Yöntem makalesi

Zebra Balığı Kraniyofasiyal Dokularının Alcian Mavisi ile Boyanması Üzerine Diseksiyonu

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 Eylül 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, 5 günlük bir zebra balığı larvasında kraniyofasiyal kıkırdakların boyanması ve diseksiyonu için basit ve takip etmesi kolay bir prosedür sunmaktadır. Çeşitli gelişim koşulları altında bu yapıların anatomisini, şeklini ve boyutunu incelemek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı, optik şeffaflığı göz önüne alındığında, embriyoda kraniyofasiyal kıkırdakların oluştuğu mekanizmaları incelemek için mükemmel bir omurgalı modelidir. Kraniyofasiyal kıkırdaklar genel olarak nörokranyum ve visserokranyum olmak üzere iki gruba ayrılabilir ve bunlar da beyni desteklemek ve diğerlerinin yanı sıra beslenme ve solunum aparatını oluşturmak için gerekli olan çok sayıda kıkırdak grubuna ayrılabilir. Bu protokol önce zebra balıklarında bu kıkırdak gruplarını görselleştirmek için basit ve yerleşik bir boyama prosedürünü, ardından nöro ve visserokranyumu incelemek ve ayırmak için bir metodolojiyi tanımlayacaktır. Bu diseksiyonlardan basit şekil ve boyut ölçümleri kolayca elde edilebilir ve bu protokolde bu, insanlarda çoğu kraniyofasiyal bozuklukta sıklıkla etkilenen bir doku olan ön nörokraniyumun bir parçası olan damak için gösterilmiştir. Protokol, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda bile basit bir şekilde çoğaltılabilir, böylece lisans öğrencilerinin kraniyofasiyal morfolojiyle tanışmaları için değerli bir eğitim aracı sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalılarda kraniyofasiyal kıkırdak, kraniyal nöral krest hücreleri1 adı verilen çok potansiyelli bir hücre popülasyonundan ortaya çıkar. Bu hücreler ilk olarak erken embriyolarda nöral plakanın dorsal kenarlarında belirtilir, daha sonra farklılaşmadan önce kraniyofasiyal bölgeye ve faringeal kemerlere ulaşmak için büyük mesafeler göç eder 2,3. Bu göçü ve farklılaşmayı yönlendiren sinyal mekanizmaları, omurgalılar arasında büyük ölçüde korunur 4,5. Buna rağmen, bireysel kıkırdak elemanlarının organizasyonu, boyutu ve şekli türler arasında farklıdır ve çeşitli kraniyofasiyal morfolojilere yol açar6. Özellikle zebra balığı, embriyoların larva aşamalarına kadar şeffaf doğası göz önüne alındığında, kraniyofasiyal morfogenezi incelemek için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Kıkırdağı işaretlemek için basit boyama prosedürleri kullanılarak, zebra balığındaki birçok kraniyofasiyal yapının morfolojisi, embriyolar veya larvalar çevrede bulunan yaygın kirleticileremaruz kaldıklarında 7,8,9 sinyal yollarına farklı bozulmalar altında karakterize edilmiştir 10. Burada kıkırdağı işaretlemek için açıklanan Alcian mavisi boyama, daha sonra kraniyofasiyal gelişim üzerinde çalışan birçok zebra balığı laboratuvarı tarafından kullanılan Walker ve Kimmel11 tarafından standartlaştırılmış asidik olmayan koşulların kullanımını içerir 5,12,13,14,15,16,17,18,19 lise ortamlarında kullanımın tanımı da dahil olmak üzere20. Asitsiz boyama, kemik yapılarını sağlam tutar ve sırasıyla Alcian mavisi ve alizarin kırmızısı kullanılarak kıkırdak ve kemiklerin birlikte boyanmasına olanak tanır. Bununla birlikte, boyama ve kraniyofasiyal kıkırdakların hassas diseksiyonunu gerçekleştirmek, özellikle de kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda yapılacak bu tür çalışmalara yardımcı olmak için ayrıntılı bir protokol eksiktir.

