Büyük Ölçekli Veri Kümelerinin Kullanıcı Dostu ve Güçlü Bir R Analizi

Bilimsel alanda büyük veri kümelerinin kullanılabilirliğinin artmasıyla birlikte, araştırmacıların bu büyük veri kümelerini doğru ve kolay bir şekilde hızlı bir şekilde analiz etmelerine olanak tanıyan kullanıcı dostu araçlar geliştirmek önemlidir. Yaygın büyük veri setinin bir türü, canlı hücrelerde ve organizmalarda gen ekspresyonunun kolay, sürekli ve invaziv olmayan bir incelemesine izin veren lusiferaz geninin bir raportör olarak kullanılmasından gelir. Lüminesans kaydındaki otomasyon, lusiferaz lüminesansının ölçümünü dönüştürdü ve özellikle sirkadiyen saat alanı ^1,2'de veri toplamanın genişlemesine yol açtı. 96 oyuklu mikroplakalar ve istifleyicili otomatik bir plaka okuyucu kullanılarak, lusiferaz genini eksprese eden binlerce örnek, tek bir deneyde, bazen günlerce bir saatlik aralıklarla zaman serilerinde ayrı ayrı test edilebilir. Bu tür yüksek verimli deneyler, elle numune toplama ve ardından RNA işlemeyi kullanan geleneksel gen ekspresyonu deneylerinin muhtemelen başaramayacağı büyük veri kümelerinin üretilmesiyle sonuçlandı. Bu kadar büyük veri kümelerini zamanında analiz etmek önemlidir ancak zor olabilir.

Ritmiklik için verileri analiz etmek için çok sayıda araç olmasına rağmen, araçların çoğu, lüminesans raportör ifadesi ^3,4,5,6,7 yerine hayvan davranışına dayalı tahlilleri analiz eder (Ek Tablo S1). Bazı araçlar, araştırmacıların Python becerileri veya MATLAB'a erişim gibi önceden bilgisayar programlama becerilerine sahip olmasını gerektirir. Diğer araçlar, maliyetli olabilen yazılım satın alınmasını gerektirir. Bazı ücretsiz uygulanabilir çözümler çevrimiçi olarak mevcuttur. Böyle bir araç, ritmiklik verilerini analiz etmek için çeşitli farklı yöntemler sunan BioDare2^8'dir. BioDare2, kullanıcı dostu bir çevrimiçi araçtır ve minimum hesaplama uzmanlığı gerektirir. Kullanıcıların daha fazla işlem için veri girişini çevrimiçi olarak yüklemeleri ve veri çıkışını çevrimiçi arayüzden indirmeleri gerekir.

Burada, büyük ölçekli veri kümelerini kolaylıkla analiz etmek için birden fazla yeteneğe sahip, kullanıcı dostu R komut dosyaları sunuyoruz. Komut dosyalarını çalıştırmak için R ve Python için bir arayüz olan ücretsiz, açık kaynaklı RStudio⁹ yazılımını kullanıyoruz. RStudio, Windows, Mac ve Linux dahil olmak üzere çeşitli bilgisayar sistemlerinde kullanılabilir. Bu raporda, özellikle protokol bölümleri 1 ve 2'de kullanıcılara R komut dosyalarının nasıl kullanılacağı konusunda rehberlik etmek için ayrıntılı adım adım talimatlar verilmektedir. Bu yöntem, kullanıcıdan minimum düzeyde girdi gerektirir. Önceden R bilgisine sahip olmayan ve programlama deneyimi olmayan yeni başlayan bir kişi, lusiferaz tahlillerinden veya zaman serisi verileriyle diğer veri kümelerinden büyük veri kümelerini analiz etmek için yöntemi kullanabilecektir. Tüm giriş ve çıkış verileri yerel bir bilgisayarda saklanır ve bu nedenle, ilgili tüm R paketleri ilk kez indirildikten sonra, internet erişimi kısıtlaması olmadan her yerde bir analiz yapılabilir. Çıktı verileri, yayınlar için işlenmeye hazır sonuçlarla birlikte iyi organize edilmiş klasörler halinde sıralanır. Örnekler arasındaki farklılıkların hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için çıktının bir parçası olarak istatistiksel analizler de dahil edilmiştir. Böylece R yöntemi, araştırmacılara büyük veri kümelerini analiz etmede kolay ve güçlü bir çözüm sağlayabilir.

