Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Özet

Bu makale, entomopatonik (EPN: böcek-parazitik) nematod ve gelişmekte olan bir genetik model olan Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliğini göstermektedir. Anlatılan teknoloji, mutantların yaratılması için faydalıdır ve nematod biyolojisinde karşılıklı ve parazitik simbiyozla ilgili gen fonksiyonlarının aydınlanmasını sağlar.

Özet

Steinernema ve Heterorhabditis cinslerindeki entomopatotik nematodlar (EPN), sırasıyla Xenorhabdus ve Photorhabdus simbiyotik bakterilerle karşılıklı etkileşimler sürdürür. Bu nematod-bakteri çiftleri birlikte, öncelikle Lepidoptera ve Coleoptera takımlarından larvalar olan böcek konaklarını enfekte eder ve öldürür; böylece karşılıklılık ve parazitizmin moleküler temelini analiz etmek için yönetilebilir üçlü bir sistem oluşturur. Bu modeli tam olarak kullanmaya yönelik önemli bir adım, EPN'lerde kararlı ve kuşaklararası genetik araçların geliştirilmesidir. Burada, gelişmekte olan Steinernema hermaphroditum modelinde güvenilir bir CRISPR–Cas9 genom düzenleme platformunu gösteriyoruz; bu tür, hem in vivo hem de in vitro kolayca korunabiliyor ve gonadal mikroenjeksiyona oldukça uygun bir tür. Önemli olarak, hermafroditik üreme, homozigot mutant hatların oluşumunu ve bakımını büyük ölçüde kolaylaştırır. Cas9 ribonükleoprotein komplekslerinin mikroenjeksiyon tabanlı teslimatını kullanarak verimli ve hedefli gen bozulması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bir kavram kanıtı olarak, korunan kas ilişkili gen unc-22'yi modifiye ettik ve bu sistemde hedefli mutagenezi doğrulayan karakteristik bir seğirme fenotipi oluşturduk. Bu CRISPR–Cas9 platformu, S. hermaphroditum'da transgen ifadesi gibi stabil genetik manipülasyonların kapısını açıyor ve tarımsal ve ekolojik öneme sahip ek EPN türlerine genişletilebilen bir çerçeve sağlıyor.

Giriş

Entomopatotik nematodlar (EPN'ler), bakteriyel simbiyontları 1 ile türe özgü karşılıklı ortaklıklar kuran böcek öldüren^{parazitlerdir.} EPN'ler iki aileden oluşur: Steinermatidae ve Heterorhabditidae; bunlar sırasıyla Photorhabdus ve Xenorhabdus türlerinin Gram-negatif bakterileriyle ilişki^{kurar, sırasıyla 2,3}. Steinernema nematodlarının serbest yaşayan enfeksif genç evresinde (IJ), Xenorhabdus bakterileri nematodun bağırsak cebinde bulunan ve alıcı olarak bilinen bir bağırsak cebinde bulunur ve böcek konakçısı hemokoelə girdiğinde bakteriler serbest bırakılır, ardından çoğalır ve septisemi ^3,4 ile böceği öldürür. Bu karşılıklı ilişkide bakteriler, konak bağışıklık yanıtına karşı koruyan ve nematoda besin destek sağlayan antimikrobiyal ve böcek öldürücü^{bileşikler üretir.} Buna karşılık, bakteriler nematod konakçısının çevresel mikroplara karşı sağladığı korumadan faydalanır ve yeni böcek^{avına yayılmaları kolaylaştırılır 6,7}.

Son birkaç on yılda, Steinernema-Xenorhabdus ortaklığı, parazitik ve karşılıklı etkileşimlerin çeşitli yönlerini incelemek için güçlü bir deneysel sistem olarak kurulmuştur; örneğin, böcek konakçı arama^{davranışları 3}, nematod^{konakçısında bakteri kolonizasyonu 8} ve simbiyotik bakterilerin nematodlar ile böcek konak hayvanları arasındaki geçişlerini kolaylaştıran adaptif^{davranışları 9}. EPN'ler toprak sürdürülebilirliğinde de önemli türlerdir ve tarımsal verimliliği artırmak için organik zararlı kontrol ajanı olarak^{kullanılırlar 10,11}.

Simbiyotik bakteriler Xenorhabdus ve Photorhabdus^12'de genetik araçların hızlı gelişimine rağmen, EPN'lerde tutarlı genetik araçlar nadir hale gelmiştir. Gonadal mikroenjeksiyon, hem Heterorhabditis hem de Steinernema ^{nematodlarında başarıyla belirlenmiştir 13,14}. Daha önce, Heterorhabditis bakteriophora'da gonadal mikroenjeksiyon, ilk nesil ^13,15 arasında gen etkisi için çift zincirli RNA tutarlı şekilde iletmek için kullanılmıştır. Son zamanlarda, Steinernema'da CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi geliştirilmiş, gonadal mikroenjeksiyon yoluyla sağlanmış ve kesin, stabil ve kalıtsal^{mutasyonlara yol açmıştır 14}.

Steinernema türlerinden biri olan S. hermaphroditum, son derece kolay kontrol edilebilir olduğu ve yeni ortaya çıkan genetik model^{organizma olarak büyük potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir 4,14}. Başlangıçta Endonezya'da^{topraktan izole edilmiş ve Hindistan'da yeniden izole edilmiş S. hermaphroditum 17} olarak her nesilde az sayıda erkek bulunur; bu iki özellik, klasik model nematod C. elegans^4'ten genetik araçların adaptasyonunu kolaylaştırmaktadır. Ayrıca, S. hermaphroditum genomu dizilenip kromozomlara monte edilmiş, böylece potansiyel Cas9 hedef bölgelerini belirleme ve primer¹⁸ tasarlama görevi basitleştirilmiştir.

EPN'nin mikroenjeksiyonu sırasında, dsRNA'lar, Cas9 proteini veya rehber RNA'lar gibi uygun reaktifleri içeren enjeksiyon karışımı, kuvars kapillerden çekilen bir iğne aracılığıyla sinsityal nematod gonad'a iletilir. Enjeksiyonun uygun hacmi ve basıncı, gonadal kol boyunca görünür bir sıvı 'akışı' ile sonuçlanır. Bu nematodlar, aynı^{sitozol 19'u} paylaşan germline çekirdeklerden oluşan bir çift sinsityal gonadlara sahip olduğundan, bu mikroenjeksiyon yaklaşımı, sitokinez gerçekleşmeden önce birden fazla germ hücrenin düzenlenmesine olanak tanır ve tohum hattı çekirdekleri gelişen^{oositlere ayrılır 20}. Gonadal mikroenjeksiyon, model olmayan nematodların birkaç türünde genetik modülasyon için tutarlı bir teknik olarak^{hizmet etse (14,21,22,23,24,25}), enjeksiyon tekniklerinin her nematod türünün uygun gonadal yapılarına, yaşam evresine ve fizyolojik koşullarına uyarlanması başarı ve yüksek verimlilik sağlamak için hayati öneme sahiptir. Enjeksiyon sonrası iyileşme teknikleri ve mutant hatların korunması, bu tekniğin maliyet verimli olmasını sağlamak için önemlidir.

Bu çalışma, Steinernema hermaphroditum'da bir CRISPR-Cas9 genom düzenleme protokolünü göstermektedir. Gonadal mikroenjeksiyon, genç yetişkinde tanımlanır; bu aşama yüksek basınçlı mikroenjeksiyona dayanıklıdır ve gen^{düzenlemeye 14} karşı duyarlıdır. Ayrıca, kalıtsal ve kararlı mutant hatların korunmasını , hem kriyokoruma hem de böcekler aracılığıyla çoğaltma yoluyla ayrıntılı yöntemler sunulmaktadır.

