Yöntem makalesi

İki katmanlı mikroakışkan cihaz kullanarak doku homeostazının elektromekanik kontrolünün ortaya çıkarılması

DOI:

10.3791/68894

⸱

19 Eylül 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, epitel dokusu homeostazının elektromekanik regülasyonunu incelemek için benzersiz bir iki katmanlı mikroakışkan cihaz üretmek için bir protokol sunuyoruz. Cihaz, doku düzlemine dik olarak statik fizyolojik elektrik akımları uygulayarak hücre-hücre yapışmasını, çoğalmasını ve ekstrüzyonunu etkiler. Canlı hücre görüntüleme ve mekanik stres ölçümleri, bu süreçlerin mekanizmalarını ortaya çıkarır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre davranışı ve hücre kaderi, endojen veya harici olarak uygulanan elektrik akımlarından veya alanlardan etkilenir. Statik elektrik sinyalleri, gelişim, yara iyileşmesi ve homeostaz gibi yavaş fizyolojik süreçlerde elektrik ortamını taklit etmek için özelleştirilmiş mikroakışkan cihazlarda uygulanabilir. Hücresel elektrik çalışmalarının önemli bir sınıfı, ~0.1-1000 A/m2 akım yoğunlukları ile yara akımlarını taklit eden basit mikroakışkan kanallarda statik düzlem içi galvanik akımlarla hücre göçünün kontrolüdür. Bununla birlikte, uyumsuz geometri nedeniyle, bu cihazlar, hücrelerin apiko-bazal polariteyi ve bir transepitelyal potansiyel farkını (TEPD) benimsediği doku homeostazındaki elektriksel etkileri incelemek için uygun değildir. Burada, TEPD'yi bozmak ve doku kararlı durumlarının elektriksel düzenlemesini araştırmak için birleşik epitel hücre katmanlarının düzlemine dik fizyolojik iyon akımları uygulayan benzersiz bir mikroakışkan tabanlı cihazı detaylandırıyoruz. Kurulum, tercih edilen hücre dışı matris proteini ile kaplanmış yumuşak, poliakrilamid jel substrat ile gömülü iki katmanlı UV ile kürlenebilen bir polimerden yapılmıştır. Bu mikroakışkan cihaz, sentometrik ölçekteki hücre katmanları boyunca nispeten düzgün bir iyon akımı indüklemek için doğru geometriyi ve geçirgen substratı sağlar. Kurulum, transepitelyal akımların neden olduğu mekanik gerilimleri anlamak için konfokal canlı hücre görüntüleme ve Çekiş Kuvveti Mikroskobu ile uyumludur. Çarpıcı bir şekilde, hücrelerin çoğalması, ekstrüzyonu ve göçü, iyon akımının yönüne bağlı olarak birleşik epitel içinde toplu olarak etkilenir ve farklı hücre-hücre etkileşim güçleri, hücre olayları (ölüm ve çoğalma) ve doku yapıları ile karakterize edilen yeni bir doku durumunu indükler. Elektrikle kontrol edilen hücre davranışları, elektrikle indüklenen mekanik stres ve hücre tepkisi olarak anlaşılabilir. Bu yeni mikroakışkan cihaz ve protokol, mekanobiyoloji ve biyomühendislik topluluklarının doku homeostazındaki elektriksel etkileri incelemesi ve yeni doku mühendisliği uygulamaları geliştirmesi için gerekli araç ve belgeleri sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyoelektrik sinyaller, hücre davranışını yönetmeye katkıda bulunan önemli biyofiziksel faktörlerdir. En ünlü örnek, elektrik sinyallerini uzun mesafelerde (bir metreye kadar) ve yüksek frekanslarda (yüzlerce Hertz'e kadar) ileten nöronlar ve kalp hücrelerindeki aksiyon potansiyelidir.1. Elektrotlarla uygulanan elektrik darbeleri, aksiyon potansiyeli ateşlemesini uyarmak için kullanılabilir ve araştırma ve tıbbi uygulamalarda faydalıdır2. Gelişim, yara iyileşmesi ve homeostaz 3,4,5,6,7,8 gibi yavaş fizyolojik süreçlerdeki endojen biyoelektrik sinyaller de saatler ila günler arasında 9,10 ölçülmüştür. Önemli bir örnek, birkaç ila onlarca milivolt 4,11 arasında değişen bir transepitelyal potansiyel farkını (TEPD) aktif olarak koruyan birleşik epitel katmanlarıdır. Bu birleşik katmanlardaki bir kesik veya yara, dokunun12,13 elektriksel aktivitesi tarafından yönlendirilen bir kısa devre akımı üretir. Onlarca μA/cm2'ye kadar yara akımları ve yüzlerce mV/mm'ye kadar elektrik alanları farklı tekniklerle bildirilmiştir. Çalışmalar, bu elektrik sinyallerinin, hücrelerin iyileşme süreci için önemli olan yara veya enfeksiyon bölgelerine göç etmeleri için yönlü bir ipucu ürettiğini göstermektedir 3,6,14. Genel olarak, hem statik (veya yavaş değişen) hem de hızlı değişen elektrik sinyalleri önemlidir ve farklı hücre veya doku tepkilerini tetikler.

Yavaş değişen sinyaller alanında önemli bir olgu, "galvanotaksi" olarak adlandırılan elektrikle yönlendirilen göç sürecidir. Kontrollü düzlem içi galvanik akımlar, yara akımlarını taklit etmek için basit kanallara sahip mikroakışkan cihazlarda uygulanabilirken, hücre göçü akım yoğunluğunun15,16 bir fonksiyonu olarak araştırılır. 0.1-1000 V/m'lik elektrik alanlarının (karşılık gelen 0.1-1000 A/m2 akım yoğunluğu) bu in vitro ayar17'de birçok hücre tipinde hücre göçünü yönlendirdiği bulunurken, kemotaksiye kanonik sinyal yolları (kimyasal gradyanlar tarafından yönlendirilen hücre göçü), PI3K gibi, galvanotaksis 7,18'de rol oynamıştır. Galvanotaksis çalışması için "çıplak" mikroakışkan cihazlar, standart yumuşak litografi ve mikrofabrikasyon teknikleri ile üretilebilir19. Bu cihazlar tipik olarak bir cam slayta (kanal kesit boyutu: yüzlerce mikrometre, uzunluk: santimetre) bağlanmış tek kanallı bir polidimetil-siloksan (PDMS) substratı içerir. Statik akımı sağlamak için kullanılan elektrotlar, hücre bölgesinden uzağa kurulur ve tuz köprüleri ile veya tuz köprüleri olmadan bağlanır. Tuz köprüsü bağlantısı, PDMS substratı, mikroakışkan konektörler ve agar ile doldurulmuş borular boyunca delinmiş deliklerle yapılabilir. Kanalın altındaki basit cam slayt (tipik olarak 170 μm kalınlığında), süreci incelemek için çok önemli bir özellik olan galvanotaksi deneyleri sırasında yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemeyi de destekler.

