Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Klotho'nun NF-κb sinyal kaskadının düzenlenmesiyle hipoksi-reoksijenasyon nedeniyle oluşan kardiyomiyosit hasarında koruyucu rolü

304 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68946

⸱

5 Aralık 2025

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

Bu makalede

Özet

Bu protokol, moleküler ve fonksiyonel testler kullanılarak hipoksiye-reoksijenlenme altında H9C2 kardiyomiyositlerinde klotho aşırı ekspresyonunun koruyucu rolünü değerlendirir.

Özet

Bu çalışma, hipoksi/reoksijenasyon (H/R) hasarına maruz kalan kardiyomiyositlerde klotho'nun koruyucu rolünü araştırmayı amaçladı. In vitro H/R modeli, klotho-aşırı eksprese lentiviral vektörlerle transfekte edilen H9C2 sıçan kardiomiyoblastları kullanılarak oluşturuldu. Hücreler altı deneysel gruba ayrıldı: kontrol, H/R, negatif kontrol (NC), klotho aşırı ekspresyon, PDTC (bir NF-κB inhibitörü) ve klotho ile lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edilen bir kombinasyon grubu. Klotho ifade seviyeleri, nicel gerçek zamanlı PCR ve western blotting ile belirlendi. Hücre canlılığı MTT testi ile ölçüldü, apoptoz ise akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. NF-κB sinyal yolunda yer alan proteinlerin ekspresyonu western blotting ile analiz edildi ve pro-inflamatuar sitokinlerin hücresel ekspresyonu, immünfloresan boyama ile değerlendirildi. Klotho aşırı ekspresyonu, H9C2 hücrelerinde klotho seviyelerini anlamlı şekilde yükseltmiş ve hücre canlılığının iyileşmesine, apoptozun azalmasına ve pro-inflamatuar sitokinlerin hücresel ekspresyonunun H/R grubuna kıyasla azalmasına yol açmıştır. Western blot analizi, klotho aşırı ekspresyonunun ve PDTC tedavisinin, azalmış p-P65/P65 oranı ve artan p-IκBα/IκBα seviyeleriyle gösterildiği NF-κB yol aktivasyonunu bastırdığını ortaya koydu. Bu etkiler, LPS ile birlikte tedavi edildiğinde kısmen tersine döndü. Bu sonuçlar, klotho'nun NF-κB sinyalini modüle ederek H/R kaynaklı hasara karşı kardiyokoruma sağladığını, iltihabı azalttığını ve hücre hayatta kalmasını teşvik ettiğini göstermektedir. Bu protokol, miyokard iskemi-reperfüzyon hasarının altında yatan moleküler mekanizmaları ve klotho'nun kalp iltihabında terapötik potansiyelini incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sunar.

Giriş

Akut miyokard enfarktüsü () öncelikle iskemi ve ardından reperfüzyon tarafından oluşur; bu da miyokard hipoksisi/reoksijenasyon (H/R) yaralanmasınınmekanizmaları üzerine kapsamlı araştırmalara yol açmıştır 1,2,3. Miyokardiyal H/R hasarının önemli bir yönü hücre apoptozudur ve bu da 4,5'in patolojik ilerlemesine önemli katkı sağlar.

Son çalışmalar, nükleer faktör kappa B (NF-κB) sinyal yolunun miyokard H/R hasarında, lipopolisakkarit (LPS) gibi uyarılara inflamatuar yanıtların modülasyonu yoluyla ilişkilendirildiğini ortaya koymuştur. NF-κB'nin aktivasyonu iki farklı mekanizma aracılığıyla gerçekleşir: kanonik ve kanonik olmayanyollar 9. Kanonik yolda, aktivasyon kappa B alfa (IκBα)10 inhibitörünün fosforilasyon kaynaklı bozunmasına dayanır. Ancak, NF-κB alt birimi p65'in fosforilasyonunun, IκBα bozunmasından bağımsız olarak apoptozu tetiklediğide bildirilmiştir. Klotho, tek geçişli bir transmembran proteini, fosfat ve kalsiyum metabolizmasını düzenler ve insülinsinyallerini inhibe eder 12,13,14. Ortaya çıkan kanıtlar, Klotho'nun böbrek, hipokampus ve yaşlanma hücreleri dahil olmak üzere çeşitli dokularda NF-κB aktivasyonuna inhibitör etkiler uyguladığını ve böylece iltihabı ve doku hasarını azalttığınıgöstermektedir 15,16,17. Bu gelişmelere rağmen, Klotho'nun'deki rolü ve miyokard H/R yaralanması sırasında NF-κB yolu ile potansiyel etkileşimi büyük ölçüde keşfedilmemiştir.