Protokol

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mikroenjeksiyondan önce nematod hazırlığı

1. Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarını Xenorhabdus griffiniae ve Comamonas aquaticus bakterileriyle tohumlanmış olarak hazırlayın.
   NOT: S. hermaphroditum nematodlarını, mikroenjeksiyondan önce kendi doğal simbiyotik bakterisi Xenorhabdus griffiniae üzerinde yetiştirerek nematod büyümesini maksimize etmek ve enjekte edilen hayvanları Comamonas aquaticus bakterisiyle iyileştirmek için enjeksiyon sonrası hayatta kalma^{süresini artırmak için} 14.
   1. Streak bakterisi X. griffiniae LB-piruvat agar plakalarında (2,5 g maya ekstraktı, 5 g tripton, 2,5 g sodyum klorür, 0,5 g sodyum piruvat, 7,5 g agar, 500 mL suda) ve gece boyunca 30 °C'de kuluçka yapın.
   2. Streak bakterisi C. aquaticus LB agar plakalarında ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka içinde.
   3. Koyu LB sıvı ortamını (5 g maya ekstraktı, 10 g tripton, 5 g sodyum klorür, 1 L suda) aşılamak için tek bir bakteri kolonisi seçin. Bakteri kültürü gece boyunca (en fazla 16 saat) ve havalandırma ile (X. griffiniae 30 °C'de ve C. aquaticus 37 °C) yetiştirin.
   4. NGM agar hazırlayın: (3 g NaCl, 2,5 g pepton ve 20 g agar eklenerek 975 mL suya eklenin, 1 mL kolesterol, 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄, 25 mL 1 M KPO₄ eklenerek otoklavlamadan sonra) 60 mm x 15 mm Petri kabı başına 10 mL ekleniyor.
   5. Tohum bakterileri: Her NGM agar plakasına gece boyunca kullanılan bakteri kültüründen birkaç damla ekleyin, bakteri damlalarını bir yama halinde yaymak için hafifçe sallayın.
   6. Bakteri tohumlu NGM plakalarını oda sıcaklığında kuluçka altına alın, böylece agarın kuruması ve bakterilerin büyümesi sağlanır.
      NOT: X. griffiniae tohumlu plakalar mümkün olan en kısa sürede kullanılmalıdır; C. aquaticus tabakları oda sıcaklığında 1-2 hafta saklanabilir.
2. Nematod aşaması
   NOT: Hermafroditin J3 aşamasını enjeksiyondan önceki gece ve genç yetişkinleri enjeksiyon gününde seçin.
   1. S. hermaphroditum nematodlarını, hazırlanmış NGM plakalarına ve X. griffiniae tohumlarına koparın veya parçalayın. Optimal büyüme için 25-28 °C sıcaklıkta kuluçka yapın.
   2. Mikroenjeksiyondan önceki gece, hermafroditlerin J3 aşamasını X . griffiniae tohumlu NGM agar'a alın. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, J3 evresi nematodun boyutu ve gonadların ve vulvaların morfolojisiyle tahmin edilir.
   3. Mikroenjeksiyon gününde, genç yetişkin hermafroditleri seçin (Şekil 1B).

