Yöntem makalesi

Floresan Yağ Asidi Analogları Kullanılarak Endotelyal Yağ Asidi Alımının Miktar Tayini

DOI:

10.3791/68859

⸱

15 Ağustos 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, uzun zincirli ve çok uzun zincirli doymuş yağ asitlerinin BODIPY-C12 ve BODIPY-C16 floresan analogları ile stimülasyon üzerine endotel hücrelerinde hücresel lipid alımını ölçmek için bir in vitro testi detaylandırır. Bu yöntem verimlidir ve diğer hücre tiplerine uyarlanabilir ve lipid metabolizmasını incelemek için yararlı bir yaklaşım sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotel hücreleri (EC'ler), kan dolaşımından metabolik dokulara yağ asidi (FA) taşınmasını düzenlemede merkezi bir rol oynar, ancak EC FA alımını güvenilir, ölçeklenebilir bir şekilde ölçmek için araçlar sınırlı kalmaktadır. Burada, 96 oyuklu plaka formatında zincir uzunluğuna özgü alım dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanıyan floresan FA analogları (BODIPY-C12 ve BODIPY-C16) kullanarak EC'lerde FA alımını ölçmek için hızlı, kantitatif ve uygun maliyetli bir test sunuyoruz. Protokol, pozitif (3-hidroksiizobutirat, laktat) ve negatif (niklosamid) kontrolleri içerir ve hem birincil (HUVEC'ler) hem de ölümsüzleştirilmiş (EA.hy926) EC hatlarında doğrulanmıştır. Tahlil, zamana ve doza bağlı FA alımını tespit eder, sonuçlar Hoechst nükleer boyama kullanılarak hücre numarasına normalleştirilir ve uygun kontroller kullanılarak arka plan için düzeltilir. Canlı hücre görüntüleme ve nabız takip formatları dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine, görüntüleme modalitelerine ve deneysel koşullara uyarlanabilir. Geleneksel lipid boyama veya radyoaktif işaretli izleyicilerle karşılaştırıldığında, bu yöntem canlı hücrelerde dinamik FA alımını yakalarken gelişmiş güvenlik, hız ve çok yönlülük sunar. Bu test, endotelyal lipid taşınmasının düzenlenmesini ve metabolik hastalığa katkısını incelemek için sağlam bir platform sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipitler gibi kan yoluyla bulaşan besinlerin iskelet kası gibi metabolik dokuya girebilmesi için önce kılcal kan damarlarının duvarlarını oluşturan endotel hücresi (EC) bariyerini geçmeleri gerekir. Uzun zamandır yağ asitlerinin (FA'lar) altta yatan dokuya ulaşmak için bu bariyer boyunca basitçe yayıldığına inanılırken, ortaya çıkan kanıtlar, EC'lerin hidrofobik molekülleri sulu hücre dışı ve hücre içi dünyalar boyunca hareket ettirmek için evrimleşen özel taşıma mekanizmaları aracılığıyla bu süreci aktif olarak düzenlediğini göstermektedir1.

Kan dolaşımında, FA'lar ya albümine bağlı serbest yağ asitleri (FFA'lar) olarak bulunur ya da şilomikronlar ve çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL'ler) gibi trigliserit açısından zengin lipoproteinler (TRL'ler) içinde paketlenir2. EC'lerin luminal yüzeyinde, lipoprotein lipaz (LPL), alım için FFA'ları serbest bırakmak üzere TRL'leri hidrolize eder. FA'nın hücreye gerçek alımını gerçekleştiren CD36 dahil olmak üzere FA taşınmasında çeşitli proteinler yer alır; vektörel taşımaya aracılık eden yağ asidi taşıma proteinleri (FATP'ler) ve asil-CoA sentetazları (ACSL'ler); lipofilik şaperonlar olarak işlev gören yağ bağlayıcı proteinler (FABP'ler) ve sayısız diğerleri, bazıları henüz keşfedilmemiş ve kategorize edilmemiştir 2,3. Altta yatan doku, taşınan yağı almak için benzer mekanizmalar kullanır, ancak mevcut spesifik izoformlar genellikle hücre tipine göre farklılık gösterir.

