Method Article

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik hücreler, DNA bakımı ve organel homeostazı dahil olmak üzere çeşitli süreçleri düzenleyen korunmuş bir hücre döngüsünü takip eder. Hücresel süreçleri hücre döngüsüne bağlı bir şekilde incelemek, deneysel sonuçları doğru bir şekilde yorumlamak için genellikle gereklidir. Omurgalı modelleri de dahil olmak üzere geniş bir organizma yelpazesinde kültürlenmiş hücrelerde hücre döngüsü senkronizasyonu üretmek için hücre döngüsüne bağlı süreçlerin incelenmesini sağlayan kimyasal ve genetik yöntemler mevcuttur. Bununla birlikte, model organizmalar arasında tomurcuklanan maya, özellikle sağlam senkronizasyon yöntemleri, kısa üretim süresi ve genetik izlenebilirliği nedeniyle hücre döngüsü analizi için bir güç merkezi olmaya devam etmektedir. Maya, çekirdek hücre döngüsü mekanizmasını diğer ökaryotlarla paylaşır ve bu da hücre döngüsü düzenlemesinde dönüm noktası niteliğindeki keşifleri mümkün kılar. Bu protokol, suş yapımı, kültür hazırlama ve mikroskopi dahil olmak üzere G1 tutuklama-serbest bırakma ve mitotik tutuklama-bırakma deneylerine odaklanarak mayada hücre döngüsü analizi yöntemlerini detaylandırır. Hücre döngüsü tutuklamaları ve floresan mikroskobu için uygun suşların üretilmesine yönelik PCR etiketleme yöntemleri sunulmaktadır. Peptit feromon α faktörü kullanılarak bir G1 tutuklaması elde edilir ve kısa yıkamalar senkron salınım ve hücre döngüsü ilerlemesi ile sonuçlanır. Numuneler, hücre döngüsüne salındıktan sonra farklı zaman noktalarında alınır ve mikroskopi için sabitlenir. İkinci bir yöntem, metafaz tutuklu bir popülasyon elde etmek için hücre döngüsü düzenleyicisi Cdc20'yi tüketerek ve ayrıca isteğe bağlı olarak anafaza salınarak maya hücrelerini mitozda durdurur. Numuneler sabitlenir ve serbest bırakma öncesi ve sonrası görüntüleme için hazırlanır ve görüntülenir ve analiz edilir. Görüntü analizi, hücre döngüsündeki proteinlerin dinamik lokalizasyonunu ve popülasyon bolluğu değişikliklerini kataloglamaya odaklanır. Bu senkronizasyon yöntemleri, çeşitli hücre döngüsü manipülasyonları için uygundur ve burada sabit hücrelerin görüntülenmesinde kullanımları vurgulanırken, canlı hücre görüntülemenin yanı sıra biyokimyasal ve moleküler analizler de dahil olmak üzere diğer birçok analiz için uyarlanabilirler.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik hücre bölünmesi, hücre döngüsü adı verilen bir program aracılığıyla yüksek oranda düzenlenir. Hücre döngüsünde meydana gelen yüksek oranda korunmuş ve dinamik süreçler, kendi içinde çalışmayı ilginç kılar, ancak aynı zamanda diğer hücre biyolojik süreçlerinin araştırmalarını bilgilendiren geniş kapsamlı çıkarımlara sahiptir - örneğin, birçok organel, hücre bölünmesi sırasında dramatik bir yeniden şekillenmeye uğrar ve birçok proteinin bolluğu ve lokalizasyonu, 1,2,3 boyunca yüksek oranda düzenlenir. Metazoan sistemlerinde, maya ile karşılaştırıldığında, daha çeşitli düzenleyici kinazlar ve proteinlerin yanı sıra metazoanlarda dış sinyalleşmeden ek girdiler de dahil olmak üzere bazı ek karmaşıklık katmanları bulunmasına rağmen, hücre bölünmesi genel olarak tüm ökaryotlarda 4,5 çok yüksek oranda korunur. Mayada hücre döngüsü ilerlemesi ve önemli düzenleyici adımlar hakkında önemli bilgiler oluşturan birçok temel çalışma yapıldı ve birçok nedenden dolayı hücre döngüsü ile ilgili soruları incelemek için son derece çekici bir organizma olmaya devam ediyor 6,7. Bunların başında, hücre döngüsünü manipüle etmek için mevcut olan, çeşitli aşamalarda tutuklamaya ve hücrelerin senkronizasyonuna olanak tanıyan çok çeşitli yöntemler gelir. Ek avantajlar arasında mayanın kısa hücre döngüsü (sıcaklık ve ortam koşullarına bağlı olarak ~90-150 dakika), genetik manipülasyon kolaylığı ve aksi takdirde vahşi tip bir bağlamda çalışmayı mümkün kılan çok çeşitli koşullu aleller yer alır.