2. Mikroenjeksiyon için CRISPR-Cas9 hazırlığı

1. CRISPR crRNA'larının ve reaktiv depolamanın seçilmesi
   1. BlastP, PRJNA982879 kullanılarak referans Steinernema hermaphroditum genomundan hedef gen dizisini çıkarın.
   2. Mümkünse erken kodlayan bir ekzon dizisini seçin, tercihen ilk ekzonu seçin ve diziyi varsayılan^{ayarlar 26} kullanarak CRISPRScan'a girerek olası CRISPR RNA'larının (crRNA'ların) bir listesini oluşturun.
   3. En üst crRNA'ları S. hermaphroditum genomuna karşı patlatarak sadece benzersiz crRNA'ların seçildiğinden emin olun.
      NOT: Isteğe bağlı: CRRNA'ların verimli bağlanmasını sağlamak için genomun hedef bölgesinin dizilimi crRNA tasarımından önce PCR amplifikasyonu ve Sanger dizileme ile doğrulan.
   4. CRISPR RNA'ları (crRNA'lar) ve evrensel trans-aktifasyon CRISPR RNA'ları (tracrRNA'lar) her biri 100 μM'de, -80 °C sıcaklıkta çift tamponda depolanın.
   5. Cas9 proteinini 10 mg/mL'de -20 °C veya -80 °C sıcaklıkta sakla. 1 M KCL'yi 4 °C'de sakla.
2. Enjeksiyon için %2 agaroz pedinin yapılması (Berkowitz ve ^ark.27'den uyarlanmıştır)
   1. %2 agarozu mikrodalga fırında suda eritin.
   2. 50 μL erimiş agarozu bir kap camına aktarın (48 x 60 mm no.1). Agararoz damlasını hemen başka bir kap bardağı ile örtün.
   3. Agarozu oda sıcaklığında 20 dakika kurut. Üst kapak camını çıkarın. Agarose pedinin ön tarafını etiketleyin.
      NOT: İsteğe bağlı: Agarose pedini gece boyunca 37 °C'de pişirerek agarose yastığını daha da kurutabilirsiniz.
   4. %2 agarose pedlerini oda sıcaklığında aylarca hatta yıllarca sakla.
3. İğne hazırlığı
   1. Lazer filament çekicisinde aşağıdaki parametreleri kullanarak kuvars iğneleri üretin. Bu çalışmada kullanılan iğne çekicisi ile önerilen program şöyledir: Isı: 700, Filament: 4, Hız: 60, Gecikme: 145, Çekme: 175.
   2. Kuvars iğnelerini (OD: 1.0 mm, ID: 0.7 mm) enjeksiyondan hemen önce veya önceden çekin ve pipet saklama kutusunda saklayın.
      NOT: Alternatif olarak, borosilikat iğnelerle de enjekte etmekte başarı elde ediyoruz (OD: 1,2 mm, ID: 0,68 mm). Farklı boyutlarda iğneler, farklı boyutlarda iğne tutucularıyla eşleşir.