Metodolojik açıdan, H9C2 sıçan kardiyomiyoblastları kullanan in vitro H/R modeli, kontrollü oksijen geriliği, tekrarlanabilirlik ve azaltılmış değişkenlik gibi hayvan modellerine göre çeşitli avantajlar sağlar. Ayrıca, lentiviral aracılı Klotho aşırı ekspresyonu, gen ifadesinin kararlı ve verimli modülasyonunu sağlar ve fonksiyonel etkisinin doğrudan incelenmesini sağlar. Bu yaklaşımlar, protokolü pratik, maliyet etkin ve mekanik çalışmalar için erişilebilir kılarken, aynı zamanda in vivo deneylerin etik ve lojistik zorluklarından kaçınır.

Pratik açıdan açısından, H9C2 hücreleri kardiyosit benzeri birçok özelliği korudukları için kardiyosit araştırmalarında yaygın olarak kullanılır; ancak olgun kardiyomiyositlerin fenotipini tam olarak taklit etmezler. Seçilen H/R durumu (5 saat hipoksi ve ardından 1 saat reoksijenlenme), in vitro iskemi-reperfüzyon yaralanmasını modellemek için yaygın olarak kullanılan bir aralık dahilindedir. Benzer şekilde, enfeksiyon çokluğu (MOI) ile yaklaşık 100 civarında lentiviral transdüksiyon, yönetilebilir sitotoksisiteyle verimli aşırı ifade sağlamak için standart bir yaklaşımdır. Bu özellikler protokolün uygulanabilirliğini artırsa da, in vivo ortamın eksik tekrarlanması gibi sınırlamalar kabul edilmelidir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı Klotho'nun miyokard hücrelerini H/R hasarından nasıl koruduğunu ve NF-κB sinyalizasyonu ile etkileşimini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir protokol oluşturmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

H9C2 fare kardiyomiyoblast hücre hattını (ATCC, CRL-1446) içeren tüm işlemler, kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmaya doğrudan hayvan veya insan denek dahil edilmedi. Şekil 1 , deneysel tasarım ve analiz boru hattının grafiksel iş akışını göstermektedir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü

H9C2 fare kardiyomiyoblast hücre hattı (ATCC, CRL-1446), Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, yüksek glikoz, 4,5 g/L) içeren dondurucu ortam kullanılarak %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenen dondurucu ortamda kriyokonserve edilmiştir. Kurtarma için, donmuş şişeler 37 °C su banyosunda 2-3 dakika hızla çözüldü ve hemen önceden ısıtılmış DMEM'e aktarıldı. Kültür ortamı %10 FBS, 100 U/mL penisillin, 100 μg/mL streptomisin, 3,7 g/L sodyum bikarbonat ve 1 mM sodyum piruvat ile hazırlanmıştır. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemli bir kuluçka makinesinde 37 °C'de tutuldu. Tüm deneylerde 6 ile 20 geçişler arasındaki H9C2 hücreleri kullanıldı. Erken geçişler (P20) geçişle ilgili fenotipik kaymayı önlemek için kullanılmamıştır.