Hücre döngüsünün farklı aşamaları boyunca ilerleme, her yerde bulunan Sikline bağımlı kinaz (Cdk), Polo benzeri kinaz ve Aurora kinazlar dahil olmak üzere birkaç anahtar kinazın aktivitesi tarafından yönlendirilir. Hücre döngüsü kontrol noktaları, hücre döngüsü boyunca ilerlemeyi düzenleyerek, belirli koşullar karşılanmadıkça hücrelerin bir sonraki bölünme aşamasına geçmemesini sağlar 8,9. Bu kontrol noktaları ve düzenledikleri geçişler, araştırmacılar tarafından uzun süreli tutuklama veya bir hücre popülasyonunu senkronize etmek için geçici tutuklama ve serbest bırakma elde etmek için ele geçirilebilir (Şekil 1). Örneğin, hücre döngüsü taahhüt kontrol noktası (Kısıtlama noktası veya mayada başlangıç), hücrenin DNA replikasyonuna10 başlamadan önce bölünmeye devam etmek için yeterli besine sahip olmasını sağlar. Bu kontrol noktası, hücre döngüsü ile etkileşime giren maya çiftleşme programından yararlanarak bir G1 tutuklaması elde etmek için haploid mayada manipüle edilebilir. Ekmek mayasında (Saccharomyces cerevisiae), haploid hücreler, genetik olarak bir çiftleşme tipi lokus tarafından belirlenen MATa veya MATα olmak üzere iki çiftleşme tipinden birine sahiptir. Bir çiftleşme tipindeki maya, diğer çiftleşme tipinin çiftleşme feromonuna duyarlıdır ve Cln1/2-Cdk kompleksine bağlanarak ve aktivitesini bloke ederek hücre döngüsü girişini önleyen Cdk inhibitörü Far1'i nihai olarak fosforile eden ve stabilize eden bir MAP kinaz sinyal kaskadını aktive ederek yanıt verir 11,12,13. Çiftleşme feromonlarına yanıt veren hücreler, bir çiftleşme projeksiyonu veya shmoo'nun varlığı ile görsel olarak belirlenebilir (Şekil 1). Böylece, bir G1 tutuklaması elde etmek için MATa hücrelerinin kültürlerine kimyasal olarak sentezlenmiş α faktörü eklenebilir. Araştırmacıların maya hücrelerini senkronize etmek için hedefleyebilecekleri bir başka hücre döngüsü geçişi, metafazdan anafaza geçiştir. Mitoz sırasında, İş Mili Düzeneği Kontrol Noktası (SAC), kinetokorların mikrotübüllere bağlanmasını izler ve bağlanmamış kinetokorlar tespit edildiğinde aktivatörü Cdc20'yi sekestre ederek anafazı teşvik eden kompleksi/siklozomu (APC/C) inhibe eder. APC/C, anafaz girişi için gerekli olan bir E3 ligaz kompleksidir. SAC tatmin edildiğinde, Cdc20 daha sonra APC/C'yi bağlar ve APC/C, başta securin ve siklin B olmak üzere çeşitli proteinleri her yerde bulunur, bu da onları bozunma için hedefler ve kromozom ayrımını ve mitotik çıkışıdestekler 14,15. Cdc20'nin kendisi SAC'nin bir bileşeni olmasa da, inhibisyonu SAC aktivasyonunun hedefidir; bu nedenle, metafazda bir maya kültürünü durdurmak için Cdc20'nin indüklenebilir tükenmesinden yararlanılabilir (Şekil 1)16.

Bu protokol, iki maya hücre döngüsü manipülasyonu yöntemini ve ayrıca her yöntemin örnek bir uygulamasını kapsar. İlkinde, G1'deki hücreleri tutuklamak için α faktörü kullanılır, ardından hücreleri tutuklamadan serbest bırakmak için bir yıkama adımı izlenir ve bu da senkron hücre döngüsünün yeniden girişiyle sonuçlanır. Senkronize hücreler tüm hücre döngüsü boyunca devam edecek ve araştırmacıların her hücre döngüsü aşamasındaki hücreleri izlemesine ve incelemesine olanak tanıyacak. Bu yöntemde, ilgilenilen GFP etiketli bir protein olan Stu2'nin dinamik lokalizasyonu baştan sona izlenir ve mitotik iğ ile ilişkisi izlenir. Bu yöntem aynı zamanda mitotik iğ uzunluğunun ölçülmesini sağlayan ve hücre döngüsü ilerlemesi17 için mükemmel bir vekil olan etiketli bir iğ direği gövdesi (SPB) bileşeni olan Spc110-mCherry'den yararlanır. Bu yöntem, hücre döngüsünün durdurulması ve serbest bırakılmasının hücre popülasyonlarının senkronizasyonunu nasıl mümkün kıldığını ve hücre döngüsü boyunca bir proteinin veya ilgilenilen başka bir bileşenin incelenmesini nasıl kolaylaştırdığını gösterir.

İkinci yöntemde, oksin ile indüklenebilir bir degron (AID) sistemi18 kullanılarak Cdc20'nin tükenmesi yoluyla bir mitotik tutuklama gerçekleştirilir. TIR1'i (bitki kökenli bir F-box proteini) eksprese eden hücrelerde, AID etiketine sahip herhangi bir protein, oksin ilavesi üzerine her yerde bulunacak ve bozulacaktır. Burada, Cdc20'nin indüklenebilir bozunmasını sağlamak için AID etiketli bir Cdc20 kullanıyoruz, böylece metafazda bir durmaya neden oluyoruz. Bu hücre popülasyonu daha sonra, etiketli kinokor proteini Mtw1-mCherry'yi referans belirteç olarak kullanarak, etiketli SAC bileşeni Bub1-GFP'nin kinetokorlara alınması için izlenir. Bub1, kinetokorlarda SAC'den bağımsız roller oynamasına ve erken mitozda kinetokorlara lokalize olmasına rağmen, tutuklanmış hücrelerdeki kalıcı kinetokor lokalizasyonu, uygun olmayan kinetokor-mikrotübül bağlantılarına işaret eder19. Bunu, hücreleri, kinetokor-mikrotübül bağlantılarını bozan mikrotübül zehiri nokodazol ile tedavi ederek gösterdik. Bu deney, farklı bir hücre döngüsü fazına özgü süreçlerin, yüksek düzeyde ayarlanabilir tutuklama yöntemleri kullanılarak nasıl incelenebileceğini vurgulamaktadır. Ayrıca, oksinin cdc20-AID kültürlerinden yıkanabileceğini, anafaza salınıma ve yeni bir hücre döngüsüne girişe izin verebileceğini gösterdik, ancak deneyimlerimize göre, bu kültürler α faktörlü bir tutuklama-salınım kadar eşzamanlı olarak salınmıyor. Bu iki tutuklama-serbest bırakma yöntemi hem etkili hem de uygulanması kolaydır, ancak mayadaki araştırmacılar için farklı hücre döngüsü aşamalarında hücreleri tutuklamak için birçok başka yöntem mevcuttur 20,21,22,23. Bu yöntemlerin daha fazla ayrıntısı Tartışma'da bulunabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre döngüsü analizi ve görüntüleme için suşların oluşturulması