Son çalışmalar, EC'lerin hedef dokulara FA taşınmasını modüle etmek için parakrin sinyalleme yoluyla komşu hücrelerle koordineli olduğunu göstermiştir. Örneğin, iskelet miyositleri, yakındaki endotel 4,5,6 ile FA taşınmasını teşvik etmek için 3-hidroksiizobutirat (3-HIB), vasküler endotelyal büyüme faktörü B (VEGFB) ve apelin gibi bir dizi parakrin faktör salgılar. İlginç bir şekilde, insülinin adipositleri laktat salgılaması için uyarması durumunda olduğu gibi, endokrin sistem de dahil olabilir, bu da EC'leri FA7'leri almaya teşvik eder.

Bu nedenle EC'ler, kardiyovasküler hastalık veya tip 2 diyabet gibi lipid metabolik bozukluklarında önemli bir rol oynadıklarını düşündüren modülatör yağ bekçileri olarak işlev görür. Son kanıtlar, EC'lerin kendilerinin aşırı yağ yüküne yanıt olarak lipid damlacıkları (LD'ler) biriktireceğini ve potansiyel olarak altta yatan dokulara yağ asidi iletimini düzenleyen bir tampon görevi göreceğinigöstermiştir 8,9. Modern diyetlerde olduğu gibi yüksek yağ tüketimi durumunda, bu LD'lerin aşırı birikimi vasküler disfonksiyona ve hipertansiyon dahil hastalıklara katkıda bulunabilir10. Toplamda, EC'lerin FA'ları nasıl ele aldığına ve taşıdığına dair daha iyi bir anlayış, lipid kaynaklı hastalıkları ele almak için bize yeni terapötik kulplar sağlayabilir.

Bu çalışmada, floresan uzun zincirli FA analogları BODIPY-C12 ve BODIPY-C16 kullanılarak endotelyal FA tutulumunu ölçmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir test tanımlanmıştır. Bu reaktifler, özellikle geleneksel olarak hücresel yağ alımını ölçmek için kullanılan radyoaktif veya ağır izotop etiketli FA'larla karşılaştırıldığında oldukça ucuz ve oldukça güvenlidir11,12. Bu reaktiflerin, hücrenin hidrofobik bölgelerinde, özellikle LD'lerde13'te pasif olarak biriken konjuge olmayan "serbest" BODIPY boyasından farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Buna karşılık, BODIPY'yi bir alifatik FA zincirine (örneğin, C12 veya C16) konjuge etmek, yapısal olarak doğal uzun zincirli FA'ları taklit eden bir molekül üretir. Bu modifikasyon, hücre içi lipid depolamasını veya damlacık oluşumunu yansıtmak yerine, hücrelere dinamik yağ asidi alımının spesifik olarak ölçülmesine izin verir.

Bu yaklaşımın önemli bir gücü esnekliğidir. Araştırmacılar, zincir uzunluğuna bağlı alımı ve hatta cis-parinarik yağ asidi14 gibi doğal floresan lipitleri incelemek için diğer hücre tiplerini, değişken inkübasyon sürelerini ve bir dizi BODIPY konjuge FA analogunu kullanabilirler. Genel olarak, bu protokol araştırmacılara birden fazla koşul altında hücresel FA alımını test etmek için kolay bir yol sağlayacak ve lipid metabolizması, endotel biyolojisi ve metabolik hastalıklardaki temel soruları yanıtlamanın yolunu açacaktır (Şekil 1).

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm insan kaynaklı endotel hücreleri (HUVEC'ler), insan biyolojik materyallerinin etik kullanımı için kurumsal ve satıcı yönergelerine uygun olarak ticari olarak temin edilebilir, tanımlanmamış kaynaklardan elde edilmiştir. Tüm adımları steril bir ortamda, laminer akış başlığı altında gerçekleştirin. Tüm reaktiflerin ve ekipmanların listesi için Malzeme Tablosuna bakın.