3. CRISPR-Cas9 mikroenjeksiyonu ve mikroenjeksiyondan sonra nematodların geri alınması

1. CRISPR-Cas9 mikroenjeksiyon karışımını hazırlayın (Wang ve ^ark.28'den uyarlanmıştır)
   1. Seçilmiş crRNA'ları ve evrensel tracrRNA'yı 1:1 oranında karıştırarak yeni rehber RNA dupleksleri hazırlayın; yani PCR tüpünde toplam crRNA'dan tracrRNA'ya kadar toplam crRNA'yı karıştırın:
      crRNA #1 (100 μM) - 1.5 μL
      crRNA #2 (100 μM) - 1.5 μL
      tracrRNA (100 μM) - 3.0 μL
      NOT: Co-CRISPR kullanılıyorsa, crRNA #1 unc-22 belirteç genini hedefliyorken, crRNA #2 ise ilgilenen ikinci bir geni hedef alan başka bir dizili ile değiştirilebilir.
   2. PCR tüpünü termosiklde 94 °C'de 2 dakika kuluçka yapın ve ardından oda sıcaklığına soğutun.
   3. Enjeksiyon karışımını aşağıdakileri birleştirerek birleştirin, ardından oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın:
      Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL
      1M KC - 0.58 μL
      gRNA dupleksleri (adım 3.1.1'den itibaren) - 2.7 μL
   4. PCR tüpünü üç kez karıştırın, ardından mini bir santrifüjde kısa bir dönüş (10-15 saniye) yapın ve tüpün içeriği toplanın. Son karışımdan sonra 1 dakikaya kadar daha uzun bir süre döndürün.
2. İğneyi yükle ve kır
   1. İğneyi mikro yükleyici ucu kullanarak 1-2 μL enjeksiyon karışımıyla doldurun.
   2. İğneyi pipet (iğne) tutucuya monte edin, ardından iğneyi halokarbon yağı ile kaplanmış çift taraflı bir bant parçası üzerinde sürükleerek ucunu kırın. İğnenin açılışını, mikroenjektörün CLEAN fonksiyonuyla test edin.
3. Genç yetişkin nematodun sinsityal gonadlarına mikroenjeksiyon
   1. Küçük bir Halokarbon yağı damlasını %2 agaroz pedine aktarın.
   2. Diseksiya stereoskobu altında, ince (yumuşak) platin bir tel kullanarak genç yetişkin hermafrodit nematodu alıp M9 tamponu içinde yıkayın (litre başı: 3 g KH₂PO4, 11.3 g Na_{2HPO 4}, 5 g NaCl, otoklavlamadan sonra 1 ml 1 M MgSO₄ eklenerek) bakterileri çıkarmak için (bkz. Şekil 1'deki genç yetişkin nematodu).
   3. Yıkanmış nematodu agaroz pedine aktarın ve halokarbon yağı damlasına yerleştirin. Nematodu nazikçe fırçalamak için yumuşak bir platin tel kullanın, hayvan hareketsiz hale gelene kadar.
   4. Agarose pedini dikkatlice mikroenjeksiyon aşamasına yerleştirin. Gonadal sinsityumun yönü iğneyi yaklaşık 45° açıda göstermelidir. 5x büyütmeden başlayın, sonra enjeksiyonlar için 20x ve 40x büyütmeye geçin.
   5. İğnenin sinsityuma nüfuz ettiğinden emin olun, ardından mikroenjektörün CLEAN işlevini kullanarak enjeksiyon karışımını yaklaşık 99 psi'de dahil edin, böylece enjekte edilen sıvının net bir gonadal akışı gözlemlenerek reaktiflerin gonadal sinsityumdaki germ hücrelere ulaşmasını sağlar.
   6. İkinci gonadal kol erişilebiliyorsa, iğneyi ikinci kola enjekte etmek için aşamayı hareket ettirin.
4. Enjeksiyon sonrası nematod iyileşmesi
   1. Enjeksiyondan hemen sonra, enjekte edilen hayvanı agaroz pedinde 1-2 μL M9 tamponunda yeniden süzülür.
   2. İnce bir platin tel kullanarak, agaroz pedinden enjekte edilen nematodu alıp yağı M9 tamponu ile yıkayın.
   3. Nematodları NGM plakalarında, C. aquatica bakteri çimleriyle (NGM plaka hazırlanması: bkz. adım 1.1) geri kazanın; bu da enjeksiyon sonrası nematodların hayatta kalma oranını artırır^. Gece boyunca 25 °C'de kuluçka yapın.
   4. Ertesi gün, enjekte edilen her nematodu (P0) X . griffiniae tohumlu bireysel bir NGM plakasına izole edin. P0 hayvanlarının fenotipleme ve genotipleme için (yumurta bırakarak veya poşetleyerek) F1 yavruları üretmesine izin verin (bkz. adım 4).