  1. Pringle Etiketleme Plazmitleri (pFA6a plazmitleri)24 kullanarak ilgilenilen geni C-terminal olarak etiketlemek için primerler tasarlayın. Kısacası, bir pFA6a serisi plazmit ile kullanıldığında, ilgilenilen genin 'etiketlenmiş' bir versiyonunu oluşturmak için doğrudan mayaya dönüştürülebilen bir PCR ürünü üreten F2 ve R1 primerleri tasarlayın. Bu protokolde ilgilenilen genleri etiketlemek için Tablo 1'de bulunan primer çiftlerini ve plazmitleri kullanın. Maya genlerinin C-terminal etiketlemesi için plazmit ve primer tasarım stratejileri Longtine ve ark.24 tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
    NOT: Bu yöntem, görüntüleme için floresan etiketli proteinler veya hücre döngüsü durmasını kolaylaştırmak için Oksin ile İndüklenebilir Degron (AID) etiketli proteinler ve bir hedef proteinin18 bozunmasıyla sağlanan diğer deneyler üretmek için kullanılabilir. Örneğin, CDC20'yi AID (IAA7) etiketiyle etiketlemek için, ileri etiketleme primeri, STOP kodonu (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC) hariç, durdurma kodonundan hemen önce CDC20 geninin 25-40 bazından oluşur
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3') ve ayrıca son primer dizisini (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). Ters CDC20 etiketleme primeri, STOP kodonundan hemen sonra 25-40 baz çiftinin ters tamamlayıcısını içerir (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTATTTTA 3') ve Pringle Plazmid R1 adaptör dizisi (5' gaattcgagctcgtttttaaac 3') son primer dizisini (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). 40 baz çiftinden daha kısa PCR primerlerinin kullanılmasının maya genomuna entegrasyon verimliliğini azaltacağına dikkat etmek de önemlidir.
  2. Primerleri moleküler biyoloji dereceli suda 10 μM'ye seyreltin.
  3. Tablo 2'de yer alan termal döngüleyici programını izleyerek standart yöntemler kullanarak F2 ve R1 plazmit çifti ve uygun etiketleme plazmidi ile PCR gerçekleştirin, ardından agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu onaylayın.
  4. 25 mL Maya özütü Pepton Adenin Dekstroz (YPAD) kültürüne dönüştürmek için maya suşunu aşılayın ve gece boyunca 23 °C'de büyütün. Cdc20-AID mayası oluşturmak için (oksin ile muamele edildiğinde Cdc20'yi bozacaktır), dönüştürülmüş suş ya bir ektopik lokustan eksprese edilen OsTIR1'i zaten içerebilir ya da OsTIR1 daha sonra18'de çaprazlanabilir.
  5. Ertesi sabah, gece kültürünün OD600'ünü kontrol edin. Kültür OD <2.0 ise adım 1.6'ya geçin. OD 2.0 > ise, ~0.2-0.4'e seyreltin ve 2-3 büyüme döngüsüne izin verin.
  6. Logaritmik büyüme aşamasında olduklarından emin olmak için hücreleri OD600 = ~0.4-2.0'da hasat edin. Dönüşüm başına 5 OD hücre toplayın (örneğin, 5 mL OD600 = 1.0). Aynı suşun birden fazla dönüşümü yapılıyorsa, hücreler bu aşamada birleştirilebilir. 23 °C'de 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyerek hücreleri hasat edin.
  7. Süpernatanı atın ve hücre peletini 25 mL su ile yıkayın, ardından 23 °C'de 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 mL 0,1 M Lityum Asetat (LiAc) içinde yeniden süspanse edin ve 1,6 mL tüp(ler)e aktarın. Birden fazla dönüşüm yapıyorsanız, 1 mL'lik yeniden süspansiyonu birden fazla tüpe bölün (örneğin, 2 dönüşüm için 2x 500 μL'ye bölün; 3 dönüşüm için 3x 333 μL'ye bölün, vb.).
  9. Hücreleri 23 °C'de 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  10. Hücre peletine aşağıdakileri ekleyin (bu sırayla): i) 240 μL PEG (%50), ii) 36 μL 1.0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μg Somon Sperm DNA'sı 5 dakika önceden kaynatılmış, iv) 54 μL su.
  11. Hücrelere 10 μL PCR ürünü (adım 1.3'te elde edilir) ekleyin ve her şeyin iyice karıştığından emin olarak 1 dakika vorteksleyin.
  12. Hücreleri 30 °C'de 30 dakika boyunca sıcak bir odada bir silindir tamburunda veya 1000 rpm'de bir termoshaker'da inkübe edin.
  13. Şok hücrelerini 42 °C'de 15 dakika boyunca bir su banyosunda ısıtın.
    NOT: Optimum ısı şoku süresi, maya suşu arka planına bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bu protokol, W303 gerinim arka planı için optimize edilmiştir.
  14. Hücreleri 23 °C'de 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 100 μL su içinde yavaşça yeniden süspanse edin.
  15. KanMX veya diğer ilaç seçimini kullanan dönüşümler için, hücreleri YPAD üzerinde plakalayın ve plakaları 23 °C'de inkübe edin, ardından ertesi gün plakayı ilaç plakasına kopyalayın.
    NOT: YPAD'de bir günlük büyümeye izin vermek, dönüştürülmüş hücrelerde ilaca direnç genlerinin ekspresyonuna izin vermek için kritik öneme sahiptir.
  16. Oksotrofik belirteçler (URA, HIS, vb.) kullanan dönüşümler için, hücreleri doğrudan seçici ortam üzerinde plakalayın.
  17. Maya dönüştürücü kolonilerinin büyümesine izin vermek için plakaları 23 °C'de 3 gün inkübe edin.
  18. Genin doğru etiketlenmesini genomik PCR veya western blotlama ile doğrulayın. Bu yöntemler Burnette25 ve Chu ve ark.26 tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
    NOT: Birden fazla etiketli alel içeren suşlar üretmek için, dönüşüm mutajenik bir süreç olabileceğinden, geri çaprazlama olmadan tekrarlanan dönüşüm önerilmez. Örneğin, Stu2-GFP ve Spc110-mCherry içeren suşu üretmek için, Stu2-GFP ve Spc110-mCherry üretmek için suşları ayrı ayrı dönüştürmeyi, ardından bu alelleri maya çaprazlama, sporülasyon, tetrad diseksiyon ve genotipik analiz ile tek bir haploid suşta birleştirmeyi öneririz. Maya çaprazlamaları hakkında daha fazla bilgi Stansfield ve Stark27 ve Morin ve ark.28'den edinilebilir. α faktörlü bir tutuklama-serbest bırakma gerçekleştirmek için, kullanılan haploid suş MATa olmalıdır.