1. 96 oyuklu plakanın jelatin kaplaması

  1. 25 mL %2 jelatin stoğunu 500 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyrelterek %0.1'lik bir jelatin çözeltisi hazırlayın.
  2. İyice karıştırın ve 0,2 μm vakum filtresi (veya otoklav) kullanarak filtreyle sterilize edin.
  3. Siyah, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakaya% 0.1 jelatinin oyuğu başına 100 μL ekleyin.
  4. 37 °C'de en az 30 dakika veya ideal olarak gece boyunca inkübe edin.

2. Hücre tohumlama

  1. Komple ortamda EC'lerin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın.
    1. Uygun bazal ortamı %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin / streptomisin (her ikisi için de v / v) ile destekleyerek tam ortam hazırlayın.
      NOT: Bazal ortam, belirli hücre tipine göre farklılık gösterecektir; Bu çalışmada, HUVEC'ler ve EA.hy926 hücreleri için sırasıyla endotelyal büyüme ortamı (EGM-2) ve Dulbecco'nun modifiye Eagle's Medium (DMEM) kullanıldı.
  2. 100 μL hücre süspansiyonunu, hücrelerin ertesi gün birleşmesine izin veren bir tohumlama yoğunluğunda her bir oyuğa pipetleyin.

3. Tedavi reaktifi hazırlama ve uygulama

  1. Tüm reaktifleri iki değerlikli PBS'de (Ca2+ ve Mg2+ ile) hazırlayın ve 37 ° C'ye önceden ısıtın.
    1. 3-HIB'yi (pozitif kontrol) 20 mM'lik bir çalışma çözümü olarak hazırlayın. Stok çözeltisini 1 M'de çift damıtılmış suda çözün ve 4 °C'de saklayın.
    2. Laktatı (pozitif kontrol) 20 mM'lik bir çalışma çözeltisi olarak hazırlayın. Stok çözeltisini 1 M'de çift damıtılmış suda çözün ve 4 °C'de saklayın.
    3. 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda niklosamid (negatif kontrol) hazırlayın. Stok çözeltisini DMSO'da 10 mM'de çözün. Donma-çözülme döngüsünü önlemek için daha küçük hacimlere ayırın ve -20 ° C'de saklayın.
  2. Hücreleri önceden ısıtılmış iki değerlikli PBS ile bir kez yıkayın.
  3. Uygun tedavi reaktifinin (3-HIB, laktat veya niklosamid) kuyucuğuna 50 μL ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika (niklosamid için) veya 60 dakika (3-HIB ve laktat için) inkübe edin.

4. BODIPY-FA: BSA kompleksinin hazırlanması ve uygulanması

  1. PBS'de 0.5 μM, 1 μM veya 2 μM nihai konsantrasyonlarda 2: 1 FA: BSA molar oranı kullanarak BODIPY-FA: BSA komplekslerini hazırlayın. 2 μM BODIPY-FA çözeltisi için, PBS'de 1 μM FA içermeyen BSA ile inkübe edin. 1 μM BODIPY-FA için 0,5 μM BSA kullanın ve bu şekilde devam edin. İnkübasyon sırasında kompleksleri daima ışıktan koruyun.
  2. Kullanmadan önce karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  3. Muamele edilmiş kuyucuklara 50 μL kompleks ekleyin.
    NOT: Kenar efektlerini önlemek için yalnızca ortadaki 10 sütunu kullanın. Dış sütunları otofloresan kontrolleri olarak ayırın ve bu kuyucuklara yalnızca PBS ekleyin.
  4. Plakayı 37 °C'de 1 dakika, 5 dakika veya 10 dakika inkübe edin.

5. Floresan söndürme ve hücre içi sinyal algılama

  1. PBS'de yıkama tamponu olarak 1 μM FA içermeyen BSA hazırlayın ve 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
  2. BODIPY-FA: BSA'yı çıkarın ve tüm plakayı PBS'de 50 μL önceden ısıtılmış 1 μM FA içermeyen BSA ile iki kez yıkayın. Her yıkamayı 1,5 dakika boyunca gerçekleştirin.
  3. Hücre dışı floresansı söndürmek için 50 μL %0.08 Tripan Mavisi ekleyin.
  4. Aşağıdaki ayarlara sahip bir mikroplaka okuyucu kullanarak hücre içi floresansı hemen ölçün: Uyarma: 488 nm, Emisyon: 515 nm, Kesme: 495 nm, Mod: Alttan okuma.
    NOT: Adım 4'te BODIPY-FA ile muamele edilmemiş hücreleri içeren dış kolon kuyucuklarını kullanarak otofloresan arka planını çıkarın.

