Geniş Ligand Kütüphanelerine Sahip Hedefler için Farmakofor Modellemesi: SARS-CoV-2 Mpro Üzerine Bir Vaka Çalışması

Özet

Bu makale, çoklu ligandlardan moleküler özellikleri entegre ederek bir konsensüs farmakofor modeli oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, bilinen liganda bağlı konformasyonlara sahip herhangi bir biyolojik hedefi hedef alan ilaç keşif çabalarına uygulanabilir ve sanal tarama ve rasyonel ilaç tasarımı için temel etkileşim özelliklerinin tanımlanmasını sağlar.

Özet

Bir farmakofor, bir bileşik ile biyolojik hedefi arasındaki optimal etkileşimler için gerekli olan moleküler özelliklerin uzamsal düzenlemesini tanımlar. Bu modeller, bir hedef ile bağlanma konformasyonlarında bilinen bir dizi ligand arasındaki moleküller arası etkileşimlerin analiz edilmesiyle türetilebilir. Bir konsensüs farmakoforu, birden fazla ligandın ortak özelliklerini entegre ederek model yanlılığını azaltır ve tahmin gücünü artırır. Bununla birlikte, geniş ve kimyasal olarak çeşitli bir ligand setinden sağlam bir konsensüs farmakoforu oluşturmak, teknik zorluklar ortaya çıkarmaktadır.

Burada, birden fazla liganda bağlı kompleksler arasında farmakoforik özellikleri tanımlamak ve kümelemek için tasarlanmış açık kaynaklı bir bilişim aracı olan ConPhar'ı kullanarak konsensüs farmakoforlarının oluşturulması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, model oluşturmayı, iyileştirmeyi ve ultra büyük moleküler kitaplıkların sanal taramasına uygulamayı içerir. Bir vaka çalışması olarak, hedefle birlikte kristalize edilmiş yüz kovalent olmayan inhibitör kullanarak yöntemi SARS-CoV-2 ana proteazına (Mpro) uyguladık. Ortaya çıkan farmakofor modeli, Mpro'nun katalitik bölgesindeki temel etkileşim özelliklerini yakaladı ve yeni potansiyel ligandların tanımlanmasını sağladı.

Bu strateji, liganda bağlı konformasyonların mevcut olduğu herhangi bir biyolojik hedefe geniş ölçüde uygulanabilir. Kapsamlı ligand veri kümelerine sahip hedefler için özellikle değerlidir ve istenen etkileşim profillerine sahip yeni adayların tanımlanmasını kolaylaştırarak rasyonel ilaç keşfini destekler.

Giriş

Farmakofor modelleme, bilgisayar destekli ilaç tasarımında temel bir tekniktir ve biyolojik aktivite^1,2'den sorumlu temel moleküler özelliklerin tanımlanmasını sağlar. Bir farmakofor, bir ligand ile biyolojik bir hedef³ arasındaki moleküler etkileşim için gerekli olan hidrojen bağı donörleri, alıcılar, aromatik halkalar ve hidrofobik bölgeler gibi özelliklerin uzamsal düzenlemesini tanımlar. Deneysel kristalografi veya moleküler modellemeden birden fazla ligand-hedef kompleksi mevcut olduğunda, paylaşılan etkileşim modelleri konsensüs farmakofor modellerine entegre edilebilir, model sağlamlığı arttırılabilir ve sanal tarama doğruluğu ^4,5 arttırılabilir.

Konsensüs farmakoforlarının faydasına rağmen, özellikle ligandlar yapısal olarak çeşitli olduğunda, bunların üretimi teknik olarak zorlu olmaya devam etmektedir. Tek tek ligandlardan farmakoforlar üretmek için çeşitli yazılım araçları mevcuttur, ancak birden fazla özellik setini tutarlı bir modele entegre etmek için standartlaştırılmış prosedürler eksikliği vardır ^6,7. Ayrıca, çok az platform, tarama ve görselleştirme araçlarıyla uyumlu formatlarda özellik kümeleme, filtreleme ve dışa aktarmayı destekleyen uçtan uca iş akışları sunar⁸. Bu sınırlamalar, büyük ölçekli ilaç keşif çabalarında konsensüs farmakoforlarının geniş çapta benimsenmesini kısıtlamıştır.