Endojen elektrik sinyallerinin doku homeostazının korunmasındaki rolü, yara iyileşmesine göre çok daha az anlaşılmıştır. Önemli bir neden, sağlam dokularda bu etkileri incelemek için uygun araçların olmamasıdır. Galvanotaksis için mikroakışkan cihaz, yalnızca düzlem içi elektrik akımlarını destekleyen geometrisi nedeniyle bu amaç için uygun değildir. Epitelyal homeostaz bağlamında, birleşik bir epitel tabakası boyunca TEPD'yi veya düzlem dışı akımları kontrol etmek ve bozmak için yeni bir cihaza ihtiyaç vardır. Bir tek tabaka boyunca nispeten düzgün bir iyon akımı yoğunluğu uygulama amacına ulaşmak için, cihaz geometrisi, malzeme kullanımı ve yerinde biyomekanik ölçüm yeteneklerinde yeniliklere sahip bir mikroakışkan cihaz tasarladık ve ürettik4. İkinci yetenek önemlidir, çünkü elektriksel etkiler, bu özellik ile incelenebilen biyomekanik ve mekanobiyoloji yolakları ile birleşerek hücre davranışını etkileyebilir.

Bu yeni cihaz birçok yenilikçi özellik sergiliyor. Galvanotoksis cihazlarında bulunan tek kanal yerine iki katmanlı olarak tasarlanmıştır (geometride yenilik), elektrot odalarına olan bağlantıyı ikincisindekine benzer tutar. Birinci mikroakışkan tabaka, iyon akımlarını doku bölgesine (veya doku bölgesinden uzağa) yönlendirmek için kanallara sahipken, ikinci tabaka, bu akımı bu ikinci mikroakışkan tabakanın üzerinde oturan epitel boyunca dik olarak yönlendirecek bir açıklığa sahiptir (Şekil 1A,B). Mikrofabrikasyon teknikleri, numune kalınlığını artıran mikroakışkan katmanların istiflenmesine rağmen yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemenin mümkün olacağı şekilde yeterince ince katmanlar üretmek için kullanılır. Diğer önemli yenilikler için, cihazın ortasına çok önemli bir rol oynayan bir poliakrilamid (PA) sentetik hidrojel eklenmiştir (Şekil 1A,B). Bu jelin fiziko-kimyasal özellikleri, hücre dışı matris proteinlerini kaplamak için mevcut kimya, iyonlara geçirgenlik ve bilinen elastikiyet gibi, sırasıyla hücre bağlanması ve büyümesi, düzlem dışı akımların uygulanması ve elektrik stimülasyonu sırasında mekanik stresin20 ölçülmesi için gereklidir. Bariyer yapıları, önceki mikroakışkan cihazlarda21 yapıldığı gibi, PA jel öncü çözeltisinin hapsedilmesi için doku bölgesinin Katman 1'ine dahil edilir (Şekil 1A,B). Son olarak, PA jel polimerizasyonu, oksijen gazı geçirgen PDMS yüzeylerinde oksijenle inhibe edildiğinden, cihaz imalatı için PA jelinin polimerizasyonuna ve sıkı bağlanmasına izin verebilen başka bir malzeme22 kullanılır. Yeni cihazın çalışması için tüm yenilikçi özellikler çok önemlidir.

Genel olarak, sağlam dokuların homeostazında statik veya yavaş değişen biyoelektrik sinyallerin derinlemesine incelenmesi, protokolü aşağıda ayrıntılı olarak açıklanacak olan bu yeni cihazla mümkün olmaktadır. Burada atıfta bulunulan protokol ve sonuçlar, hücre olayları (proliferasyon, ölüm ve ekstrüzyon ve göç) ve elektrik akımının neden olduğu doku yapısal değişiklikleri dahil olmak üzere Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II) epitel hücre hattına odaklanmıştır. Bu çalışmalar aynı zamanda epitel taşınmasının elektriksel düzenlemesini ve hücre olaylarının indüklenmesini ve hücre katmanlarında ve birincil hücreler ve 2D organoidler gibi daha karmaşık sistemlerde hücre kaderi değişikliklerini incelemek için bu tekniği uygulamakla ilgilenen araştırmacılar için de öğreticidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol, statik elektrik akımları uygulayan ve birleşik epitelin TEPD'sini bozan bir kurulum oluşturmak ve etkilerini canlı hücre görüntüleme ve mekanobiyoloji teknikleriyle incelemek için adımlar sağlar (Şekil 1). Kurulum, mikroskopta çoğullanmış deneyler için birden fazla cihazı barındırmak üzere kartuşlara, eklere ve tutuculara bağlı mikroakışkan çiplerden yapılmış cihazlardan, bir kaynak ölçere ve cihazlara bağlı bir çift elektrot odasından ve uygun canlı hücre koşullarının korunması için bir canlı hücre odası kapağından oluşur (Şekil 1C). Kartuşun ve kurulumun diğer önemli bileşenlerinin tasarım ilkeleri ve CAD dosyası çizimleri Ek Dosya 1'de bulunabilir. Adımlar şunları içerir: 1) PDMS yumuşak litografi; 2) Çip imalatı ve cihaz montajı; 3) Kurulum tamamlandı; ve 4) Tek katmanlı büyüme ve canlı hücre deneyleri. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve malzemeler ile ilgili ayrıntılı bilgi Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. PDMS yumuşak litografi

NOT: Bu bölüm, mikroakışkan çipin UV ile kürlenebilen yapışkan bazlı katmanlarını kalıplamak için SU-8 gofretlerinden (Şekil 2A, B) PDMS elastomerlerinin üretilmesini detaylandırmaktadır.

