Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Trombositten Zengin Fibrinin Büyüme Faktörlerindeki Sirkadiyen Varyasyonun Değerlendirilmesi: Bir Pilot Çalışma

509 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68902

⸱

24 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, University of Çukurova, 2Private Practice, 3Department of Biology, Faculty of Medicine, University of Çukurova

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, trombositten zengin fibrinden (PRF) büyüme faktörü salınımındaki sirkadiyen varyasyonları incelemekte ve PRF bazlı rejeneratif prosedürlerin zamanlamasını optimize etmek amacıyla kortizol seviyeleri ile korelasyonları araştırmaktadır.

Özet

Trombositten zengin fibrin (PRF), diş hekimliğinde, özellikle yumuşak ve sert dokuların yenilenmesi, ekstraksiyon soketi iyileşmesi, periodontal defektlerin tedavisi, sinüs büyütme ve mukogingival prosedürlerde kapsamlı klinik uygulamalara sahiptir. PRF, tek aşamalı santrifüj protokolü ile hazırlanan, trombosit türevi, büyüme faktörü açısından zengin bir biyomateryaldir. Bu çalışmada PRF kaynaklı büyüme faktörlerinin sabah ve akşam saatleri arasında sirkadiyen farklılık gösterip göstermediğinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Yirmi sağlıklı gönüllü katıldı ve her biri üçü 08:00'de ve üçü 20:00'de olmak üzere altı venöz kan örneği verdi. Her zaman noktasından tam kan sayımı için bir tüp, serum kortizol analizi için bir tüp ve PRF hazırlama için bir tüp kullanıldı (12 dakika boyunca 708 x g'dasantrifüjlendi). PRF'deki büyüme faktörleri (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) ELISA kullanılarak 24 saat ve 72 saatte ölçüldü. Seviyeleri zaman noktaları arasında karşılaştırıldı ve serum kortizol seviyeleri ile ilişkilendirildi. FGFR seviyeleri, akşam örneklerinde 72 saatte 24 saate göre önemli ölçüde daha yüksekti. Ancak sabah ve akşam arasında IGF-1, PDGF, VEGF veya TGFβ-1 için anlamlı bir fark bulunmadı. Kortizol seviyeleri, sabah örneklerinde 72 saatte PDGF ile ve akşam örneklerinde 72 saatte IGF-1 ile negatif korelasyon gösterdi; ancak başka anlamlı bir korelasyon gözlenmedi. Bu bulgular, kan alma zamanlamasının PRF büyüme faktörü içeriğini önemli ölçüde etkilemediğini ve numune zamanlamasına ilişkin klinik protokollerde esnekliğe işaret ettiğini göstermektedir.

Giriş

Trombositten zengin fibrin (PRF), otolog kökeni, hazırlanma kolaylığı ve biyolojik olarak aktif içeriği nedeniyle rejeneratif diş hekimliğinde yaygın olarak kullanılan ikinci nesil bir trombosit konsantresidir1. Antikoagülan olmadan tam kanın santrifüjlenmesiyle oluşan PRF, trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), dönüştürücü büyüme faktörü-beta 1 (TGF-β1), insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblast büyüme faktörü reseptörü (FGFr) gibi büyüme faktörlerini salgılayan trombosit ve lökositlerden zengin bir fibrin matriksi sağlar. Bu biyomoleküller hücresel proliferasyon, anjiyogenez, hücre dışı matris yeniden şekillenmesi ve doku rejenerasyonunda merkezi roller oynar2. Antikoagülanlar ve eksojen aktivasyon gerektiren trombositten zengin plazma (PRP) ile karşılaştırıldığında, PRF, hapsolmuş lökositler ve trombositler içeren fizyolojik bir fibrin iskelesi sağlayan tek adımlı, antikoagülan içermeyen bir işlemle üretilir. Bu mimari, büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin daha yavaş, daha sürekli bir salınımını destekleyerek, kullanım karmaşıklığını ve maliyetini azaltırken potansiyel olarak yara stabilitesini ve erken doku onarımını artırır 1,2. Ayrıca, antikoagülanların ve aktivatörlerin yokluğu, manipülasyona bağlı değişkenliği en aza indirir ve doğal trombosit davranışını daha iyi koruyabilir, bu da hasta başı kullanımı ve operatörler arasında standardizasyon için pratik avantajlar sunar2.