Bu boşluğu gidermek için ConPhar, önceden hizalanmış ligand-hedef komplekslerinin kapsamlı setlerinden farmakoforik özelliklerin sistematik olarak çıkarılması, kümelenmesi ve konsensüs modellemesi için özel olarak tasarlanmış yeni bir açık kaynaklı araç olarak geliştirildi. Mevcut yazılımdan farklı olarak ConPhar, esnek parametre ayarı, otomatik özellik entegrasyonu ve birden fazla çıktı formatıyla uyumluluk sunarak sanal tarama boru hatlarına uygun sağlam fikir birliği modellerinin oluşturulmasını kolaylaştırır. Böylece bu araç, büyük ve kimyasal açıdan çeşitli ligand kütüphanelerinin işlenmesinde önceki darboğazların üstesinden gelerek farmakofor modelleme iş akışlarında tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği artırır.

Bu yaklaşımı göstermek için, ligand-hedef komplekslerinin koleksiyonlarından konsensüs farmakofor modelleri oluşturmak için tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. İş akışı, farmakofor özellik çıkarımı, kümeleme, görselleştirme ve aşağı akış uygulamaları için açık kaynaklı araçları entegre eder. Bir vaka çalışması olarak, protokolü kapsamlı yapısal verilere sahip kritik bir terapötik hedef olan SARS-CoV-2 ana proteaza (Mpro) uyguladık⁹. Apo formları ve gereksiz kompleksler hariç, Mpro ile birlikte kristalize edilmiş 100 kovalent olmayan liganddan oluşan bir veri kümesi (27 Mayıs 2025 itibarıyla PDB girişleri) derledik. Bireysel farmakoforik özellikler ekstrakte edildi ve özellik kümelemesi¹⁰ için özel olarak tasarlanmış bir araç olan ConPhar kullanılarak bir konsensüs modelinde birleştirildi. Bu vaka, protokolün korunmuş etkileşim modellerini ortaya çıkarma ve ultra büyük kitaplıkların rasyonel taramasını destekleme kapasitesini göstermektedir.

Protokol

1. Yöntem 1

1. Konsensüs farmakofor üretimi için ligandları hazırlayın
   1. PyMOL yazılımını kullanarak tüm protein-ligand komplekslerini hizalayın¹¹.
   2. Hizalanmış her ligand konformerini çıkarın ve SDF formatında ayrı bir dosya olarak kaydedin.
      NOT: Burada açıklanan protokol için MOL, MOL2 ve PDB gibi diğer formatlar da kullanılabilir.
2. Pharmit¹² kullanarak farmakofor JSON dosyaları oluşturun
   1. Özellikleri Yükle seçeneğini kullanarak her ligand dosyasını ayrı ayrı Pharmit'e yükleyin (Pharmit'e bağlantı için Malzeme Tablosuna bakın).
   2. İlgili farmakofor JSON dosyasını indirmek için Oturumu Kaydet seçeneğini kullanın.
3. JSON dosyalarını ConPhar'da kullanmak üzere düzenleyin
   1. İndirilen tüm JSON dosyalarını tek bir klasörde depolayın. Bu dosyalar bir sonraki yöntemde Google Colab ortamına yüklenecektir.