4. CRISPR-Cas9 aracılı nakavt etmeleri doğrulamak için tarama

1. unc-22'yi co-CRISPR işaretleyicisi olarak kullanırken seğirme fenotipi için F1'in nikotin bazlı (DIKKAT) ekranı
   1. Enjekte edilen P0 hayvanlardan F1 yapayını %2 nikotin çözeltisi olan bir noktaya aktarın.
   2. Nikotin noktasından tek bir seğiren hayvanı seçin ve hemen hayvanı X . griffiniae tohumlu NGM agar'da geri alın. Her seğiren F1'i tek bir plakaya izole edin ve genotiplendirme için F2 hayvanları üretmesine izin verin (bkz. adım 4.2).
2. Genotipleme
   1. Genotipleme için her F1 seğirme hattından sekiz F2 veya F3 yavru seçin. Bu hayvanlar muhtemelen hem +/mut heterozigot hem de mut/mut homozigot hayvanları içermektedir.
   2. 180 μL solucan lizis tamponu (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8.0, 2.5 mM MgCl₂, %0.45 NP-40, %0.45 Tween 20, %0.01 jelatin) 20 μL Proteinaz K (10 mg/mL) ekleyerek taze DNA ekstraksiyon tamponu hazırlayın.
   3. PCR tüplerindeki DNA ekstraksiyon tamponunun 10 μL'sine nematodlar ekleyin. 65 °C'de 10 dakika kuluçka, ardından genomik DNA çıkarmak için 15 dakika 95 °C'de inkübe yapın.
   4. Nematodları, üreticinin talimatlarına uygun olarak Cas9 hedef bölgesini PCR ile amplifikasyonla genotiple, 4.2.2. adımdan itibaren 1-2 μL lizat kullanılarak genotiplendirir. Büyük silinmeler durumunda, mümkün olursa Cas9 kesim noktaları ile primer bağlanma noktaları arasında geniş bir alan (en az 300 bp) tanımak önemlidir.
      NOT: Agaroz jel elektroforezi, dizilemeden önce başarılı amplifikasyonu doğrulamak için kullanılabilir.
   5. Doğru Sanger dizileme iz analizini sağlamak için PCR ürününü üreticinin talimatlarına uygun şekilde temizleyin.
   6. 4.2.4. adımda üretilen PCR amplikonlarını Sanger dizileme ile dizileyin ve kromatografileri ICE^{programı 29} ile analiz edin.
   7. Eğer mutant alleller 4.2.6. adımda doğrulanırsa, orijinal F1 seğirme plakasına geri dönüp en az sekiz hermafroditi bireysel plakalara izole edin. Her bir nematodun nesil üretmesine izin verin, ardından soyu toplu genotiple homozigotluğu doğrulayın. Homozigot hatlar laboratuvarda 5. adımda belirtildiği gibi tutulabilir.

5. CRISPR hattı bakımı

NOT: Hat bakımının üç ana yöntemi vardır. Bunlar arasında trehaloz-DMSO tabanlı kriyokoruma (adım 5.1), mum solucanlarından in vivo geçiş (adım 5.2) ve NGM plakalarında in vitro mainenance (adım 5.3) yer alır.