2. H9C2 hücrelerinde Klotho'nun lentiviral aşırı ekspresyonu

EF1α promotoru kontrolü altında tam boy sıçan Klotho (Kl) genini kodlayan üçüncü nesil kendini inaktive eden lentiviral vektör, H9C2 hücrelerinde kararlı aşırı ekspresyonu oluşturmak için uygulandı. Yapı, görselleştirme için bir P2A-EGFP raporlayıcı, metin stabilitesi için woodchuck hepatit virüsü posttranskripsiyonel düzenleyici element (WPRE) ve merkezi polipurin traktı (cPPT) elementleri ile seçim için PGK promotörünün yönlendirdiği bir puromisin dirençli kaseti içeriyordu. Lentiviral parçacıklar, transfer plazmidinin psPAX2 (gag/pol/devir) ve pMD2.G (VSV-G) plazmidleriyle birlikte transfekte edilmesiyle, polietilenemin kullanılarak 4:3:1 oranında HEK293T hücrelerde üretildi (PEI; DNA: PEI = 1:3, w/b). Süpernatanlar 48 saat ve 72 saat içinde hasat edildi, 3.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjle arındırıldı, 0,45 μm PES membranından süzüldü ve 25.000 × g hassasiyette ultrasantrifüjle 2 saat boyunca 4 °C'de yoğunlaştırıldı. Viral pelletler, %1 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS'de yeniden süspansiyona alındı ve fonksiyonel titreler (TU/mL) 72 saatte HEK293T hücrelerin EFFP okuması ile sınırlayıcı-sulandırılması enfeksiyonu ile belirlendi. H9C2 hücreleri, her kuyu başına 2 × 10-5 hücre bulunan 6 kuyu plakalarına tohumlanmış, bu da transdüksiyon anında yaklaşık %60 birleşme oranına ulaşmıştır. Lentiviral parçacıklar, enfeksiyon verimliliğini artırmak için 1 mL taze kültür ortamında 100 enfeksiyon çokluğunda (MOI) eklendi ve polibren (8 μg/mL) ile takviye edildi. Aşı 12 saat sonra çıkarıldı ve yerine 2 mL tam ortam kondu. Enfeksiyondan 72 saat sonra, transdüksiyon etkinliği floresan mikroskobu altında EGFP floresansı ile doğrulandı. Stabil hücre hatlarının kurulması için, puromisin (2 μg/mL, önceden titrasyonlu) enfeksiyondan 48 saat sonra 3-5 gün boyunca uygulanmış, her 48 saatte bir ortam değişimi yapılmıştır. Klotho'nun aşırı ekspresyonu RT-qPCR ve immünoblotlama ile doğrulandı. Tüm lentiviral prosedürler biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) muhafazası altında gerçekleştirildi ve tüm viral atıklar, bertaraf edilmeden en az 30 dakika önce %10 çamaşır suyu ile inaktive edildi.

3. Deney grupları

H9C2 hücreleri, 6 kuyu tabakasına (büyüme alanı 9,6 cm²) 3 × 10⁵ hücre halinde tohumlanmış, 24 saat sonra yaklaşık %70-80 birleşme sağlamıştır; bu oran hipoksi/reoksijenasyon (H/R) işlemi ve sonraki testler için gerekli yoğunluktur. Gece boyunca bağlandıktan sonra hücreler altı deneysel gruba ayrıldı: (1) Ek tedavi görmeden kontrol grubu; (2) H/R grubu, daha önce tanımlandığı gibi kapalı modüler bir hipoksi odasında hipoksi/reoksijenasyon (H/R) geçiren, ardından daha önce tanımlandığı gibi 5 saat hipoksiye (%1 O₂, %94 N₂, %5 CO₂) ve 1 saat reperfüzyona (%5 CO₂) maruz kalan H/R grubu; (3) H/R tedavisinden 24 saat önce hücrelerin boş bir vektörle transfekte edildiyi negatif kontrol (NC) grubu; (4) Klotho grubu, hücreler H/R tedavisinden 24 saat önce Klotho'yu kodlayan lentiviral vektörlerle transfekte edilmiş; (5) H/R tedavisinden önce 24 saat boyunca 200 mg/L NF-κB yol inhibitörü PDTC ile tedavi edilen pyrrolidin ditiyokarbamat tedavigrubu (PDTC) 19; (6) Klotho + LPS grubu, hücreler Klotho'yu kodlayan lentiviral vektörlerle transfekte edilip, ardından 24 saat boyunca 1 mg/L ile lipopolisakkarit ile tedavi edildikten sonra H/Rtedavisi 20.

4. qRT-PCR

H9C2 hücreleri, her kuyu başına 1 × 10⁶ hücre yoğunluğunda 6 kuyu talı plakalara tohumlanmıştır. Tedaviden sonra, toplam RNA fenol-kloroform ekstraksiyon protokolü kullanılarak izole edildi. Kısa bir süreliğine, her kuyu başına 1 mL reaktif eklendi, ardından kloroform ekstraksiyonu, izopropanol çökeltmesi ve %75 etanol ile yıkama yapıldı. RNA peleti hava kurutuluyor ve RNase içermeyen suda çözünüyordu. RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometrik olarak belirlendi. cDNA sentezi için, üreticinin protokolüne göre ticari bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak 1 μg toplam RNA tersi transkribe edildi; genomik DNA çıkarımı ve rastgele heksamer astarlama dahil. SYBR Green kimyası ile gerçek zamanlı PCR sisteminde nicel gerçek zamanlı PCR işlemi şu koşullarda gerçekleştirildi: ilk denatürasyon 95 °C'de 30 saniye, ardından 5 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C ile 40 döngü. Asal dizileri, Primer-BLAST (NCBI) kullanılarak tasarlandı ve ticari bir tedarikçi tarafından sentezlendi: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTTAT-3′; (2) β-aktin (iç kontrol): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′. Göreceli ifade seviyeleri 2^-ΔΔCT yöntemiyle hesaplanmış ve amplifikasyon özgüllüğü tek bir erime eğrisi zirvesiyle doğrulanmıştır.

