Method Article

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik hücreler, DNA bakımı ve organel homeostazı dahil olmak üzere çeşitli süreçleri düzenleyen korunmuş bir hücre döngüsünü takip eder. Hücresel süreçleri hücre döngüsüne bağlı bir şekilde incelemek, deneysel sonuçları doğru bir şekilde yorumlamak için genellikle gereklidir. Omurgalı modelleri de dahil olmak üzere geniş bir organizma yelpazesinde kültürlenmiş hücrelerde hücre döngüsü senkronizasyonu üretmek için hücre döngüsüne bağlı süreçlerin incelenmesini sağlayan kimyasal ve genetik yöntemler mevcuttur. Bununla birlikte, model organizmalar arasında tomurcuklanan maya, özellikle sağlam senkronizasyon yöntemleri, kısa üretim süresi ve genetik izlenebilirliği nedeniyle hücre döngüsü analizi için bir güç merkezi olmaya devam etmektedir. Maya, çekirdek hücre döngüsü mekanizmasını diğer ökaryotlarla paylaşır ve bu da hücre döngüsü düzenlemesinde dönüm noktası niteliğindeki keşifleri mümkün kılar. Bu protokol, suş yapımı, kültür hazırlama ve mikroskopi dahil olmak üzere G1 tutuklama-serbest bırakma ve mitotik tutuklama-bırakma deneylerine odaklanarak mayada hücre döngüsü analizi yöntemlerini detaylandırır. Hücre döngüsü tutuklamaları ve floresan mikroskobu için uygun suşların üretilmesine yönelik PCR etiketleme yöntemleri sunulmaktadır. Peptit feromon α faktörü kullanılarak bir G1 tutuklaması elde edilir ve kısa yıkamalar senkron salınım ve hücre döngüsü ilerlemesi ile sonuçlanır. Numuneler, hücre döngüsüne salındıktan sonra farklı zaman noktalarında alınır ve mikroskopi için sabitlenir. İkinci bir yöntem, metafaz tutuklu bir popülasyon elde etmek için hücre döngüsü düzenleyicisi Cdc20'yi tüketerek ve ayrıca isteğe bağlı olarak anafaza salınarak maya hücrelerini mitozda durdurur. Numuneler sabitlenir ve serbest bırakma öncesi ve sonrası görüntüleme için hazırlanır ve görüntülenir ve analiz edilir. Görüntü analizi, hücre döngüsündeki proteinlerin dinamik lokalizasyonunu ve popülasyon bolluğu değişikliklerini kataloglamaya odaklanır. Bu senkronizasyon yöntemleri, çeşitli hücre döngüsü manipülasyonları için uygundur ve burada sabit hücrelerin görüntülenmesinde kullanımları vurgulanırken, canlı hücre görüntülemenin yanı sıra biyokimyasal ve moleküler analizler de dahil olmak üzere diğer birçok analiz için uyarlanabilirler.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik hücre bölünmesi, hücre döngüsü adı verilen bir program aracılığıyla yüksek oranda düzenlenir. Hücre döngüsünde meydana gelen yüksek oranda korunmuş ve dinamik süreçler, kendi içinde çalışmayı ilginç kılar, ancak aynı zamanda diğer hücre biyolojik süreçlerinin araştırmalarını bilgilendiren geniş kapsamlı çıkarımlara sahiptir - örneğin, birçok organel, hücre bölünmesi sırasında dramatik bir yeniden şekillenmeye uğrar ve birçok proteinin bolluğu ve lokalizasyonu, 1,2,3 boyunca yüksek oranda düzenlenir. Metazoan sistemlerinde, maya ile ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre döngüsü analizi ve görüntüleme için suşların oluşturulması

  1. Pringle Etiketleme Plazmitleri (pFA6a plazmitleri)24 kullanarak ilgilenilen geni C-terminal olarak etiketlemek için primerler tasarlayın. Kısacası, bir pFA6a serisi plazmit ile kullanıldığında, ilgilenilen genin 'etiketlenmiş' bir versiyonunu oluşturmak için doğrudan mayaya dönüştürülebilen bir PCR ürünü üreten F2 ve R1 primerleri tasarlayın. Bu protokolde ilgilenilen genleri etiketlemek için Tablo 1'de bulunan primer çiftlerini ve plazmitleri kullanın. Maya genlerinin C-terminal etiketlemesi için plazmit ve primer ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan mikroskobu ile hücre döngüsüne bağlı protein lokalizasyonundaki değişikliklerin analiz edilmesi, burada açıkladığımız yöntemler kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Grubumuz uzun zamandır mitotik milin dinamik düzenlenmesi ve işleviyle ilgilenmektedir. Mayada, iğ kutup gövdeleri (bileşen Spc110 ile işaretlenmiştir), mitotik iğin30 yapisini olusturmak için mikrotübül filamentlerinin yayildigi mikrotübül düzenleme merk.