1. Luciferase tabanlı sirkadiyen saat analizi

1. Lusiferaz testi için deney düzeneği
   NOT: Lusiferaz testi, sirkadiyen saat aktivitesini gerçek zamanlı olarak ölçmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Canlı transgenik organizmalar ve/veya hücreler tarafından taşınan lusiferaz raportöründen yayılan lüminesans, otomatik olarak kaydedilebilir ve bu da büyük ölçekli zaman serisi veri kümelerinin üretilmesine yol açar. Laboratuvarımızda öncelikle lusiferaz genini eksprese eden Arabidopsis thaliana fideleri raportör olarak kullanılmaktadır. Şekil 1 ve Şekil 2, laboratuvarımızda 96 oyuklu bir formatta fidelerle lusiferaz tahlili için tipik deney düzeneğinin bir akış şemasını göstermektedir ve önceki bir açıklama^2'ye göre değiştirilmiştir.
   1. Tohumları, bir beherde 3 saat boyunca 100 mL ev tipi ağartıcıya 3 mL %36 (a/a) HCl eklenerek oluşturulan ağartıcı buharı ile sterilize edin. Beheri, kimyasal bir davlumbaz içine yerleştirilmiş, kapalı kapaklı bir fanusa yerleştirin. Sterilizasyondan sonra, tohumları steril bir cam Pasteur pipeti kullanarak %0.5 sakaroz ve %0.8 agar (pH 5.7) içeren 1/2MS plakalara laminer akış kabininde yerleştirin. Kimyasal atıkları kapaklı bir kavanozda toplayın ve kurumsal çevre sağlığı hizmetleri departmanı ile birlikte çalışarak bertaraf edin.
   2. Plakaları 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık ışık döngüsüne (LD) sahip bir doku kültürü odasına taşımadan önce 2 gün boyunca 4 °C'ye koyun.
   3. Fidelerin LD'de 4 gün büyümesine izin verin.
   4. Fideleri 96 oyuklu bir plakaya aktarın; her kuyucuk 180 μL tahlil ortamı (1/2MS, %0.5 sakaroz, %0.4 agar, 0.25 mM lusiferin) içerir. Plakaları 1 gün boyunca LD'ye, ardından 1 gün boyunca 24 saat sabit ışıkta (LL) yerleştirin.
   5. Kuyucuklara tedaviler veya sahte çözelti ekleyin ve lüminesansı 5-7 gün boyunca 1 saat aralıklarla LL'de kaydedin. Emisyon filtresi merceğini kazanç için 3.600'e ve ölçüm aralığı süresini 1 s'ye ayarlayın.
      NOT: Kayıt için başlangıç zamanı herhangi bir zamanda olabilir. Ancak, R betiği yalnızca tam sayıları (tam sayıları) aldığından, kayıt aralıkları bir tam sayı olmalıdır. Örneğin, 1 saatlik bir aralığa izin verilir, ancak R betiği için 15 dakikalık bir aralığa izin verilmez.
   6. Kaydın sonunda, fide büyümesini kaydetmek için plakanın fotoğrafını çekin.
   7. Plaka okuyucu için veri analiz yazılımıyla birlikte farklı kaydet işlevini kullanarak ham verileri R analizi için CSV dosyası olarak kaydedin.
2. Lusiferaz bazlı sirkadiyen verilerin R analizinin aşamalı açıklaması
   NOT: Bu R analizi, R betiğini kullanırEk Dosya 1(LUC_2025.R), sirkadiyen veri analizi için geliştirilmiştir ve giriş dosyasıEk Dosya 2(NO7.csv). R betiği, girdi dosyasıyla birlikte çevrimiçi depo platformu Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis) aracılığıyla herkese açıktır.
   1. Bilgisayar sistemi ^9,10 ile uyumlu RStudio yazılımını indirin.
   2. Ek Dosya 1 (LUC_2025.R) için gereken RStudio algoritmik paketlerini indirin: MetaCycle¹¹: MetaCycle paketinin ARSER algoritması¹², ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, dairesel¹⁸, AICcmodavg¹⁹ ve süpürge²⁰.
      NOT: Paketlerin listesi için R betiğinin üst kısmına da bakın.
   3. Kullanıcı Girişi I'i Değiştir (çalışma dizini, girdi dosyasının adı, tedaviler için etiketler ve testin göreli başlangıç zamanı dahil olmak üzere yerel bir bilgisayardaki belirli bir veri kümesine göre.
      NOT: Adım 1.2.1 ve 1.2.2'nin yalnızca bir kez tamamlanması gerekir; bundan sonra RStudio arayüz konsolu, her yeni analiz için değişikliklerle birlikte kullanıcı girdisi almaya hazırdır. Kullanıcı Girişi bölümünde iki bölüm vardır (Ek Şekil S1).
      1. Çalışma dizinini seçin. Giriş dosyasının nerede olduğunu belirtin. Aynı klasör çıktı dosyalarının konumu olacaktır.
      2. R betiği için doğru biçimlendirilmiş bir CSV dosyası olan giriş dosyasını seçin (Şekil 2B). Spesifik olarak, üst satırda zaman serisi bulunur ve ilk sütun 96 oyuklu bir plaka üzerinde ayrı numune konumlarını içerir.
         NOT: Böyle bir giriş CSV dosyasının bir örneği Ek Dosya 2'de (NO7.csv) bulunabilir.
      3. Numuneleri ve/veya tedavileri adlandırın. Bu analiz, bir zaman süreci ile 96 kuyucuklu ortamlardan elde edilen veriler için kullanıldığından, deneyleri plaka başına toplam 12 işleme kadar tedavi için tedavi başına 8 kopya veya plaka başına toplam 8 işlem için tedavi başına 12 kopya olarak tasarlayın. Numune numarası önemli olduğundan, 8 veya 12 olmak üzere doğru numune sayısını girdiğinizden emin olun; Örnek sayısı 8 veya 12 değilse kod çalışmaz. Bununla birlikte, boş kuyu satırları varsa, bunları tedavi adları için alanda olduğu gibi listeleyin, örneğin, boş 1, boş 2...
         NOT: Örnek adlar için, dosya adı sorunlarına neden olabileceğinden ters eğik çizgi veya benzer semboller kullanmaktan kaçınılmalıdır. Ek olarak, Kullanıcı Girişi II'de ANOVA'yı kullanmayı seçerken etiket olarak "NA" kullanmaktan da kaçınılmalıdır. Tam olarak aynı adı taşıyan tüm tedaviler, büyük bir tedavi grubunda birleştirilecektir.
      4. Test için göreceli başlangıç zamanını belirtin. 24 saatlik belirli bir gün için öznel şafak, normal bir aydınlık/karanlık döngüsü sırasında oda ışığının açılmasıdır. Örneğin, sabah 7'de ışık yanıyorsa, bu zamanı sirkadiyen saat 0 olarak düşünün. Bir lusiferaz tahlili sabah 9'da başlarsa, tahlil zamanı sirkadiyen zaman 2'dedir; Göreli başlangıç zamanı olarak 2 girin.
         NOT: Göreli başlangıç zamanı bir tam sayı olmalıdır ve negatif olamaz. Bu, numunelerin faz okumasını etkileyecektir.
   4. Kullanıcı Girişi II seçeneklerini belirli ihtiyaçlara göre değiştirin.
      NOT: Aşağıdaki talimatlar, Kullanıcı Girişi bölümlerinin daha ayrıntılı bir açıklamasını ve değişiklikleri yapmak için adım adım bir kılavuz sağlar.
      1. Grafikleri dahil edin: lüminesans eğrileri, genotip ve tedavi başına periyot, faz ve genlik için grafikler.
      2. Tedavileri periyotlarına, fazlarına ve genliklerine göre karşılaştırmak için Tukey HSD ile ANOVA testini kullanın. ANOVA test çıktısı için bir denetim seçin; ANOVA testine ilişkin kontrolü belirtin veya ikili karşılaştırmada her tedaviyi kontrol olarak kullanmak için seçeneği boş bırakın. Alternatif olarak, daha hızlı başvuru ve düzenleme için ANOVA çıkış dosyalarının numaralandırılıp numaralandırılmayacağını seçin.
      3. Tedavileri periyotlarına, fazlarına ve genliklerine göre karşılaştırmak için bir t-testi kullanın. T-testinin ikili bir karşılaştırma olup olmayacağını seçin; İkili bir t-testi seçilirse, verilerin eşleştirilip eşleştirilmediğini seçin. t-testi için bir kontrol seçin; t-testi için kontrolü belirtin veya her tedaviyi kontrol olarak kullanmak için seçeneği boş bırakın. Daha hızlı başvuru ve düzenleme için t-testi çıktı dosyalarının numaralandırılıp numaralandırılmayacağını seçin.
         NOT: Bu, yalnızca SA veya Mock eklenmiş aynı genotipin iki satırı gibi iki tedaviyi aynı anda karşılaştırmak için kullanılmalıdır. Gösterilen p değerleri, aynı çizgiyle birden fazla karşılaştırmayı hesaba katacak şekilde ayarlanmamıştır.