  1. PDMS yumuşak litografi
    1. Fotolitografi tekniklerini kullanarak her bir mikroakışkan katman, Katman 1 ve 2 için ayrı bir SU-8 bazlı gofret üretin (Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3).
      NOT: Bir mikrofabrikasyon/temiz oda tesisine bir talep gönderilirse, gofret üretimi bir ay sürebilir. Gofret üretimi için silikon aşındırma tekniği de kullanılabilir.
    2. PDMS'nin kalıptan çıkarılmasına izin vermek için silikon gofreti silanize edin19.
      1. Gofreti basınçlı nitrojen hava üfleme tabancasıyla temizleyin. Kısa bir oksijen plazma işlemi (1-3 mbar'lık bir reaktör basıncında 20 sccmO2 gaz akışında 30 s, 30 W) uygulayarak gofretin yüzeyini etkinleştirin23.
      2. Temiz bir plastik kapağa (çap 60 mm, yükseklik 15 mm) 200 μL Tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil-1-triklorosilan pipetleyin. Kapağı vakumlu kurutucuya gofretin yanına koyun (sadece silanizasyon için). Vakum pompasını açın ve buharlaşan silan silikon gofret üzerinde tek tabaka halinde biriktirilirken 1-2 saat bekleyin.
        DİKKAT: Silan aşındırıcı ve zehirlidir. Güvenli çalışmayı sağlamak için eldiven ve koruyucu gözlük takın ve çeker ocakta çalıştırın.
        NOT: 10-20 adet PDMS kalıbı üretmek için yeni silanize edilmiş bir gofret kullanılabilir. Vakum süresi, vakum pompasının durumuna bağlıdır. Aşırı silanizasyon, eşit olmayan kalınlığa neden olur ve kaçınılması gereken bulanık bir görünüme neden olur. Gofreti kullanılmadığı zaman nem kontrollü odalarda saklayın. Yeni gofretlerden yapılan PDMS yapıları, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak kontrol edilebilir.
    3. Yeterli miktarda baz PDMS reçinesini ve çapraz bağlama maddesini (w:w = 10:1 ve 70-80 g) bir Petri kabında (çap 150 mm, yükseklik 25 mm) birkaç dakika boyunca iyice karıştırın. Karışımda küçük kabarcıkların eşit şekilde oluştuğundan emin olun, bu da iyi bir karışımı doğrular. Karışımı 50 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve hava kabarcıklarını iyice gidermek için 550 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
      NOT: PDMS sıvısı yapışkandır ve temizlenmesi zordur; dökerken dikkatli olun. Tezgah yüzeyleri dökülen PDMS karışımı ile kirlenmişse izopropanol ile temizleyin.
    4. PDMS karışımını, düz tabanlı plastik veya cam bir tabağa (çap 150 mm, yükseklik 25 mm) gofret üzerine yavaşça dökün, ardından PDMS'yi gofretin altından boşaltmak için gofreti aşağı doğru bastırın. Bir vakum pompası ile karışımın gazını alın.
      NOT: Sıvı PDMS'nin gofretin altından temizlenmesi önemlidir; alttaki kalın bir PDMS tabakası, levhanın plastik tabaktan çıkarılmasını zorlaştırarak levhanın parçalanma olasılığını artırır. Alternatif olarak, PDMS gofretin kenarı boyunca kesilebilir ve gofreti petri kabında tutabilir. Daha sonraki imalat adımlarında kalıbın esnekliğini sağlamak için Katman 1 için PDMS kalınlığının yaklaşık 1,5 mm olduğundan emin olun. Daha sonraki imalat adımlarında sarkma olasılığını azaltmak için Katman 2 için PDMS kalınlığının yaklaşık 2,5 mm olduğundan emin olun. PDMS kalıpları ihtiyaç duyulan şekillerde kesildikten sonra PDMS kalınlığı bir cetvelle ölçülür.
    5. PDMS'yi 80 °C'de 2 saat fırında kürleyin ve işlem sırasında yemeğin mümkün olduğunca yatay olarak yerleştirildiğinden emin olun. PDMS kalıbının ve gofretin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Keskin bir cerrahi bıçak ve yastıklı cımbız kullanarak PDMS kalıbını gofretten tamamen dikkatlice çıkarın.
      NOT: Gofretin yüzeyini çizmemeye dikkat edin. PDMS soyulduğunda gofret yüzeyinde PDMS kalıntılarının oluşup oluşmadığını kontrol edin. Bu, gofret yüzeyinin yeniden silanlaştırılması gerektiğinin sinyalini verir.
    6. PDMS kalıbını ilgilenilen özellikleri içeren bloklar halinde kesin ve bu blokları kullanılmadığında temiz Petri kaplarında (çap 150 mm, yükseklik 25 mm) veya bir vakum odasında saklayın. Temel özelliklere dokunmadan PDMS kalıbını manipüle edin.

2. Çip imalatı ve cihaz montajı

NOT: Mikroakışkan çipi PDMS kalıplama yoluyla üretmek için düşük viskoziteli, UV ile kürlenebilen bir polimer (maksimum UV absorpsiyon aralığı 350-380 nm) kullanın. UV ile kürlenebilen yapıştırıcı, poliakrilamid (PA) hidrojelin şeffaf, iyon geçirgen ve elastik bir hücre substratı olarak entegrasyonuna olanak tanır. PA jelin özellikleri, onu canlı hücre görüntülemeye ve statik akım stimülasyonuna izin veren bir doku mekanik stres sensörü olarak destekler. Çip son olarak kültür ortamını barındıran ve elektrot odalarına bağlanan bir kartuşa bağlanacak.