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsü senkronizasyonunun kullanılması, çeşitli hücresel süreçler için önemli mekanizmaların incelenmesini sağlar. G1 tutuklama salımlarının α faktörlü tedavi ile kullanılması, hücre döngüsünün aşamaları boyunca bir hücre popülasyonunun senkronize ilerlemesine izin verir ve gösterdiğimiz gibi, Stu236 gibi hücresel düzenleyicilerin dinamik lokalizasyon modellerini ortaya çıkarabilir. Hücre döngüsü tutuklamaları, metafazdaki hücreleri dur.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Delta Vision mikroskop tesisini koruduğu için Utah Üniversitesi Hücre Görüntüleme Çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen NIH hibeleri F31CA2717405 (MGS'ye) ve T32GM141848 (MGS ve TCS'ye), 5 For the Fight (MPM'ye), Pew Biomedical Scholars (MPM'ye) ve NIH hibe R35GM142749 (MPM'ye) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-etkenUtah Üniversitesi Çekirdek Sentez TesisiDizili: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL Eppendorf TüpleriAxygenMCT-175-C
10mM dNTP karışımıTermo BilimselR0193
50 mL konik borularGreiner Bio-One227 261
5x Phusion HF reaksiyon tamponuNew England BioLabsB0518S
Asetik Asit, BuzulFisher ChemicalBP2401C-212
Adenin hemisülfat tuzuSigma-AldrichA9126-100G
Agar, GranüllüApex Kimyasalları ve Reaktifleri20-275
agarozApex Bioresearch Ürünleri20-102GP
Otoklav Amsco Yüzyıl Buharlı SterilizatörSterisSV-1262
otoklavlanmış DI su
AuxinSigma-AldrichCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Lazer SıvısıCargille Laboratuvarları20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40, 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür)Moleküler ProblarCat#D1306
Somon testislerinden alınan deoksiribonuklein asit sodyum tuzuSigma-AldrichD1626
DekstrozFisher ChemicalD16-10
Disodyum Etilendiamin TetraasetatFisher ChemicalS811-10
DMSOTermo Bilimsel20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Sabit Hızlı Vortex MikserVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Floresan mikroskop DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESeri #: NV01063. Artık desteklenmiyor
FormaldehitFisher ChemicalCat#F79-500
Jel CihazıTermo BilimselBaykuş Kolay Döküm B1
GeneRuler DNA Merdiven KarışımıFermentalarSM0333
cam boncuklarFisher Scientific11312A
Cam KaydıraklarVWR48300-026
Innova 2300 Platform ShakerNew BrunswickNB-2300
KimwipeKimtech06-666
1.5 mL tüpler için laboratuvar santrifüjEppendorf2525
50 mL tüpler için laboratuvar santrifüjEppendorf5804
Lityum asetat dihidratSigma-AldrichL4158-250G
Master cycler nexus X2Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Mikro-pipetler p2, p20, p200 ve p1000 ile ilgili uçlarRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Mikroskop Kapak CamıFisher Scientific12541014
NokodazolCalbiochemCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705
Turuncu GSigma-AldrichO7252
PİMHampton AraştırmalarıHR2-591
Peptone granüllü Fisher BiyoreagentleriBP9725-5
Füzyon HF DNA PolimerazNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Potasyum fosfat, dibazikTermo Bilimsel424195000
Potasyum fosfat, monobazikTermo Bilimsel424200025
Güç kaynağıBio-Rad23786
Başlat Ultra 1.2.2 Edin.softWoRx CytivaDV Ultra ile Elde Edin
Tris ÜssüFisher BiyoreagentleriBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Tüp rotatörüVWR10136-084
su banyosuVWRWBE10A11B
Su, Ultra SafApex Bioresearch Ürünleri18-194
Maya Ekstraktı GranüllenmişFisher BiyoreagentleriBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles