için Norm'u NRB'ye etkinleştirin.
      3. NRB sapması, ped faktörü ve kenar piksel ortalaması dahil olmak üzere parametreleri ayarlayın.
      4. Alınan Raman spektrumlarını elde etmek için KK dönüşümünü yürütün.
    5. KK sonrası hata düzeltmeleri gerçekleştirin
      1. Savitzky-Golay düzeltmeyi kullanarak faz hatalarını düzeltin: Faz hatası düzeltme aracını açın (Şekil 6B). Düzgünleştirme penceresi boyutunu ve polinom sırasını ayarlayın. Önizleme panelini kullanarak orijinal ve düzeltilmiş spektrumları inceleyin.
      2. Ölçek hatalarını düzeltin: Ölçek hatası düzeltme aracını açın (Şekil 6B). Veri kümesi genelinde göreli yoğunluk ölçeklendirmesini düzeltmek için spektrumları normalleştirin. Uzamsal ve spektral boyutlar arasında tutarlılık sağlayın.
    6. Spektral ekseni kalibre edin (yanlış hizalanmışsa isteğe bağlı): Kalibrasyon aracını açın (Şekil 6B). Ölçülen dalga sayılarını bilinen referans tepe noktalarıyla karşılaştırın. Spektral ekseni yeniden hizalamak için düzeltilmiş eğimi/kesişimi uygulayın.
    7. İlgi alanlarından (ROI) veri tanımlama ve ayıklama
      1. ROI Spect'i kullanın. veya Pt Spect. BCARS görüntüsünde uzamsal ilgi alanlarını veya ilgi çekici noktaları işaretlemek için araç (Şekil 6B).
      2. Farklı yatırım getirilerinin spektral içeriğini görselleştirin ve karşılaştırın.
      3. Daha fazla kantitatif veya kemometrik analiz için alınan spektrumları dışa aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 5, dar bant probunun ölçülen spektrumlarını ve BCARS uyarımı için kullanılan geniş bant süper süreklilik (SC) darbelerini göstermektedir. Ev yapımı bir optik parametrik osilatörden (OPO, Şekil 1530) ~3 nm'lik bir sinyalin ikinci harmonik üretimi yoluyla üretilen prob darbesi, 764.2 nm'lik yarı maksimumda (FWHM) tam genişlik ile 0.2 nm'de ortalanır ve elde edilen Raman spektrumlarında ~6.8 cm-1'de spektral çözünürlük sağlar. Önceden cıvı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, BCARS ve 2p-FLIM/TPEF görüntüleme platformunun mimarisini ayrıntılı olarak göstermektedir. Mevcut kurulumumuzda çift çıkışlı 1030 nm lazer kullanılırken, çoğu yüksek güçlü fs 1030 nm fiber lazer, bir BCARS mikroskobu oluşturmak için ana lazer kaynağı olarak kullanılabilir. OPO/SHG PPLN kristallerinin uzunluğunu ve periyodunu dikkatli bir şekilde seçerek, bir sub-ps OPO 1030 nm pompa ile birkaç ps'lik bir prob darbesi oluşturmak mümkündür. Burada nispeten yüksek bir lazer tekr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur ve rekabet eden hiçbir mali çıkarları yoktur.

Teşekkürler

W-W.C. NIH (R21AG086974)'nin desteğini kabul eder. M.T.C., ABD Enerji Bakanlığı'nın (DOE BERDE-SC0022121) desteğini kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KameraHamamatsuORCA-FüzyonsCMOS, 2304× 2304 piksel
Toplama hedefi  Olympus  LUMPLFLN60XW  Suya daldırma, 1.0 NA
DAQ  Çalışkan  MCC USB-1208HS  Veri toplama kartı
Gecikme hattı  Newport  DL225 Serisi  Prob darbesi için mekanik gecikme
Dikroik  Semrock  FF925-Di01 Serisi  prob ve SC'yi birleştirme
Dikroik  Semrock  FF705-Di01 Serisi  Epi-Mod Floresansının Tespiti
Dikroik  Thorlab'lar  DMLP550R  FLIM sinyalini ve TPEF sinyalini ayırma
Uyarma hedefi  Olympus  UPLSAPO60XWIR  Suya daldırma, 1.2 NA
Filtre  Semrock  FF01-1326 / SP-25  SHG'den sonra temel lazeri reddedin
Filtre  Semrock  FF01-758/SP  BCARS kameradan önce temel lazeri reddedin
Filtre  Thorlab'lar  FESH0650  Floresan modalitesinden önce temel lazeri reddedin
FLIM PMT  PicoQuant  PMA Hibrit  FLIM tek foton dedektörü
FPGA  Redpitaya  STEMlab 125-14  Tarama senkronizasyonu ve tetikleme
Galvo  Thorlab'lar  GVS101 Serisi  Tarama ve taramayı kaldırma için
Izgara  Yapışık  Işık Smyth 1040nm  1000 Groves/mm, SC için ön cıvıltı
Yarım dalga plakası  Thorlab'lar  AHWP05M-980  Polarizasyon kontrolü
K-küp  Thorlab'lar  KPA101 Otomatik hizalayıcı için PSD sürücüsü
Lazer  Muhtemel Araçlar  FSX-Çift  Çift çıkışlı femtosaniye lazer
Lazer  Yapışık  Mira-900 Serisi  Floresan uyarımı için femtosaniye lazer
PBS  Thorlab'lar  PBS255 Serisi  SC ve prob için ışın kombinasyonu
PCF  Thorlab'lar  LMA-PM-5 Serisi  SC üretimi için 10 cm fotonik kristal fiber
PD  Thorlab'lar  PDA100A2  OPO geri bildirim döngüsü
Piezo ayna montajı  Thorlab'lar  POLARIS-K1S2P  Otomatik hizalayıcı için Piezoelektrik Ayarlayıcı
Ön amplifikatör  Edmund Optik  59-179  TPEF ön amplifikatörü
Prizma  Lambda Araştırma optikleri  EQP-30SF10 Serisi  SC sıkıştırma
PSD  Thorlab'lar  PDQ80A  Otomatik hizalayıcı için Konuma Duyarlı Dedektör
Spektrometre  Teledyne Princeton Enstrümanları  IsoPlane 160 Serisi  300 g/mm ızgara, 700 nm'de ortalanmış
Safha  ASI  MS-2000 Serisi  Motorlu 3 eksenli sahne
TCSPC  PicoQuant  Çoklu Arp 150  FLIM için foton sayma cihazı
TPEF PMT  Hamamatsu  H9305-03 Serisi  TPEF dedektörü
Tüp Lens  Thorlab'lar  TL200-2P2  Tarama giderme sisteminde kullanılır

Kaynaklar

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresans Ömür GörüntülemeRaman Parmak İzi Spektroskopisiİki Fotonlu MikroskopiMetabolik ProfillemeHücre Altı ÇözünürlükIn Vivo GörüntülemeC. elegansYeşil Floresan Protein
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.