2. Maya kültürü ve hücre döngüsü senkronizasyonu: α faktörlü tutuklama-serbest bırakma

  1. Mayayı gece boyunca 23 °C'de 25 mL YPAD kültürüne aşılayın, ertesi sabah OD600 = 0.5-2.0'da olun.
    1. Hücreler sabah OD600 = 2.0'ın üzerindeyse, OD600 = 0.2-0.4'e geri seyreltin ve en az 1 hücre döngüsü (23 °C'de 2-3 saat) boyunca büyümelerine izin verin.
  2. Hücreleri OD600 = 0.5'e geri seyreltin ve 1 μg/mL'lik nihai konsantrasyona α faktörü ekleyin (DMSO'da stok 10 mg/mL). Hücreler ideal olarak bir bar1 mutasyonuna (örneğin bar1-1) sahip olur, bu da onları α faktörüne daha duyarlı hale getirir. BAR1 vahşi tip hücreler, α faktöre daha az duyarlıdır ve düzgün bir şekilde tutuklamak için en az bir büyüklük sırası daha yüksek bir α faktörü konsantrasyonu gerektirir, bu da daha az ekonomiktir.
  3. Tutuklamadan 2.5-3.5 saat sonra, tomurcuklanmamış shmooed hücrelerin yüzdesini sayarak tutuklama derecesini kontrol edin. Hücrelerin %90-95'i shmooed olduğunda (G1'de tutuklandığında), serbest bırakmaya devam edin. Zamanlama, maya türüne, büyüme ortamına ve sıcaklığa bağlı olarak değişecektir.
  4. 23 ° C'de 3-5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjde döndürerek ve ardından süpernatantı dökerek hücreleri α faktörlü tutuklamadan serbest bırakın.
  5. Peleti 25 mL YPAD + %1 DMSO içinde yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın.
  6. Toplam üç yıkama için 2.4-2.5 adımlarını iki kez tekrarlayın ve ilk yıkamadan sonra kullanılmış tüpü bir kez değiştirin.
  7. Son hacmi 25 mL'ye getirmek için hücrelere YPAD ekleyin ve hücreleri yeni bir şişeye aktarın.
    NOT: Yeni bir şişe kullanmak, salınımı engelleyebilecek eser miktarda α faktörü kalmasını ortadan kaldırmak için çok önemlidir.
  8. Zaman noktası (0 dakika) numunesi alın ve düzeltin (4.1 ila 4.4 arasındaki adımlardaki sabitleme talimatlarına bakın).
  9. Büyüme 23 °C'de gerçekleşirse, her 15 dakikada bir zaman noktası örnekleri almaya devam edin. Bu zamanlama, hücrelerin ne kadar hızlı büyüdüğüne bağlı olarak diğer sıcaklıklarda değişecektir.
  10. 60 dakikalık zaman noktasında, ışık mikroskobu altında tek tip küçük tomurcukları (tomurcuk boyutu < %25 ana hücre boyutu) kontrol ederek salınımın senkronizasyonunu değerlendirin.
  11. İsteğe bağlı) Serbest bırakmadan 60 dakika sonra, bir sonraki hücre döngüsüne ilerlemeyi önlemek için 1 μg/mL'lik nihai konsantrasyona tekrar α faktörü ekleyin. Eklemeden önce tek tip küçük tomurcuklu morfolojiyi doğrulayarak senkron hücre salınımını onaylayın.
  12. 180 dakikaya kadar veya istediğiniz kadar zaman noktası örnekleri almaya devam edin. 23 °C'de, metafaz salınımdan ~45-60 dakika sonra meydana gelir, anafaz salınımdan ~60-90 dakika sonra meydana gelir ve çoğu hücre, salınımdan 120 dakika sonra yeni G1'de olacaktır.