6. Hücre normalizasyonu için Hoechst nükleer boyama

  1. Trypan Blue solüsyonunu çıkarın ve PBS ile nazikçe yıkayın.
    NOT: Hücreler biraz kırılgan olabilir ve dökülmeye eğilimli olabilir. Yıkarken dikkatli olun.
  2. %10 besiyerine 4 μg/mL Hoechst ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Hoechst inkübasyon süresi optimizasyon gerektirebilir. Hücre tipine bağlı olarak, tek tip nükleer etiketleme ve yeterli sinyal yoğunluğu elde etmek için 5 dakika ila 60 dakika gerekebilir. Hoechst'i dış sütunlara eklemeyin.
  3. Plakayı PBS ile bir kez yıkayın.
  4. Yeni PBS ekleyin ve aşağıdaki ayarları kullanarak Hoechst floresansını ölçün: Uyarma: 350 nm, Emisyon: 461 nm, Kesme: 455 nm, Mod: Alttan okuma.
    NOT: Dış sütun kuyularını kullanarak Hoechst otofloresan arka planını çıkarın.
  5. Adım 5.3'teki otofloresan düzeltmeli değerleri adım 6.4'te elde edilen karşılık gelen Hoechst değerlerine bölerek BODIPY-FA floresansını hücre numarasına normalleştirin. Hem BODIPY hem de Hoechst sinyalleri için arka plan düzeltmeli değerler kullanın.
    NOT: Nihai değerler, hem BODIPY hem de Hoechst kanallarında otofloresan için düzeltilmiş, hücre numarasına normalleştirilmiş BODIPY-FA alımını temsil eder.

7. İstatistiksel analiz

  1. Zaman, konsantrasyon ve bunların etkileşimlerinin etkilerini değerlendirmek için iki yönlü ANOVA kullanarak Şekil 2 için istatistiksel analiz yapın. Çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post hoc testini uygulayın.
  2. Şekil 3 ve Şekil 4 için, iki koşulu karşılaştırırken Student'ın eşleşmemiş iki kuyruklu t-testini kullanın. Üç veya daha fazla koşul içeren deneyler için, tek yönlü ANOVA ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Dunnett'in testini kullanın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1'de gösterildiği gibi, bu tahlil, EC'lerin doğrudan kuyucuklara ekildiği 96 oyuklu bir plaka formatı kullanır. BODIPY işaretli FA'lar sığır serum albüminine (BSA) konjuge edilir ve hem deneysel hem de kontrol kuyucuklarına uygulanır. FA tedavisinden önce, EC'ler farmakolojik tedaviler veya siRNA transfeksiyonu veya CRISPR gen düzenlemesi gibi genetik bozulmalar yoluyla manipüle edilebilir. En önemlisi, bu tür manipülasyonlar, tahlil güvenilirliğini sağlamak için uygun pozitif ve negatif kontrollerin dahil edilmesine de izin verir.

BODIPY-C 12'nin hem HUVEC'lerde hem deEA.hy926 hücrelerinde 1 dakika, 5 dakika ve 10 dakika boyunca 0.5 μM, 1 μM ve 2 μM'de inkübe edilmesinden sonra hücre içi BODIPY-C12 sinyalinde net bir doz ve zamana bağlı artış gözlenmiştir (Şekil 2). Kuyucuk başına hücre sayısındaki potansiyel değişiklikleri hesaba katmak için, BODIPY-C12 değerleri Hoechst nükleer boyamasına normalize edildi ve floresan olarak ölçüldü. Arka plan otofloresansı, BODIPY ve Hoechst kontrol kuyuları kullanılmadan düzeltildi.