2. Yöntem 2

1. Google Colab ortamını kurma
   1. Yeni bir Google Colab not defteri başlatın: Web tarayıcısında Google Colab'i açın ve yeni bir not defteri oluşturun ve Çalışma Zamanı → 2025.07 çalışma zamanı sürümünü değiştir → Çalışma Zamanı'nı seçerek ayarları daha önceki bir sürümü kullanacak şekilde ayarlayın.
   2. Conda ve PyMOL'u yükleyin. Conda ve PyMOL'u Google Colab'a yüklemek için gereken kod, referans olması açısından burada italik olarak verilmiştir ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      # CondaColab'ı yükleyin: Google Colab'de Conda ortam desteğini etkinleştirir
      IPython.utils'den io içe aktar
      tqdm.notebook'u içe aktar
      İşletim sistemini içe aktar
      toplam = 100
      pbar olarak tqdm.notebook.tqdm(total=total) ile:
      yakalandığı şekliyle io.capture_output() ile:
      # CondaColab'ı yükleyin
      !pip yükleme -q condacolab
      Condacolab'ı içe aktar
      condacolab.install()
      pbar.güncelleme(10)
      # Yüklü paketleri bulmak için Python yolunu güncelleyin
      İçe Aktarma Sistemi
      sys.path.append('/usr/local/lib/python3.7/site-packages/')
      pbar.güncelleme(20)
      # Schrödinger kanalından mamba kullanarak PyMOL paketini kurun
      %shell mamba install -c schrödinger pymol paketi --evet
      pbar.güncelleme(90)
   3. Başarılı yürütmeyi doğrulayın: Oynat simgesine tıklayarak veya Shift + Enter tuşlarına basarak hücreyi çalıştırın. Başarılı bir yürütme sonrasında hücrenin üzerinde yatay bir yeşil çubuk görünecektir (bkz. Şekil 1).
2. ConPhar Python paketini kurun ve gerekli modülleri içe aktarın
   1. ConPhar'ı yükleyin ve içeri aktarın. ConPhar paketini yüklemek ve gerekli modülleri Google Colab'e aktarmak için gereken kod, referans olması açısından burada italik olarak verilmiştir ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      # ConPhar farmakofor analiz paketini kurun
      Pymol'ü içe aktar
      !pip install conphar
      Conphar'dan. Farmakoforlar parse_json_pharmacophore, show_pharmacophoric_descriptors, save_pharmacophore_to_pymol, save_pharmacophore_to_json compute_concensus_pharmacophore
      İşletim sistemini içe aktar
      pandaları pd olarak içe aktar
      NOT: Conphar'dan içe aktarma bildirimi. Farmakoforlar netlik sağlamak için birden fazla satıra bölünmüştür, ancak tek bir sürekli satır olarak girilmelidir. ConPhar aracı (https://github.com/AngelRuizMoreno/ConcensusPharmacophore) aktif olarak geliştirilme aşamasındadır. Mevcut protokol, açıklanan prosedür için doğrulanmış kararlı bir sürüm (0.1.2) kullanır. Tekrarlanabilirliği sağlamak için kullanıcıların bu sürümü kullanmaları önerilir.
   2. Başarılı yüklemeyi onaylayın: Oynat simgesine tıklayarak veya Shift + Enter tuşlarına basarak hücreyi çalıştırın. ConPhar araçlarının başarılı bir şekilde yüklenmesi ve içe aktarılması üzerine bir onay mesajı görünecektir (bkz. Şekil 2).
3. JSON dosyalarından Bireysel Farmakofor modellerini yükleyin
   1. Farmakofor JSON dosyaları için bir klasör oluşturun. Farmakofor giriş dosyalarını Google Colab'de depolamak üzere bir klasör oluşturmak için gereken kod, burada referans olması amacıyla italik olarak verilmiştir ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      # Giriş JSON dosyalarını depolamak için bir klasör oluşturun
      os.makedirs("JSON_FOLDER", exist_ok=Doğru)
      NOT: Bu komut, zaten mevcut değilse klasörü otomatik olarak oluşturur.
   2. JSON dosyalarını klasöre yükleyin: Colab'ın sol panelindeki klasör simgesine tıklayın, yeni oluşturulan klasörü açın ve Yükle'yi seçmek için sağ tıklayın. Gerekli JSON dosyalarını ekleyin (bkz. Şekil 3).
      NOT: Dosyaların Pharmit tarafından oluşturulan beklenen formata uygun olduğundan emin olun.
4. Farmakoforik özellikleri ayrıştırın ve birleştirin
   1. Yüklenen dosyalardan farmakoforik özellikleri çıkarın. Yüklenen JSON dosyalarını ayrıştırmak, farmakoforik özellikleri ayıklamak ve bunları Google Colab'de tek bir DataFrame'de depolamak için gereken kod, burada referans olması için italik biçimde sağlanmıştır ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      p4_table=pd. Veri Çerçevesi()
      os.listdir('/content/JSON_FOLDER' dosyasındaki dosya için:
      dosyada '.json' ise:
      denemek:
      p4,lig,rec=parse_json_pharmacophore(f"/content/JSON_FOLDER/{file}")
      p4['ligand']=dosya.değiştir('.json','')
      p4_table=pd.concat([p4_table,p4],ignore_index=Doğru)
      İstisna hariç:
      geçmek
      p4_table
   2. Birleştirilmiş DataFrame'i oluşturmak için oynat simgesine tıklayarak veya Shift + Enter tuşlarına basarak hücreyi çalıştırın (bkz. Şekil 4). Ortaya çıkan konsolide DataFrame, bireysel ligandlardan ekstrakte edilen tüm farmakoforik özellikleri birleşik bir tabloda derleyerek aşağı yöndeki kümelemeyi ve istatistiksel analizi kolaylaştırır.
      NOT: Komut dosyası, iş akışının kesintiye uğramasını önlemek amacıyla işleme sırasında hatalı biçimlendirilmiş JSON dosyalarını atlamak için temel istisna işlemeyi içerir. Çok sayıda dosya göz önüne alındığında, her birini önceden kontrol etmek pratik değildir; Bunun yerine, komut dosyası, yüklenemeyen herhangi bir dosyanın adını yazdırmak için değiştirilebilir, böylece kullanıcı dosyayı tek tek inceleyebilir ve düzeltebilir.
5. Konsensüs Farmakoforunu oluşturun ve kaydedin
   1. Tüm farmakoforik tanımlayıcıları görüntüleyin. Google Colab'deki giriş dosyalarından çıkarılan farmakoforik tanımlayıcıları görselleştirmek için gereken kod, burada referans olması için italik biçimde sağlanmıştır ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      show_pharmacophoric_descriptors(p4_table)
   2. Farmakoforik özelliklerin kümelenmesini görselleştirmek için oynat simgesine tıklayarak veya Shift + Enter tuşlarına basarak hücreyi çalıştırın (bkz. Şekil 5). Özellik kümelenmiş çıktılar, birden fazla liganddaki benzer farmakoforik özellikleri, uzamsal konumlarına göre gruplandırarak, korunmuş etkileşim modellerinin tanımlanmasına olanak tanır.
   3. Farmakofor modelini PyMOL formatında kaydedin. Konsensüs farmakofor modelini Google Colab'da PyMOL uyumlu biçimde oluşturmak ve kaydetmek için gereken kod, burada referans olması için italik biçimde sağlanmıştır ve tam yürütülebilir komut dosyası da Destekleyici Dosya 1'de mevcuttur.
      save_pharmacophore_to_pymol(p4_table, out_file='ConPhar_pymol.pse')
   4. İlgili .pse dosyasını oluşturmak için hücreyi çalıştırın (bkz. Şekil 6).
   5. Farmakofor modelini JSON formatında kaydedin. Google Colab'de Pharmit uyumlu biçimde konsensüs farmakofor modelini oluşturmak ve kaydetmek için gereken kod, burada referans olması için italik biçimde sağlanmıştır ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      ​save_pharmacophore_to_json(p4_table,out_file=
      'ConPhar_pharmit.json')
   6. Karşılık gelen .json dosyasını oluşturmak için hücreyi çalıştırın (bkz. Şekil 6).
   7. Özellik kümelenmiş çıktılar ve dendrogramlar oluşturun. PyMOL ve Pharmit uyumlu formatlar ve Google Colab'deki dendrogram görselleştirmeleri dahil olmak üzere özellik türüne göre gruplandırılmış konsensüs farmakofor dosyaları oluşturmak için gereken kod, burada referans olması için italik biçimde sağlanmıştır ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      konsensüs,bağlantılar=compute_concensus_pharmacophore
      (p4_table,save_data_per_descriptor=Doğru,out_folder='/içerik')
   8. Oynat simgesini tıklatarak veya Shift + Enter tuşlarına basarak hücreyi çalıştırın (bkz. Şekil 7). Sonuçlar, kümelenmiş farmakoforik özellikler arasındaki hiyerarşik ilişkileri bir ağaç biçiminde temsil eden ve kullanıcıların kümeler arasındaki benzerlik derecesini ve mekansal yakınlığı yorumlamasına yardımcı olan dendrogram görselleştirmelerini görüntüler.
      NOT: Bu adım, birden fazla çıktı kaydeder files ve şekiller belirtilen klasöre.
   9. Konsensüs farmakofor sonuçlarını bir CSV dosyasına aktarın. Nihai konsensüs farmakofor tablosunu Google Colab'da CSV formatında kaydetmek için gereken kod, burada referans olması için italik biçimde sağlanmıştır ve yürütülebilir komut dosyasının tamamı Destekleyici Dosya 1'de de mevcuttur.
      concensus.to_csv('consensus_result.csv', dizin=Yanlış)
   10. Konsensüs farmakofor verilerini daha fazla analiz için consensus_result.csv adlı bir CSV dosyasına aktarmak için oynat simgesine tıklayarak veya Shift + Enter tuşlarına basarak hücreyi çalıştırın (bkz. Şekil 8).
       NOT: CSV dosyası, elektronik tablo yazılımında istatistiksel analiz veya görselleştirme gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırır.
6. Sanal tarama için konsensüs Farmakoforunu kullanın
   1. Konsensüs farmakoforunu JSON formatında dışa aktarın. Dosyanın tüm özellikler için uzamsal koordinatlar içerdiğinden emin olun. Bu format, Pharmit¹² gibi web tabanlı tarama araçlarıyla doğrudan uyumludur. Sanal bir tarama gerçekleştirmek için farmakoforun JSON dosyasını Özellikleri Yükle seçeneği aracılığıyla Pharmit sunucusuna yükleyin. Sunucu, özellikleri değiştirerek, ekleyerek veya kaldırarak ve ayrıca PubChem¹³veya ZINC¹⁴ gibi büyük bileşik kitaplıklara karşı tarama yaparak modelin iyileştirilmesine izin verir.
      NOT: Bu çalışmada açıklanan analizleri çoğaltmak için gereken tüm komut dosyaları Destekleyici Dosya 1'de verilmiştir ve ayrıca https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing aracılığıyla etkileşimli olarak erişilebilir. Okuyucuların, orijinal komut dosyasını değiştirmeden analizleri çalıştırmak ve değiştirmek için Colab not defterinin kişisel bir kopyasını oluşturmaları önerilir.