  1. Cam lamel tabanı hazırlığı
    1. Kartuş boyutlarına uyması için gerekli miktarda dikdörtgen cam lamel (170 μm) elmas kesici ile 37 × 24mm2 boyutunda çentik atın (Ek Dosya 4).
      NOT: Lamel, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumlu 170 μm kalınlığa sahiptir, ancak kırılgandır ve dikkatli kullanım gerektirir. Eldiven ve göz koruması kullanın. Dikdörtgen cam lamellerin herhangi bir görünür çatlak ortaya çıkması durumunda dikdörtgen cam lamellerin hemen atılması gerekir, çünkü bu dikdörtgen cam lamellerin talaşları sızıntı riski oluşturabilir. Alternatif olarak, lamel üreticilerinden doğru boyutta lameller sipariş edin. Dikdörtgen cam lamellerin yüzeylerine çıplak elle dokunmaktan kaçının ve görüntüleme kalitesini bozabilecek lekeler bırakın.
    2. Dikdörtgen lamellerin üst üste gelmeden temiz bir Petri kabına koyun ve bir plazma odasına aktarın. Bir vakum koşulu oluşturun, ancak sonunda biraz hava girmesine izin verin. Dikdörtgen cam lamellerin yüzeylerini hava plazması kullanarak etkinleştirin (ekipmanın durumuna bağlı olarak 30 s ila 5 dakika, 29,6 W)
      NOT: Sonraki adımda (adım 2.1.3) yalnızca plazmaya tamamen maruz kalan taraflar (yani üst yüzeyler) kullanılmalıdır. Plazma maruziyetinden sonraki 30 dakika içinde adım 2.1.3'ü tamamlayın. Hava plazması üretilmişse hazne bu aşamada Pembe-Mor olarak görünmelidir. Sonraki yapıştırma adımları başarılı olursa, kolaylık sağlamak için plazma süresini azaltın.
    3. %100 etanol içinde çözülmüş %0.3 asetik asit ve %0.5 3-(trimetoksisilil)propil metakrilattan yapılmış 10 mL yüzey işleme çözeltisi hazırlayın. UV ile kürlenebilen yapışkan bazlı mikroakışkan katmanlarla iyi bir yapışma sağlamak için dikdörtgen cam lamellerin bu solüsyona bir Petri kabında (çap 150 mm, yükseklik 25 mm) bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca muamele edin. Dikdörtgen cam lamellerin solüsyona tamamen daldırıldığından ve her iki tarafın da işlendiğinden emin olun.
      DİKKAT: Yüzey işleme solüsyonu aşındırıcıdır. Çeker ocakta tutun.
    4. Dikdörtgen cam lamellerin işlem sırasında kurumasına izin vermeden üç kez %100 etanol ile durulayın. Dikdörtgen cam lamellerin nitrojen gazı ve üfleme tabancası ile tek tek kuruması. Lameli taban yüzeylerinden sıvı damlacıklarını temiz bir şekilde temizleyen ve sıvı lekelerini önleyen yeterli bir üfleme hızı sağlayın. Dikdörtgen cam lamel fişlerini temiz bir Petri kabında saklayın (çap 150 mm, yükseklik 25 mm).
      NOT: Hava akışını lamel tabanlarına paralel yönlendirmek için bir üfleme tabancası kullanın ve camların kırılmasını önlemek için aşırı üfleme hızı kullanmaktan kaçının.
  2. Katman 1 imalatı (Şekil 2C)
    1. Temiz bir Katman 1 PDMS kalıbını yüzü yukarı bakacak şekilde temiz bir plastik bulaşık kapağına (çap 60 mm, yükseklik 15 mm) yerleştirin ve düzleştirin. 500 μL sıvı UV ile kürlenebilen yapıştırıcıyı kalıba yavaşça pipetleyin, tüm çıkıntılı yapıları bir spatula yardımıyla dikkatlice ıslatın. Islatma işlemi nedeniyle oluşan hava kabarcıklarını giderin.
      NOT: Temiz PDMS kalıpları, tozu veya UV ile kürlenebilen yapışkan kalıntılarını gidermek için bant kullanılarak veya etanol ile temizlenerek hazırlanabilir. Ek önlem olarak, PDMS kalıplarını kullanılmadığı zaman vakum odalarında saklayın.
    2. Lameli PDMS kalıbına hafifçe bastırın. UV ile kürlenebilen yapışkan kalıntıları temiz ve düz bir lamel oluşmasını önleyebileceğinden, UV ile kürlenebilen fazla yapıştırıcının lamel üst tarafını ıslatmasını önleyin. UV ile kürlenebilen fazla yapıştırıcıyı laboratuvar silecekleriyle çıkarın.
      NOT: UV ile kürlenebilen yapışkan tabakaya aktarılan PDMS kalıbının özelliklerinin, yapıştırılacağı kartuşla aynı hizada olmasını sağlamak çok önemlidir. Bunu yapmak için, kartuş kuyularının merkezlerinin (üç tane) yerleştirileceği yerde lamel çözünür bir işaretleme kalemiyle işaretleyin. Dikdörtgen cam lamel aşağı bastırırken lamel PDMS kalıp özellikleriyle hizalamak için bu işaretleri kullanın.
    3. Yapıyı eşit şekilde aydınlatılmış bir UV ışığı (363-370 nm, 224 mW/cm2) altında 10 saniye boyunca kısmen kürleyin. İzleri daha sonra %75 etanol ile silin. Yapıyı düz bir yüzeyde sıkıca tutun ve Katman 1 PDMS kalıbını yavaşça soyun.
      NOT: Kısmi kürleme, yeterince katı UV ile kürlenebilen yapışkan bir tabakanın oluşmasını sağlar ve bu aşamada PDMS kalıbının soyulmasına izin verir. Bu aynı zamanda, iki katmanlı UV ile kürlenebilen bir yapışkan yapının üretimi için sonraki adımlarda kısmen kürlenmiş bir Katman 2 ile bağlanmayı kolaylaştırır. 1,5 mm kalınlığında hazırlanan Katman 1 PDMS kalıbı (adım 1.2.4), soyma işlemi sırasında ince lamellerin parçalanma olasılığını azaltan yeterli PDMS esnekliği sağlar. PDMS kalıbı on ila yirmi defaya kadar yeniden kullanılabilir, bundan sonra PDMS yüzeyinde beyazımsı bir UV ile kürlenebilen yapışkan kalıntı tabakası oluşabilir ve bu da yapı kalınlığını azaltır. Bu durumda yeni PDMS kalıpları kullanın.
  3. Katman 2 imalatı (Şekil 2D)
    1. Temiz bir Katman 2 PDMS kalıbını, yüzü aşağı bakacak şekilde düz bir PDMS levhası üzerine yerleştirin (yüksek sertlik sağlamak için levha kalınlığı > 2,5 mm'dir). Bir cımbız kullanarak özelliklere yukarıdan hafifçe vurun. Özelliklerin altındaki koyulaştırma veya optik kontrast için arayüzü gözlemleyin - bu, doğru teması gösterir.
      NOT: Ana özellikleri çevreleyen destek direkleri (iki yuvarlak açıklık ve bir yarık), PDMS kalıp yüzeyinin sarkmasını önlemek için çok önemlidir.
    2. PDMS kalıbı ve levha arasındaki boşluğu kılcal etki yoluyla sıvı UV ile kürlenebilen yapıştırıcı ile doldurun. Yapıyı UV ışığı altında (363-370 nm, 224 mW/cm2) 10 saniye boyunca kısmen kürleyin.
    3. Kompozit UV ile kürlenebilen yapışkan tabakayı ve PDMS kalıbını yumuşak yastıklı bir cımbızla PDMS levhasından nazikçe soyun. Gerekirse UV ile kürlenebilen yapışkan tabakanın fazla kenarlarını keskin bir makasla kesin.
  4. Katman 1 ve 2 yapıştırma (Şekil 2E)
    1. Dikdörtgen bir cam lamel üzerine tutturulmuş Katman 1'i düz bir yüzeye yerleştirin. Katman 2'yi (hala PDMS kalıbına bağlı) Katman 1 ile hizalayın ve her iki katmana da sıkıca bastırarak özelliklerin altında "gölgelerin" görünmesini sağlayın.
    2. Mikroakışkan çipin iki katmanlı yapısını oluşturan Katman 1 ve 2'yi yapıştırmak için yapıyı UV ışığı (363-370 nm, 224 mW/cm²) altında 10 saniye boyunca kürleyin. PDMS kalıbını çipten yavaşça soyun.
      NOT: PDMS kalıbının çipten başarılı bir şekilde soyulmasını sağlamak için, adım 2.4.1'de her bir PDMS destek sütununu UV ile kürlenebilen yapışkan Katman 2'den ayırmak için cımbız kullanın. Bu eylem, soyulma için önemli olan PDMS kalıbı ile Katman 2 arasındaki genel yapışmayı azaltmaya yardımcı olur.
  5. Poliakrilamid jel entegrasyonu (Şekil 2F)
    NOT: Bu bölümden önce, çoğullanmış bir deney için gerektiği kadar çip hazırlayın.
    1. Aşağıdaki tabloda yer alan bileşenleri, tercih edilen PA jel sertliğine24 karşılık gelecek şekilde hafifçe karıştırarak PA jel öncü solüsyonunu hazırlayın ( Tablo 1'i kontrol edin). Oksijen jelleşmeyi engellediğinden pipetleme sırasında hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin.
      DİKKAT: TEMED ve APS toksiktir. Çeker ocakta çalışın ve eldiven giyin.
      NOT: Küçük hacimlerde sıvılar söz konusu olduğundan dikkatli pipetleme ve kullanım gereklidir (1 mL PA jel öncü çözeltisi için 1 μL TEMED). Jel sertliği, birçok mekanobiyoloji çalışmasında gösterildiği gibi hücre davranışını etkileyebilir. Deneyleriniz için en uygun sertliği seçin. Floresan boncuklar, jel deformasyonu ve mekanik stres çıkarımı için referans işaretleyici görevi görür. Çözeltiyi PA jel öncü çözeltisine pipetlemeden önce vorteks boncuk çözeltisi. PA jel öncü çözeltileri her iki başlatıcı da eklendiğinde jelleşmeye başladığından ve bu kısa süre içinde küçük hacimlerin iyice karıştırılması zor olduğundan, küçük hacimli TEMED'in en son karıştırılmaması önerilir.
    2. Hemen doku bölgesinin ortasına ve Katman 2'nin yarığının üstüne 10 μL PA jel öncü solüsyonu pipetleyin (Şekil 1B, 2F). Düz bir jel oluşturmak için yuvarlak bir cam lamel (çap 10 mm) ile hafifçe bastırın. PA çözeltisinin yarıktan Katman 1'e aktığını gözlemleyin ve bariyer sütunları sırasında durun.
      NOT: 10 μL hacimli PA jel öncü çözeltisi, Katman 2'nin üzerinde 100 μm kalınlığında bir jel üretir. Gerekli jel kalınlığına bağlı olarak bu hacmi değiştirin. Başlatıcılar eklendikten sonra PA çözeltisi polimerleşmeye başladığından, çözeltiyi mümkün olan en kısa sürede çip üzerinde pipetleyin. Çözeltinin bariyer direkleri boyunca taşmasını ve kanalı tıkamasını önlemek için çözeltiye doğru miktarda kuvvetle bastırın. Kanallar tıkalıysa çipi atın. 5 kPa veya daha düşük sertliğe sahip yumuşak jeller için, lamelleri hidrofobik hale getirmek için yuvarlak cam lamelleri işlemek için cam su itici kullanın. Özellikle lamelleri 5 dakika cam su iticiye batırın, 3 kez %100 etanol ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın. Bu, daha sonra jeli tahrip etmeden lamel polimerize jelden soyulmasını kolaylaştırır.
    3. Mikroakışkan çipi hemen UV ışığı altında (363-370 nm, 224 mW/cm2) 5 dakika kürleyin. PA jelinin tamamen katılaşması için en az ~1 saat bekleyin.
      NOT: Bu, polimerize PA jelinin yapıya bağlanmasına izin verirken çipi tamamen sertleştirecektir. Adım 2.5.1, 2.5.2 ve 2.5.3 hızlı bir şekilde art arda tamamlanmalıdır.
    4. Jeli ıslatmak ve lamel ile jel arasındaki yapışmayı gevşetmek için çipi HEPES (0.1 M, pH 7.4) içinde en az 1 saat veya daha uzun süre iyice inkübe edin. Kapak camını keskin bir cımbızla yavaşça çıkarın.
      NOT: 5 kPa veya daha düşük sertliğe sahip daha yumuşak jeller için, jel yapısını bozmadan kapak camının jelden temiz bir şekilde çıkarılmasını sağlamak için bir çalkalayıcıda inkübasyon süresini 10 saate kadar artırın. Bazen, dikdörtgen lamel tabanı ile UV ile kürlenebilen yapışkan bazlı Katman 1 arasında onlarca ve yüzlerce mikrometrelik yapısal desenler oluşabilir. Bu modeller parlak alan görüntülemeye müdahale edebilir, ancak floresan görüntüleme üzerinde minimum etkiye sahiptir. Bu, adım 2.1.2'de olduğu gibi dikdörtgen lamellerin plazma aktivasyonu ile geliştirilebilir.
  6. Çip ve kartuş yapıştırma (Şekil 2F)
    1. Temizlenmiş, tıbbi sınıf bir polikarbonat kartuşu (Ek Dosya 4) alt yüzü yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye yerleştirin. Çip üzerindeki jeli yandan laboratuvar mendilleriyle kurutun. Çipi yüzü aşağı bakacak şekilde kartuşla hizalayın.
      NOT: Yeni kartuş tasarımlarını test ederken, işleme veya 3D baskı yöntemleri kullanılabilir. Tasarım ayarlandığında, büyük miktarlarda kartuş üretmek için enjeksiyonlu kalıplama kullanılabilir.
    2. Kılcal etki ile doldurulacak olan çip ve kartuş arasındaki yarıklara UV ile kürlenebilen yapıştırıcıyı pipetleyin. UV ışığı (363-370 nm, 224 mW/cm2) ile 5 dakika kürleyin.
      NOT: UV ile kürlenebilen yapıştırıcının kanallara veya lamel tabanının diğer tarafına taşmasını önlemeye dikkat edin.
  7. Polimerize edilmemiş PA çözeltisinin çıkarılması
    1. Hücreler için toksik olan polimerize edilmemiş PA jel öncü çözeltisini temizlemek için atık giderme kanallarından yaklaşık 5 mL HEPES (0.1 M, pH 7.4) çekmek için bir PDMS tıpa ve bir şırınga kullanın.
    2. Jeli cihazda cihaz başına 2 mL HEPES (0.1 M, pH 7.4) ile inkübe edin ve polimerize edilmemiş PA jel öncü çözeltisinin tamamen çıkarılmasını sağlamak için 1-2 gün boyunca bir çalkalayıcıya koyun.