Yetişkin zebra balıklarında yüz iskelet yapısı oldukça karmaşık olmasına rağmen, 43 kıkırdak türevli kemikten21 oluşur, döllenmeden 5 gün sonra (dpf) bir larvadaki kraniyofasiyal kıkırdak, beslenme yeteneğini yeni kazanmış, nispeten basittir ve genel olarak bir dorsal nörokranyum ve ventral visserokranyum4 olarak ayrılabilir. Bu yapılar beyni destekler, beslenme aparatına katkıda bulunur ve solungaç dokuları için destekleyici kıkırdaklara yol açar. Burada açıklanan protokol, zebra balığı kıkırdaklarının Alcian mavisi ile boyanmasına izin verecek, ardından nöro ve visserokranyumun ayrı yapılara ayrılması için ayrıntılı bir prosedür izleyecek ve bu da sonuçta bu yapılardaki çeşitli kıkırdakların şeklinin ve boyutunun dikkatli bir şekilde karakterizasyonunu sağlayacaktır. Örnek olarak, nörokraniyumun bir parçası olan etmoid plaka adı verilen damağın ön bölgesinin (ağzın çatısı) boyutlarını ölçüyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan zebra balığı bakımı ve deneysel prosedürleri, Referans TIFR/IAEC/2023-1 ile kurumsal hayvan etik kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktif hazırlama

  1. E3 medyası:
    1. 3.25 g sodyum fosfat dibazik (0.458 mM Na2HPO4 ), 0.29 g potasyum dihidrojen fosfat (0.042 mM KH2PO4 ), 11.93 g sodyum klorür (4.084 mM NaCl) ve 0.48 g potasyum klorür (0.128 mM KCl) 1 L damıtılmış su içinde karıştırarak 50x stok 1 hazırlayın.
    2. 2.43 g kalsiyum klorür (0.33 mM CaCl2 ) ve 4.07 g magnezyum sülfat (0.33 mM MgSO4 ) 1 L damıtılmış suda karıştırarak 50x stok 2 hazırlayın.
    3. 500 mL 1x E3 ortamı hazırlamak için 480 mL damıtılmış suya, stok 1 ve 2'nin her birine 10 mL ekleyin (pH = 7.4).
      NOT: Bu solüsyonların hazırlanması sırasında eldiven giyin.
  2. 1x PBS'de (Fosfat tamponlu salin) %4 paraformaldehit (PFA):
    1. 100 mL 1x PBS'yi 68 °C'de önceden ısıtın. 4 g PFA ekleyin ve çözeltiyi 68 °C'de PFA tamamen eriyene kadar periyodik karıştırma ile inkübe edin.
      NOT: Bu reaktifi hazırlarken, tercihen çeker ocak altında, PFA oldukça toksik olduğu için eldiven ve maske takın.
  3. %0,05 MS-222 (yaygın olarak trikain olarak bilinir) çözeltisi:
    1. E3'te %4 trikain stoğu yapın ve 4 °C'de saklayın. 10 mL trikain stoğu yapmak için 7 mL E3'e 0,40 g MS-222 ekleyin. Karıştırmak ve hacmi 10 mL'ye çıkarmak için çözeltiyi içeren tüpü hafifçe sallayın. 50 mL %0.05 trikain çözeltisi yapmak için, 49.375 mL E3'e %4 stoktan 625 μL ekleyin.
      NOT: Bu reaktifi hazırlarken eldiven ve maske takın.
  4. %70 etanol içinde %0,4 Alcian mavi stok çözeltisi