5. Western Blot

Proteinler, H9C2 hücrelerinden radyoimmünoprecipitasyon testi (RIPA) tamponu (6 kuyululu plaka başına 200 μl) ve buz üzerinde proteaz inhibitörü kokteyli ile takviye edilerek çıkarıldı. Protein konsantrasyonları bicinchoninic acid (BCA) testiyle ölçüldü ve elektroforetik ayrım için her şerit başına eşit miktarda protein (20-30 μg) %10 SDS-PAGE jeline yüklendi. Proteinler, 100 V'da ıslak transfer sistemi kullanılarak 4 °C'de 90 dakika boyunca poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarıldı. Zarlar, TBST'de 1 saat boyunca oda sıcaklığında hazırlanan %5 yağsız sütle bloklandı, ardından Klotho (1:500), fosfo-p65 (1:500), p65 (1:500), fosfo-IκBα (1:500), IκBα (1:500) ve β-aktine (1:1000) karşı birincil antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. TBST ile üç yıkamadan sonra, zarlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca yapara peroksidaz (HRP) ile konjuge ikincil antikorlarla (1:1000) kuluçka edildi. Protein bantları, geliştirilmiş kemilyüminesans algılama sistemi kullanılarak görselleştirildi ve sinyal yoğunlukları aynı eşik ayarlarıyla ImageJ yazılımıyla nicelendirildi.

6. MTT testi

H9C2 hücreleri, 100 μL tam ortamda her kuyu başına 2 × 10³ hücre yoğunluğunda 96 kuyu tabakalarına tohumlanarak yapışma sağlanması için gece boyunca kuluçka edildi. Her kuyuya 10 μL hacimli MTT çözeltisi (PBS içinde 5 mg/mL) eklendi ve %5 CO₂ ile nemlendirilmiş koşullarda 37 °C'de 4 saat kuluçka edildi. İnkubasyondan sonra, süpernatant dikkatlice çıkarıldı ve formazan kristallerini çözmek için 100 μL dimetil sülfoksit (DMSO) eklendi, ardından oda sıcaklığında hafif bir çalkalama ile 10 dakika kuluçka yapıldı. Daha sonra mikroplaka okuyucu kullanılarak 490 nm soğurma ölçüldü. Beklenen görsel sonuç, DMSO eklenmeden önce canlı hücrelerde mor formazan kristallerinin ve çözünmeden sonra homojen mor bir çözeltinin ortaya çıkmasıydı.

7. Akış sitometrisi

Hücreler, tedaviden 24 saat sonra tripsizasyon ile toplandı ve 1.500 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle toplandı. Hücre peleti 100 μL 1× bağlanma tamponunda (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.4) yeniden askıya alındı. Annexin V-APC ve propidium iyodid (PI) 1:2 oranında karıştırıldı ve hücre süspansiyonuna eklenen 15 μL boyama çözeltisi hazırlandı. Karışım, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika kuluçka içinde geçirildi. İnkubasyondan sonra, aynı bağlama tamponundan 400 μL eklendi ve örnekler hemen akış sitometresi kullanılarak analiz edildi. Her örneklem için toplam 10.000 olay toplandı. Veriler FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi. Hücreler önce döküntü dışlamak için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) temelinde kapatılmış, ardından canlı hücreleri (Annexin V-/PI-), erken apoptotik hücreleri (Annexin V+/PI-) ve geç apoptotik/nekrotik hücreleri (Annexin V+/PI+) ayırt etmek için Annexin V ile PI arasında dörtlü kapı atımı yapılmıştır. Annexin V-pozitif/PI-negatif boyama erken apoptozu gösterirken, Annexin V/PI çift pozitif boyama geç apoptoz veya nekrozu gösteriyordu.

