Yöntem makalesi

Fos-tag SDS-PAGE Jel Elektroforezi ve İn Vitro Kinaz Testi Kullanılarak Fosforilasyon Modifikasyonunun Ortaya Çıkarılması

DOI:

10.3791/68884

⸱

8 Ağustos 2025

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, klinik numunelerde ve in vitro kinaz deneylerinde Fos-tag jel elektroforezi kullanılarak hedef proteinlerin fosforilasyon modifikasyonlarındaki değişiklikleri tespit etmek için prosedürleri açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforilasyon, protein fonksiyonunu düzenleyen klasik bir translasyon sonrası modifikasyondur. Proteinler tipik olarak, farklı konumlardaki çeşitli kinazlar tarafından modifiye edilebilen çoklu potansiyel fosforilasyon bölgeleri içerir. Hastalıkta hedef proteinlerin fosforilasyon değişikliklerini incelemek genellikle fosfo-spesifik antikorlar gerektirir. Ancak, ticari seçenekler tek bir siteyle sınırlı olabilir veya tamamen kullanılamayabilir. Burada, Phos-tag jel elektroforezi kullanılarak klinik numunelerde hedef proteinlerin fosforilasyon modifikasyonlarındaki değişiklikleri tespit etmek ve in vitro kinaz testleri yoluyla ayrıntılı fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Fos-tag'a bağlı fosforile proteinler, SDS-PAGE jel elektroforezinde daha yavaş migrasyon oranları sergiler ve yavaş göç eden bantların ortalama piksel yoğunluğuna dayalı olarak hastalık dokularındaki fosforilasyon değişikliklerinin yarı kantitatif analizini mümkün kılar. Araştırmacılar, Phos-tag SDS-PAGE'i birden fazla aday proteine karşı pan-spesifik antikorlar kullanarak immünoblotlama ile birleştirerek, fosforilasyon değişiklikleri ile hedef proteinleri verimli bir şekilde tanımlayabilirler. Aday kinazların taranmasını takiben, hedef protein ile in vitro kinaz testleri gerçekleştirilir ve elde edilen fosforile ürünler, kesin bölge tanımlaması için kütle spektrometresine tabi tutulur. Bu yöntem, spesifik fosforile protein antikorları gerektirmez, bu da hastalıktaki değişmiş fosforilasyon durumlarını tanımlamak için doku örneklerinin büyük ölçekli taranmasına izin verir. Ayrıca, tanımlanan fosforilasyon bölgeleri, hastalık dokularında kantitatif ve lokalizasyon analizi için spesifik antikorlar geliştirmek için kullanılabilir ve fonksiyonel rolleri hakkında daha derin bilgiler sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforilasyon, proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu, kinaz aktivitesini ve transkripsiyonel aktivitesini modüle etmek için önemli bir translasyon sonrası modifikasyondur. İnsan genomunda, sinyal iletimi, gen ekspresyonu ve protein-protein etkileşiminde rol oynayan 500'den fazla protein kinaz geni bulunmuştur1. Fosforilasyon ve defosforilasyon, hücre yapışmasını, hücre proliferasyonunu ve hücre farklılaşmasını düzenlemek için hızlı bir şekilde geri dönüşümlü olan çeşitli kinazların kontrolü altındadır2. Bununla birlikte, anormal protein fosforilasyon modifikasyonları, tümör oluşumu, otoimmün bozukluklar, nörodejenerasyon ve subfertilite 3,4,5 dahil olmak üzere birçok insan hastalığından sorumludur.