    1. 2 mL stok çözeltisi hazırlamak için 8 mg Alcian mavisini 1 mL %50 etanol içinde çözün. Çözeltiyi 37 °C'de 15-20 dakika ısıtın ve çözünmesi için periyodik olarak karıştırın. Leke çözüldükten sonra, 900 μL %100 etanol ve 100 μL damıtılmış su ekleyerek çözeltiyi %70 etanole hazırlayın.
      NOT: Stok solüsyonu oda sıcaklığında 2 haftaya kadar saklanabilir.
  5. Leke çözeltisi -- %0,02 Alcian mavisi, 200 mM magnezyum klorür (MgCl2 ) ve %70 etanol
    1. 5 mL Alcian mavisi leke çözeltisi hazırlamak için, 250 μL suya 1 mL 1 MgCl2 , 3.5 mL %100 etanol ve 250 μL %0.4 Alcian mavisi stoğu (2 mL %70 etanol içinde 8 mg Alcian mavisi) ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: En iyi boyama sonuçları için leke solüsyonunu taze olarak hazırlayın.
  6. Çamaşır suyu çözeltisi:
    1. Eşit hacimlerde %3 hidrojen peroksit (H2O2 ) ve %2 potasyum hidroksit (KOH) karıştırın. 2 mL çamaşır suyu çözeltisi yapmak için 1 mL %3 hidrojen peroksit ve 1 mL %2 potasyum hidroksiti karıştırın.
      NOT: Bu adıma başlamadan önce bu solüsyonu taze olarak hazırlayın. H2O2 ışığa duyarlı olduğundan, mümkün olduğunca ışığa maruz kalmaktan koruyun. H2O2 ve KOH ile çalışırken eldiven giyin .
  7. Çözüm I: %20 gliserol + %0,25 KOH
    NOT: Gliserol oldukça viskoz olduğundan, dikkatli bir şekilde pipetleyin. Bu solüsyonları hazırlarken eldiven giyin.
    1. 5 mL çözelti I hazırlamak için 2.375 mL suya 2 mL %50 gliserol ve 625 μL %2 KOH ekleyin ve iyice karıştırın.
  8. Çözüm II: %50 gliserol + %0,25 KOH
    1. 5 mL çözelti II hazırlamak için 805 μL suya 3.570 mL %70 gliserol ve 625 μL %2 KOH ekleyin ve iyice karıştırın.
  9. Depolama çözeltisi: %50 gliserol + %0,1 KOH
    1. 5 mL depolama solüsyonu hazırlamak için 1.180 mL suya 3.570 mL %70 gliserol ve 250 μL %2 KOH ekleyin ve iyice karıştırın.
  10. %3 agaroz
    1. 3 g agarozu 100 mL damıtılmış suda eritin. Çözelti berraklaşana kadar mikrodalgada pişirin.
  11. %0,1 PBST (%0,1 1x PBS'de Tween 20)
    1. 1 L 1x PBS yapmak için, 1.000 mL damıtılmış suya 8 g NaCl, 0.20 g KCl, 1.44 gNa2HPO4 ve 0.24 g KH2PO4 ekleyin. Çözeltiyi karıştırın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. 500 mL %0.1 PBST yapmak için, 5 mL %10 Tween 20 ila 495 mL 1x PBS ekleyin.
  12. 0,50 μg/mL DAPI çözeltisi
    1. 1x PBS'de 10 mg/mL DAPI stoğu yapın. 10 mL 0.50 μg/mL DAPI çözeltisi yapmak için, 10 mL 1x PBS'ye 0.50 μL stok ekleyin ve DAPI'nin tamamen çözünmesini sağlamak için kuvvetlice çalkalayın.
      NOT: Bu solüsyonları hazırlarken eldiven giyin. Işığa duyarlı olduğu için DAPI'yi ışıktan koruyun. DAPI stoğu 4 °C'de bir yıldan fazla saklanabilir.