Yaygın klinik kullanımına rağmen, PRF'nin biyoaktif bileşenlerinin zamansal dinamikleri tam olarak anlaşılamamıştır. 24 saatlik içsel bir biyolojik döngü olan sirkadiyen ritim, bağışıklık fonksiyonu, hormon sekresyonu ve hematolojik parametreler dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik sistemleri etkiler 3,4. Birincil sirkadiyen hormon olan kortizol, sabahın erken saatlerinde zirve yapar ve gün boyunca kademeli olarak azalır5. Daha da önemlisi, çalışmalar trombosit aktivitesinin, agregasyon kapasitesinin ve sayısının sirkadiyen mekanizmalar tarafından da modüle edilebileceğini ve pıhtılaşma ve yara iyileşmesi üzerinde etkileri olduğunu göstermiştir6.

PRF doğrudan periferik kandan türetildiğinden, kan alımının sirkadiyen zamanlaması, trombosit aktivasyon durumunu ve ardından fibrin polimerizasyonu sırasında büyüme faktörlerinin salınmasını potansiyel olarak etkileyebilir. Trombositten zengin plazmada trombosit sayısı ve büyüme faktörlerindeki günlük değişimler daha önce Aoto ve ark.7 tarafından analiz edilmiş olmasına rağmen, günün farklı saatlerinde hazırlanan FRF'nin büyüme faktörü bileşiminde ölçülebilir farklılıklar gösterip göstermediğini sistematik olarak inceleyen bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu pilot çalışma, sağlıklı bireylerden sabah ve akşam toplanan örnekleri karşılaştırarak PRF kaynaklı büyüme faktörlerinin sirkadiyen varyasyonunu araştırmayı amaçlamaktadır. Ek olarak, her zaman noktasında serum kortizol düzeylerini değerlendirdik ve bunların PRF büyüme faktörü salınımı ile korelasyonlarını araştırdık. Bu tür zamansal değişkenliği anlamak, klinik protokollerin optimize edilmesine yardımcı olabilir ve PRF bazlı rejeneratif tedavilerin standardizasyonuna katkıda bulunabilir. Bu çalışmanın sıfır hipotezi, kan alımının sirkadiyen zamanlamasının trombositten zengin fibrinden (PRF) salınan büyüme faktörlerinin konsantrasyonunu önemli ölçüde etkilemediğiydi; bununla birlikte, trombosit aktivitesi ve hormon sekresyonunun bilinen sirkadiyen düzenlemesine dayanarak, başlangıçta kan alma zamanının (sabah veya akşam) PRF büyüme faktörü içeriğini değiştirebileceği varsayılmıştır. Klinik açıdan bakıldığında, PRF büyüme faktörü içeriğinin sirkadiyen varyasyona duyarlı olup olmadığının açıklığa kavuşturulması, rejeneratif protokollerin standardizasyonu için önemlidir. Büyüme faktörü salınımı gün boyunca büyük ölçüde sabit kalırsa, klinisyenler damar delinmesinin zamanlamasının tedavi sonuçlarını önemli ölçüde etkilemeyebileceğinden emin olabilirler, böylece planlama prosedürlerinde esneklik sağlanır. Tersine, anjiyogenez veya doku onarımı ile ilgili olanlar gibi belirli faktörlerde ince farklılıklar ortaya çıkarsa, örneğin iyileşme koşullarının tehlikeye atıldığı durumlarda, maksimum rejeneratif potansiyelin istendiği durumlarda kan alma zamanlaması optimize edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Periodontoloji Anabilim Dalı'nda Adana, Türkiye'de 20 sağlıklı gönüllünün katılımıyla gerçekleştirilmiştir. Çalışmaya dahil edilmeden önce tüm katılımcılara çalışmanın amacı, metodolojisi ve prosedürleri hakkında bilgi verildi ve yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Etik onay Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu tarafından verilmiştir (Onay No: 125/55, Tarih: 16.09.2022). İnsan kanının işlenmesine ilişkin temel biyogüvenlik kılavuzu ve biyolojik olarak tehlikeli maddeler ve kimyasal reaktifler için atık imha talimatları da dahil olmak üzere tüm prosedürler, NIH-CDC yönergelerineuygun olarak gerçekleştirildi 8. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Katılımcı seçimi