3. Kurulumun tamamlanması

NOT: Yapılan cihazlarla, hücre tohumlaması için PA jelini ECM proteini ile kaplayarak, cihazları elektrik stimülasyonu için elektrot odasına bağlayarak ve cihazları eklere, tutuculara ve çoğullanmış, canlı hücre görüntüleme deneyleri için bir canlı hücre odası kapağına yerleştirerek kurulumu tamamlayın (Şekil 1C).

  1. Sterilize edilmiş bileşenlerin hazırlanması
    1. Cihaz (Malzeme Tablosu) dışındaki kurulumun tüm bileşenleri aşağıdaki sırayla sonikasyona tabi tutulmalıdır: önce 30 dakika sabunlu suda, daha sonra 30 dakika MQ suda ve son olarak 30 dakika boyunca% 75 etanol içinde. Daha sonra 60 °C'de fırında kurutun ve sterilizasyonu sağlamak için biyogüvenlik kabininde 200-280 nm'de UV ışığıyla 30 dakika tedavi edin.
  2. ECM proteini ile PA jel işlevselleştirmesi
    1. Cihazları bir biyogüvenlik kabininde UV ışığı (200-280 nm) ile sterilize edin.
    2. Gerekli miktarda 50 μg/mL Collagen I çalışma solüsyonunu buz üzerinde 1x DPBS'de hazırlayın.
      NOT: Jelleşmeyi önlemek için Collagen I stoğunu buz üzerinde tutun. Her cihazın jeli tamamen daldırması için 100-150 μL Collagen I çalışma solüsyonu gereklidir. Lif oluşumunu önlemek için Collagen I solüsyonlarını nazikçe pipetleyin.
    3. Gerekli miktarda Sulfo-SANPAH (SS) çalışma solüsyonunu buz üzerinde hazırlayın. Her jel işlemi, 2 μL SS stok çözeltisinin (susuz DMSO içinde çözünmüş) 80 μL soğuk HEPES (4 °C buzdolabından, 0,1 M, pH 7,4) içinde seyreltildiği yaklaşık 80 μL SS çalışma çözeltisi gerektirir.
      NOT: SS neme duyarlıdır; Stok şişelerini açmadan önce oda sıcaklığına dengeleyerek ürün üzerinde nem yoğunlaşmasını önleyin. En iyi performans için Ağırlıksız SS kullanın ve stokları susuz DMSO'da hazırlayın. En kısa sürede kullanın. SS çalışma çözeltisine hazırlanırken SS'nin hidroliz oranını azaltmak için soğuk bir HEPES tamponu kullanılır. Her jel, PA jel yüzeyinin iyi bir şekilde işlevselleştirilmesini sağlamak için SS çalışma solüsyonu ile iki işlem gerektirir.
    4. Jelin kenarlarına laboratuvar mendilleri ile dokunarak jeli cihaz içinde kurutun. Jel yüzeyinin tamamen SS çözeltisine daldırıldığından emin olarak jel üzerine 80 μL SS çalışma solüsyonu pipetleyin. SS'yi aktive etmek için jeli 5 dakika boyunca UV (363-370 nm, 24,5 mW/cm2) ile işlemden geçirin. Soğuk HEPES (0,1 M, pH 7,4) ile 3 kez durulayın.
      NOT: SS'nin duvara çekilmesini önlemek için kartuş kuyusunun ortasına SS'yi dikkatlice pipetleyin.
    5. 3.2.4 adımını tekrarlayın, ancak sonunda soğuk 1x DPBS ile üç kez durulayın.
      NOT: SS hidrolizini önlemek için 3.2.3 ila 3.2.5 arasındaki adımlar hızlı bir şekilde art arda yapılmalıdır. SS ile yüzey aktivasyonu başarılı olursa, durulanan jel bu aşamada daha koyu bir kırmızı tonu olarak görünmelidir.
    6. 100 μL Kollajen I solüsyonunu PA jel üzerine pipetleyin ve jeli tamamen batırdığınızdan emin olun. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, ardından bağlanmamış kolajeni 1x DPBS ile üç kez durulayın. Kullanmadan önce jeli 1x DPBS'ye batırın.
      NOT: Kollajen I kaplı numune 4 °C buzdolabında birkaç gün saklanabilir.
  3. Cihazların elektrot odalarına bağlanması
    1. Cihazları vidalarla kesici uçlara takın (Şekil 1C, vida tipi: M3 X 10 mm). Ardından, dört adede kadar cihaz ekleme tertibatını mikroskop tablasına monte edilmek üzere tasarlanmış tutucuya sabitleyin (vida tipi: M3 X 5 mm).
      NOT: Maksimum sayıda cihaz ekleme düzeneği kullanılmazsa, daha sonra görüntüleme deneyleri için iyi canlı hücre koşullarının korunabilmesi için alanı kapatmak için diğer tüm tutucu yuvalarının boş cihazlarla doldurulması önerilir. Boş cihazlar, kartuşları çıplak dikdörtgen cam lameller yapıştırarak kolayca yapılabilir.
    2. Cihazları kültür ortamıyla doldurun (DMEM++, ana kuyucukların her birinde 2 mL). Ayrıca 1x DPBS'yi temizlemek ve değiştirmek için atık giderme kanallarından 2 mL ortam çekin.
    3. Elektrot odaları olarak işlev görecek deliklere sahip kapaklı iki adet 50 mL'lik tüp hazırlayın. Platin elektrotları ve Tygon borularını güvenli bir şekilde oturtmak için uygun boyut ve miktarda delikler oluşturun ve elektrot odalarını cihazlara bağlayın. Her elektrot odasını 45 mL kültür ortamı ile doldurun.
      NOT: Keskin cerrahi bıçaklar kullanılarak kapaklarda kolayca delikler oluşturulabilir.
    4. Elektrot odaları ve cihazlar arasındaki bağlantıyı hazırlayın: Her cihaza iki boru konektörü takın. Her bir Tygon borusuna bir boru klipsi yerleştirin (Şekil 1C). Kültür ortamını bir şırınga ile tüplerden çekin ve sıkıca klipsleyin. Ortamla doldurulmuş borunun bir ucunu elektrot odasına, diğer ucunu da cihaza bağlayın.
      NOT: Önceden ısıtılmış ortam kullanarak ve/veya ortamın bir vakum odasında gazını gidererek borularda kabarcık oluşma olasılığını azaltın. Tygon boru sistemi ile boru konektörü arasındaki arayüzde hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin, tüpün içindeki ortama daldırmadan önce ortam yüzeyini dışarı çıkarmak için boru uçlarını sıkıştırın veya boru konektörlerine fiziksel bir bağlantı yapın.
    5. Bir laboratuvar jakı kullanarak cihazlardaki kültür ortamı yüzeyleri ile elektrot odaları arasındaki bağıl yükseklikleri ayarlayın. Boru klipslerini serbest bırakın ve tüm orta yüzeylerin aynı yükseklikte dengelenmesine izin verin.
      NOT: Sıvıların taşmasını önlemek için tüm kurulum hareket ettirilirken boru klipslerini sabitlemeyi unutmayın.
    6. Bir elektrik kaynağı ölçer kullanarak her cihazın direncini ayrı ayrı ölçerek kalite kontrolü gerçekleştirin.
      NOT: Paralel bağlı diğer cihazların klipslerini güvenli bir şekilde sabitlerken, yalnızca direncin ölçüldüğü cihazın boru klipsini serbest bıraktığınızdan emin olun.