1. Vahşi tip ve mutant hatların trehaloz-DMSO kriyo-koruması
   NOT: Trehaloz-DMSO kriyokoruma^{yöntemi 4} kullanılarak, S. hermaphroditum uzun süre -80 °C'de stabil şekilde saklanabilir ve NGM ortamında geri kazanılabilir. Nematodlar 2 mL kriyojenik şişelerde dondurulur. Optimal donma, polistiren köpük kap kullanılarak kademeli soğutma yoluyla sağlanır.
   1. S. hermaphroditum'u NGM üzerinde X. griffiniae tohumlu olarak yetiştirin (bkz. adım 1.1), popülasyonun çoğunluğu J1 veya poşetli hermafroditlere ulaşana kadar.
      NOT: Bu yöntemle iyi donmadıkları için enfektif genç (IJ) evrelerinden kaçının.
   2. Nematod solucanlarını NGM agar plakalarından M9 tamponunda yıkayın ve 5 mL işaretine kadar 15 mL konik tüplerde toplayın. Santrifüjle konsantre edin (1-2:30 dakika için 1372 x g yeterlidir).
   3. Süpernatantı çıkarın ve 5 mL oda sıcaklığında Trehalose-DMSO dondurma tamponunda bir kez örnek olarak 5.1.2'de verilen parametreleri santrifüj ile yıkayın.
   4. Solucanları 5 mL oda sıcaklığında Trehalose-DMSO dondurma tamponunda yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında tüpü yan yatarak 30 dakika kuluçka yapın. Bu, hayatta kalma oranını artırır.
   5. Her tüp için 4 kriyojenik şişeye 1 mL dağıtın.
   6. Şişeleri polistiren köpük kutulara -80 °C dondurucuya yerleştirin.
   7. Bir hafta sonra, şişelerden birini test edin.
   8. Geri kalan şişeleri -80°C soğukta dondurucu kutularına aktarın ve kalıcı olarak saklayın.
   9. S. hermaphroditum testinin donmuş stoklardan geri alınması veya geri alınması
      1. Dondurucudan bir şişe çıkarın ve oda sıcaklığında tamamen çözülmesini izleyin.
      2. Sıvı içeriği taze bir NGM tabağına dök. Donmuş stok genellikle yeterli simbiyotik bakteri içerdiğinden, simbiyotik bir bakteri eklemesinin gerekmediğini unutmayın. Solucanlar dakikalar ile saatler içinde iyileşmeye başlamalı.
      3. Nematod hareketini ve üremesini gözlemleyin. Bir iki gün sonra, birkaç nematodu X. griffiniae tohumlu yeni NGM plakalarına aktarın.
2. Galleria mellonella aracılığıyla in vivo bakım
   NOT: In vivo büyüme için, S. hermaphroditum mutant hatlarını Galleria mellonella (mum kurdu) 5^. instar larvaları aracılığıyla yaygınlaştırın. Bu yöntem özellikle kriyo-rezervasyondan sonra uygulanamayan hatlar için faydalıdır. Entomopatotik nematodun böcekler ve diğer ortamlar aracılığıyla doğal yayılmasına dair ayrıntılı ve benzer bir protokol (McMullen ve ^ark.30) içinde bulunabilir. Kısaca:
   1. Nematodların aç kalıp NGM plakalarında IJ haline gelmesine izin verin.
   2. IJ'leri NGM plakalarından çıkarmak için M9 tamponu kullanın.
   3. IJ'leri Beyaz Tuzağı kullanarak Galleria böceklerini enfekte etmek için transfer edin.
3. NGM plakalarında in vitro bakım için şu adımları izleyin:
   1. Yaklaşık 100 μL taze sıvı kültür içeren tohum NGM plakaları, S. hermaphroditum symbiont, X. griffiniae.
   2. Nematodları tabağa aktarmadan önce bakteri yamasının tamamen kurumasına izin verin.
   3. Plakaları 25 °C'de saklayıp nematodları yaklaşık ayda bir kez taze tohumlanmış tabaklara aktarın.

Sonuçlar

İki CRISPR RNA, daha önce yayımlanmış Pam^{siteleri 14'te} unc-22'nin S. hermaphroditum homologunu hedefleyen iki CRISPR RNA tasarlandı (Pam site numarası - Pam 3 ve Pam 5 ile tanımlandı). Her crRNA, tracrRNA ile kompleksleşerek tek bir rehber RNA (sgRNA) oluşturdu ve Cas9'a dahil edilerek 3.1. adımda tanımlandığı gibi ribonükleoprotein oluşturuldu. Bu protokolde, aynı geni hedefleyecek şekilde iki crRNA tasarlandı; anc...