Çalışmaya dahil edilen katılımcılar 18-25 yaş aralığında, bilinen herhangi bir sistemik hastalığı olmayan ve işlemler sırasında yeterli işbirliği gösteren sağlıklı bireylerdi. Herhangi bir sistemik rahatsızlığı olan, hamile veya emziren ya da hematolojik veya hormonal parametreleri etkileyebilecek herhangi bir ilaç veya hormonal ajan kullanan kişiler çalışma dışı bırakıldı.

2. Kan alma ve grup tahsisi

Her katılımcıdan üçü sabah (08:00) ve üçü akşam (20:00) olmak üzere toplam altı adet 10 mL venöz kan örneği alındı. Çalışmada katkısız camdan (10 mL) steril PRF tüpleri kullanıldı. Sabah seansında tam kan sayımı (CBC) için Tüp 1, serum kortizol analizi için Tüp 2 ve PRF hazırlığı için Tüp 3 ve ardından büyüme faktörü analizi yapıldı. Akşam seansında CBC için Tüp 4, serum kortizol analizi için Tüp 5 ve PRF hazırlama ve büyüme faktörü analizi için Tüp 6 kullanıldı. Kan alma zamanına göre örnekler iki gruba ayrıldı: Grup 1 sabah kanından hazırlanan saf PRF'den (08:00) ve Grup 2 akşam kanından hazırlanan saf PRF'den (20:00) oluşuyordu.

3. PRF hazırlık

Kan örnekleri, 40° sabit açılı rotor ve 10 mL cam tüplerle donatılmış bir santrifüj kullanılarak oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 708 x g'da santrifüj edildi. Kullanılan cihazın rotor yarıçapı 88 mm ile 110 mm arasında ayarlanabiliyordu; Bu çalışmada, protokolü standardize etmek için 88 mm'lik bir yarıçap seçilmiştir. İşlem sırasında antikoagülan kullanılmadı. Santrifüjlemenin ardından, elde edilen PRF, pürüzsüz ve homojen bir yüzey, elastik ve silindirik bir şekil ve kompakt, sağlam bir kıvam ile karakterize edilen uygun oluşumu sağlamak için makroskopik olarak değerlendirildi.

4. Büyüme faktörü ELISA analizi

PRF pıhtıları, steril makas kullanılarak kırmızı kan hücresi tabakasından dikkatlice ayrıldı. Her pıhtı tartıldı ve tüm numunelerde inkübasyon ortamını standartlaştırmak ve PRF matrisinden çözünür büyüme faktörlerinin tutarlı difüzyonunu sağlamak için ağırlığa (g = mL) göre 1:1 oranında RPMI-1640 kültür ortamı eklendi. Bu oran, pıhtı boyutuna bağlı olarak orantılı ekstraksiyona izin vererek, eşit olmayan pıhtı kütleleri nedeniyle büyüme faktörü konsantrasyonlarındaki değişkenliği en aza indirir. Numuneler, büyüme faktörlerinin PRF matrisinden kültür ortamına düzgün difüzyonunu teşvik etmek için 100 rpm ve 3 °C'de 24 saat ve 72 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe edildi. İnkübasyonun ardından süpernatanlar toplandı ve analize kadar -8 °C'de saklandı. Büyüme faktörü konsantrasyonları, üreticinin hazırlama protokolü9,10'a uygun olarak FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF ve TGF-β1 dahil olmak üzere ticari ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü.

5. ELISA adımları

Kuyucuklara standartlar ve numuneler (her biri 100 μL) ilave edildi ve 3 °C'de 90 dakika inkübe edildi. Kuyular daha sonra yıkama tamponu ile üç kez yıkandı. Daha sonra, her bir oyuğa 100 μL biyotin etiketli antikor eklendi ve 3 °C'de 60 dakika inkübe edildi, ardından üç ek yıkama yapıldı. Daha sonra 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) çözeltisi ilave edildi ve 3 °C'de 30 dakika inkübe edildi. Üç yıkamadan sonra, 100 μL substrat reaktifi eklendi ve 15 dakika inkübe edildi. Son olarak, her kuyucuğa 50 μL durdurma solüsyonu eklendi ve absorbans 450 nm'de ölçüldü.