2. Embriyo toplama

  1. Erkek ve dişi zebra balığı çiftlerini, embriyoların gerekli olmasından önceki akşam, erkek ve dişi balıklar bariyerlerle ayrılacak şekilde üreme tanklarına yerleştirin.
  2. Ertesi sabah bariyerleri kaldırın ve bariyerlerin kaldırılmasından sonra 15-20 dakika içinde embriyoları toplayın.
    NOT: Bariyerin kaldırılma zamanlaması, zebra balığı embriyolarının ve larvalarının evrelenmesinde yardımcı olur.
  3. Embriyoları 5 dpf'ye ulaşana kadar 28,5 °C'de yükseltin.
    NOT: E3 ortamını her 3 günde bir 28.5 °C'de önceden ısıtılmış yeni bir E2 partisi ile değiştirdiğinizden emin olun.

3. Alcian mavisi boyama

NOT: Bu deneyi yaparken eldiven giyin

  1. 20-25 5 günlük zebra balığı larvasını 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde (MCT) %0.05 trikain kullanarak uyuşturun.
  2. Larvalar hareket etmeyi bıraktıktan sonra, ki bu tipik olarak ~4-5 dakika sürer, anesteziyi çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 1.5 mL %4 PFA'ya 60 rpm'de 2 saat sabitleyin.
  3. Bir pipet kullanarak fiksatifin mümkün olduğu kadar çoğunu çıkarın ve numuneye 1,5 mL %50 etanol ekleyin. RT'de 60 rpm'de sallanırken 10 dakika inkübe edin.
  4. Bir pipet kullanarak etanolün mümkün olduğu kadar çoğunu çıkarın ve 1,5 mL Alcian mavi leke solüsyonu ekleyin.
  5. Sabit larvaları leke solüsyonunda 18-20 saat boyunca RT'de 60 rpm'de bir külbütör üzerinde inkübe edin.
    NOT: Daha kısa veya daha uzun süre inkübe etmek, kıkırdağın belirli bölgelerinin sırasıyla az veya fazla boyanmasına neden olabilir. Burada, 18-20 saatlik boyama, 5 günlük bir larvanın nöro ve iç organlarını net bir şekilde görselleştirmek için en iyi sonucu veriyor gibi görünüyordu.
  6. Leke solüsyonunu çıkarın, 1,5 mL damıtılmış su ekleyin ve RT'de bir rocker üzerinde 1-2 dakika inkübe edin.
    NOT: Diseke edilen kıkırdaklardaki hücre sınırlarını görselleştirmek için boyama bu adımda durdurulabilir. Bununla birlikte, sonraki temizleme adımlarını gerçekleştirmeden bu adımda boyama protokolünü durdurmanın bir dezavantajı, nöro ve visserokranyumun sınırlarının hala biraz bulanık kalması ve diseksiyonları tam olarak gerçekleştirmenin daha zor hale gelmesidir.
  7. Numuneye 1 mL ağartma çözeltisi ekleyin ve plaka veya kuyucuklar üzerinde herhangi bir kapak olmadan açıkta RT'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: Hidrojen peroksit ve potasyum hidroksit arasındaki reaksiyon, kapatıldığında kapağın fırlamasına neden olabilecek oksijen gazı ürettiğinden, bu adım sırasında MCT'lerin üzerini örtmeyin.
  8. Çamaşır suyu solüsyonunu çıkarın ve aşağıdaki doku temizleme adımlarını gerçekleştirin.
    1. Numuneye 1,5 mL çözelti I ekleyin ve RT'de 40 dakika boyunca 60 rpm'de bir külbütör üzerinde tutun.
    2. Çözelti I'i çıkarın ve numuneye 1,5 mL çözelti II ekleyin ve RT'de 2 saat boyunca 60 rpm'de bir külbütör üzerinde tutun.
      NOT: Temizleme adımları, fazla lekenin çıkarılmasına yardımcı olur, numunelerin optik berraklığını artırır ve böylece diseksiyonların verimli bir şekilde gerçekleştirilmesine yardımcı olur. Çözeltileri değiştirirken numuneleri dikkatli kullanın, çünkü herhangi bir hasar morfolojilerinin gelecekteki analizini etkileyebilir.
  9. Çözelti II'yi çıkarın ve 1.5-2 mL depolama çözeltisi ekleyin. Gliserol varlığı nedeniyle, lekeli numuneler 10 dakika içinde yavaş yavaş dibe çöker.
    NOT: Boyalı numuneler 4 °C'de bir yıldan fazla saklanabilir.