Şekil 1: CondaColab'ı yükleyerek Google Colab ortamını kurmak için kullanılan ilk kod bloğunun ekran görüntüsü. Yürütme sırasında hücrenin üzerinde yatay mavi bir ilerleme çubuğu belirir ve başarılı bir şekilde tamamlandığında yeşile döner. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ConPhar paketini Google Colab'a yüklemek için kullanılan ikinci kod bloğunun ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farmakofor JSON dosyalarının Google Colab'da belirlenen klasöre başarıyla yüklendiğini gösteren ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: JSON dosyalarından farmakoforik özellikleri çıkarmak ve bunları tek bir DataFrame'de birleştirmek için kullanılan kodu gösteren ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Konsensüs farmakofor modelinin oluşturulması sırasında üretilen farmakoforik özelliklerin kümelenmesinin görselleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Konsensüs farmakofor dosyalarının PyMOL ve Pharmit uyumlu formatlarda başarılı bir şekilde oluşturulmasını gösteren ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: PyMOL, Pharmit ve dendrogram görselleştirmeleri için çıktılar da dahil olmak üzere özellik türüne göre kümelenmiş konsensüs farmakofor dosyalarının oluşturulmasını gösteren ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Konsensüs farmakofor verilerinin consensus_result.csv dosyasına başarılı bir şekilde aktarılmasını gösteren ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Şekil 9A'da örneklendiği gibi, farklı kovalent olmayan inhibitörlerle birlikte kristalize edilmiş yüz Mpro kompleksi hizalandı. Her ligand daha sonra ayrı bir dosya olarak çıkarıldı (Şekil 9B) ve ardından Pharmit sunucusuna yüklendi. Oturum, karşılık gelen bir JSON dosyası oluşturmak için kaydedildi (bkz. Şekil 9C).

Şekil 9: Konsensüs farmakofor modellemesi için ligand hazırlığı. (A) Kovalent olmayan inhibitörlerle birlikte kristalize edilmiş üç temsili Mpro kompleksinin yapısal hizalanması. (B) Bu çalışmaya dahil edilen 100 ligandın süperpozisyonu. (C) "Özellikleri Yükle" seçeneğini kullanarak her ligandın Pharmit sunucusuna yüklenmesi ve ardından "Oturumu Kaydet" seçeneği aracılığıyla JSON dosyasının oluşturulması. Her iki seçenek de kırmızı oklarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

JSON dosyalarının tamamı, 110 küme halinde gruplandırılmış 1450 farmakoforik özellikten oluşan konsensüs farmakofor modelini oluşturmak için kullanıldı: 23 aromatik (Aro), 30 hidrojen bağı alıcısı (HBA), 16 hidrojen bağı donörü (HBD), 36 hidrofobik (Hyd) ve 5 negatif yüklü (Anyon) küme (Şekil 10A, Ek Tablo 1). Konsensüs modeline dahil edilmeleri için her özellik için daha büyük kümeler belirledik. Aro kümeleri arasından 20'den fazla elemente sahip olanları seçtik. HBA, HBD ve Hyd gruplarından en az 50 element içeren kümeleri koruduk. Anyon kümelerinin hiçbirinin 4'ten fazla üyesi yoktu, bu nedenle konsensüs modelinden çıkarıldılar (Şekil 10B). Bu sayısal eşikler (Aro için >20 üye; HBA, HBD ve Hyd için ≥50), en çok korunan ve yoğun nüfuslu etkileşim modellerine öncelik vermek için küme boyutlarının dağılımına dayalı olarak ampirik olarak tanımlanmıştır.