Tahlil tekrarlanabilirliğini ve aralığını doğrulamak için, yağ asidi metabolizmasının bilinen modülatörleri, BODIPY-C12 kullanılarak EA.hy926 EC'lerde test edilmiştir (Şekil 3). Artan laktat konsantrasyonları (0 mM, 5 mM, 20 mM) veya 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) ile 1-h tedavisi, doza bağlı bir şekilde BODIPY-C12 alımını arttırdı ve FA alımının pozitif düzenleyicileri olarak rollerini doğruladı. Tersine, kimyasal niklosamidin mitokondriyal ayrılma15 yoluyla yağ asidi alımını inhibe edebileceği daha önce gösterilmiştir. Gerçekten de, niklosamid (1 μM) ile 30 dakikalık tedavi, araç kontrolüne göre BODIPY-C12 sinyalini önemli ölçüde azalttığından, negatif bir kontrol olarak faydasını doğruladığından, burada da benzer sonuçlar elde edildi. Bu veriler, hücre sayısındaki herhangi bir farklılığı hesaba katmak için Hoechst'e normalleştirilirken, bu tedavilerin hiçbiri hücre canlılığını veya Hoechst floresan değerlerini değiştirmedi.

Testin farklı yağ asidi analoglarına uyarlanabilirliğini değerlendirmek için, çok uzun zincirli bir yağ asidi için bir vekil olarak kabul edilebilecek BODIPY-C16, HUVEC'lere verildi ve 5 dakikalık inkübasyonların ardından alımı ölçüldü (Şekil 4). Laktat tedavisinin (0 mM, 10 mM, 20 mM) BODIPY-C16 sinyalini doza bağımlı bir şekilde arttırdığı, niklosamidin (1 μM) ise sinyali azalttığı, BODIPY-C12 ile sonuçları yansıttığı gözlendi.

Sonuç olarak, bu test hem birincil (HUVEC) hem de ölümsüzleştirilmiş (EA.hy926) EC'lerde FA alımının sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlamıştır. Ayrıca, bu bulgular, hem pozitif hem de negatif kontrollerin geçerliliğini göstermenin yanı sıra, farklı zincir uzunluklarına sahip FA'lar arasında testin çok yönlülüğünü göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: BODIPY etiketli yağ asitleri kullanılarak yapılan yağ asidi alım testinin şeması. Endotel hücreleri siyah, şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakaya ekilir ve hücre içi alımı sağlamak için BODIPY konjuge yağ asidi (FA) analogları ile inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, hücre dışı floresan Tripan Mavisi ile söndürülür ve hücre içi sinyal, alttan okunan bir floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülür. Hoechst nükleer boyası, normalizasyon için hücre sayısını ölçmek için floresan ölçümünden sonra uygulanır. BODIPY-FA inkübasyonu öncesinde farmakolojik tedavi veya genetik bozukluklar uygulanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Primer ve ölümsüzleştirilmiş endotel hücrelerinde BODIPY-C12 tutulumunun miktar tayini. (A) 0.5 μM, 1 μM ve 2 μM'de 1 dakika, 5 dakika ve 10 dakikalık inkübasyonları takiben HUVEC'lerde BODIPY-C12 alımında zamana ve konsantrasyona bağlı artış BODIPY-C12 sırasıyla 0.25 μM, 0.5 μM ve 1 μM FA içermeyen BSA'ya komplekslenmiştir. (B) EA.hy926 hücreleri, aynı koşullar altında benzer zaman ve doza bağlı BODIPY-C12 alımı sergiledi. Ortalama floresan yoğunluğu Hoechst ile boyanmış çekirdeklere (hücre sayısı) ve BODIPY olmayan kontrollere normalize edildi. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir. İstatistiksel analiz, zaman, konsantrasyon ve etkileşimlerinin etkilerini değerlendirmek için iki yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post hoc testi yapıldı. Zaman (p < 0.0001), konsantrasyon (p < 0.0001) ve bunların etkileşimi (p = 0.0443) için anlamlı ana etkiler gözlendi. Tukey'in testi ile tanımlanan istatistiksel olarak anlamlı ikili karşılaştırmalar çubuk grafikte şu şekilde belirtilmiştir: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: EA.hy926'da pozitif ve negatif kontroller kullanılarak testin doğrulanması. (A) 1 saatlik laktat tedavisi (0 mM, 5 mM, 20 mM) doza bağlı bir şekilde BODIPY-C12 alımını arttırdı. (B) 1-h 3-HIB tedavisi (0 mM, 5 mM, 20 mM) benzer şekilde FA alımını arttırdı. (C) 30 dakikalık Niclosamide tedavisi (1 μM), araç kontrolüne (DMSO) göre BODIPY-C12 alımını önemli ölçüde baskıladı. Ortalama floresan yoğunluğu Hoechst ile boyanmış çekirdeklere (hücre sayısı) ve BODIPY olmayan kontrollere normalize edildi. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir. 2 μM BODIPY-C12 (1 μM yağ asidi içermeyen BSA'ya kompleks haline getirilmiş) tüm deneyler için 5 dakika inkübe edildi. (A) ve (B) için istatistikler tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve çoklu karşılaştırmalar için Dunnett testi, C için ise Student eşleşmemiş iki kuyruklu T testi kullanılarak belirlendi. p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: HUVEC'lerde BODIPY-C16 kullanılarak tahlil validasyonu. (A) Laktat tedavisi (1 saat boyunca 0 mM, 10 mM, 20 mM) doza bağlı bir şekilde BODIPY-C16 alımını arttırdı. (B) Niklosamid işlemi (1 saat boyunca 1 μM), araçla tedavi edilen kontrole kıyasla BODIPY-C16 sinyalini önemli ölçüde azaltmıştır. Ortalama floresan yoğunluğu Hoechst ile boyanmış çekirdeklere (hücre sayısı) ve BODIPY olmayan kontrollere normalize edildi. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir. 2 μM BODIPY-C16 (1 μM yağ asidi içermeyen BSA'ya kompleks haline getirilmiş) tüm deneyler için 5 dakika inkübe edildi. (A) için istatistikler çoklu karşılaştırmalar için Dunnett testi ile tek yönlü varyans analizi ve B için Student eşleşmemiş iki kuyruklu T testi kullanılarak belirlendi. *p < 0.05, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu test, 96 oyuklu plaka bazlı format ve floresan uzun zincirli FA analogları kullanarak EC'lerde FA alımını ölçmek için hızlı, kantitatif ve uygun maliyetli bir yöntem sunar. Hem pozitif hem de negatif kontrolleri bir araya getirerek ve birincil (HUVEC'ler) ve ölümsüzleştirilmiş (EA.hy926) EC'ler arasında doğrulama yaparak, bu protokol sağlamlık, tekrarlanabilirlik ve geniş uygulanabilirlik gösterir.