Klinik örneklerin fosfoproteomik profillemesi, çoklu aday diferansiyel fosforile proteinler6 verir. İnsan hastalıklarındaki temel fosforilasyon modifikasyonlarını ortaya çıkarmak için, spesifik hedef proteinlerin fosforilasyon durumunu tespit etmek için kolay ve etkili bir yöntem gereklidir. Farklı bölgelerdeki fosforilasyon, proteinde belirgin fonksiyonel değişikliklere yol açabilir. Bu nedenle, belirli amino asit bölgelerini hedef alan fosforilasyona özgü antikorların kullanılması, protein fosforilasyonundaki değişiklikleri tespit etmek için şüphesiz en iyi yöntemdir. Bununla birlikte, birçok protein için iyi karakterize edilmiş fosfo-spesifik antikorlar yoktur. Ek olarak, yeni potansiyel fosforilasyon bölgelerini tanımlamak için daha uygun bir yaklaşım gereklidir. Spesifik amino asit kalıntılarındaki fosforilasyon genellikle bir proteinin jel elektroforezindeki göç hızını değiştirir ve daha yavaş göç eden bantlar fosforilasyon durumundaki değişiklikleri yansıtabilir7. Bununla birlikte, bu hareketlilik değişimleri genellikle incedir ve bu da onları ayırt etmeyi zorlaştırır. Fos-etiketi, fosforile Ser/Thr/Tyr ve His/Asp/Lys kalıntılarını yakalayabilen, model olarak bir alkalin fosfataz katalitik alandan tasarlanmış sentezlenmiş bir kimyasal bileşiktir. Bu nedenle, fos-etiket konjugasyonu, fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş proteinler arasındaki göç hızı farklılıklarını etkili bir şekilde yükseltirken, aynı zamanda fosforilasyon bölgelerinin sayısındaki varyasyonları da ayırt eder8.

Doku örneklerinde hedef protein fosforilasyon değişikliklerini tespit etmek için kullanılan bu Fos etiketi tabanlı metodoloji, geleneksel yaklaşımlara göre belirgin avantajlar sunar. En önemlisi, fosfo-spesifik antikorlara olan gereksinimi ortadan kaldırır, bunun yerine tespit için standart WB dereceli proteine özgü antikorları kullanır. Hedef proteinlerin fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş formları, Phos-tag SDS-PAGE sırasında farklı bantlar olarak çözülür ve karşılaştırmalı bant yoğunluğu analizi yoluyla hastalık durumlarındaki fosforilasyon seviyesi değişikliklerinin yarı kantitatif değerlendirmesini sağlar. Bu protokoldeki iş akışı şunları içerir: (1) protein örneklerinin fos-tag SDS-PAGE ayrımı, (2) fosforile hedefler için immünoblot taraması, (3) fosfo-Ser / Thr antikorları tarafından doğrulanan aday kinazlarla in vitro kinaz testleri. Sonraki kütle spektrometresi analizi (harici bir hizmet platformu tarafından yürütülür), bölgeye özgü antikor gelişimini sağlamak için fosforilasyon bölgelerini tanımlar; Ayrıntılı metodoloji mevcut protokolde yer almamaktadır. Özellikle, bu yaklaşım, klinik numunelerde Nur77 fosforilasyon değişikliklerini tespit etmek, Mst1 kinazını Nur77 fosforilasyonunun yukarı akış düzenleyicisi olarak tanımlamak ve Nur779'un treonin 366'sında fosforilasyonun klinik tespiti için bölgeye özgü bir fosfo-antikor geliştirmek için başarıyla uygulanmıştır. Bu nedenle, bu yaklaşım, ticari olarak mevcut antikorlar kullanılarak çok sayıda hedefte fosforilasyon durumu değişikliklerinin büyük ölçekli taranmasına izin verdiği için, birden fazla aday proteini araştırırken ön araştırma aşamalarında özellikle değerli olduğunu kanıtlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanjing Drum Tower Hastanesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulları insan araştırmasını onayladı (2013-408081-01). Mevcut protokol, temsili bir model olarak endometriyal doku kullanılarak oluşturulmuştur. Uygun optimizasyon ile bu metodoloji, protein ekstraksiyonu ve sonraki analizler için tümör dokuları dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere diğer klinik örneklere genişletilebilir. Endometrial biyopsi, fertil kadınlardan (Kontrol grubu) vetüp bebek-embriyo transferi yapılan tekrarlayan embriyo implantasyon başarısızlığı olan kadınlardan (Hastalık grubu) orta salgı döneminde yapılır. Tüm hastalar örnekleme prosedüründen önce bilgilendirilmiş onam verdi. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Numunelerin hazırlanması

  1. Elde edilen taze doku örneklerini kan hücrelerini çıkarmak için önceden soğutulmuş PBS ile iki kez durulayın ve yaklaşık 100 mg dokuyu 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne ayırın.
  2. Dokuyu 1 mL doku proteini lizis tamponu (150.0 mmol/L NaCl, %1.0 NP-40, 50.0 mmol/L Tris pH 8.0, %0.5 sodyum deoksikolat, proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitör kokteyli 2 ve 3) içeren 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir öğütme tüpüne yerleştirin.
  3. Yüksek hızlı doku dağıtıcının hızını seviye 5'e (6 seviye üzerinden) ayarlayın ve dokuyu 10 saniye topraklayın, ardından buz üzerinde 30 saniye inkübasyon yapın. Doku homojenatı elde etmek için bu işlemi 5 kez tekrarlayın.
  4. Homojenatı 4 ° C'de 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde yavaş döndürerek parçalayın, ardından 4 ° C'de ve 13.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
  5. BCA yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
  6. Toplam 300 μg protein alın, eşit bir hacme ayarlayın ve 4× Laemmli protein numune tamponu ile karıştırın. Karışımı 95 °C'de 8 dakika ısıtarak, oda sıcaklığına soğutarak ve ardından daha fazla analiz için yükleyerek denatüre edin.
    NOT: 2. adımdan önce, ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için toplam antikorlar kullanılarak ilgilenilen proteini tespit etmek için geleneksel Western blotlama analizleri önerilir.

2. Phos-tag SDS-PAGE jelin jel hazırlanması

  1. 29.0 g Akrilamid ve 1.0 g N, N'-metilen-bisakrilamid ekleyerek 100 mL %30 w/v Akrilamid / N, N'-metilen-bisakrilamid Karışık Çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  2. Geleneksel SDS-PAGE'de kullanıldığı gibi 1.5 mol / L Tris-HCl Çözeltisi (pH 8.8), 0.5 mol / L Tris-HCl Çözeltisi (pH 6.8),% 10 w / v SDS Çözeltisi ve% 10 w / v Amonyum Persülfat Çözeltisi hazırlayın.
  3. Phos-tag SDS-PAGE jeli için özel 5.0 mmol/L Phos-tag Çözeltisi ve 10 mmol/L MnCl2 Çözeltisi hazırlayın.
  4. 10 mL çözeltinin, 50 μM Fos-tag Çözeltisi ve 100 μM MnCl2 ile 6 w/v% poliakrilamid jel ile hazırlanması durumunda, 2 mL %30 (a/h) Akrilamid / Bis-akrilamid karışık çözeltisi, 2.5 mL 1.5 mol / L Tris/HCl Çözeltisi (pH 8.8), 0.1 mL 5.0 mmol / L Fos-tag çözeltisi karıştırılarak çözülen jel çözeltisini hazırlayın, 0.1 mL 10 mmol/L MnCl2 çözeltisi, 0.1 mL %10 (a/h) SDS çözeltisi, 10 μL TEMED ve 5.14 mL damıtılmış Su.
  5. Homojenliği sağlamak için hazırlanan çözülen jel çözeltisini nazikçe girdaplayın, ardından jel çözeltisi tüpünü bir vakumlu kurutucuya yerleştirin ve görünür kabarcık kalmayana kadar 2 dakika boyunca bir vakum (0,1 MPa) uygulayın.
  6. 50 μL% 10 amonyum persülfat ekleyin ve nazikçe ama iyice karıştırın.
  7. Solüsyonu, kısa plakanın üst kenarının ~ 1 cm altına ulaşana kadar hemen monte edilmiş jel kasetine pipetleyin. Baloncukları tanıtmaktan kaçının.
  8. Havayı dışarı atmak ve düz bir arayüz sağlamak için jelin üzerine dikkatlice 0,5 mL damıtılmış su koyun. Oda sıcaklığında 20-30 dakika polimerizasyona izin verin.
  9. Aynı zamanda, 0.6 mL %30 (a/h) Akrilamid/Bis-akrilamid karışık çözelti, 1 mL 0.5 mol/L Tris-HCl Çözeltisi (pH 6.8), 40 μL %10 (a/h) SDS çözeltisi, 4 μL TEMED ve 2.33 mL damıtılmış Su karıştırarak standart bir Tris-HCl tamponlu istifleme (%4,5 a/h poliakrilamid jel) jel çözeltisi hazırlayın. Nazikçe girdap yapın ve gazı alın.
  10. Jelenin tamamen katılaştığından emin olun (ara arayüzün hareketsizliğini onaylarken üst sıvı tabakasının eğilmesini gözlemlemek için jel kasetini eğin). Su tabakasını dikkatlice dökün, ardından tamamen boşaltın.
  11. Hazırlanan istifleme jeli çözeltisine 20 μL% 10 amonyum persülfat ekleyin, hafifçe karıştırın ve hemen çözünen jelin üzerine pipetleyin.
  12. Kabarcıkları önleyerek istifleme jeli çözeltisine dikkatlice 10 veya 15 oyuklu bir tarak yerleştirin. İstifleme jelinin oda sıcaklığında 10 dakika polimerize olmasına izin verin.
    NOT: Jeli her zaman kullanmadan hemen önce hazırlayın. Lütfen ilgilendiğiniz her protein için Fos etiketli ve akrilamid konsantrasyonlarını optimize edin.

3. Fos etiketli SDS-PAGE'in elektroforezi

  1. Elektroforez ekipmanını monte edin ve elektrot odalarını geleneksel Tris/Glisin/SDS Çalışma Tamponu ile doldurun.
  2. Bir mikropipet kullanarak her bir oyuğa 30 μg protein örneği yükleyin.
  3. Bromofenol mavisi çözünen jelin dibine ulaşana kadar sabit akım koşulları altında (30 mA / jel) elektroforez gerçekleştirin.
  4. İki değerlikli katyonları çıkarmak için jelleri 5 mM EDTA'lı metanol içermeyen SDS-PAGE Transfer Tamponunda iki kez 10 dakika bekletin.
  5. Proteinleri, Islak / Tank Lekeleme Sistemlerini kullanarak 90 dakika boyunca 90 V'ta PVDF membranına aktarın.

4. İmmünoblotlama ve analiz

  1. Membranı% 5 yağsız süt veya sığır serum albümen tozu çözeltisi (1×Tris-Borat-Sodyum Ara-20 çözeltisi, TBST içinde seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1 saat bloke edin.
  2. Hedef proteine karşı birincil antikoru uygun bir oranda seyreltin ve gece boyunca 4 ° C'de zar ile inkübe edin.
  3. Membranı TBST ile 3 kez, yıkama başına 10 dakika, oda sıcaklığında hafif çalkalama ile yıkayın.
  4. Membranı HRP ile konjuge edilmiş bir ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  5. Membranı TBST ile 3 kez, yıkama başına 10 dakika, oda sıcaklığında hafif çalkalama ile yıkayın.
  6. Gelişmiş kemilüminesans substratı ile karanlıkta 1 dakika inkübe edin, ardından maruz bırakın.
  7. Otomatik bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak görüntüleri yakalayın ve ImageJ yazılımını kullanarak gri tonlama yoğunluğu için hedef bantları (yavaşça göç eden fosforile hedef protein ve hızla göç eden fosforile olmayan hedef protein) ölçün.
    NOT: Western blotları Phos-Tag jelleri, moleküler ağırlık atamaları yapmak için kullanılamaz.
  8. Her numune için yavaş göç eden fosforile bantların hızla göç eden fosforile olmayan bantlara oranını hesaplayın ve gruplar arasındaki fosforilasyon yüzdesinin istatistiksel farkını analiz edin.

5. Hedef proteinin immünopresipitasyonu

  1. Hedef proteinin FLAG etiketli (veya HA, GFP, GST veya His dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere alternatif epitop etiketleri) vahşi tip veya bölgeye özgü fosfo-mutantlarını kodlayan ekspresyon plazmitleri oluşturun.
  2. HEK293 hücrelerini, üreticinin protokolüne göre Lipofectamine 3000 kullanarak ekspresyon plazmitleri ile transfekte edin.
  3. Protein süpernatanı ekstrakte etmek için adım 1'de tarif edildiği gibi 1 mL doku proteini lizis tamponundaki lizaz hücreleri.
  4. Süpernatanı 20 μL Anti-FLAG M2 afinite jeli ile gece boyunca 4 °C'de rotasyonla inkübe edin.
  5. Santrifüjleyin (1000 × g, 3 dakika), agaroz boncukları toplayın ve spesifik olarak bağlanmamış proteinleri çıkarmak için 10 sütun hacmi TBS ile yıkayın.
  6. FLAG peptidini TBS içinde 100 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona çözün.
  7. Anti-FLAG M2 afinite jelinden bağlı FLAG füzyon proteinini, beş adet tek sütunlu hacim FLAG peptit çözeltisi (20 μL agaroz boncukları için 100 μL çözelti kullanın) ile 5-10 dakika boyunca nazikçe karıştırarak elde edin.
  8. Santrifüjleyin (1000 × g, 3 dakika) ve süpernatan toplayın.
    NOT: Kinaz biliniyorsa, 6. adıma geçin; aksi takdirde, 6. adıma geçmeden önce maya iki hibrit taraması veya biyoinformatik tahmini (örneğin, PhosphositePlus veya Grup Tabanlı Tahmin Sistemi kullanarak) yoluyla potansiyel kinazları tanımlayın.

6. Fosforile amino asitleri tanımlamak için in vitro kinaz testi

  1. Kinaz tamponu hazırlayın (reaksiyon başına 30 μL): 40 mM HEPES pH7.6, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2.5 mM β-gliserofosfat, 200 μM ATP, 100 ng aktif kinaz, immünopresipite edilmiş FLAG füzyon proteini.
  2. 30 ° C'de 30 dakika boyunca bir termomikserde hafif çalkalama ile inkübe edin.
  3. 10 μL 4× Laemmli tamponu ekleyerek reaksiyonları durdurun ve 95 ° C'de 5 dakika denatüre edin.
  4. Aktif kinaz ile veya aktif kinaz olmadan reaksiyona giren immünopresipite edilmiş FLAG füzyon proteini kullanarak geleneksel SDS-PAGE elektroforezi gerçekleştirin.
  5. Fosforile amino asitleri tanımlamak için Anti-fosfo-Thr antikoru ve Anti-fosfo-Ser antikoru ile sondalayın. Kontrol olarak Anti-Flag antikoru ile problayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. İmmünoblotlama ve analizi 4. adımda açıklandığı gibi tamamlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrol grubundan ve hastalık grubundan alınan insan örneklerinin ön fosfoproteomik profili, Nur77'yi aday diferansiyel fosforile protein olarak tanımladı. Phos-tag SDS-PAGE'in Nur77 protein fosforilasyonunu tespit etmedeki etkinliğini değerlendirmek için bir Mn2 +-Phos-tag SDS-PAGE deneyi yapıldı. Doku örneklerinden toplam protein ekstraksiyonundan sonra, 30 μg protein yüklendi ve Mn2 + -Fos-tag jel elektroforezi ile ayrıldı, ardından PVDF membranına transfer edildi. İmmünoblotlama, bir Nur77 prime...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik dokulardaki hedef proteinlerin fosforilasyon değişikliklerini tespit etmek için Phos-tag tabanlı yaklaşım, protein fosforilasyon araştırmaları için önemli avantajlar sunar. Fosforile proteinler, Fos-tag bağlanması nedeniyle azalmış elektroforetik hareketlilik sergiler ve fosfo-spesifik antikorlar gerektirmeden aday proteinlerin fosforilasyon durumunun yüksek verimli taranmasını sağlar. Bu, özellikle çoklu aday proteinlerin ilk büyük ölçekli profillemesi için değerlidir. Değiştiril...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82271698) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20231117) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 SDS ÇözümüSangon BiotechB548118
10x Tris / Glisin / SDSBIO-RAD
1610732 4 kez;   Laemmli protein numune tamponuBIO-RAD1610747
AkrilamidSangon BiotechA601032
Amonyum persülfatSangon BiotechA100486
Anti-FLAG M2 afinite jeliMilliporeA2220
Geliştirilmiş kemilüminesans kitiThermoFisher32106
FLAG antikoruCST14793
BAYRAK  PeptitMilliporeF3290
HRP konjuge ikincil antikorBioworld TeknolojisiBS13278
Lipofektamin 3000ThermoFisherL3000015
Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez HücresiBIO-RAD1658005
Mst1 antikoruCST3682
N, N'-metilen-bisakrilamidSangon BiotechA600025
N, N, N', N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)Sangon BiotechA610508
Nur77 antikoruCST3960
fosfataz İnhibitörü Kokteyli 2SigmaP5726Tirozin protein fosfatazlarının inhibisyonu için, asit ve alkalin fosfatazlar
Fosfataz İnhibitörü Kokteyl 3SigmaP0044Protein fosfataz 2A, alkalin fosfatazlar, protein fosfatazlar 1 ve 2A'nın inhibisyonu için
Fosfo-serin antikoruSigmaP5747
Fosfo-treonin antikoruSigmaP6623
Fos-tag AkrilamidWako304-93526Phos-tag'ın hazırlanması için SDS PAGE jel
Pierce BCA Protein Test KitiTermo 23227
Proteaz İnhibitörü KokteylSigmaS8830EDTA içermez, tablet, serin, sistein, aspartik ve metaloproteazların inhibisyonu için
PVDF membranı Roche3010040001
ThermoMixerEppendorf2231001127
Doku DağıtıcıIKAT 10 Doku homojenatı elde etmek için
Tris-HCl Tamponu (0,5 M, pH 6,8)Sangon BiotechB546020
Tris-HCl Tamponu (1,5 M, pH 8,8)Sangon BiotechB546019
Vakumlu kurutucuThermoFisher5311-0250Jel çözeltisinin gazını almak için
β-MerkaptoetanolSigmaM3148
Mini Trans-Blot Hücresi BIO-RAD 1703930