6. İstatistiksel analiz

Kategorik değişkenler frekans ve yüzde olarak ifade edilirken, sayısal veriler uygun şekilde ortalama ± standart sapma veya medyan (minimum-maksimum) olarak sunuldu. Sayısal değişkenlerin normalliği Shapiro-Wilk testi kullanılarak değerlendirildi. Normallik varsayımını karşılamayan değişkenler, özellikle büyüme faktörü konsantrasyonları ve kortizol seviyeleri, eşleştirilmiş karşılaştırmalar için Wilcoxon işaretli sıra testi ve ilişkiler için Spearman'ın sıra korelasyon katsayısı dahil olmak üzere parametrik olmayan testler kullanılarak analiz edildi. Tüm istatistiksel analizler IBM SPSS Statistics yazılımı kullanılarak yapıldı. P değeri <0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Tüm karşılaştırmalar, bireyler arası değişkenliği kontrol etmek için konu içinde yapılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

20 gönüllü katılımcının tamamı (10 kadın ve 10 erkek, yaşları 18 ile 25 arasında) çalışmayı herhangi bir örneklem kaybı olmadan tamamladı. Tam kan sayımı sonuçları, trombosit ve hematolojik parametrelerin tüm örneklerde normal referans aralıklarında olduğunu doğruladı ve PRF preparatlarının güvenilirliğini doğruladı.

Sabah ve akşam arasındaki kan parametrelerinin karşılaştırılması
Kortizol düzeyleri sabah örneklerinde akşama göre anlamlı derecede yüksekti (p < 0.001), bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Trombosit aktivitesi ve hormon sekresyonunun bilinen sirkadiyen düzenlemesine dayanarak, başlangıçta kan alma zamanının (sabah veya akşam) PRF büyüme faktörü içeriğini değiştirebileceği varsayılmıştır. Bu çalışmanın amacı, böyle bir zamansal varyasyonun olup olmadığını ve varsa serum kortizol düzeyleri ve hematolojik parametrelerle ilişkili olup olmadığını test etmektir. Çalışma, PRF'den türetilen büyüme faktörü salınımındaki sirkadiyen varyasyonu araştırmak için bir pilot araşt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SANTRİFÜJ MAKİNESİDUO913023410238
ELISA KİTLERİİnce Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. IGF-1 (Katalog no:EH0165)
ELISA KİTLERİİnce Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. PDGF (Katalog no:EH3531)
ELISA KİTLERİİnce Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. FGFR (Katalog no:EH0715)
ELISA KİTLERİİnce Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. VEGF (Katalog no:EH0327)
ELISA KİTLERİİnce Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. TGF-β 1(Katalog no:EH0287)
PRF Tüplerifigure-materials-16370