3. Maya kültürü ve hücre döngüsü senkronizasyonu: Cdc20 tükenme durdurma-serbest bırakma

  1. Ertesi sabah OD600 = 0.5-2.0'da olacak şekilde 23 °C'de bir gece maya kültürünü aşılayın.
    1. Hücreler ertesi sabah OD600 = 2.0'ın üzerindeyse, OD600 = 0.2-0.4'e geri seyreltin ve en az 1 hücre döngüsü (23 °C'de 2-3 saat) boyunca büyümelerine izin verin.
  2. OD600 = 0.5'e geri seyreltin ve tüm kültürlere 1 M stoktan (500x) 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona oksin ekleyin. Diğer ilaçları (nokodazol) alan kültürler için, bunları uygun konsantrasyonda oksin ile eşzamanlı olarak ekleyin (ör., ~10 μg / mL nokodazol).
  3. Tutuklamadan 2 saat sonra, büyük tomurcuklu hücrelerin yüzdesini sayarak tutuklama derecesini kontrol edin (büyük tomurcuklu, tomurcuk varlığı > %25 ana hücre boyutu olarak belirlenir). Hücrelerin %90-95'i mitozda tutukladığında, deneysel uygulamaya bağlı olarak ya numune toplamaya ya da hücreleri tutuklamadan serbest bırakmaya devam edin. Hücrelerin% 90'ı tutuklanmazsa, kültürün büyümeye devam etmesine izin verin ve her 15-30 dakikada bir kontrol edin. Zamanlama, maya türüne, büyüme ortamına ve sıcaklığa bağlı olarak değişecektir.
    NOT: Uzun süreli tutuklamalar hücre canlılığını azaltabileceğinden, serbest bırakılıyorsa tutuklamaların çok uzun süre (4 saatten fazla) devam etmesine izin verilmesi tavsiye edilmez.
  4. Cdc20 tükenme tutuklamasından kurtulmak için, 23 ° C'de 3-5 dakika boyunca 3000 x g'da santrifüjleme yoluyla kültürü hasat edin.
  5. Peleti 25 mL YPAD + %1 DMSO içinde yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın, ardından 23 °C'de 3-5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme yoluyla hasat edin.
  6. Toplam 2 yıkama için 3.4-3.5 adımlarını tekrarlayın.
  7. Son hacmi 25 mL'ye getirmek için hücrelere YPAD ekleyin ve hücreleri yeni bir şişeye aktarın.
    NOT: Yeni bir şişe kullanmak, salınımı engelleyebilecek eser miktardaki oksini çıkarmak için çok önemlidir.
  8. Zaman noktası 0'ı alın ve düzeltin (4.1 ila 4.4 arasındaki adımlardaki sabitleme talimatlarına bakın).
  9. İstenilen zaman kursu uzunluğu için her 10-15 dakikada bir zaman noktaları almaya devam edin. 23 °C'de, çoğu hücre 50-70 dakika sonra tutuklamadan kurtulmuş olacaktır.
    NOT: Hücreler, bu Cdc20 tükenme durmasından α faktörlü tutuklamada olduğu kadar eşzamanlı olarak salınmazlar. Bununla birlikte, anafaz veya mitotik çıkış olaylarını incelemek faydalı olabilir. Ek olarak, bu tutuklama-salınımın teknik bir sınırlaması, salınımdan sonraki zaman noktalarında, henüz salınmamış metafaz hücreleri ile daha önce salınan ve bir sonraki hücre döngüsünün metafazına ulaşan hücreler arasında ayrım yapmanın daha zor olmasıdır. Gerekirse, bu, ya tek tek hücreleri tutuklamadan salınırken izlemek için canlı hücre görüntüleme yaparak ya da mitotik çıkıştan sonra G1'deki hücreleri durdurmak için kültüre α faktörü ekleyerek (hücrelerin MATa olduğu varsayılarak) aşılabilir.

4. Maya fiksasyonu

  1. 23 ° C'de maksimum hızda (~ 20.000 x g) 1 dakika boyunca 1 mL (veya 0,5-1,5 OD) kültürü santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 500 μL fiksatif çözelti (0.1 M potasyum fosfat (KPi) pH 6.4 içinde% 3.7 formaldehit) içinde yeniden süspanse edin.
  3. Hücreleri fiksatif solüsyonda 2-15 dakika inkübe edin.
    23 °C'dir. Zaman süreci deneyleri için, numune alırken santrifüj hücrelerinin zamanlamasını hizalamak için hücrelerin 15 dakika sabitlenmesi genellikle tavsiye edilir.
    NOT: Fiksasyon zamanlaması, ilgilenilen spesifik floroforlar ve proteinler için optimize edilmelidir.
  4. Hücreleri 23 °C'de maksimum hızda 1 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve 500 μL 0,1 M KPi'de (pH 6,4) yeniden süspanse edin. KPi'deki hücreler, görüntüye hazır olana kadar 4 °C'de saklanabilir.
    NOT: Sabit hücre floresan sinyali, florofora bağlı olarak 2 haftaya kadar sürebilir, ancak floresan sinyallerinin nicelleştirilmesi için görüntüleri 7 gün içinde toplayın.

5. Slaytları görüntüleme için hazırlama

  1. Görüntülemeye hazır olduğunda, hücreleri 23 ° C'de maksimum hızda 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 10-100 μL Triton/DAPI/sorbitol çözeltisi (1.2 M sorbitol, %1 triton, 0.1 M KPi, pH 7.5, 2 μg/mL DAPI) içinde yeniden süspanse edin.
  2. ~0,8 μL hücreyi doğrudan temiz bir lamel üzerine pipetleyin. Hücre damlacığını lamel ortasında yaklaşık 1cm2'lik bir daireye nazikçe yaymak için bir pipet ucu kullanın.
  3. Lameli bir mikroskopi lamına yerleştirin. Numuneyi dağıtmak için slaytın etrafına hafifçe bastırmak için bir Kimwipe kullanın.
  4. Lamelin kenarlarını oje ile kapatın.
  5. İsteğe bağlı olarak, hücrelerin yerleşmesine ve aşırı hareketi önlemesine yardımcı olmak için görüntülemeden önce 4-6 saate kadar serin ve karanlık bir yerde saklayın.