Tartışma

Alışılmadık genetik model hayvan sistemleri, ökaryot gen fonksiyonlarının, örneğin parazitik bir konak veya organizmanın doğal mikrobiyomunun varlığında doğal olarak ortaya çıkan ekolojik ve fizyolojik bağlamlarda incelemek için değerli fırsatlar sunar. Entomopatogenetik nematodlarda (EPN) genetik manipülasyon bazı RNAi tabanlı yaklaşımlara^{dayanmıştır 13,32}. RNAi bazı türlerde fonksiyonel genetik çalışmaları mümkün kılsa da, dsRNA'nın geçic...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar (80-100 Ağ)	Fisher Scientific	BP26411	Ayrıca LB Pyruvate plakalarında da kullanılır
Agarose	Fisher Scientific	16500500	Genotiplemede de kullanılır
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nukleaz V3	IDT	1081058
Borosilikat iğneler	Dünya Hassas Enstrüman	1B120F-4
Kalsiyum klorür (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901
Kolesterol	VWR	433	5 mg/mL etanol içinde
Comamonas aquatica (DA1877)
Agarose pedi için kapak camı	Beyin araştırma laboratuvarları	#4860-1D	48 x 60 mm no1 kalınlığı
CRISPRScan			https://www.crisprscan.org/
Dimetil Sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301	0.5 M
DNA Temizliği ve Konsantretör-5	Zymo Araştırması	D4014
FemtoJet 4x Grip başlığı setli Mikroenjektör 4 numara 0 iğne tutucu	Eppendorf/Calibre	5253000017
Galleria melonella 5. instar larvaları	GrubCo		https://www.grubco.com/index.cfm
Jel görüntüleme sistemi	Azure400	AZI400-01
Jel yüklemeli boya	Thermo Fisher Scientific	B72
Jelatin (%2)	Sigma Aldrich	G1393
GelRed	Biyotyum	#41003
Genotipleme primerler: DNA oligo, 25 nmol	IDT	Yok
Gibco Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
Gibco Bacto Tripton	Fisher Scientific	DF0123-17-3	Ayrıca Dark LB, LB Pyruvate plakalarında ve nbsp;
Gibco Bacto Maya Ekstraktı	Fisher Scientific	DF0127-17-9	Ayrıca Dark LB, LB Pyruvate plakalarında ve nbsp;
Grip head set 4 numara 1 iğne tutucu	Kalibre	EPE-5196083008	(borosilikat iğne 1B120F-4 ile eşleştirilir)
Halokarbon yağı 700	Sigma Aldrich	H8898
Günlük bakım için sert platin tel solucan kazması	Tritech Araştırması	PT-9901
CRISPR düzenlemelerinin çıkarımı (ICE)	Synthego	Yok	Sanger dizilerini analiz etmek için kullanılan yazılım indelleri tanımlamak için
KCl	Sigma Aldrich	P9541
Lazer iğne çekicisi P-2000	Sutter	P-2000G
Magnezyum klorür (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266
Magnezyum sülfat (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506	M9 tamponu için, NGM'de de kullanılır
Mikroloader ucu 2x96ST	Kalibre	930001007
Zeiss Axio Observer ve Axiovert 200 için Mikromanipülatör Montaj Adaptörü	Tritech Araştırması	NZ-19-2
Mikroskop	Tritech	SMT1
Nikotin	Sigma Aldrich	N3876
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85124
Nukleaz Serbest Dupleks Tamponu	IDT	11-01-03-01
OneTaq MasterMix	NEB	M0486
Pipet depolama kutusu	Sutter Instruments	BX10
Potasyum klorür (KCl)	Sigma Aldrich	793590
Potasyum fosfat, dibazik (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786	NGM için KOH
Potasyum fosfat, monobazik (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655	M9 tamponu için, NGM'de de kullanılır
Proteinaz K	Sigma Aldrich	P6556
Kuvars iğneleri	Sutter Instruments	QF100-70-10
S. hermaphroditium genom	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA'ları	IDT	Yok
Sodyum klorür (NaCl)	VWR	SS0430	Ayrıca M9, Dark LB, LB Pyruvate plakalarında da kullanılır
Sodyum fosfat, dibazik (Na2HPO4.7H20)	Sigma Aldrich	S9390	M9 tamponu için
Sodyum piruvat	Sigma Aldrich	P2256	Ayrıca LB Pyruvate plakalarında ve nbsp'de de kullanılır;
Mikroenjeksiyon için yumuşak platin tel solucan kazması	Surepure Chemetals	6824	Platin 90%, İridyum %10 Alaşım Tel, 0.002 inç çapında x 5 ft uzunluğunda
Standart İğne Tutucu	Tritech Araştırması	HI-7
Steinernema hermaphroditum
Stereo mikroskop	Leica	Inveta 3
Trehalose	Cole-Parmer	EW-88195-99	0.08 M
Tris	Fisher Scientific	AM9855G	pH 8.0
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
Dikey Mikromanipülatör Montaj Adaptörü	Tritech Araştırması	NR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)