Şekil 10: 100 Mpro-ligand kompleksinden farmakoforik özelliklerin kümelenmesi. (A) 1450 farmakoforik özelliğin dağılımı: mor renkte aromatik (Aro), turuncuda hidrojen bağı alıcısı (HBA), beyazda hidrojen bağı donörü (HBD), yeşilde hidrofobik (Hyd) ve kırmızıda negatif yüklü (Anyon). (B) ≥10 üye içeren kümeler Aro, HBA, HBD ve Hyd için gösterilir; tüm Anyon kümeleri görüntülenir. Aro için ≥20 üye, HBA, HBD ve Hyd için ≥50 üye ve Anion için ≥4 üye olanlar olarak tanımlanan en büyük kümeler noktalı kürelerle vurgulanır. En büyük kümelerin her birindeki üye sayısı açıkça belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu nedenle, konsensüs farmakofor modelimiz 11 özellik içeriyordu: sırasıyla 20, 24 ve 45 üyeli kümelerden türetilen 3 aromatik (Aro) özellik, Aro 1, 2 ve 3; Sırasıyla 51, 55, 77 ve 81 üyeli kümelerden 4 hidrojen bağı alıcısı (HBA), HBA 1, 2, 3 ve 4; Sırasıyla 51 ve 71 üyeli kümelerden 2 hidrojen bağı donörü (HBD); ve sırasıyla 50 ve 52 üyeli kümelerden 2 hidrofobik (Hyd) özellik (bkz. Şekil 11A).

Farmakofor modeli, daha önce^{bildirilen 10} stratejiyi kullanarak PubChem veri tabanında arama yapmak için kullanıldı, ancak hiçbir eşleşme bulunamadı. Arama esnekliğini artırmak için, en küçük ve en az temsili kümeden türetilen aromatik özellik Aro 1 kaldırıldı. Bu ayarlama, bileşiğin PubChem CID'leri 101267741 ve 10285538 ile bir konformeri dahil olmak üzere iki isabetin tanımlanmasına yol açtı (bkz. Şekil 11B). Bileşik 101267741'in 2 boyutlu kimyasal yapısı Şekil 11C'de gösterilmektedir. İlginç bir şekilde, tanımlanan bu bileşik, Mpro bağlama cebine iyi uyum sağlar. Birlikte kristalize ligand 38a¹⁵ (PDB ID: 9HAJ) ile karşılaştırmalı bir analiz, 101267741'nin farmakofor eşleştirme konformerinin, Mpro'nun S1 ve S2 alt cepleri içinde 38a'dan bile daha derine gömüldüğünü göstermektedir. Bununla birlikte, 38a, esas olarak S1' cebine doğru uzanan etil karboksamid yan zinciri nedeniyle cebin daha geniş bir bölgesini kaplar. Bununla birlikte, 38a'nın temel moleküller arası etkileşimleri, bu yan zincirden ziyade diğer kısımları içerir. Buna karşılık, bileşik 101267741, yedi hidrojen bağı ve dört hidrofobik temas dahil olmak üzere 11 moleküller arası etkileşim oluşturur. 38a tarafından oluşturulan üç hidrojen bağı ve iki hidrofobik etkileşimle karşılaştırıldığında, bileşik 101'in bağlanma modu daha güçlü görünmektedir (Şekil 11D).