4. Kraniyofasiyal iskeletin diseksiyonu

  1. %3'lük agaroz çözeltisini, çözelti berraklaşana kadar mikrodalgada eritin.
    NOT: Çözelti şişeden dışarı fırlayabileceğinden aşırı ısıtmayın. Bu adımı gerçekleştirirken çözümü dikkatli bir şekilde kontrol edin.
  2. 90 mm'lik bir Petri kabını, erimiş agarozu Petri kabının derinliğinin üçte biri kaplanana kadar dökerek ve katılaşmasına izin vererek %3 agaroz ile kaplayın. Bu Petri kabında diseksiyonlar yapılacaktır.
    NOT: Agaroz kaplamalı Petri kapları bir hafta önceden hazırlanıp 4 °C'de saklanabilir. Agaroz kaplama, forsepslere zarar vermeden diseksiyonların yapılabileceği daha yumuşak bir alt tabaka sağlar.
  3. Kullanılacak forsepsleri %70 etanol ile temizleyin ve temiz bir parça standart laboratuvar kağıt mendille silin.
  4. Bir Pasteur pipeti kullanarak, 3-4 lekeli larvayı 0,5 mL depolama solüsyonu ile birlikte agaroz kaplı petri kabına aktarın.
    NOT: Depolama çözümü, E3'te aynısını yapmaya kıyasla diseksiyonları gerçekleştirmek için daha fazla optik netlik sağlar.
  5. Lekeli bir larvayı yan tarafına yönlendirin (Şekil 1A) ve forseps kullanarak yumurta sarısını larvanın vücudundan dikkatlice kazıyın
    NOT: Şekil 1B , yumurta sarısının çıkarıldığı bir embriyoyu göstermektedir. Etrafta yüzen yapışkan yumurta sarısı kütlesinin diseksiyona müdahale etmemesi için daha sonraki diseksiyon adımlarına geçmeden önce yumurta sarısı kazınmış embriyoyu yeni bir Petri kabına aktarmak iyi bir uygulamadır.
  6. Sarısı çıkarıldıktan sonra, larvayı bir forseps ile kuyruk bölgesinden tutun ve diğerini gözleri dikkatlice çıkarmak için kullanın.
    NOT: Şekil 1C , sarısı ve gözleri çıkarılmış bir embriyoyu göstermektedir. Kraniyofasiyal iskelete yakınlıkları diseksiyonlarını engelleyebileceğinden gözler dikkatle çıkarılmalıdır.
  7. Forsepsleri kullanarak beyni ve nörokraniyumun dorsalindeki diğer dokuları dikkatlice çekin ve sıkıştırın. Larvayı bir çift forseps ile hareketsiz tutun ve diğer forseps çiftini kullanarak ortada bir kesi yapın (Şekil 1C, kırmızı ok), ardından dokuları sıkıştırın (Şekil 1D).
    NOT: Bu adımı gerçekleştirirken, nörokraniyumun en ön bölgelerine yakın dokuları çıkarırken dikkatli olun, çünkü kıkırdak onlarla birlikte çıkabilir.
  8. Larvanın başını vücudun geri kalanından ayırın. Bu adımdan sonraki baş bölgesi öncelikle ön ve arka uçlarda olmak üzere iki noktada birbirine bağlı nörokranyum ve visserokranyumu ve bu kraniyofasiyal yapılara bağlı birkaç küçük boyanmamış dokuyu içerir (Şekil 1E).
    NOT: Doğrudan nörokraniyuma ve visserokranyuma bağlı boyanmamış dokuları tamamen çıkarmak zordur. Bazı rezidüel dokular mevcut olsa da, bunların varlığı boyanmadıkları için herhangi bir aşağı akış şekli veya boyut analizini etkilemeyecektir.
  9. Nörokranyum ve visserokranyum arasındaki iki bağlantıyı ayırmak için dikkatlice kesin (Şekil 1F, kırmızı kesikli çizgiler). Hem sağlam hem de diseke edilmiş embriyolarda nörokranyum ve visserokranyumun görüntüleri için Şekil 2'ye bakın.
  10. Temiz bir cam slayt üzerine bir veya iki damla %100 gliserol ekleyin. Forseps yardımıyla, diseke edilmiş nörokranyum veya visserokranyumu dikkatlice bu slayta aktarın. Bu dokuların üzerine nazikçe bir lamel yerleştirmek için forseps kullanın, kabarcık oluşmadığından emin olun ve tüm slaytlardaki lamel oje ile kapatın.
    NOT: Bu slaytlar lekeyi kaybetmeden 4 °C'de bir yıldan fazla saklanabilir.