      4. Zaman noktalarının yuvarlanıp yuvarlanmayacağını seçin. Zaman noktaları yalnızca bir veya iki dakika farklıysa, en yakın saate yuvarlayın ve bu analizi kullanın.
         NOT: Bu kod, ARS yöntemi^12'yi kullanarak periyodu, fazı ve genliği hesaplar. Bu yöntemin çalıştırılması için saat cinsinden tutarlı bir zaman serisi gerekir.
      5. Plaka okuyucunun kuyuları nasıl kaydettiğine bağlı olarak, girişin okunma şeklini değiştirin. A1, A2, A3'e göre kuyuların standart veri listesini seçin... veya A1, B1, C1 tarafından listelenen kuyular için olanı...
   5. Konsolun sağ üst köşesindeki Kaynak düğmesine tıklayarak analizi çalıştırın.
      NOT: Analizin tamamlanması 1 dakikadan az sürer. R analizinin çıktısı, giriş veri kümesiyle aynı dosya klasöründe otomatik olarak görünecektir.
   6. Çıktıyı görüntüle: Çıktı klasöründe, her bir genotipin ve/veya tedavinin kopyaları için ortalama periyot, faz ve genliğin istatistiksel bilgileri de dahil olmak üzere kapsamlı bir analiz sağlamak için çeşitli belgeler ve alt klasörler bulunur.
      NOT: Giriş dosyası Ek Dosya 2 (NO7.csv) için, protokol bölümü 1'deki Ek Dosya 1 (LUC_2025.R) komut dosyası tarafından oluşturulan çıktı belgelerinin bir listesi Tablo 1'de açıklanmıştır ve Ek Şekil S2'deki ağaç yapısıyla rahatlıkla görüntülenebilir.

2. Luminol bazlı ROS Testi

1. ROS testi için deney düzeneği
   1. 25 günlük bitkilerin dördüncü ila yedinci yapraklarından 4 mm çapında yaprak disklerini biyopsi zımbası ile kesin.
   2. Yaprak disklerini tüylü tarafı yukarı bakacak şekilde 96 oyuklu bir plakada 100 μL steril suyun üzerinde yüzdürün.
   3. Plakayı temiz kalay folyo ile örtün ve gece boyunca bir LD büyüme odasına yerleştirin.
   4. Suyu 100 μL luminol çözeltisi ile değiştirin (pH 7.4 ile 10 mM MOPS tamponunda 300 μM ve 1 μM flg22 veya başka bir elisitor). Kontrol olarak flg22 yerine sahte çözüm kullanın.
   5. Hemen 40-60 dakika boyunca her dakika lüminesans okumalarını kaydetmeye başlayın.
2. ROS verilerinin R analizinin aşamalı açıklaması
   NOT: Bu R analizi, Rstudio'yu, R komut dosyasını,  Ek Dosya 3'ü (ROS_2025.R) ve Ek Dosya 4 (ROS_flg22.csv) veya Ek Dosya 5 (ROS_elf26.csv) giriş dosyalarını kullanır. R betiği, Ek Dosya 4 (ROS_flg22.csv) giriş dosyasıyla birlikte çevrimiçi depo platformu Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis) aracılığıyla herkese açıktır
   1. RStudio paketlerini indirin: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ ve filesstrings¹⁷.
      NOT: Adım 2.2.1'in yalnızca bir kez tamamlanması gerekir. Kullanıcıların her analizi bilgisayardaki belirli bir veri kümesine uyarlamasına yardımcı olmak için, kullanıcıların deneyleri için belirli parametreleri belirtmelerine olanak tanıyan "Kullanıcı Girişi" adlı bir bölüm oluşturuldu (Ek Şekil S3).
   2. Kullanıcı Girişi I'i, çalışma dizini, giriş dosyasının adı, tedaviler için etiketler ve testin göreli başlangıç zamanı dahil olmak üzere yerel bir bilgisayardaki belirli bir veri kümesine göre değiştirin.
      1. Çalışma dizinini seçin. Giriş dosyasının nerede olduğunu belirtin. Aynı klasör çıktı dosyalarının konumu olacaktır.
      2. R betiği için doğru biçimlendirilmiş bir CSV dosyası olan giriş dosyasını seçin (Şekil 2B). Spesifik olarak, üst satırda zaman serisi bulunur ve ilk sütun 96 oyuklu bir plaka üzerinde ayrı numune konumlarını içerir.
         NOT: Böyle bir girdi CSV dosyasının bir örneği, Ek Materyal, Ek Dosya 4 (ROS_flg22.csv) veya Ek Dosya 5'te (ROS_elf26.csv) bulunabilir.
      3. Numuneleri ve/veya tedavileri adlandırın. Bu analiz, bir zaman süreci ile 96 kuyucuklu ortamlardan elde edilen veriler için kullanıldığından, deneyleri plaka başına toplam 12 işleme kadar tedavi için tedavi başına 8 kopya veya plaka başına toplam 8 işlem için tedavi başına 12 kopya olarak tasarlayın. Boş kuyu satırları varsa, bunları tedavi adları için alanda olduğu gibi listeleyin, örneğin, boş 1, boş 2...
         NOT: Numune numarası önemli olduğundan, 8 veya 12 olmak üzere doğru numune sayısını girmek önemlidir. Örnek sayısı 8 veya 12 değilse kod çalışmaz. Örnek adlar için, dosya adı sorunlarına neden olabileceğinden ters eğik çizgi veya benzer semboller kullanmaktan kaçının. Ayrıca, Kullanıcı Girişi II'de ANOVA'yı kullanmayı seçerken etiket olarak "NA" kullanmaktan kaçının. Ek Dosya 1 (LUC_2025.R) komut dosyasından farklı olarak, aynı ada sahip tedaviler bu Ek Dosya 3 (ROS_2025.R) komut dosyasında tek bir grupta birleştirilmez.
   3. Kullanıcı Girişi II seçeneklerini kullanıcının özel gereksinimlerine göre değiştirin.
      NOT: Örnek Kullanıcı Girişi Ek Şekil S3'te görülebilir.
      1. Tedavi lüminesans toplamlarını karşılaştırmak için Tukey HSD ile ANOVA testini kullanın.
      2. Aynı anda yalnızca iki tedaviden elde edilen verileri karşılaştırmak için iki taraflı bir t-testi kullanın.
         NOT: Gösterilen p değerleri, aynı çizgiyle birden fazla karşılaştırmayı hesaba katacak şekilde ayarlanmamıştır.
      3. Floresan eğrilerinin grafiğini ve toplam floresan toplamını karşılaştıran bir çubuk grafiği çizin. Grafiklere standart sapma veya standart ortalama hatası ekleyin.
      4. Plaka okuyucunun kuyuları nasıl kaydettiğine bağlı olarak, girişin okunma şeklini değiştirin. Ya A1, A2, A3'e göre kuyuların standart veri listesini kullanın... veya A1, B1, C1 tarafından listelenen kuyular için olanı...
3. Konsolun sağ üst köşesindeki Kaynak düğmesine tıklayarak analizi çalıştırın.
   NOT: Analizin tamamlanması 1 dakikadan az sürer. R analizinin çıktısı, giriş veri kümesiyle aynı dosya klasöründe otomatik olarak görünecektir.
4. Çıktıyı görüntüleyin: Çıktı klasörü, kapsamlı bir analiz sağlamak için birkaç belge ve alt klasöre sahiptir.
   NOT: Giriş dosyası Ek Dosya 4 (ROS_flg22.csv) için, protokol bölüm 2'de açıklanan Ek Dosya 3 (ROS_2025.R) komut dosyası tarafından oluşturulan çıktı belgelerinin bir ağaç yapısı Ek Şekil S4'te gösterilmektedir.

Örnek olay incelemesi 1. Arabidopsis fideleri ile sirkadiyen saat aktivitesi için lüminesans testi

Daha önce, GLİSİN ZENGİN RNA BAĞLAYICI PROTEİN 7 (GRP7) geninin, ana saat proteini CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) tarafından kontrol edildiğini ve GRP7'nin sirkadiyen ekspresyonunun, vahşi tip GRP7 promotörünün (pGRP7wt:LUC)21 kontrolü altında lusiferaz raportörünü eksprese eden transgenik Col-0 bitkileri kullanılarak bitki savunmasındaki rolü için önemli olduğunu göstermiştik. Bu transgenik bitkilerin sirkadiyen saat aktivitelerini, kontrol tesisi CCA1:LUC/Col-0 ile birlikte LUC_2025.R adlı R betiğini kullanarak analiz ettik (protokol bölüm 1'deki Ek Dosya 1).

NO7.csv (Ek Dosya 2) adlı girdi dosyası, yedi bağımsız pGRP7wt:LUC hattı ve CCA1:LUC/Col-0 kontrolü (Ek Dosya 2 (NO7.csv)) için lüminesans okumalarına sahiptir. Komut dosyasını çalıştırdıktan sonra, NO7 output adlı çıktı alt klasörü, NO7.csv girdi dosyasıyla aynı klasör altında oluşturulacaktır (Ek Dosya 2 (NO7.csv)). NO7 çıktı klasörünün dosyaları Tablo 1'de açıklanmıştır ve Ek Şekil S2'deki ağaç yapısı ile rahatlıkla görüntülenebilir. NO7 çıktı klasöründeki değerler, Şekil 3 ve Şekil 4'ü yapmak için daha fazla işlendi. Şekil 3, CCA1:LUC raportörünün 3.000 RLU'luk bir genlik, 23,5 saatlik bir periyot ve 3,5 saatlik bir faz sergilediğini göstermektedir. Bu saat parametreleri, önceki raporlarla22,23 büyük ölçüde tutarlıdır. pGRP7wt:Luc çizgileri için farklı bir ekspresyon paterni gözlendi. Tüm pGRP7wt:LUC çizgileri periyot ve faz olarak benzer görünse de, muhtemelen kromozomlardaki transgenlerin konumsal etkisinden dolayı bu çizgilerin genlik değerlerinde farklılıklar vardı. Bu gözlemler, periyot, genlik ve faz parametreleri R betiği aracılığıyla hesaplandığında daha da doğrulandı (Şekil 4). Bu analizi doğrulamak için aynı veri seti, sirkadiyen veri analizi için ücretsiz bir çevrimiçi platform olan BioDare2 kullanılarak yeniden analiz edildi8. R analizinden elde edilen sonuçlar, BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) algoritması 8,24'ten elde edilenlerle karşılaştırılabilir düzeydeydi (Şekil 4).

Örnek olay 2. Memeli hücreleri ile sirkadiyen saat aktivitesi için lüminesans testi
R betiği LUC_2025.R (Ek Dosya 1, memeli hücreleri25 tarafından görüntülenen sirkadiyen saat aktivitesini analiz etmek için daha fazla kullanıldı. Bir sirkadiyen saat raportörünü ifade eden U2 OS hücre hattı, memeli sirkadiyen saat aktivitelerini26,27 ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir model hücre hattıdır. 96 oyuklu bir plakada kültürlenmiş Per2d:Luc raportörünü ifade eden U2 OS hücreleri ile oluşturulan zaman serisi verilerini yeniden analiz ettik. Hücreler, spesifik genleri hedef alan siRNA molekülleri ile tedavi edildi. Şekil 5, siRNA ile tedavi edilmeyen negatif kontrol hücrelerinin 23.3 saatlik bir periyot, 2.8 saatlik bir faz ve 184.8 RLU'luk bir genlik gösterdiğini göstermektedir. Beklendiği gibi, CRY2 genini hedefleyen siRNA, genliği önemli ölçüde azalttı ve raportörün periyodunu ve fazını etkiledi. PSMD4 ve PSMD7 genleri, protein yıkımı için 26S proteazom kapak bileşeninin bir parçası olan proteinleri kodlar. Önceki rapor25 ile tutarlı olarak, R analizi, PSMD4 veya PSMD7'nin ilgili siRNA'ları tarafından yıkılmasının saat parametrelerini etkilemediğini göstermektedir. Bu nedenle, bu R betiği sirkadiyen saat çalışmaları için farklı deneysel sistemlere kolayca uygulanabilir.

Örnek olay incelemesi 3. Bir savunma yanıtı için ROS testi
Lüminesan sirkadiyen saat analizlerinden elde edilen büyük veri kümelerine ek olarak, R betiği diğer veri türlerini analiz etmek için uyarlanabilir. Burada reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçülmesi için böyle bir uygulama sunuyoruz. Bitkilerin patojen istilasına karşı savaşmak için çeşitli stratejiler geliştirdikleri bilinmektedir. Stratejilerden biri, bir patojenden kendi kendine olmayan molekülleri tanımak ve ardından doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini aktive etmektir. Böyle bir erken bağışıklık tepkisi, bir konakçı kendi kendine olmayan bir molekülle karşılaştığında dakikalar içinde meydana gelen bir ROS patlamasıdır. Tipik bir ROS testi, tedavi başına genotip başına 12 yaprak disk içeren 96 oyuklu bir plaka ile gerçekleştirildi (protokol bölüm 2). Burada, iki yaygın elicitor molekül, bakteriyel flagellin proteinleri28'in korunmuş bölgesinden türetilen 22 amino asitli bir peptit olan flg22 ve uzama faktörü Tu proteini29'dan 26 amino asitli bir peptit olan elf26, ROS patlamasını indüklemek için kullanıldı. Ek Dosya 3 (ROS_2025.R) komut dosyası, ROS veri analizi için geliştirilmiştir. ROS tahlillerinden R analizi formatına dönüştürülen Ek Dosya 4 (ROS_flg22.csv) ve Ek Dosya 5 (ROS_elf26.csv) olmak üzere iki CVS dosyası, Ek Materyal bölümünden indirilebilir. R analizinden sonra, çıktı klasörleri, istatistiksel analizlerle birlikte ROS patlama eğrilerini ve tahlil süresi boyunca toplam ROS değerlerini içeren, kişinin kendi bilgisayarındaki her giriş dosyasıyla aynı klasörde oluşturulacaktır (Ek Şekil S4). Veriler, Şekil 6'yı oluşturmak için daha fazla işlendi. Burada gösterilen sonuçlar, manuel olarak işlenen yayınlananlara benzer30.

Şekil 1: R analizi için lusiferaz testinin akış şeması. Bir saat promotörü tarafından tahrik edilen bir lusiferaz raportörünü eksprese eden fideler sterilize edildi ve 4 gün boyunca LD'de 1/2 MS ortamında büyütüldü. Fideler, D-lusiferin içeren 180 μL 1/2 MS ortamı içeren 96 oyuklu plakalara aktarıldı. Her kuyuda bir fide vardı. LD'de 1 gün ve ardından LL'de 1 gün sonra, lüminesans bir plaka okuyucu ile kaydedildi. Bir plaka üzerindeki fideler tipik olarak 5-7 gün boyunca 1 saat aralıklarla LL'de lüminesans için kaydedildi. Kayıttan sonra, fide büyümesini değerlendirmek için plakaların fotoğrafı çekildi ve ham veriler R analizi için bir CSV dosyası olarak kaydedildi. Kısaltmalar: LD = 12 saat aydınlık/12 saat karanlık; LL = sabit ışık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Lüminesans veri toplama ve R analizinin akış şeması. (A) R betiği kullanılarak sirkadiyen saat analizi için beş adımlı bir prosedür özetlenmiştir. 1. Adım. Deneyleri genotip ve/veya tedavi başına 8 veya 12 fide olarak ayarlayın; Adım 2. 5-7 gün boyunca 1 saatlik aralıklarla LL'de lüminesansı kaydedin; Aşama 3. Verileri bir CSV dosyasında alın ve biçimlendirin; 4. Adım. R kullanarak verileri analiz edin; ve Adım 5. Çıktı verilerini görüntüleyin. Kayıt için başlangıç zamanı herhangi bir zamanda olabilir. Ancak, R betiği yalnızca tam sayıları (tam sayıları) aldığından, kayıt aralıkları bir tam sayı olmalıdır. (B) R betiği için doğru biçimlendirilmiş bir giriş CSV dosyasının ekran görüntüsü. Orijinal giriş dosyası, NO7.csv, Ek Dosya 2'de bulunabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Transgenik bitkilerde pGRP7wt:LUC'nin sirkadiyen ekspresyonu. pGRP7wt:LUC'un lüminesans izleri gösterilmiştir. X ekseninin altındaki çubuklar öznel gündüzü (açık çubuklar) ve geceyi (gri çubuklar) gösterir. Her genotipin lüminesans izi ortalama 12 kopyadır. Çok sayıda eğri nedeniyle hata çubukları gösterilmedi. Kısaltma: RLU = Bağıl lüminesans birimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: R betiği ve BioDare2'den alınan çıktı verilerinin karşılaştırması. Şekil 3'te gösterilen aynı veri seti, sirkadiyen saat parametreleri, genlik, periyot ve faz için R betiği ve BioDare2 tarafından analiz edildi. Veriler ortalama ± SEM'i temsil etmektedir (n=12). Farklı harfler örnekler arasında anlamlı fark olduğunu gösterir (P < 0.05; Post hoc Tukey'in HSD testi ile tek yönlü ANOVA). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Memeli hücreleri ile sirkadiyen saat aktivitesinin analizi. DD'de 96 oyuklu bir plaka üzerinde kültürlenen Per2dLuc raportörünü eksprese eden U2 OS hücreleri ile üretilen zaman serisi verileri daha önce 25 olarak tanımlanmıştı. Hücreleri tedavi etmek için CRY2, PSMD4 veya PSMD7'yi hedefleyen siRNA molekülleri kullanıldı. ( A) Lüminesans izleri. (B) Per2d:Luc'un Genliği, Periyodu ve Fazı. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder (n = 3). Paneldeki farklı harfler (B), negatif kontrol ile siRNA ile muamele edilmiş bir numune arasındaki önemli farkı gösterir (P<0.05; Post hoc Tukey'in HSD testi ile tek yönlü ANOVA). Kısaltma: RLU = bağıl lüminesans birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: R tarafından ROS patlama analizi. Fideler, 1 μM flg22 (solda) veya 1 μM elf26 (sağda) ile muamele edildikten hemen sonra bağıl lüminesans birimi için kaydedildi. ( A) Genotip başına 12 fideden ortalama lüminesans izleri (n = 12) ortaya çıkarıldıktan sonraki bir zaman sürecinde. Tedavi başına genotip başına ortalama değerler, R çıktısının bir parçasıdır. (B) flg22 veya elf26 tedavisi ile her genotip için ortalama toplam lüminesans sayıları. Veriler, ortalama ± SEM'i temsil eder (n = 12). Farklı harfler örnekler arasında anlamlı fark olduğunu gösterir (P < 0.05; Post hoc Tukey'in HSD testi ile tek yönlü ANOVA). Kısaltma: RLU = bağıl lüminesans birimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: R analizinden elde edilen çıktı belgelerinin listesi. Bu, LUC_2025.R betiği (Ek Dosya 1) ve giriş dosyası NO7.csv (Ek Dosya 2) tarafından oluşturulan çıktı belgelerinin bir listesidir.

Ek Şekil S1: Protokol bölümü 1'deki Giriş I ve Giriş II için ekran görüntüleri. Kullanıcı Girişi Analizi yerel bir bilgisayardaki belirli bir veri kümesine uyarlamak için I'in değiştirilmesi gerekir. Kullanıcı Girişi II'deki değişiklikler, deneysel ortama bağlı olarak isteğe bağlıdır. Ek Dosya 1 (LUC_2025.R) komut dosyasının, yalnızca seçilen veya kullanılan kuyuların değil, tüm kuyuların dosyada bulunmasını beklediğini unutmamak önemlidir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Çıktı belgeleri için ağaç yapısı. Bu çıktı, LUC_2025.R betiği (Ek Dosya 1) ve giriş dosyası NO7.csv (Ek Dosya 2) kullanılarak oluşturulmuştur. LUC_2025.R betiği, giriş dosyası adına göre bir çıkış klasörü oluşturur. Çıktı dosyalarıyla ilgili daha fazla ayrıntı için Tablo 1'e bakın. Kutular dosya klasörlerini temsil eder. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Protokol bölümü 2'deki Kullanıcı Girişi I ve Kullanıcı Girişi II için ekran görüntüleri. Ek Dosya 3 (ROS_2025.R) komut dosyası, Ek Dosya 1 (LUC_2025.R) komut dosyasıyla aynı genel giriş biçimini kullanır. Kullanıcı Girişi Analizi yerel bir bilgisayardaki belirli bir veri kümesine uyarlamak için I'in değiştirilmesi gerekir. Kullanıcı Girişi II'deki değişiklikler, deneysel ortama bağlı olarak isteğe bağlıdır. Ek Dosya 3 (ROS_2025.R) komut dosyasının, yalnızca seçilen veya kullanılan kuyuların değil, tüm kuyuların dosyada bulunmasını beklediğini unutmamak önemlidir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: Çıktı belgeleri için ağaç yapısı. Bu çıktı, ROS_2025.R betiği (Ek Dosya 3) ve giriş dosyası ROS_flg22.csv (Ek Dosya 4) kullanılarak oluşturulmuştur. ROS_2025.R betiği, giriş dosyası adına göre bir çıkış klasörü oluşturur. Bu klasörün içinde Toplam ROS Sayıları için bir dosya ve grafikler için bir dosya bulunur. PRISM ve grafik verileri, ANOVA testi ve t-testleri için alt klasörler de vardır. Kutular dosya klasörlerini temsil eder. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Sirkadiyen veri analizi için mevcut biyoinformatik araçlarının bir listesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: LUC_2025.R. Bu, sirkadiyen saat verilerini analiz etmek için kullanılan R betiğidir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: NO7.csv. Bu, sirkadiyen saat verilerinin bir örneğini içeren girdi dosyasıdır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: ROS_2025.R. Bu, ROS verilerini analiz etmek için kullanılan R betiğidir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: ROS_fig22.csv. Bu, ROS verilerinin bir örneğini içeren girdi dosyasıdır. ROS, 1 μM flg22 tedavisi ile indüklendi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: ROS_elf26.csv. Bu, ROS verilerinin bir örneğini içeren girdi dosyasıdır. ROS, 1 μM elf26 tedavisi ile indüklendi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.