4. Tek katmanlı büyüme ve canlı hücre deneyleri

NOT: Uygun bir birleşik tek katman oluşturmak ve tek katmanın birleşmesine ve elektrik direncine bağlı olarak düzgün dağılmış bir elektrik akımı yoğunluğu elde etmek. Ardından, uzun süreli görüntüleme ve elektrik stimülasyon deneyleri için mikroskopta uygun canlı hücre koşullarını sağlayın.

  1. Tek katmanlı büyüme
    1. Tripsin kullanarak MDCK hücrelerini T25 şişelerinden ayırın. Santrifüjleyin ve 0,1 milyon hücre elde etmek için gereken orta hacmi sayın. Bu sayıda hücreyi askıya alın ve santrifüj tüplerinde 2 mL'lik ortamda iyice karıştırın.
    2. Tüm hücre yüklü ortamı kuyuya doku bölgesine pipetleyin. Tüm kurulumu yavaşça bir doku kültürü inkübatörüne aktarmadan önce hücrelerin 15 dakika çökelmesine izin verin.
      NOT: Her cihaz için, 0,1 milyon hücrelik bir tohumlama yoğunluğu, santimetre kare başına 0,06 milyon hücreye (6 × 104 hücre/cm2) karşılık gelir. Bu tohumlama yoğunluğu yeterince seyrektir ve hücreler birleşik bir duruma ulaşmadan önce 2 gün boyunca büyür. Bu işlem, dokuyu bozma riski taşıyan aşırı bağlanmamış hücrelerin durulanmasına gerek kalmadan, uygun şekilde polarize ve homojen bir tek tabaka sağlar. Sedimantasyon adımının bozulmadan bırakılması önemlidir, böylece hücrelerin tohumlanması bile olur.
    3. Hücrelerin inkübatörde (37 °C,% 5 CO2,% 90 nem) 72 saat boyunca >~50 hücre / 100 μm2 hücre yoğunluğuna ulaşmasına izin verin. Büyüme sürecini izlemek için faz kontrastlı bir tezgah üstü mikroskopta günlük olarak kontrol edin.
      NOT: Tohumlanan bu hücre sayısı ile, MDCK hücreleri 24 saat sonra% 70-% 80 birleşmeye, 48 saat sonra tam birleşmeye ve 72 saate kadar daha fazla hücre yoğunluğu artışına ve doku olgunlaşmasına ulaşmış olacaktır. 24 saat sonra ortalama hücre uzunluğu yaklaşık 10-20 μm'dir. 48 saatte, hücre-hücre bağlantıları ve hücre gövdesi, faz kontrast görüntüleme altında net bir kontrasta sahiptir. Bu kontrast 72 saat sonra büyük ölçüde azalır.
  2. Canlı hücre görüntüleme
    1. Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak bir epifloresan veya konfokal mikroskop seçin. Hücreler floresan işaretleyicileri eksprese ettiğinde veya bunlarla boyandığında, hücre şeklinin ve jel substrat deformasyonlarının üç boyutlu gözlemi için konfokal seçin. İki boyutlu gözlem için, daha az fototoksisite üreten faz kontrastını ve epifloresansı seçin. Kurulumu mikroskoba getirmeden 1 saat önce canlı hücre sistemini açın ve mikroskop tablası üstü inkübatörün 37 °C,% 5CO2 ve% 90 neme stabilize olmasını sağlayın.
      NOT: Canlı hücre sistem denetleyicisi, sahne üstü inkübatördeki koşulları gösterir ve koşullar optimumun altında olduğunda bir uyarı sesi çıkarır. Sahne üstü inkübatör kapağı, dışa doğru uzanan cihaz borularını barındırma ihtiyacı nedeniyle ticari olandan farklı olduğundan, uzun süreli deneyler için (birkaç günden bir haftaya kadar) iyi canlı hücre koşulları sağlamak için sistemin yeniden kalibrasyona ihtiyacı vardır. Kalibrasyon, kullanım kılavuzuna göre yapılabilir ve deneylerde sensörlerin konumlarının kalibrasyon koşullarında olduğu gibi aynı tutulması gerekir. Kademe üstü inkübatördeki ortamın buharlaşma hızını ve fenol kırmızısı ile aşılanmış ortamla pH koşullarını kontrol edin.
    2. Kurulumu, elektrot odaları yanlarda olacak şekilde mikroskoba monte edin. Mikroskop elektronik tablasının hareket etmek için yeterli alana sahip olduğundan ve elektrot odalarına çarpmadığından emin olun. Orta yüzey yüksekliklerinin dengelendiğinden ve cihazlardakiler ile elektrot odalarındakiler arasında aynı yükseklikte olduğundan emin olun.
      NOT: Doku bölgesinin bulunduğu cihaz kuyucuklarındaki ortam yüzeyi (Şekil 1C), parlak alan ve faz kontrast görüntüleme üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Menisküs istenmeyen ışık odaklanmasına neden olur. Ortam yüzeyinin kuyunun ağzında düz olduğundan emin olun, ancak canlı hücre odasındaki ortam buharlaşmasının bir süre sonra bu düz yüzeyin bozulmasına yol açacağını unutmayın. Bu sorunun üstesinden gelmek için çözümlerden biri, bu yüzeyi düzleştirmek için ortam yüzeyiyle temas edecek şekilde düz bir cam lamel yerleştirmektir. Bu lamel kuyudan daha küçük bir alana sahip olmalıdır, böylece hücre büyümesi için önemli olan gaz değişimini engellemez. Diğer bir seçenek de hücre kültürü dereceli mineral yağın ortam üzerine katmanlanmasıdır.
    3. Yazılımı kurun.
      1. Epifloresan mikroskopla tüm doku görüntüleme için 10x veya 20x objektif lensleri ve daha yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme için 30x objektif lensleri (WD 0,8 mm, NA 1,05) seçin.
      2. Tüm doku görüntüleme için, doku bölgesindeki dikdörtgen alanı kaplamak için birden fazla konum seçin (Şekil 1A, örneğin, 5 satıra 5 sütun, orta sıra yarığı kaplarken, diğerleri yarığın dışında). Sonuç bölümünde kullanılan hücre hatlarına göre floresan ve parlak alan kanallarını seçin (yeşil floresan için kanal 488 ve kırmızı floresan için kanal 561). Bu uzun süreli görüntüleme deneyinde fototoksisiteyi birkaç güne kadar azaltmak için 1 saatlik zaman aralığını seçin.
        NOT: Tüm dokunun daha büyük bir görünümüne ihtiyaç duyulursa, 4x gibi diğer objektif lensler seçilebilir.
  3. Elektrik stimülasyonu
    1. Her cihazın cihaz sayısını, bağıl cihaz direncini ve hedef elektrik akımını kontrol edin. Genel kurulumda birkaç saatten bir haftaya kadar sağlanacak toplam elektrik akımına karar verin.
    2. Akım cl altında bir elektrik sinyali verinamp modu. Aynı kanal direncine sahip 3 cihaz için, bir kontrol grubu (elektrik akımı yok, boru klipsi bağlı), bir apikal-bazal (AtB) akım durumu ve bir bazal-apikal (BtA) akım durumu (Şekil 1D), bir kaynak ölçer ile toplam 20 μA akım sağlayın. Bu, fizyolojik olarak ilgili tahmini akım yoğunluğu ~10 μA/cm2 olan her cihaz için 10 μA'nın sağlanmasına yol açar (daha fazla ayrıntı tartışmada).
      NOT: Toplam voltaj, Tygon hortumunun uzunluğuna bağlı olarak onlarca milivolt civarındadır. Böyle bir elektrik akımı birkaç günden bir haftaya kadar sürekli olarak sağlanabilir. Fenol kırmızısı göstergesi, elektrot odalarında renk değiştirecektir (pozitif elektrotlu odada daha asidik), ancak iyi kalibre edilmiş sahne üstü inkübatörde değişmeyecektir. Canlı hücre koşulları iyi korunduğu sürece hücreler sağlıklı kalacaktır. Araştırmacılar, sahne üstü inkübatördeki ortamı gün aşırı ve elektrot odalarındaki ortamı birkaç günde bir değiştirebilirler. Ortamın taşmasını önlemek için elektrot odalarını değiştirirken boru klipslerini sabitleyin. Adım 3.1.1'de belirtildiği gibi, tutucu alanını kapatmak için boş bir cihaza sahip olmayı unutmayın. Bu, canlı hücre odasının uygun durumda olmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan tüm sonuçlar önceki yayından uyarlanmıştır4; Daha fazla ayrıntı için bu yayına bakın.

Bu protokol, hücre veya doku düzlemine dik bir harici iyon akımının veya elektrik alanının uygulanmasına izin verir. Bu elektrik stimülasyonu, endojen transepitelyal elektrik potansiyeli farkını (TEPD) bozar ve TEPD'nin doku davranışını yönetmedeki rolünün incelenmesine izin verir. Protokolün ardından, vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş MDCK hücreleri (GFP-aktin, H1-GFP...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, transepitelyal elektrik potansiyeli pertürbasyon deneyleri gerçekleştirmek ve canlı hücre görüntüleme ve mekanobiyoloji yöntemleriyle biyoelektrik etkileri incelemek için yeni bir mikroakışkan cihaz üretmek için ayrıntılı adımlar ve tasarım mantığı sağlar. Bu yöntemin önemi, diğer ilgili yöntemlerle karşılaştırıldığında açıktır. Örneğin, ilgili bir yöntem, galvanomaksiyi (akım yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak hücre göçü) incelemek için sabit bir düz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarların her türlü çıkar çatışmasını açıkladığından emin olun.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF ve TBS, Dr. Xumei Gao, Xinru Yu ve Doku Biyofiziği Laboratuvarı'nın diğer grup üyeleriyle yapılan yararlı tartışmaları kabul eder. Şematik çizimimize yardımcı olduğu için Westlake Üniversitesi'ndeki Özelleştirilmiş Teknoloji Hizmet Tesisine (CTSF) teşekkür ederiz. Bu çalışma Westlake Eğitim Vakfı, Westlake Yaşam Bilimleri ve Biyotıp Laboratuvarı ve Westlake Üniversitesi'ndeki Geleceğin Endüstrileri Araştırma Merkezi (RCIF) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x DPBSGibco14190144
3-(trimetoksisilil)propil metakrilat, TPMSigma2530850Açtıktan sonra azot altında saklayın.
50 mL Falcon tüpüCorning430829Elektrot ve hortumun kapaktan geçmesini ve ortama daldırılmasını sağlamak için 50 mL'lik şahin tüpü kapağına 4 delik açın. Bir dizi mikroakışkan cihaz için en az 2 kapak gereklidir.
Asetik asitSinopharm10000208
Akrilamid çözeltisi, %40Sigma79061Zehirli
PompaTamam laboratuvarıOKO-APMikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
Amonyum Persülfat, APSAladdinA112447
Fişek--Kartuş özel yapımdır ve tasarım ek malzemeye atıfta bulunur. Hammadde PC Makrolon 2858 Tıbbi Sınıftır ve burada daha fazla ayrıntı bulabilirsiniz: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Klip -leri--Robert Clip, tüpler için  dış çapı 4,5 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Kolajen ICorning354236
DI Milli-Q suMilli-Q-
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta kültür ortamı, DMEM (yüksek glikoz)Gibco11965092DMEM++ DMEM'dir ve ek %10  FBS (Sigma-Aldrich) ve 100  birim/mL Penisilin-Streptomisin (Gibco).
Muhafaza siyah kafesTamam laboratuvarıH201 SerisiMikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
Epi-Floresans Ters MikroskopOlympusIX83
Etanol mutlakSinopharm10009218
Fetal Sığır SerumuSigmaF8318 Serisi
Floresan boncuklar, 0.1 μ L, kırmızı (580/605)TermoF8801 Serisi
Gaz odasıTamam laboratuvarıH201-ÖNCEKİ-SP200/400/600Mikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
Gaz Manuel MikserTamam laboratuvarı2GF-MİKSERMikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
GenetikGibco10131027GFP– aktin ve H1– GFP MDCK, 0.5  mg / mL genetikin (Gibco) gen ekspresyonlarını sürdürmek için
HEPESSigma736459
İzopropanolSinopharm80109218
KimmendilKimberly-Clark ProfesyonelLH-70155 SerisiLaboratuvar sileceği
Daha uzun vida--Nikel kaplı yuvarlak başlı çapraz hassas makine vidası, M3 x 10 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Mikroakışkan konektör--Polipropilen Düz Birlik Bağlantı Parçası, 1/16"-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch
Çok kuyulu plaka tutucuTamam laboratuvarıH201-MW-TUTUCU-NZ500Mikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
N',N'-Metilenbisakrilamid, %2Sigma110269Zehirli
NOA 73Norland Ürünleri17-345UV ile kürlenebilen yapıştırıcı
Penisilin-Streptomisin, PS (10.000 U/mL)Gibco15140122
Petri kabı (150 mm &akut; 25 mm)Corning430599En az 80 ° 2 saat boyunca C
Pico Plazma aracıDiener Elektronik GmbH + Co. KGPico PlazmaO2 plazma işlemi için
Plazma temizleyiciHarrick PlazmaÜrün Kodu-002Hava plazma işlemi için
Plastik tabak (çap 60 mm, yükseklik 15 mm)Yuva705001
Platin elektrotlarTianjin Aida HengshengPT005Çap 0.5 mm, uzunluk 37 mm 
Rain-X Orijinal Cam Su İticiITW Kimyasal Ürünler800002242
Dikdörtgen lamelMarienfeld'in0107222  1.5H, 24 &akut; 50 mm2, 170 μ m kalınlık
Yuvarlak cam lamelMarienfeld'in0111500  1.5H, yuvarlak 10 mm çap
Daha kısa vida--Nikel kaplı yuvarlak başlı çapraz hassas makine vidası, M3 x 4 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH, ağırlık yokTermoA35395 SerisiSS stok çözeltisi: 20 mg/mL susuz DMSO, 2 μ Her biri için L; SS çalışma solüsyonu: HEPES içinde 0,5 mg/mL SS (0,1 M, pH 7,4).
SYLGARD 184 Silikon Elastomer KitiDow CorningH052KCM147Nihai ürün polidimetilsiloksan, PDMS'dir. Bu Kit, baz PDMS reçinesi ve çapraz bağlama ajanı içerir. 
Sıcaklık BirimiTamam laboratuvarıH201-T-BİRİM-BLMikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
Tetrametiletilendiamin, TEMEDSigma110189Zehirli
Dokunmatik EkranTamam laboratuvarıTAMAM-DOKUNUŞMikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
Tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil-1-triklorosilanSigma78560459
Tripsin-EDTA (%0,25)Gibco25200072
Tygon borularıTygonAJK00002Dış çap (OD) = 3,2 mm, İç çap (ID) = 1,6 mm
Ultrasonik temizleyiciSupmileKD-300DE
UV LED kürleme makinesiGHUVGHS-MFLGUV-LED ışık kaynağı, Emisyon aralığı: 363– 370 nm, maksimum güç yoğunluğu: 230 mW/cm2
Titreşimsiz Nemlendirme ModülüTamam laboratuvarıHM-VFMikroskop kademe üstü inkübatörün bileşeni
GörüşZiyaretçi Sistemleri GmbH-Daha yumuşak eşyaların görüntülenmesi
Gofret katmanı1Singapur Ulusal Üniversitesi, Mekanobiyoloji enstitüsü mikrofabrikasyon tesisi-Gofret özel yapımdır ve tasarım ek malzemeye atıfta bulunur.
Gofret katmanı2Singapur Ulusal Üniversitesi, Mekanobiyoloji enstitüsü mikrofabrikasyon tesisi-Gofret özel yapımdır ve tasarım ek malzemeye atıfta bulunur.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).
  2. Cogan, S. F. Neural stimulation and recording electrodes. Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  3. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
  5. Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. Stretch-induced collective cell migration in vivo. Nat Mater. 24, 452-470 (2025).
  6. Kennard, A. S., Theriot, J. A. Osmolarity-independent electrical response to injury in zebrafish epidermis. Elife. 9, 62386(2020).
  7. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).
  8. Levin, M., Thorlin, T., Robinson, K. R., Nogi, T., Mercola, M. Early step in left-right patterning. Cell. 111 (1), 77-89 (2002).
  9. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of surface electrical currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
  10. Metcalf, M. M., Shi, R., Borgens, R. B. Endogenous ionic currents in embryos. J Exp Zool. 268 (4), 307-322 (1994).
  11. Barratt, L., Rector, F., Kokko, J., Seldin, D. Factors governing the Journal of Clinical Investigation. J Clin Invest. 53 (2), 454-464 (1974).
  12. Zhao, M., et al. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  13. Barker, A., Jaffe, L., Vanable, J. Jr The glabrous epidermis in integrative and comparative physiology. Am J Physiol Integr Comp Physiol. 242 (3), R358-R366 (1982).
  14. Sun, Y., et al. Infection-generated electric field in gut epithelium guides migration of macrophages. PLoS Biol. 17 (4), e3000044(2019).
  15. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay in a microfluidic culture device. J Vis Exp. (68), e4193(2012).
  16. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  17. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions of cell signaling. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  18. Meng, X., et al. PI3K-mediated electrotaxis of embryonic and adult fibroblasts exposed to physiological electric fields. Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  21. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  22. Stoecklin, C., et al. A new approach to design artificial 3D microenvironmental and rheological cues. Adv Biosyst. 2 (7), 1700237(2018).
  23. Khoo, B. L., et al. Expansion of patient-derived circulating tumor cells in a microfluidic culture device. Nat Protoc. 13 (1), 34-58 (2018).
  24. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Methods Cell Biol. 47, 11-16 (2010).
  25. Choudhury, M. I., et al. Kidney epithelial cells are active mechanosensors that drive physiological fluid pumps. Nat Commun. 13 (1), 2317(2022).
  26. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Roy, B., et al. Fibroblast rejuvenation by mechanical reprogramming in the National Academy of Sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (19), 10131-10141 (2020).
  28. Tao, J., et al. Mechanical compression creates a quiescent muscle stem cell niche. Commun Biol. 6 (1), 43(2023).
  29. Iberite, F., Gruppioni, E., Ricotti, L. Skeletal muscle differentiation: Perspectives and challenges. NPJ Regen Med. 7 (1), 23(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektrik Alan Stim lasyonuTransepitelyal PotansiyelH cre ProliferasyonuH cre Ekstr zyonuPoliakrilamid JelKonfokal MikroskopiTraksiyon Kuvveti Mikroskopisi

İlgili makaleler