6. Görüntüleme

  1. Slaytı 60x/1.42 yağ objektifi ve Kırmızı, Yeşil, Mavi, Uzak Kırmızı lazer ve filtre seti ile donatılmış bir mikroskoba alın. Daha yüksek büyütme hedefleri (100x'e kadar) da kullanılabilir.
  2. Mikroskobu lamel üzerine yapışmış maya hücrelerine odaklayın.
    NOT: Maya hücreleri çok fazla hareket ediyorsa, slaytlar yerleşmesi için 20-60 dakika serin ve karanlık bir yerde bırakılabilir.
  3. Maya odakta olduğunda, her kanalın pozlama ayarlarını en az 3:1'lik bir sinyal-gürültü oranı üretecek şekilde ayarlayın ve floresan punktaların aşırı pozlanmadığından emin olun.
    NOT: Örneğin, bilimsel bir CMOS kamera ile kullandığımız bir görüntüleme sisteminde, kırılma indisi n = 1.516 olan 60x 550 objektif ve daldırma yağı kullanarak, kırmızı kanalın maksimum sinyalini 1000-2000 au'ya, yeşil kanalı 3000 au'ya, mavi kanalı 3000 au'ya ve DIC kanalını 4000-5000 au'ya ayarlayarak yüksek kaliteli görüntüler üretir.
  4. Toplama ayarlarını, toplamda 2-4 μm'ye yayılacak şekilde 14-20 0,2 μm Z-yığını alacak şekilde ayarlayın.
  5. İşlem sonrası modüllerle donatılmış mikroskoplar için, her yığın için Dekonvolüsyon ve Hızlı Projeksiyon'u seçin.
  6. Her koşul veya zaman noktası için ~100-200 hücre yakalamaya yetecek kadar görüntü alarak Z hücre yığınlarını toplayın.
  7. Görüntüleme yazılımından ekran görüntüleri içeren yazılım talimatları için Ek Dosya 1'e bakın.

7. Görüntü analizi

  1. Yansıtılan görüntüleri ImageJ'de açın ve farklı kanalları görüntülemek için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Görüntüleme için kullanılan mikroskobun işlem sonrası modülleri yoksa, bu aşamada Z yığınlarının maksimum projeksiyonunu gerçekleştirin.
  2. Hücre döngüsü ilerlemesini belirlemek için, zaman noktası başına 100 hücre sayın ve bunları bir veya iki çekirdek içerecek şekilde sınıflandırın. Alternatif olarak, hücre döngüsü durumunu tanımlamak için iş mili uzunluğunu veya iş mili kutup gövdeleri arasındaki mesafeyi hesaplayın. Spc110 odakları < 1.5 μm arasındaki mesafe metafaz hücrelerine, 1.5 μm > mesafe ise anafaz hücrelerine karşılık gelir.
  3. Protein punktasının yoğunluklarını hesaplamak için (örneğin, Stu2-GFP), ilgilenilen sinyalin sınırını çizmek için serbest seçim aracını kullanın. Bu sinyali T tuşuna basarak veya Menüyü kullanarak ROI (İlgi Bölgesi) yöneticisine ekleyin. ROI yöneticisinde , seçilen her noktanın yoğunluğunu hesaplamak için Ölç'ü seçin. Puncta sinyalinde zaman içinde meydana gelen değişiklikleri görüntülemek için, her zaman noktası için bir çizgi grafiğinde %95 güven aralığı ile ortalama yoğunluğu çizin.
  4. Bub1-GFP puncta'lı hücrelerin yüzdesini hesaplamak için yeşil kanal minimum ve maksimum parlaklık ayarlarının farklı görüntülerde aynı olduğundan emin olun. Bir Mtw1-mCherry puncta ile örtüşme gösteren bir Bub1-GFP punktasına sahip hücreler, kinetokorda lokalize Bub1 olarak sayılır; aksi takdirde hücre negatif olarak sayılır. Koşul başına ~100 hücre sayın. Aravamudhan ve ark.29 Bub1'in kinetokorlara lokalizasyonu hakkında daha fazla bilgi içermektedir.
  5. Büyük tomurcuklu mononükleer hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, popülasyondaki büyük tomurcuklu ve bir çekirdekli (bir DAPI sinyali) hücre sayısını sayın ve toplam hücre sayısına bölün.
  6. Görüntüleme yazılımından ekran görüntüleri içeren yazılım talimatları için Ek Dosya 1'e bakın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan mikroskobu ile hücre döngüsüne bağlı protein lokalizasyonundaki değişikliklerin analiz edilmesi, burada açıkladığımız yöntemler kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Grubumuz uzun zamandır mitotik milin dinamik düzenlenmesi ve işleviyle ilgilenmektedir. Mayada, iğ kutup gövdeleri (bileşen Spc110 ile işaretlenmiştir), mitotik iğin30 yapisini olusturmak için mikrotübül filamentlerinin yayildigi mikrotübül düzenleme merk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsü senkronizasyonunun kullanılması, çeşitli hücresel süreçler için önemli mekanizmaların incelenmesini sağlar. G1 tutuklama salımlarının α faktörlü tedavi ile kullanılması, hücre döngüsünün aşamaları boyunca bir hücre popülasyonunun senkronize ilerlemesine izin verir ve gösterdiğimiz gibi, Stu236 gibi hücresel düzenleyicilerin dinamik lokalizasyon modellerini ortaya çıkarabilir. Hücre döngüsü tutuklamaları, metafazdaki hücreleri dur...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Delta Vision mikroskop tesisini koruduğu için Utah Üniversitesi Hücre Görüntüleme Çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen NIH hibeleri F31CA2717405 (MGS'ye) ve T32GM141848 (MGS ve TCS'ye), 5 For the Fight (MPM'ye), Pew Biomedical Scholars (MPM'ye) ve NIH hibe R35GM142749 (MPM'ye) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-etkenUtah Üniversitesi Çekirdek Sentez TesisiDizili: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL Eppendorf TüpleriAxygenMCT-175-C
10mM dNTP karışımıTermo BilimselR0193
50 mL konik borularGreiner Bio-One227 261
5x Phusion HF reaksiyon tamponuNew England BioLabsB0518S
Asetik Asit, BuzulFisher ChemicalBP2401C-212
Adenin hemisülfat tuzuSigma-AldrichA9126-100G
Agar, GranüllüApex Kimyasalları ve Reaktifleri20-275
agarozApex Bioresearch Ürünleri20-102GP
Otoklav Amsco Yüzyıl Buharlı SterilizatörSterisSV-1262
otoklavlanmış DI su
AuxinSigma-AldrichCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Lazer SıvısıCargille Laboratuvarları20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40, 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)Moleküler ProblarCat#D1306
Somon testislerinden alınan deoksiribonuklein asit sodyum tuzuSigma-AldrichD1626
DekstrozFisher ChemicalD16-10
Disodyum Etilendiamin TetraasetatFisher ChemicalS811-10
DMSOTermo Bilimsel20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Sabit Hızlı Vortex MikserVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Floresan mikroskop DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESeri #: NV01063. Artık desteklenmiyor
FormaldehitFisher ChemicalCat#F79-500
Jel CihazıTermo BilimselBaykuş Kolay Döküm B1
GeneRuler DNA Merdiven KarışımıFermentalarSM0333
cam boncuklarFisher Scientific11312A
Cam KaydıraklarVWR48300-026
Innova 2300 Platform ShakerNew BrunswickNB-2300
KimwipeKimtech06-666
1.5 mL tüpler için laboratuvar santrifüjEppendorf2525
50 mL tüpler için laboratuvar santrifüjEppendorf5804
Lityum asetat dihidratSigma-AldrichL4158-250G
Master cycler nexus X2Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Mikro-pipetler p2, p20, p200 ve p1000 ile ilgili uçlarRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Mikroskop Kapak CamıFisher Scientific12541014
NokodazolCalbiochemCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705
Turuncu GSigma-AldrichO7252
PİMHampton AraştırmalarıHR2-591
Peptone granüllü Fisher BiyoreagentleriBP9725-5
Füzyon HF DNA PolimerazNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Potasyum fosfat, dibazikTermo Bilimsel424195000
Potasyum fosfat, monobazikTermo Bilimsel424200025
Güç kaynağıBio-Rad23786
Başlat Ultra 1.2.2 Edin.softWoRx CytivaDV Ultra ile Elde Edin
Tris ÜssüFisher BiyoreagentleriBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Tüp rotatörüVWR10136-084
su banyosuVWRWBE10A11B
Su, Ultra SafApex Bioresearch Ürünleri18-194
Maya Ekstraktı GranüllenmişFisher BiyoreagentleriBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nature. 561 (7723), 411-415 (2018).
  3. Litsios, A., et al. Proteome-scale movements and compartment connectivity during the eukaryotic cell cycle. Cell. 187 (6), 1490-1507.e21 (2024).
  4. Satyanarayana, A., Kaldis, P. Mammalian cell-cycle regulation: Several Cdks, numerous cyclins and diverse compensatory mechanisms. Oncogene. 28 (33), 2925-2939 (2009).
  5. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling growth factor signaling and cell cycle progression in individual fibroblasts. J Biol Chem. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  6. Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast, I. detection of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 66 (2), 352-359 (1970).
  7. Forsburg, S. L., Nurse, P. Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu Rev Cell Biol. 7 (1), 227-256 (1991).
  8. Morgan, D. O. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol. 13 (1), 261-291 (1997).
  9. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: Controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  10. Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J. R., Reid, B. J. Genetic control of the cell division cycle in yeast: A model to account for the order of cell cycle events is deduced from the phenotypes of yeast mutants. Science. 183 (4120), 46-51 (1974).
  11. Chan, R. K., Otte, C. A. Isolation and genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by a factor and α factor pheromones. Mol Cell Biol. 2 (1), 11-20 (1982).
  12. Madhani, H. D. From a to alpha: Yeast as a model for cellular differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2007).
  13. Skotheim, J. M., Di Talia, S., Siggia, E. D., Cross, F. R. Positive feedback of G1 cyclins ensures coherent cell cycle entry. Nature. 454 (7202), 291-296 (2008).
  14. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  15. Stern, B. M., Murray, A. W. Lack of tension at kinetochores activates the spindle checkpoint in budding yeast. Curr Biol. 11 (18), 1462-1467 (2001).
  16. Lim, H. H., Goh, P. Y., Surana, U. Cdc20 is essential for the cyclosome-mediated proteolysis of both Pds1 and Clb2 during M phase in budding yeast. Curr Biol. 8 (4), 231-237 (1998).
  17. Chan, L. Y., Amon, A. Spindle position is coordinated with cell-cycle progression through establishment of mitotic exit-activating and -inhibitory zones. Mol Cell. 39 (3), 444-454 (2010).
  18. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  19. Gillett, E. S., Espelin, C. W., Sorger, P. K. Spindle checkpoint proteins and chromosome-microtubule attachment in budding yeast. J Cell Biol. 164 (4), 535-546 (2004).
  20. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  21. Yeong, F. M., Lim, H. H., Padmashree, C. G., Surana, U. Exit from mitosis in budding yeast. Mol Cell. 5 (3), 501-511 (2000).
  22. Uhlmann, F., Wernic, D., Poupart, M. A., Koonin, E. V., Nasmyth, K. Cleavage of cohesin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast. Cell. 103 (3), 375-386 (2000).
  23. Wäsch, R., Cross, F. R. APC-dependent proteolysis of the mitotic cyclin Clb2 is essential for mitotic exit. Nature. 418 (6897), 556-562 (2002).
  24. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  25. Burnette, W. N. "Western blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).
  26. Chu, J. H., Yeast, A. M. Yeast colony PCR: it doesn't get any easier than this. , https://www.protocols.io/view/yeast-colony-pcr-it-doesn-t-get-any-easier-than-th-gzwbx7e (2017).
  27. Stansfield, I., Stark, M. J. Yeast genetics and strain construction. Methods Microbiol. 36, 23-43 (2007).
  28. Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci. J Vis Exp. (27), e1146(2009).
  29. Aravamudhan, P., Chen, R., Roy, B., Sim, J., Joglekar, A. P. Dual mechanisms regulate the recruitment of spindle assembly checkpoint proteins to the budding yeast kinetochore. Mol Biol Cell. 27 (22), 3405-3417 (2016).
  30. Kilmartin, J. V. Lessons from yeast: the spindle pole body and the centrosome. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1650), 20130456(2014).
  31. Brouhard, G. J., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  32. Zahm, J. A., Stewart, M. G., Carrier, J. S., Harrison, S. C., Miller, M. P. Structural basis of Stu2 recruitment to yeast kinetochores. Elife. 10, e65389(2021).
  33. Wang, P. J., Huffaker, T. C. Stu2p: A microtubule-binding protein that is an essential component of the yeast spindle pole body. J Cell Biol. 139 (5), 1271-1280 (1997).
  34. Severin, F., Habermann, B., Huffaker, T., Hyman, T. Stu2 promotes mitotic spindle elongation in anaphase. J Cell Biol. 153 (2), 435-442 (2001).
  35. van Breugel, M., Drechsel, D., Hyman, A. Stu2p, the budding yeast member of the conserved Dis1/XMAP215 family of microtubule-associated proteins is a plus end-binding microtubule destabilizer. J Cell Biol. 161 (2), 359-369 (2003).
  36. Stewart, M. G., Carrier, J. S., Zahm, J. A., Harrison, S. C., Miller, M. P. A coordinated kinase and phosphatase network regulates Stu2 recruitment to yeast kinetochores. J Cell Biol. 224 (8), e220410196(2025).
  37. London, N., Ceto, S., Ranish, J. A., Biggins, S. Phosphoregulation of Spc105 by Mps1 and PP1 regulates Bub1 localization to kinetochores. Curr Biol. 22 (10), 900-906 (2012).
  38. Lampson, M. A., Grishchuk, E. L. Mechanisms to avoid and correct erroneous kinetochore-microtubule attachments. Biology (Basel). 6 (1), 1-15 (2017).
  39. Samson, F., Donoso, J. A., Heller-Bettinger, I., Watson, D., Himes, R. H. Nocodazole action on tubulin assembly, axonal ultrastructure and fast axoplasmic transport. J Pharmacol Exp Ther. 208 (3), 411-417 (1979).
  40. Banerjee, A., Deshaies, R. J., Chau, V. Characterization of a dominant negative mutant of the cell cycle ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34. J Biol Chem. 270 (44), 26209-26215 (1995).
  41. Jones, M. H., et al. Chemical genetics reveals a role for Mps1 kinase in kinetochore attachment during mitosis. Curr Biol. 15 (2), 160-165 (2005).
  42. Valenti, R., et al. A proteome-wide yeast degron collection for the dynamic study of protein function. J Cell Biol. 224 (2), e202409050(2025).
  43. Sepers, J. J., et al. The mIAA7 degron improves auxin-mediated degradation in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 12 (10), jkac222(2022).
  44. Yesbolatova, A., et al. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat Commun. 11 (1), 5701(2020).
  45. Feng, W., et al. Genomic mapping of single-stranded DNA in hydroxyurea-challenged yeasts identifies origins of replication. Nat Cell Biol. 8 (2), 148-155 (2006).
  46. Osborn, A. J., Elledge, S. J., Zou, L. Checking on the fork: the DNA-replication stress-response pathway. Trends Cell Biol. 12 (11), 509-516 (2002).
  47. An, Z., et al. Autophagy is required for G1/G0 quiescence in response to nitrogen starvation in Saccharomyces cerevisiae. Autophagy. 10 (10), 1702-1711 (2014).
  48. Smets, B., et al. Life in the midst of scarcity: adaptations to nutrient availability in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 56 (1), 1-32 (2010).
  49. Haase, S. B., Lew, D. J. Flow cytometric analysis of DNA content in budding yeast. Methods Enzymol. 283, 322-332 (1997).
  50. Touati, S. A., Kataria, M., Jones, A. W., Snijders, A. P., Uhlmann, F. Phosphoproteome dynamics during mitotic exit in budding yeast. EMBO J. 37 (10), e98745(2018).
  51. Baro, B., et al. SILAC-based phosphoproteomics reveals new PP2A-Cdc55-regulated processes in budding yeast. Gigascience. 7 (5), giy053(2018).
  52. Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast. J Vis Exp. (122), e55610(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles