Fare Oosit Mayozu Sırasında Kromozom Ayrışmasının Canlı Hücre Görüntülemesi

Özet

Burada, kromatin için H2B-RFP ve iğ görselleştirmesi için SiR-Tubulin kullanarak fare oositlerinde kromozom ayrımını incelemek için canlı hücre görüntüleme tekniklerini özetliyoruz. Mayotik kromozom dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ve minimal fototoksik görüntülemesini elde etmek için pratik bir kılavuz sunarak numune hazırlama, mikroenjeksiyon, kültür, görüntüleme kurulumu ve analizini detaylandırıyoruz.

Özet

Oosit mayozu sırasında doğru kromozom ayrımı, uygun embriyonik gelişimi sağlamak ve anöploidi ile ilişkili bozuklukları önlemek için gereklidir. Floresan etiketleme teknikleriyle birleştirilmiş canlı hücre görüntüleme, mayotik kromozom dinamiklerini yüksek uzay-zamansal çözünürlükle incelemek için güçlü bir yaklaşım haline geldi. Bu protokolde, kromatin etiketleme için histon H2B-RFP ve iğ takibi için SiR-Tubulin kullanımına odaklanarak, canlı fare oositlerinde kromozom ayrımını görselleştirmek için temel metodolojileri özetliyoruz. Numune hazırlama, mRNA mikroenjeksiyonu, oosit kültürü, canlı hücre görüntüleme odası kurulumu ve konfokal mikroskopi ayarları için prosedürleri, tümü fototoksisiteyi en aza indirirken yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için optimize edilmiş olarak açıklıyoruz. Ayrıca fototoksisite, görüntü işleme ve mayotik olayların niceliksel analizi gibi kritik deneysel hususları da vurguluyoruz. Mevcut metodolojilerin kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayan bu protokol, canlı oositlerde kromozom dinamiklerini araştırmak ve mayotik çalışmaların doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini geliştirmek isteyen araştırmacılar için pratik bir rehber görevi görmektedir.

Giriş

Oosit mayozu sırasında kromozomal ve iğ dinamiklerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesi, dişi gamet olgunlaşmasını ve anöploidi riskini yöneten mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir 1,2,3,4,5. Memeli oositleri, germinal vezikül parçalanması (GVBD), kromozom yoğunlaşması, iğ düzeneği ve asimetrik bölünme⁶ dahil olmak üzere oldukça koordineli bir dizi mayotik olaya maruz kalır. Sabit zaman noktalı görüntüleme, bu süreçlerin değerli anlık görüntülerini sağlarken, zamansal çözünürlükten yoksundur ve örnekleme aralıkları arasında meydana gelen geçici veya hızlı olayları yakalayamaz. Buna karşılık, floresan etiketli kromozomların ve mikrotübüllerin canlı hücre görüntülemesi, bu dinamik süreçleri gerçek zamanlı olarak izlemek için güçlü bir yaklaşım sunar ^2,3,7. Bu, bireysel oositlerdeki mayotik olayların zamanlamasının, süresinin ve sırasının doğrudan gözlemlenmesine ve sabit numunelerde aksi takdirde gözden kaçabilecek geçici olayların tanımlanmasına olanak tanır. Bununla birlikte, mikroenjeksiyon ve görüntüleme sırasında oosit canlılığını ve fizyolojik bütünlüğünü korumak, titiz bir kullanım ve optimize edilmiş koşullar gerektirir⁸.

Bu protokol, fare germinal vezikül (GV) aşamasındaki oositlerin H2B-RFP cRNA ile mikroenjekte edilmesi için kapsamlı bir iş akışını açıklar, kromatinin floresan etiketlenmesini ve ardından mayoz⁴ boyunca kromozomların ve iğ davranışının hızlandırılmış konfokal görüntülenmesini sağlar. Yöntem, hormonal hazırlama, oosit izolasyonu, kontrollü sıcaklık koşulları altında mikroenjeksiyon ve çevresel kontrol ^4,9 ile konfokal mikroskopi kullanarak canlı görüntüleme gibi temel adımları entegre eder. Bu makalenin genel amacı, canlı fare oositlerinde kromozomal ve iğ dinamiklerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunmak, mayotik düzenleme ve anöploidi riskinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için bir platform sağlamaktır.

Bu protokol yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük sağlarken, endojen protein dinamiklerini tam olarak kopyalayamayabilen ve aşırı eksprese edilirse doğal mayotik süreçlere potansiyel olarak müdahale edebilen eksojen raportör ekspresyonuna dayanır. Araştırmacılar bu sınırlamaları göz önünde bulundurmalı ve mümkün olduğunda tamamlayıcı yaklaşımlar kullanarak bulguları doğrulamalıdır.

Bu protokol, mayotik mekanizmaları, kromozom ayrışma hatalarını ve genetik veya çevresel bozulmaların oosit kalitesi üzerindeki etkisini araştıran çalışmaları desteklemek için tasarlanmıştır. Üreme biyolojisinde hem temel araştırmalar hem de translasyonel uygulamalar için sağlam bir platform sağlar.

Protokol

Tüm deneyler, yerel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapılmalıdır. Deneysel prosedürler, 3R ilkelerine (Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme) sıkı sıkıya bağlı kalmalıdır. Fareler, yiyecek ve suya serbest erişimi olan standart çevre koşulları (22 °C, %60 nem) altında akredite bir hayvan tesisinde barındırılmalıdır.

1. Oosit toplama ve hazırlama

NOT: Tüm ekipman ve reaktifler steril olmalıdır. Tüm oosit işlemlerini stereomikroskop altında bir ağız pipeti kullanarak gerçekleştirin (bkz. Tüm kültür ortamı damlacıklarını mineral yağ ile kaplayın (Şekil 1A-E).

1. Hormonal uyarım
   1. 3-4 haftalık dişi farelere, oosit toplamadan 46-48 saat önce 5 uluslararası birim (IU) hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG ; bkz.
      NOT: B6CBAF1 fareler (C57BL / 6J × CBA / CaCrl'nin F1 yavruları) üstün oosit verimi ve uygun olgunlaşma özellikleri nedeniyle tercih edilir.
2. Kültür ortamının hazırlanması
   1. 0,2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak M2 ve M16 ortamını filtreleyin (Malzeme Tablosuna bakın). 100 mM'lik bir stoktan seyrelterek IBMX ile 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona tamamlayın.
   2. 35 mm plastik doku kültürü kaplarında 5-6 damla M2-IBMX (her biri ~30 μL) ve 3 damla M16-IBMX hazırlayın. Tüm damlacıkları mineral yağ ile kaplayın. M2-IBMX kaplarını 37 ° C'lik bir sıcak blok üzerine yerleştirin (Şekil 1A) ve M16-IBMX kapları oosit izolasyonundan önce en az 30 dakika boyunca 37 ° C'lik,% 5 CO₂ inkübatörde (Şekil 1C).
   3. Yumurtalık diseksiyonu için 800-1.000 μL M2-IBMX (yağsız) içeren ek bir kap hazırlayın. Stereomikroskop üzerine monte edilmiş 37 °C'lik bir ısıtma plakasına yerleştirin (Şekil 1B).
3. Oosit izolasyonu
   1. Fareleri servikal çıkık ile kurban edin. Alt karın bölgesini %70 etanol ile silin, ardından periton boşluğuna girmek için ciltte ve peritonda küçük bir yatay kesi yapın. Kesiğin kenarlarını parmaklarınızla ayırarak kesiyi uzatın.
   2. Forseps kullanarak, böbreklerin üst kutbunda bulunan üst karın bölgesindeki yumurtalıkları ortaya çıkarmak için bağırsağı yoldan çekin. İnce forseps ve mikro makas kullanarak, dokuya zarar vermemek için yumurtalıkları dikkatlice çıkarın. Yumurtalıkları hemen 100-200 μL önceden ısıtılmış M2-IBMX ortamı içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   3. Yumurtalıkları 1 mL önceden ısıtılmış M2-IBMX ortamına aktarın ve ısıtılmış diseksiyon mikroskobu aşamasına geçin (Şekil 1B). Yağ dokusunu ve yumurta kanalı kalıntılarını dikkatlice çıkarın.
      NOT: Foliküllere veya oositlere zarar vermemek için yumurtalıkları nazikçe tutun. Hayvan odasından laboratuvara transfer sırasında yumurtalıkları ılık bir ortamda tutun.
   4. 27 G'lik bir iğne kullanarak folikülleri delerek kümülüs-oosit komplekslerini (KOK'ler) serbest bırakın (Şekil 1A-B). COC'leri toplayın ve 25-30 μL'lik M2-IBMX damlacıklarına aktarın (Şekil 1D).
   5. Dar delikli bir cam Pasteur pipeti ile tekrarlanan pipetleme ile kümülüs hücrelerini ayırın (Şekil 1E).
      NOT: Ağızdan pipetleme, oosit işleme için yaygın olarak kullanılırken, mekanik pipetleyiciler veya mikromanipülatörler, özellikle ağızdan pipetlemenin kısıtlı olduğu veya mümkün olmadığı ortamlarda alternatifler sunar. Bu alternatifler benzer protokollerde^{başarıyla kullanılmıştır 10,11}.
   6. 20x-40x büyütmede bir stereomikroskop kullanarak daha büyük bir çapa ve merkezi olarak yerleştirilmiş GV'ye dayalı olarak tamamen büyümüş GV evresi oositlerini tanımlayın ve seçin. Işıktan korunan 37 ° C'lik bir sıcak blok üzerinde taze 30 μL M2-IBMX damlacıklarına aktarın.
      NOT: Fizyolojik bütünlüğü korumak için tüm prosedürler boyunca oositleri 37 ° C'de tutun. Tüm ortamları önceden ısıtın ve tüm mikroskop tabanlı kullanım ve mikroenjeksiyon için sıcaklık kontrollü aşamalar kullanın.
   7. Mikroenjeksiyondan önce oositlerin 37 ° C'de ısıtılmış bir aşamada 20 dakika iyileşmesine izin verin.

2. H2B-RFP cRNA hazırlama

NOT: Tüm adımları temiz, RNaz içermeyen bir ortamda eldiven giyerek gerçekleştirin. Yalnızca RNaz içermeyen su ve reaktifler kullanın ve tercihen RNaz inhibitörlerinin varlığında çalışın.

1. H2B-RFP plazmitini, eki çevreleyen primerleri kullanarak Sanger dizilimi ile sırayla doğrulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Yetkili E. coli'yi (örneğin, DH5α) dönüştürerek, tek bir koloni seçerek ve uygun antibiyotiklerle LB suyunda büyüterek plazmidi çoğaltın. Standart bir midi veya maxi hazırlık kiti kullanarak plazmidi saflaştırın. Ayrıntılı prosedürler için Green ve Sambrook^12'ye bakın.
2. Plazmit DNA'yı, üreticinin talimatlarına göre ticari bir mini hazırlık kiti kullanarak saflaştırın. Bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
3. Vektör omurgasında bir kez kesen uygun bir kısıtlama enzimi kullanarak ekin aşağı akışında 2-4 μg plazmit DNA'yı doğrusallaştırın (H2B-RFP için NotI kullanıldı). Tablo 1'de tarif edildiği gibi uygun tampon ve enzim konsantrasyonunu kullanarak sindirim reaksiyonunu kurun ve 37 °C'de 1-2 saat inkübe edin. Agaroz jel elektroforezi ile tam doğrusallaştırmayı onaylayın. Çoklu bantlar eksik sindirimi gösterir. Ticari bir kit kullanıyorsanız, üreticinin talimatlarını izleyin.
   NOT: Ek parçanın tam olarak aşağı akışında ve optimum sindirim koşulları altında kesen bir kısıtlama enzimi seçin. Bir agaroz jel üzerinde küçük bir alikot çalıştırarak doğrusallaştırmayı doğrulayın.
4. Sindirim reaksiyonunu 1 μL Proteinaz K (10 μg/mL), 5.3 μL %10 SDS ve 50 μL nükleaz içermeyen su ile 50 °C'de 1 saat inkübe ederek RNaz kontaminasyonunu giderin.
   NOT: Bu adım, RNaz ve protein kirleticilerini ortadan kaldırmak için gereklidir. Yalnızca RNaz içermeyen reaktifler kullanın ve temiz çalışma koşullarını koruyun.
5. Sindirilmiş DNA'yı fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) ile ekstrakte edin, ardından bir kloroform ekstraksiyonu yapın.
   NOT: Toksisiteyi en aza indirmek ve numune işlemeyi kolaylaştırmak için, fenol/kloroform ekstraksiyonu yerine ticari kolon veya boncuk bazlı saflaştırma yöntemleri (örneğin, silika membran veya manyetik boncuk sistemleri) de kullanılabilir.
6. 3 M sodyum asetat ve %100 etanol ekleyerek DNA'yı çökeltin. -80 °C'de en az 2 saat inkübe edin.
7. DNA'yı 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000-14.000 x g'da santrifüjleme ile pelet haline getirin. Peleti %70 etanol ile yıkayın, 4 °C'de 5 dakika boyunca aynı hızda tekrar santrifüjleyin, kısa bir süre havayla kurutun (2-5 dakika) ve 6 μL RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.
   NOT: Etanol çökeltme ve santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde görünür yarı saydam veya beyaz bir pelet oluşmalıdır. Pelet görülmezse, santrifüjlemeyi daha yüksek bir hızda tekrarlayın veya DNA konsantrasyonunu yeniden değerlendirin.
8. Üreticinin protokolünü izleyerek T7 mMESSAGE mMACHINE kitini kullanarak in vitro transkripsiyon gerçekleştirin (bkz.
9. Transkripsiyon reaksiyonunu 37 °C'de en az 2 saat inkübe edin. Transkript uzunluğu 5 kb'yi aşarsa inkübasyonu uzatın.
10. 10 μL reaksiyon hacmi başına 1 U DNase I kullanarak DNase muamelesi ile şablon DNA'yı çıkarın, 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
11. Sentezlenen cRNA'yı lityum klorür çökeltme¹³ kullanarak saflaştırın. Çökeltme ve santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde görünür yarı saydam veya beyaz bir topak oluşmalıdır. RNA peletini %70 etanol ile yıkayın.
12. Nihai cRNA peletini 20 μL RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. RNA konsantrasyonunu ölçün ve RT-PCR gerçekleştirerek ve ardından PCR ürününün dizilimini yaparak poli(A) kuyruğunun varlığını ve uzunluğunu doğrulayın. cRNA'yı 1 μL hacimlere ayırın ve -80 °C'de saklayın.

3. Oositlerin hazırlanması ve mikroenjeksiyonu

NOT: İşlem boyunca, oosit kalitesini korumak için önceden ısıtılmış ortam ve sıcaklık kontrollü mikroskop aşamaları kullanarak oositleri 37 ° C'de tutun.

1. Hazırlık
   1. H2B-RFP cRNA alikotlarını buz üzerinde çözün, kısaca santrifüjleyin ve istenen konsantrasyona (örneğin, 250 ng/μL) seyreltin.
      NOT: Optimal cRNA konsantrasyonu, yapıya, ekspresyon sistemine ve deneysel hedeflere bağlı olarak değişebilir. Yeterli sinyal sağlarken aşırı ekspresyon artefaktlarını en aza indirmek için cRNA konsantrasyonunun titre edilmesini (örneğin, 50-300 ng/μL aralığında) öneririz. Kullanıcılar ayrıca, yapı ekspresyonunu takiben oosit sağlığı ve canlılığının işlevsel bir okuması olarak mayotik ilerlemeyi (örneğin, GVBD, iğ oluşumu ve polar gövde ekstrüzyonu) izlemelidir. cRNA'nın enjeksiyon konsantrasyonlarının tipik olarak 0,2 ila 1 μg/μL arasında değiştiği ve optimal sonuçların genellikle 0,5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9'da elde edildiği bildirilmiştir.
   2. Bir pipet çektirmesi kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan (OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm, uzunluk = 100 mm) mikroenjeksiyon iğneleri hazırlayın (Şekil 2A).
      NOT: Dikey bir pipet çekici kullanıyoruz ( bkz. Şekil 2A). Çekme parametrelerini ampirik olarak optimize edin. İğne ucu, oosit hasarını en aza indirecek kadar ince, ancak tıkanmayı önleyecek ve düzgün cRNA iletimine izin verecek kadar geniş olmalıdır.
   3. RNaz içermeyen mikro yükleyici uçlarını kullanarak iğne ucuna 0,5-1,5 μL cRNA çözeltisi yükleyin. Enjeksiyondan önce hava kabarcıklarını giderin.
2. Mikroenjeksiyon kabı kurulumu
   1. 100 μL M2-IBMX ortamı içeren bir mikroenjeksiyon kabı hazırlayın ve buharlaşmayı ve ozmolarite kaymalarını önlemek için tamamen mineral yağ ile kaplayın.
3. Oosit mikroenjeksiyonu
   1. Tutma ve enjeksiyon pipetlerini mikromanipülatör sistemine monte edin (Şekil 2B,C).
   2. Mikroenjeksiyon kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Bir ağız pipeti kullanarak oositleri M2-IBMX damlacığına aktarın.
   3. Tutma ve enjeksiyon pipetlerini oositlerle aynı yatay düzleme getirin.
   4. Tutma pipeti ile hafif emme kullanarak bir oosit yakalayın (Şekil 2B ve C).
   5. Enjeksiyon iğnesini zona pellucida ve oolemmadan geçirin, sitoplazmayı hedefleyin ve çekirdekten kaçının.
   6. Hücre içi bir elektrometre aracılığıyla kısa bir negatif kapasitans darbesi kullanarak H2B-RFP cRNA'sını iletin (Şekil 2B-E). Enjeksiyon hacmini oosit hacminin yaklaşık %5'i kadar tutun. Başarılı bir enjeksiyon tipik olarak küçük ama belirgin bir sitoplazma dağılımı olarak görülebilir. Membran hasarını önlemek için enjeksiyon basıncını ve enjeksiyon zamanlamasını ayarlayın.
   7. Membran yırtılmasını en aza indirmek için iğneyi aynı açıda hızlı ve düzgün bir şekilde geri çekin.
   8. Oositi tutma pipetinden ayırın ve enjekte edilenleri enjekte edilmemiş oositlerden ayırt etmek için kabın ayrı bir alanına yeniden yerleştirin (Şekil 2F). Bu kurulum için, enjekte edilmemiş oositleri yemeğin üstünde tutarak ve enjekte edilenleri en alta taşıyarak iş akışını düzenleyin.
   9. Kalan tüm oositler için 3.3.4-3.3.8 adımlarını tekrarlayın. Enjeksiyon sonrası hayatta kalma oranları tekniğe ve mRNA özelliklerine göre değişir. %60-%80 canlılık bekleyin.
4. Enjeksiyon sonrası taşıma
   1. Enjekte edilen oositleri temiz bir kültür kabında taze bir M16-IBMX ortamı damlacığına aktarın.
   2. H2B-RFP ekspresyonuna izin vermek için 37 °C'de 1-4 saat inkübe edin. İnkübasyon süresini cRNA konsantrasyonuna, transkript boyutuna ve ekspresyon verimliliğine göre ayarlayın.

4. Mayoz bölünme sırasında H2B-RFP etiketli kromozomların hızlandırılmış görüntülemesi

1. Ekipman ve medyanın hazırlanması
   1. Konfokal mikroskop aşaması inkübatörünü ve çevre odasını kullanmadan önce ≥ 30 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtın (Şekil 3A). Gaz kontrol cihazını açın ve hazneyi %5_CO2 ve ortam O_2'de tutmak için gaz akışını başlatın. Uzun süreli canlı hücre görüntüleme sırasında oosit sağlığını desteklemek için odanın nemlendirildiğinden emin olun.
   2. Kültür damlalarını hazırlayın: 35 mm'lik bir Petri kabına SiR-Tubulin (100 nM nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş 5-6 damla 50 μL M16 ortamı yerleştirin. Mineral yağ ile kaplama. Ayrı bir cam tabanlı görüntüleme kabına üç adet 5 μL damla M16 + SiR-Tubulin yerleştirin ve mineral yağ ile kaplayın. Kullanmadan önce her iki tabağı da 37 °C'de ≥ 30 dakika ısıtın.
2. Oosit transferi ve yıkama
   1. Oositlerin yıkanması: Enjekte edilen oositleri, kalan IBMX'i yıkamak için 50 μL M16 + SiR-Tubulin damlalarından sırayla aktarın (5 yıkama önerilir). Oosit hasarını önlemek için yıkamaları nazikçe yapın.
      NOT: Artık IBMX, mayoz bölünmenin yeniden başlamasını engelleyebilir, bu nedenle kapsamlı yıkama çok önemlidir.
   2. Son transfer: Yıkamalardan sonra, önceden ısıtılmış cam tabanlı görüntüleme kabında 15-20 oositi 5 μL'lik M16 + SiR-Tubulin damlasına aktarın.
3. Mikroskop kurulumu
   1. Görüntüleme çanağının montajı: Cam tabanlı çanağı konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin (Şekil 3A). Oositlerin ~10 dakika yerleşmesine izin verin.
   2. Sahne konumlandırma: Parlak alan görüntülemeyi kullanarak, oositleri görüş alanında ortalayın. Mikroskop yazılımını kullanarak konumları kaydedin.
      NOT: Bu çalışmada, HC PL APO 20x/1.0 NA suya daldırma objektif lensli bir Leica TCS SP8 konfokal mikroskop kullandık. Bununla birlikte, kullanılabilirliğe bağlı olarak benzer özelliklere sahip diğer konfokal sistemler ve objektif lensler kullanılabilir.
   3. Suya daldırma hedefleri için su pompası kurulumu: Suya daldırma objektif merceği kullanıyorsanız, su pompası sistemini 5-10 dakikalık aralıklarla aralıklı olarak su sağlamak için çalıştırın. Bu periyodik akış, lens ile cam tabanlı görüntüleme kabı arasındaki su sütununu koruyarak kurumayı önler ve uzun süreli deneyler sırasında stabil görüntüleme koşulları sağlar. Yağa daldırmalı lensler için bu su akışı kurulumu gerekli değildir.
4. Görüntüleme ayarları
   1. Lazer tarama moduna geçin. Lazer yoğunluklarını aşağıdaki gibi ayarlayın: H2B-RFP (kromozomlar) için %0,5'te (hedefte ~100 μW) 561 nm; SiR-Tubulin (iğ mikrotübülleri; Şekil 3B,E).
      NOT: Uygun lazer güvenlik yönergelerini izleyin. Numune canlılığını korumak için lazere maruz kalmayı en aza indirin.
5. Z-yığını alımı
   1. 2-4 μm adım boyutuyla 30-50 μm'yi kapsayan Z yığınları elde edin (Şekil 3B,C).
   2. 600 Hz tarama hızı kullanarak 5-10 dakikalık aralıklarla görüntü yakalayın (Şekil 3B,D). Toplam görüntüleme süreleri, izlenen mayotik evreye bağlı olarak 12-16 saat sürebilir ve fototoksisite ve oosit toleransı ile genişletilmiş in vitro kültüre sınırlıdır.
6. Sıralı görüntü alımı
   1. Mikroskop sistemlerinde, iki HyD dedektörü ile sıralı tarama gerçekleştirin: H2B-RFP: 561 nm'de uyarma; 580-630 nm'de toplanan emisyon; 633 nm'de SiR-Tubulin Uyarımı; 650-700 nm'de toplanan emisyon (Şekil 3E).
7. Hızlandırılmış görüntülemeyi başlatma
   1. Uzun vadeli hızlandırılmış çekime başlamadan önce, bir test görüntüsü alarak sinyal kalitesini doğrulayın. Floresan sinyaller eşit olarak dağıtılmalıdır: H2B-RFP, kromatini belirgin bir şekilde etiketlemeli ve SiR-tübülin, aşırı arka plan olmadan mikrotübül yapılarını vurgulamalıdır. Kısa ön görüntüleme çalışmalarında otomatik netleme kararlılığını ve minimum ışıkla ağartmayı onaylayın.
   2. Başlat'ı tıklatarak hızlandırılmış görüntülemeyi başlatın.
      NOT: M fazı girişini işaretleyen GVBD, tipik olarak IBMX yıkamasından 60-90 dakika sonra gerçekleşir (Şekil 4A). Bu kurulumda, C57BL / 6 oositleri, GVBD'den yaklaşık 8-9 saat sonra ilk kutup gövdesini ekstrüde eder (Şekil 4A). Zamanlama, fare suşu ve kültür koşullarına göre değişebilir.

5. Görüntüleme sonrası işleme

1. Dosya > Aç'ı seçip görüntüleme oturumundan .lif Dosyasını seçerek görüntüleme dosyasını bir görüntü analiz yazılımında açın.
2. İşleme > Projeksiyon Oluştur'u seçerek H2B RFP ve SiR-Tubulin kanalları için Z projeksiyonları oluşturun. Projeksiyon türünü Maksimum Yoğunluklu Projeksiyon olarak ayarlayın. Hem RFP hem de SiR Tubulin kanallarını seçin, ardından Çalıştır'a tıklayın.
   NOT Bulanık bir görüntüye neden olabileceğinden, DIC kanalı için Z projeksiyonu yapmayın. Bunun yerine, en keskin şekilde odaklanan tek DIC düzlemini belirleyin ve seçin. Optimum görselleştirme elde etmek için bu odaklanmış DIC görüntüsünü H2B-RFP ve SiR-Tubulin kanallarının maksimum yoğunluk projeksiyonlarıyla birlikte kullanın.
3. Tek bir parlak alan odak düzlemi çıkarın. İşlem Araçları'na dönün ve Düzenle > Kırp'ı seçin. Brightfield kanalını seçin, en uygun odak düzlemini bulmak için Z kaydırıcısını kullanın ve Uygula'yı tıklatın.
4. İşlem Araçları'nı açıp Birleştir > Kanal Ekle'yi seçerek projeksiyon ve parlak alan görüntülerini birleştirin. RFP projeksiyonunu, SiR-Tubulin projeksiyonunu ve tek parlak alan görüntüsünü ekleyin. Birleştirilen kümeye sağ tıklayın ve ardından Uygula'ya tıklayın.
5. Dosya > Görüntüyü Dışa Aktar'ı seçerek son birleştirilmiş görüntüyü dışa aktarın>. Yüksek kaliteli, sıkıştırılmamış çıktı için TIFF formatını seçin.
   NOT: Aşağı akış analizi ve şekil hazırlama için TIFF formatında dışa aktarma önerilir.

Sonuçlar

Şekil 4A,B'de gösterildiği gibi, bu protokol oositlerdeki kromozomların (H2B-RFP) ve iğ mikrotübüllerinin (SiR-tübülin) yüksek kaliteli canlı hücre görüntülemesini sağlar, böylece mayotik olgunlaşma boyunca kapsamlı uzay-zamansal bilgi sağlar.

Şekil 4A'daki H2B-RFP kanalı, GVBD'yi takiben ilk hizalamadan (Şekil 4A, 03:00 - 08:00) anafaz I'de ayrışmaya (Şekil 4A

Tartışma

Burada sunulan protokol, fare oositlerinin mikroenjeksiyonu ve canlı hücre görüntülemesi için sağlam bir yöntemin ana hatlarını çizerek, mayoz bölünme sırasında kromozom dinamiklerinin yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlükle görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşımın başarısı için kritik olan, toplama ve mikroenjeksiyondan görüntülemeye kadar prosedürün her aşamasında oositlerin titizlikle ele alınmasıdır. Oositler çevresel dalgalanmalara karşı oldukça hassastır ve sıcaklık, pH veya ozmo...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 ml'lik şırıngalar	Terumo	SS+01T Tüberkülin	Hassas PMSG enjeksiyonları için şırıngalar.
agaroz jel	Davetli	16500500	H2B-RFP dizisine uymak için nükleik asitleri boyuta göre ayırmak için DNA ve RNA jel elektroforezi için kullanılır
Alkol brülörü	Laboratuvar Tek	LW15557-01	Sterilizasyon ve ağız pipiti hazırlama için kullanılır.
Bakteri kültürü ortamı (LB et suyu)	Sigma-Aldrich	L3022 Serisi	E. coli ve diğer bakteri kültürlerini büyütmek için kullanılan standart ortam.
Hücre kültürü kapları (35 × 10 mm ve 60 × 15 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430165, CLS430166	Oositlerin kültürlenmesinde kullanılır; çeşitli boyutlarda mevcuttur.
Santrifüj (tezgah üstü)	Eppendorf Belediyesi	5424R Serisi	Araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan küçük numune hacimleri için kompakt bir santrifüj.
Santrifüj tüpleri (15 ml ve 50 ml)	Corning	352096, 352070	Santrifüjleme için daha büyük tüpler, genellikle hücre ve protein işleme için kullanılır.
Kloroform	Sigma-Aldrich	C2432 (İngilizce)	Moleküler biyoloji protokollerinde, özellikle DNA/RNA ekstraksiyonunda yaygın olarak kullanılan bir çözücü.
CO2 inkübatörü	Sanyo	(model: MCO-18AIC)	Oosit kültürü için kontrollü bir CO2 atmosferi sağlamak üzere tasarlanmış inkübatör.
Tek kullanımlık ultra ince iğneler (27 G × 1/2")	Hanke Şımarık Kurt	4710004012	Oosit toplama için ince iğneler
DNase I (RNase içermez)	Thermo Fisher Bilimsel	EN0521	RNA preparatlarından kirletici DNA'yı çıkarmak için kullanılan enzim.
Kuru ısıtma bloğu	Grant Instruments	(model: QBD4)	Numuneleri veya reaksiyonları suya ihtiyaç duymadan hassas sıcaklıklarda ısıtmak için kullanılan bir blok.
Etanol (moleküler biyoloji sınıfı)	Sigma-Aldrich	E7023 (İngilizce)	DNA ve RNA çökeltmelerinin yanı sıra sterilizasyon prosedürlerinde kullanılır.
İnce diseksiyon makası	Met-App Bilimsel ve Cerrahi Aletler	2235	Fare oositlerinin hassas diseksiyonu için kullanılır
İnce forseps	Met-App Bilimsel ve Cerrahi Aletler	2127	Fare oositlerinin hassas diseksiyonu için kullanılır
Jel elektroforez sistemi	Biyo-Rad	1645050	Jellerdeki nükleik asitlerin veya proteinlerin elektroforezini gerçekleştirmek için bir sistem.
Gentamisin sülfat	Sigma-Aldrich	G1264 Serisi	Hücre kültürlerinde bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kullanılan antibiyotik.
Cam Pastör pipetleri (230 mm)	VWR	6121702	Oosit ağız pipeti için kullanılan cam pipetler
IBMX Hakkında	Sigma-Aldrich	I5879	GVBD'yi önlemek için kullanılan bir fosfodiesteraz inhibitörü
Ters Mikroskop	Nikon		Kültür kabının altından canlı hücreleri veya organizmaları gözlemlemek için tasarlanmış bir mikroskop.
Fare embriyo kültürüne uygun hafif mineral yağ	Sigma-Aldrich	M5310 Serisi	Buharlaşmayı önlemek ve sıcaklığı korumak için kültürde oositleri kaplamak için kullanılır.
Lityum klorür	Sigma-Aldrich	L9650 Serisi	RNA çökeltme yöntemlerinde kullanılır.
Canlı Hücre Görüntüleme Sistemi	Leica	LAS X	Gelişmiş mikroskopi teknikleri kullanılarak canlı hücrelerin gerçek zamanlı gözlemlenmesi için tasarlanmış görüntüleme sistemi.
M16 ortamı (in vitro kültür için)	Sigma-Aldrich	M7292 Serisi	Fare oositlerinin ve embriyolarının kültürü ve diğer in vitro uygulamalar için tasarlanmış bir ortam.
Mikrosantrifüj tüpleri (0,6 ml ve 1,6 ml)	Neptün	3735.X, 3745.X	Genellikle moleküler biyoloji ve biyokimya protokollerinde kullanılan santrifüjleme için küçük hacimli tüpler.
Mikrosantrifüj tüpleri (RNaz içermez)	Eppendorf / Neptün	022431081 (Eppendorf)	RNA için RNaz içermeyen tüpler, RNA'nın bozulmasını önlemek için çalışır.
Mikroenjeksiyon İğneleri	Sutter Enstrümanları	P-30 Pipet Çektirme	Oositlere hassas mikroenjeksiyon için iğneler
Mikroenjeksiyon Sistemi	Harvard Aparatı	FemtoJet, PicoPump	cRNA'nın fare oositlerine yüksek hassasiyetle enjekte edilmesi için kullanılan sistemler.
Mini hazırlık kiti	Qiagen	27106 (QIAprep Spin Miniprep Kiti)	Moleküler biyoloji uygulamaları için plazmit DNA'yı bakteri kültürlerinden izole etmek için bir kit.
Ağız aspiratörü tüp tertibatı	Sigma-Aldrich	A5177 Serisi	aspirasyon oositleri için
Pelet Boya	Merck Millipore	69049-3	Santrifüjleme sırasında pelet oluşumunu görselleştirmek için bir ürün.
Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol	Thermo Fisher Bilimsel	15593031	Faz ayrımı için H2B-RFP ekstraksiyonunda kullanılan bir çözelti.
H2B-RFP'yi kodlayan plazmit	Addgene	Plazmid #20972	Kromozomları kırmızı floresan proteini (RFP) ile etiketlemek için kullanılan plazmit
PMSG	Özellik	HOR-272	Fare süperovalasyonu için
Proteinaz K	Thermo Fisher Bilimsel	EO0491	DNA/RNA ekstraksiyon prosedürlerinde yaygın olarak kullanılan, proteinleri sindirmek için kullanılan bir enzim.
Kısıtlama enzimi NotI	New England Biyolaboratuvarları (NEB)	R3189S	DNA klonlama ve moleküler biyoloji uygulamalarında kullanılan bir kısıtlama enzimi, H2B-RFP plazmidi lineerize eder.
RNaz inhibitörü (isteğe bağlı)	New England Biyolaboratuvarları (NEB)	M0314S	RNA ile ilgili deneyler sırasında RNA bozulmasını önlemek için kullanılan enzim.
RNaz içermeyen eldivenler	VWR / Fisher Bilimsel	Boyuta göre değişir	RNA manipülasyon protokollerinde kullanılan RNaz kontaminasyonunu önlemek için işlenmiş eldivenler.
RNaz içermeyen pipet uçları	Axygen / Termo Fisher	T-300-R-S	RNA ile ilgili uygulamalar için RNaz kontaminasyonu olmayacak şekilde tasarlanmış pipet uçları.
RNaz içermeyen su	Thermo Fisher Bilimsel	AM9932	Bozulmayı önlemek için RNA çalışması için gerekli olan RNaz enzimlerini uzaklaştırmak için arıtılmış su.
SDS (%10)	Sigma-Aldrich	L3771 Serisi	Elektroforez ve diğer deneylerde proteinleri denatüre etmek için kullanılan sodyum dodesil sülfat.
SiR-Tübülin	Spirokrom	SC002 Serisi	İğnin canlı hücre görüntülemesi için spesifik olarak tübüline bağlanan bir floresan boya
Sodyum asetat (3 M)	Sigma-Aldrich	S7899 Serisi	Moleküler biyoloji prosedürlerinde tampon olarak ve DNA'nın çökeltilmesi için kullanılır.
Spektrofotometre	Termo Fisher (NanoDrop)	ND-BİR-W	Absorbansı ölçerek nükleik asitleri, proteinleri ve diğer maddeleri ölçmek için kullanılan alet.
Stereomikroskop	Leica Microsystems	M165C	Numuneleri düşük büyütmelerde üç boyutlu olarak gözlemlemek için tasarlanmış, diseksiyonlar için yararlı bir mikroskop.
Şırınga filtre ünitesi (0.22-µ m)	Merck	SLGP033RS	Özellikle mikrobiyoloji ve moleküler biyoloji uygulamalarında sıvıların steril filtrasyonu için kullanılır.
Şırıngalar ve İğne Düzeneği	Terumo	SS+01T Tüberkülin Şırıngaları	hassas PMSG iletimi için kullanılır.
T7 mMESSAGE mMAKİNE Kiti	Thermo Fisher Bilimsel	AM1344	H2B-RFP cRNA hazırlığı için bir T7 promotöründen RNA'nın in vitro transkripsiyonu için bir kit.
Su banyosu / ısıtma bloğu	Hibe Araçları	QBD4	Isı gerektiren deneylerde hassas sıcaklıkları korumak için kullanılır.