Kaynaklar

  1. Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generation platelet concentrate. Part I: Technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
  2. Ehrenfest, D. M. D., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: From pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27 (3), 158-167 (2009).
  3. Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nat Rev Immunol. 13 (3), 190-198 (2013).
  4. Haus, E., Smolensky, M. Biological clocks and shift work: Circadian dysregulation and potential long-term effects. Cancer Causes Control. 17, 489-500 (2006).
  5. Weitzman, E. D., et al. Twenty-four hour pattern of the episodic secretion of cortisol in normal subjects. J Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 14-22 (1971).
  6. Scheer, F. A., et al. The human endogenous circadian system causes greatest platelet activation during the biological morning independent of behaviors. PLoS One. 6 (9), e24549(2011).
  7. Aoto, K., et al. Circadian variation of growth factor levels in platelet-rich plasma. Clin J Sport Med. 24 (6), 509-512 (2014).
  8. Richmond, J. Y., McKinney, R. W. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , US Government Printing Office. (2009).
  9. Hyslop, P. A., Bender, M. H. Methods for sample preparation for direct immunoassay measurement of analytes in tissue homogenates: ELISA assay of amyloid β-peptides. Curr Protoc Neurosci. 18 (1), 7.20.21-7.20.27 (2002).
  10. ELISA sample preparation protocol. , FineTest. (2022).
  11. Karolczak, K., et al. Plasma concentration of cortisol negatively associates with platelet reactivity in older subjects. Int J Mol Sci. 24 (1), 717(2022).
  12. Bass, J., Takahashi, J. S. Circadian integration of metabolism and energetics. Science. 330 (6009), 1349-1354 (2010).
  13. Atkinson, G., Todd, C., Reilly, T., Waterhouse, J. Diurnal variation in cycling performance: Influence of warm-up. J Sports Sci. 23 (3), 321-329 (2005).
  14. Petrovsky, N., Harrison, L. C. The chronobiology of human cytokine production. Int Rev Immunol. 16 (5-6), 635-649 (1998).
  15. Hilderink, J. M., et al. Within-day biological variation and hour-to-hour reference change values for hematological parameters. Clin Chem Lab Med. 55 (7), 1013-1024 (2017).
  16. Xie, Y., et al. FGF/FGFR signaling in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 181(2020).
  17. Farooq, M., Khan, A. W., Kim, M. S., Choi, S. The role of fibroblast growth factor (FGF) signaling in tissue repair and regeneration. Cells. 10 (11), 3242(2021).
  18. Murgo, E., Falco, G., Serviddio, G., Mazzoccoli, G., Colangelo, T. Circadian patterns of growth factor receptor-dependent signaling and implications for carcinogenesis. Cell Commun Signal. 22 (1), 319(2024).
  19. McCarthy, T. L., Centrella, M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-I in skeletal cells. Endocrinology. 126 (3), 1569-1575 (1990).
  20. Dong, J., et al. The proliferative effect of cortisol on bovine endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol. 17, 1-9 (2019).
  21. Moraes, L. A., et al. Ligand-specific glucocorticoid receptor activation in human platelets. Blood. 106 (13), 4167-4175 (2005).
  22. Deutsch, V., et al. Sustained leukocyte count during rising cortisol level. Acta Haematol. 118 (2), 73-76 (2007).
  23. Lightman, S. L., Conway-Campbell, B. L. The crucial role of pulsatile activity of the HPA axis for continuous dynamic equilibration. Nat Rev Neurosci. 11 (10), 710-718 (2010).
  24. Gabbitas, B., Pash, J. M., Delany, A. M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-binding protein-5 in bone cell cultures by transcriptional mechanisms. J Biol Chem. 271 (15), 9033-9038 (1996).
  25. Gado, M., Baschant, U., Hofbauer, L. C., Bad Henneicke, H. to the bone: The effects of therapeutic glucocorticoids on osteoblasts and osteocytes. Front Endocrinol. 13, 835720(2022).
  26. Raica, M., Cimpean, A. M. Platelet-derived growth factor (PDGF)/PDGF receptors (PDGFR) axis as target for antitumor and antiangiogenic therapy. Pharmaceuticals. 3 (3), 572-599 (2010).
  27. Li, J., Forhead, A., Dauncey, M., Gilmour, R., Fowden, A. Control of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I expression by cortisol in ovine fetal skeletal muscle. J Physiol. 541 (2), 581-589 (2002).
  28. Al-Sharabi, N., et al. Proteomic analysis of mesenchymal stromal cells secretome in comparison to leukocyte- and platelet-rich fibrin. Int J Mol Sci. 24 (17), 13057(2023).
  29. Coucke, B., et al. Leukocyte- and platelet-rich fibrin for enhanced tissue repair: An in vitro study characterizing cellular composition, growth factor kinetics and transcriptomic insights. Mol Biol Rep. 51 (1), 954(2024).
  30. Chtourou, H., Souissi, N. The effect of training at a specific time of day: A review. J Strength Cond Res. 26 (7), 1984-2005 (2012).
  31. Kang, Y. H., et al. Platelet-rich fibrin is a bioscaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration. Tissue Eng Part A. 17 (3-4), 349-359 (2011).
  32. Miron, R. J., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: A systematic review. Clin Oral Investig. 21, 1913-1927 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kan Toplama ZamanlamasıPRF HazırlamaTek Adımlı SantrifüjlemeSerum KortizolELISA AnaliziYumuşak Doku RejenerasyonuSert Doku Rejenerasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.