5. Etmoid plakanın boyutlarının ölçülmesi

  1. Stereo mikroskoba bağlı bir kamera kullanarak damağın görüntülerini elde edin (Şekil 2D). Bilimsel düzeyde bir kameranın yokluğunda, görüntü elde etmek için stereo mikroskoba standart bir akıllı telefon takın.
  2. Niceleme için, bir damağın görüntüsünü FIJI22'ye yükleyin ve ardından etmoid plakanın genişliğini ve yüksekliğini mikron cinsinden ölçmek için çizgi aracını kullanın (bkz. Şekil 3A-C) ve kameranın piksel çözünürlüğünü kullanarak boyutları belirleyin.
  3. Etmoid plakanın etrafına bir taslak çizin ve Analiz Et | Set Ölçümleri | etmoid plakanın alanını elde etmek için alan (Şekil 3D,E).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı kraniyofasiyal iskeleti, döllenmeden 5 gün sonra (dpf) tamamen kıkırdaklıdır ve bu nedenle, kıkırdaklarda23 bol miktarda bulunan glikozaminoglikanlara bağlanabilen bazik bir boya olan Alcian mavisi kullanılarak boyanabilir. Bu, kıkırdağın maviye boyanmasına neden olur (Şekil 1), böylece çoğu lisans laboratuvarı ortamında bulunan standart bir stereo mikroskop kullanılarak larvada bulunan diğer dokulardan ayırt edilebilir. Sarısı kazındıktan (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kraniyofasiyal malformasyonlar, insanlardaki tüm doğum kusurlarının çoğunluğunu oluşturur ve sıklıkla bebek ölümlerine yol açar. Bununla birlikte, çoğu kraniyofasiyal anomalide altta yatan etiyoloji aydınlatılmayı beklemektedir25. Kraniyofasiyal yapılar herhangi bir omurgalıda karmaşıktır ve lisans ortamı perspektifinden bakıldığında, bu nedenle ilk koşul, öğrencilere kraniyofasiyal bölgedeki farklı yapılara genel bir bakış sağlayan bir eğitim aracına sahip olmakt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek hiçbir çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Balık tesisinin bakımı için Dr. Kalidas Kohale ve ekibine teşekkür ederiz. SRN, Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı'ndan (DAE) mali destek aldığını kabul eder (Proje Tanımlama no. RTI4003, DAE OM no. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 tarih ve 11.02.2020), Max Planck Topluluğu Ortak Grubu programı (M.PG. A MOZG0010) ve Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu Başlangıç Araştırma Bursu (SRG/2023/001716). Anlayışlı yorumları için laboratuvardan Dr. Shweta Verma'ya teşekkür ederiz. El yazması için figürler yapma konusundaki yardımları için Swetha Nagarajan ve Upal Chatterjee'ye teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarozLonza biyobilimi50004Petri kaplarını kaplamak için
Alcian mavi 8G Sigma-AldrichA3157 SerisiKıkırdakları boyamak için
Kalsiyum Klorür dihidratSigma-Aldrich12022Tampon yapmak için
KameraOlympusDP28 HakkındaGörüntülerin elde edilmesi için
DAPIRoche Yaşam Bilimleri10236276001Çekirdekleri etiketlemek için
EtanolHoneywell32221Alcian mavisi lekesi için çözücü
FİJİSürüm: ImageJ 1.54f
ForsepsDumontDumontDiseksiyon yapmak için
GliserolMP biyomedikal193996Yıkama yapmak ve örnekleri monte etmek için 
Hidrojen peroksitMP biyomedikal194057Çamaşır suyu çözeltisi yapmak için
Magnezyum klorür heksahidratSARD Biyolojik BilimlerSBRC0217Tampon yapmak için
Magnezyum sülfat heptahidratSigma-AldrichM2773 SerisiTampon yapmak için
MS-222 (Trikain)Sigma-AldrichA5040 SerisiLarvaları uyuşturmak için
Potasyum klorürSigma-AldrichP9541Tampon yapmak için
Potasyum hidroksitSigma-Aldrich484016Tampon yapmak için
Potasyum fosfat monobazikSigma-AldrichP0662Tampon yapmak için
Sodyum klorürSigma-AldrichS3014 SerisiTampon yapmak için
Sodyum fosfat dibazikSigma-Aldrich71640Tampon yapmak için
stereoskopOlympusSZX61 SerisiDiseksiyon yapmak için
Ara-20HIMEDIATC287 SerisiHücreleri geçirgenleştirmek için kullanılan deterjan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  2. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).
  3. Hammond, N. L., Dixon, M. J. Revisiting the embryogenesis of lip and palate development. Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).
  4. Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).
  5. Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  6. Selleri, L., Rijli, F. M. Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis. Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).
  7. Beaty, T. H., et al. Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate. Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).
  8. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  9. Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models. Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).
  10. Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors. Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).
  11. Walker, M., Kimmel, C. A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  12. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).
  13. Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).
  14. Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).
  15. Farmer, D. T., et al. A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development. Development. 148 (16), dev197244(2021).
  16. Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis. Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).
  17. Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model. Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).
  18. Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions. Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).
  19. Stenzel, A., et al. Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning. Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).
  20. Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom. Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).
  21. Cubbage, C. C., Mabee, P. M. Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).
  22. Schindelin, J. Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Tuckett, F., MorrissKay, G. Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).
  24. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140 (1), 76-81 (2013).
  25. Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  27. Ding, J., et al. Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae. J Vis Exp. (178), e63251(2021).
  28. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrafish Kraniofasiyal DiseksiyonuAlcian Blue BoyamaKraniofasiyal K k rdakN rokranyum DiseksiyonuViscerokranyum DiseksiyonuEtmoid PlakaPalatum MorfogeneziI k Sayfas MikroskobuDoku effafla t rmaG r nt Analizi

İlgili makaleler