Şekil 11: PubChem veritabanında farmakofor araması. (A) Tam konsensüs farmakofor modeli 11 özellik içerir: 3 aromatik (mor), 4 hidrojen bağı alıcısı (turuncu), 2 hidrojen bağı donörü (beyaz) ve 2 hidrofobik (yeşil). (B) PubChem bileşiğinin konformeri 101267741 Aro 1 özelliğinin çıkarılmasından sonra indirgenmiş farmakofor modeliyle hizalanır ve (C) Tanımlanan bileşiğin iki boyutlu kimyasal yapısı. (D) Bileşik 38a (macenta; PDB ID: 9HAJ'dan) ve bileşik PubChem CID 101267741'nin (yeşil) SARS-CoV-2 Mpro katalitik cebine bağlanma modlarının karşılaştırmalı analizi. Her bileşik için karşılık gelen moleküller arası etkileşimler sağda gösterilmiştir. Hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimler sırasıyla mavi ve gri renkte kesikli çizgiler olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Destekleyici Dosya 1: Farmakofor iş akışı komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Destekleyici Tablo 1: Farmakoforik Özelliklerin Kümeleme Özeti. Küme Sayısı, Küme Başına Üye, Centroid Koordinatları ve Küme Yarıçapları Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Farmakofor modelleme, rasyonel ilaç keşfine yardımcı olur¹⁶. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, düzinelerce kovalent olmayan inhibitörden başlayarak SARS-CoV-2 ana proteaz (Mpro) için bir konsensüs farmakoforunun oluşturulması için kullanıldı, ancak bilinen liganda bağlı konformasyonlara sahip herhangi bir biyolojik hedefe, özellikle kapsamlı ligand veri setlerine sahip olanlara uygulanabilir. Bireysel farmakofor veya tamamen ligand bazlı modellerle karşılaştırıldığında, bu fikir birliği yaklaşımı, birden fazla ligand konformasyonunu entegre ederek sağlamlığı artırır ve yanlılığı azaltır. Bu protokol tarafından oluşturulan konsensüs farmakofor modeli, ChEMBL¹⁷ve ZINC¹⁴ gibi halka açık veri tabanları, ticari koleksiyonlar ve tescilli şirket içi bileşik kütüphaneleri dahil olmak üzere çeşitli moleküler kütüphanelere uygulanabilir. Bu çok yönlülük, sanal tarama kampanyalarında geniş ve çeşitli kimyasal alanların araştırılmasına olanak tanır ve böylece yeni biyoaktif bileşiklerin tanımlanma olasılığını artırır. Böylece bu iş akışı, istenen etkileşim profillerine sahip yeni biyoaktif bileşiklerin tanımlanmasını destekler.

Bu protokoldeki kritik bir adım, ligand-hedef komplekslerinin doğru bir şekilde hazırlanmasını ve hizalanmasını içerir. Yanlış hizalama, model tahmin gücünü zayıflatabileceğinden, özelliklerin anlamlı ve güvenilir entegrasyonunu sağlamak için ligandların biyoaktif konformasyonlarında hassas bir şekilde önceden hizalanması esastır¹⁰. Optimum hizalamayı elde etmek için, korunmuş protein bağlanma bölgesi kalıntıları veya omurga atomları kullanarak yapısal süperpozisyon gerçekleştirmenizi öneririz. Farklı ligandlara sahip veri kümeleri için, temel etkileşim noktalarının veya farmakoforik özelliklerin hizalanması, küme genelinde tutarlılığı artırır. Ek olarak, model doğruluğunu azaltabilecek artefaktları önlemek için aykırı ligand konformasyonlarının dikkatli bir şekilde manuel olarak incelenmesi ve düzeltilmesi tavsiye edilir. Ayrıca ConPhar'ın açık kaynak yapısı, diğer hesaplamalı iş akışlarına entegrasyonun yanı sıra kümeleme parametrelerinde gelişmiş ayarlamaları da kolaylaştırır. Deneyimli kullanıcılar, model genelliği ve özgüllüğü arasında bir denge sağlamak için farmakoforik özelliklerin kümeleme parametrelerini değiştirebilir. Bu modifikasyonlar, ligand veri kümesi boyutu, kimyasal çeşitlilik veya hedef karmaşıklığı tarafından yönlendirilebilir. Örneğin, çok çeşitli ligandlarla uğraşırken, kademeli kümeleme veya alt grup analizi, ilgili özellikleri daha iyi yakalayabilir¹⁸.