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation and dephosphorylation. Cell Biosci. 6, 25(2016).
  3. Pang, K., et al. Role of protein phosphorylation in cell signaling, disease, and the intervention therapy. MedComm. 3 (4), e175(2022).
  4. Bollu, L. R., Mazumdar, A., Savage, M. I., Brown, P. H. Molecular Pathways: Targeting protein tyrosine phosphatases in cancer. Clin Cancer Res. 23 (9), 2136-2142 (2017).
  5. Martin, L., et al. Tau protein kinases: involvement in Alzheimer's disease. Ageing Res Rev. 12 (1), 289-309 (2013).
  6. Bhardwaj, S., et al. Integrating the analysis of human biopsies using post-translational modifications proteomics. Protein Sci. 33 (4), e4979(2024).
  7. Kristjansdottir, K., Wolfgeher, D., Lucius, N., Angulo, D. S., Kron, S. J. Phosphoprotein profiling by PA-GeLC-MS/MS. J Proteome Res. 7 (7), 2812-2824 (2008).
  8. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  9. Cai, X., et al. Mst1-mediated phosphorylation of Nur77 improves the endometrial receptivity in human and mice. EBioMedicine. 88, 104433(2023).
  10. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E. Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling. Proteomics. 11 (2), 319-323 (2011).
  11. Shih, H. H., et al. An ultra-specific avian antibody to phosphorylated tau protein reveals a unique mechanism for phosphoepitope recognition. J Biol Chem. 287 (53), 44425-44434 (2012).
  12. Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay. J Vis Exp. (135), e57674(2018).
  13. Mehla, J., Caufield, J. H., Uetz, P. Mapping protein-protein interactions using yeast two-hybrid assays. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (5), 442-452 (2015).
  14. Ayati, M., Yilmaz, S., Blasco Tavares Pereira Lopes, F., Chance, M., Koyuturk, M. Prediction of kinase-substrate associations using the functional landscape of kinases and phosphorylation sites. Pac Symp Biocompu. 28, 73-84 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein FosforilasyonuTranslasyon Sonras ModifikasyonmmunoblotlamaK tle SpektrometrisiFosforilasyon B lgesi Tan mlamaHastal k Dokusu Analizi

İlgili makaleler