Floresan bazlı analizler, daha önce belirtildiği gibi, endotelyal lipid taşınmasının parakrin düzenleyicilerini ortaya çıkarmada etkili olmuştur 4,5,7. Bu örnekler, standartlaştırılmış bir sistemin, kontrollü bir in vitro ortamda lipid taşınmasının metabolit güdümlü regülasyonunu güvenilir bir şekilde aydınlatmaya nasıl devam edebileceğini vurgulamaktadır. Burada açıklanan protokol, BODIPY-C12 ve BODIPY-C16'nın çoklu konsantrasyonlarda (0.5-2 μM) ve inkübasyon sürelerinde (1 dakika, 5 dakika ve 10 dakika) kullanımı dahil olmak üzere güvenilir FA alım ölçümleri için temel parametreleri belirler. Ayrıca, 3-HIB ve laktata yanıt olarak artan alımı ve niklosamid ile tedaviyi takiben alımın azaldığını etkili bir şekilde tespit etti ve hem duyarlılığını hem de dinamik aralığını doğruladı. Burada EC'ler için optimize edilmiş olsa da, bu test BODIPY: BSA oranları ve tedavi koşullarında yapılan ayarlamalarla adipositler, miyotüpler veya hepatositler gibi diğer hücre tiplerine kolayca uyarlanabilir. Ayrıca, uyumlu plakalar kullanılarak canlı hücre görüntüleme için modifiye edilebilir veya hücre içi FA tutulmasını, metabolizmasını veya akışını değerlendirmek için bir nabız takip formatına uyarlanabilir.

Diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu yöntem belirgin avantajlar sunar: ölçeklenebilir, niceliksel ve çeşitli FA zincir uzunluklarına uyarlanabilir. Ek olarak, uygun maliyetlidir, yalnızca birkaç adım içerir ve ortak bir mikroplaka okuyucudan daha karmaşık olmayan aletler gerektirir, bu da öğrenciler de dahil olmak üzere yeni kullanıcıların bu protokolde hızlı bir şekilde ustalaşmasına olanak tanır. Son olarak, kalitatif mikroskopi tabanlı yöntemlerin veya kümülatif lipid içeriğini yansıtan Oil Red O gibi son nokta lekelerinin aksine, bu protokol fiksasyon veya lizis gerektirmeden gerçek zamanlı FA alımını yakalar.

Bununla birlikte, birkaç sınırlamaya dikkat edilmelidir. 2D statik kültür sisteminin kullanılması, vasküler ortamın fizyolojik karmaşıklığını tam olarak özetlemez. Kayma gerilimi veya LPL aracılı lipoliz gibi temel faktörlerin yanı sıra endotelyal-parankimal etkileşimler bu basitleştirilmiş modelde yoktur. Mikroakışkan veya organoid tabanlı 3D ko-kültürler gibi gelişmiş sistemler, daha fazla teknik uzmanlık ve altyapı gerektirmelerine rağmen, in vivo mimariyi ve sinyalizasyonu daha iyi taklit eder16,17. Örneğin, mikroakışkan Biyoreaktörler, EC'lerin mikrovasküler sistem oluşumunu taklit edebileceği ve diğer doku tipleriyle etkileşime girebileceği bir ortam sağlayarak, araştırmacıların parakrin dinamiklerini daha fizyolojik bir ortamda modellemelerine olanak tanır18. Ayrıca, son çalışmalar, 3D hidrojel kültürlerinde canlı floresan görüntüleme yapmak için özel sistemlerin geliştirilebileceğini göstermiştir19. Bu tür ilerlemeler, bu tahlilin bir gün fizyolojik olarak daha temsili olan hücre kültürü sistemlerine uyarlanabileceğine dair güven sağlar, ancak optimizasyonun yapılması gerekecektir.

Özetle, bu tahlil, çeşitli koşullar altında hücresel FA alımını araştırmak için esnek, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir platformu temsil eder. Mekanistik in vitro çalışmalar için en uygun olsa da, bu sistemden elde edilen bilgiler, endotelyal lipid taşınmasının fizyolojik olarak daha ilgili modellerini kullanarak gelecekteki çalışmaları bilgilendirebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanisha Choudhury, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi Lisans Araştırma Ofisi'nden bir Yaz Lisans Araştırma Bursu tarafından finanse edildi. Boa Kim, NHLBI (R56HL162660) ve AHA (24CDA1264317) tarafından desteklendi. Ayon İbrahim, Union College Fakülte Araştırma Fonu tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-Hidroksiizobutirat (3-HIB)Cayman Chemicals26105Pozitif kontrol, 5 veya 20 mM nihai konsantrasyon
96 kuyuyla siyah, şeffaf tabanlı polistiren mikroplakaSigma-AldrichCLS3603-48EAKaplama hücrelerinin analiz edilmesi için
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3822Yeşil floresan uzun zincirli yağ asidi
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3821Yeşil floresan çok uzun zincirli yağ asidi
Sığır Serumu Albümin ÇözeltisiSigma-AldrichA9205-50MLBodipy:BSA kompleksini hazırlamak için kullanıldı
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650İlaç stokları için çözücü
Tek Kullanımlık Pipetleme RezervuarlarıVWR89094-680Hücrelere pipetlenecek çeşitli çözeltileri içerir
Dulbecco' ' Modifiye Kartal' s MediumCorning Yaşam Bilimleri10-013-CVEA.hy926 hücreleri için medya
EA.hy926 hücreleriATCCCRL-2922 Ölümsüzleştirilmiş endotel hücre hibrit hattı
EGM-2 Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 BulletKitLonzaCC-3162HUVEC'ler için medya
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR97068-085EGM-2 ve DMEM'de %10 takviye
Floresans mikroplaka okuyucuÇeşitliYokFloresan ölçümleri yapabilen herhangi bir mikroplaka okuyucu
Jelatin çözeltisiSigma-AldrichG1393-100mlPlakaları %0,1 çalışma konsantrasyonuyla kaplamak için kullanılır
Hoechst 33342 ÇözümüYaşam Bilimleri62249Hücre normalizasyonu için nükleer boyama (4 μ M)
İnsan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC)LonzaC2519ABirincil insan endotel hücreleri
Çok Kanallı PipetVWR76627-76896 kuyruklu bir plakaya pipetleme için
Niclosamide Millipore SigmaN3510-50GNegatif kontrol, 1 μ M  Son yoğunlaştırma
PBS, kalsiyum ve magnezyum ile birlikteFisher Scientific21031CVTedaviler hazırlamak ve yıkama tamponu olarak (BSA ile) kullanılır
PBS, kalsiyum ve magnezyum olmadanGenesee Scientific25-508Jelatin seyreltme, Hoechst boyama ve genel yıkamalar için
Penisilin/StreptomisinThermo Fisher Scientific15140122EGM-2 ve DMEM'de %1 takviye
Sodyum L-laktatSigma-AldrichL7022-5GPozitif kontrol, 5 veya 20 mM nihai konsantrasyon
Trypan Blue çözeltisiSigma-AldrichT8154-20ML%0,08 oranında hücre dışı floresansı söndürmek için kullanılır
Vakum Filtre Sistemleri, 500ml PES Membran, 0.45µ mGenClone25-227Jelatin çözeltisini sterilize etmek için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).
  2. He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).
  3. Mashek, D. G., Coleman, R. A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Curr Opin Lipidol. 17 (3), 274-278 (2006).
  4. Jang, C., et al. A branched-chain amino acid metabolite drives vascular fatty acid transport and causes insulin resistance. Nat Med. 22 (4), 421-426 (2016).
  5. Hagberg, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor B controls endothelial fatty acid uptake. Nature. 464 (7290), 917-921 (2010).
  6. Hwangbo, C., et al. Endothelial APLNR regulates tissue fatty acid uptake and is essential for apelin's glucose-lowering effects. Sci Transl Med. 9 (407), eaad4000(2017).
  7. Ibrahim, A., et al. Insulin-stimulated adipocytes secrete lactate to promote endothelial fatty acid uptake and transport. J Cell Sci. 135 (5), jcs258964(2022).
  8. Kuo, A., Lee, M. Y., Sessa, W. C. Lipid droplet biogenesis and function in the endothelium. Circ Res. 120 (8), 1289-1297 (2017).
  9. Ibrahim, A., Arany, Z. Does endothelium buffer fat. Circ Res. 120 (8), 1219-1221 (2017).
  10. Kim, B., et al. Endothelial lipid droplets suppress eNOS to link high-fat consumption to blood pressure elevation. J Clin Invest. 133 (24), e173160(2023).
  11. Dubikovskaya, E., Chudnovskiy, R., Karateev, G., Park, H. M., Stahl, A. Measurement of long-chain fatty acid uptake into adipocytes. Methods Enzymol. 538, 107-134 (2014).
  12. Watkins, O. C., et al. Metabolism of 13C-labeled fatty acids in term human placental explants by liquid chromatography-mass spectrometry. Endocrinology. 160 (6), 1394-1408 (2019).
  13. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. J Biomed Biotechnol. 2011, 598358(2011).
  14. Fraser, H., et al. Fatty acid uptake in diabetic rat adipocytes. Mol Cell Biochem. 167 (1-2), 51-60 (1997).
  15. Ibrahim, A., Yucel, N., Kim, B., Arany, Z. Local mitochondrial ATP production regulates endothelial fatty acid uptake and transport. Cell Metab. 32 (2), 309-319.e7 (2020).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Opin Biotechnol. 25, 95-102 (2014).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  18. Maiullari, F., et al. Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB). Biomaterials. 323, 123441(2025).
  19. Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue. Small. , e2501834(2025).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BODIPY Fatty AcidEndothelial CellsFatty Acid Transport96 Well Plate AssayHoechst Nuclear StainingLive Cell ImagingDose Dependent UptakeMetabolic Disease

İlgili makaleler