ConPhar aracı şu anda aktif olarak geliştirilme aşamasındadır. Bu, aracı tamamlayıcı yazılım hatlarıyla entegrasyon da dahil olmak üzere belirli araştırma ihtiyaçlarına göre uyarlamak isteyen kullanıcılara önemli bir esneklik sunar. Ancak yazılımda hâlâ değişiklik yapılabileceğinden kullanıcıların resmi güncellemeleri izlemeleri ve sürüme özel belgelere başvurmaları önerilir. Karşılaşılan sorunların bildirilmesi, sürekli iyileştirilmesine ve daha geniş topluluk onayına katkıda bulunacaktır. Protokolümüz, kapsamlı etkileşim modellerine sahip modeller oluşturacak ve böylece büyük kütüphanelerin sanal taramasında kullanılabilecekler. Temsili sonuçlarımızda, elde edilen farmakoforu Mpro'nun katalitik bölgesi için iki yeni potansiyel ligandın tanımlanmasında kullandık. Sonuç olarak, bu konsensüs farmakofor yöntemi, isabet tanımlamayı kolaylaştırır ve potansiyel müşteri optimizasyonunu hızlandırır.

Bununla birlikte, protokolün aşağıdaki sınırlamalarını belirliyoruz: i) düşük çözünürlüklü veriler model doğruluğunu azaltabileceğinden, yüksek kaliteli liganda bağlı yapılara bağımlılık; ii) konsensüs farmakoforu ortak özellikleri vurguladığından, belirli ligandlar için çok önemli olan benzersiz ve önemli etkileşimleri gözden kaçırma riski; ve iii) tekrarlanabilirlik, farklı yazılım araçlarındaki farklı özellik tanımlarından etkilenebilir¹⁹. Bununla birlikte, bu sınırlamalar, moleküler dinamik simülasyonları²⁰ ile bir protein-ligand sisteminin yapısını iyileştirerek, kullanıcı bilgisine dayalı küme tutma ve farmakoforik özelliklerin tanımlanması için yazılımın tutarlı kullanımı ile aşılabilir.

Bu protokoldeki konsensüs farmakofor modeli klasik ikili metrikler kullanılarak doğrulanmamış olsa da, tahmin kapasitesi önceki bir çalışmada^{gösterilmiştir 10}. Bu çalışmada, aynı metodoloji ile oluşturulan bir konsensüs farmakoforunu doğrulamak için kimyasal olarak çeşitli 78 liganddan oluşan bağımsız bir test seti kullanıldı. Doğrulama seti, ≤0.5 Tanimoto benzerliğine, 200 ila 700 g/mol arasında moleküler kütlelere, ≤17 dönebilen bağlara ve en az üç farmakoforik özelliğe sahip ligandları içeriyordu. Model, bilinen aktifleri başarıyla tanımlayarak sanal tarama iş akışlarında uygulanabilirliğini ve kimyasal olarak çeşitli adaylar arasındaki sağlamlığını destekledi.

Burada bildirilen protokol, hedefin karakteristik özelliği olan kapsamlı etkileşim modellerini yakalayan farmakofor modellerinin oluşturulmasını sağlar. Bu, viral proteazlar, kinazlar ve nükleer reseptörler²¹ gibi kapsamlı ligand verilerine sahip hedefler için özellikle değerlidir. Oluşturulan modeller, büyük bileşik kütüphanelerinin sanal olarak taranması için uygundur ve yeni biyoaktif adayların tanımlanmasını kolaylaştırır. Konsensüs farmakofor yaklaşımı, korunmuş ve işlevsel olarak ilgili özellikleri vurgulayarak hem erken aşamadaki isabet keşfini hem de müteakip potansiyel müşteri optimizasyonunu destekler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Google Ortak Çalışması	Google LLC	https://colab.google	Python not defterlerini çalıştırmak için web tabanlı platform; burada konsensüs farmakofor modellemesi için ConPhar ve PyMOL komut dosyalarını yürütmek için kullanılır.
İlaç	Pittsburgh Üniversitesi'ndeki Koes Laboratuvarı	https://pharmit.csb.pitt.edu/search.html	Ligand dosyalarının yüklenmesine ve farmakofor özelliklerinin oluşturulmasına olanak tanıyan, etkileşimli farmakofor sanal taraması ve kimyasal alan keşfi için web platformu
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://www.pymol.org	Protein için kullanılan moleküler görselleştirme ve yapısal hizalama yazılımı– Ligand Kompleksi Süperpozisyonu ve Analizi
Destekleyici Dosya 1 Farmakofor İş Akışı Komut Dosyası	Google LLC	https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing	Conda, PyMOL'u yüklemek ve Google Colab'da farmakofor iş akışını çalıştırmak için tam yürütülebilir komut dosyası. Ayrıca Destekleyici Dosya 1 olarak da sağlanır.