8. İmmünoflüoresans

H9C2 hücreleri, 6 kuyu başı 1 × 10⁵ hücre yoğunluğunda steril cam kapak kapaklarına yerleştirildi ve tedavilere tabi tutuldu. Hücreler oda sıcaklığında %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitlenmiş, 10 dakika boyunca PBS'de %0,1 Triton X-100 ile permeabilize edilmiş ve oda sıcaklığında PBS'de %5 sığır serum albümini (BSA) ile 30 dakika bloke edilmiştir. Coverslipler, TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) ve IL-6 (1:100) karşısında birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkubasyon edildi. PBS'de üç yıkamadan sonra, hücreler oda sıcaklığında, karanlıkta 1 saat boyunca fikoeritrin (PE) etiketli ikincil antikorlarla (1:500) kuluçka edildi. Çekirdekler 5 dakika boyunca DAPI ile karşı boyandı. Kapak kaymaları, antifade montaj ortamı olan cam slaytlara monte edildi ve floresans sinyalleri floresans mikroskobu kullanılarak görselleştirildi. Görüntüler ImageJ (sürüm 1.54) ile analiz edildi. Kırmızı floresans sitokin ekspresyonunu gösterirken, mavi floresans çekirdekleri işaretlerdi.

9. İstatistiksel analiz

Tüm veriler SPSS yazılımı kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar, en az üç bağımsız deneyden ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. Birden fazla grup karşılaştırması için, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin sonradan yaptığı test uygulandı. P-değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Klotho aşırı ekspresyonu, hücre hayatta kalma durumunu artırır ve NF-κB aracılı inflamatuar hasarı azaltır

Gen teslimatının verimliliğini doğrulamak için Klotho ekspresyonu hem mRNA hem de protein seviyelerinde nicelendirildi. Klotho aşırı eksprese eden hücreler, hem hipoksi/reoksijenasyon (H/R) hem de negatif kontrol gruplarına (p < 0.05) kıyasla sağlam bir artış gösterdi;

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, hipoksi/reoksijenasyon (H/R) hasarına maruz kalan kardiyomiyositlerde Klotho'nun koruyucu rolü araştırılmış ve Klotho aşırı ekspresyonunun hücre canlılığını önemli ölçüde iyileştirdiği, apoptozu azalttığı ve pro-inflamatuar sitokin ekspresyonunu bastırdığı bulunmuştur. Bu etkiler, p65'in azalmış fosforilasyonu ve IκBα'nın artan fosforilasyonu ile birlikte gerçekleşti; bu da NF-κB sinyalizasyonunun inhibisyonunun koruyucu fenotipe katkıda bulunduğunu göstermektedir. PDTC ile...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%4 ParaformaldehitBiosharpXG1050
Ek V APC/PI Boyama ÇözümüElabscienceE-CK-A217
cDNA Sentez KitiQiagen205410
DAPI ÇözümüBioFroxx1155MG010
Dulbecco' s Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)HyCloneSH30243.01B
ECL Tespit Reaktif KitiMeilunbioMA0186-1
Elektroforez Güç Kaynağı (POWER PAC 200)Bio-RadPOWER PAC 200
Fetal Sığır Serumu (FBS)VivaCellC04001-500, C04002-500
Akış Sitometresi (Gallios)Beckman CoulterGallios
Floresan Mikroskobu (BK6000)Chongqing OptecBK6000
Formazan ÇözücüsüSolarbioM1020
HRP-Konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG AntikorBetilA120-101P
LPS (NF-Κ B Yol Agonisti)Sigma-AldrichL2630
Mikroplaka Okuyucu (Model K3)TermoK3
Modüler Kuluçka Odası (Hipoksi Odası)Billups-RothenbergMIC-101
MTT ÇözümüCayman21795
PDTC (NF-Κ B Yol İnhibörü)Sigma-AldrichP8765
PE-Konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG AntikoruBiyografibs-0295G-PE
Polibren (Heksadimethrine Bromid)InvitrogenX2351
PVDF ZarıMerckISEQ00010
Tavşan Anti-Fare IL-1 ve beta; AntikorBiorbytorb378927
Tavşan Anti-Fare IL-6 AntikoruZEN BIYOGRAFISI384702
Tavşan Anti-Fare Iκ Bα AntikorBiorbytorb223182
Tavşan Anti-Fare Klotho AntikoruBiorbytorb333711
Tavşan Anti-Fare p65 AntikorBiorbytorb229138
Tavşan Anti-Fare Fosfo-Iκ Bα AntikorBiorbytorb223035
Tavşan Anti-Fare Fosfo-NF-κ B p65 AntikorBiorbytorb304662
Tavşan Karşıtı Fare TNF-α AntikorBiorbytorb106548
Tavşan Anti-Fare β-aktin AntikoruHuabioET1702
Gerçek Zamanlı Nicel PCR Sistemi (LightCycler 96)RocheLight Cycler96
RIPA Liz TamponuMredaMO52447
SDS-PAGE Jel Hazırlık KitiElabscienceE-IR-R305
TRIzol Reaktif KitiYaşam Teknolojileri15596-018

Kaynaklar

  1. SupplemenDong, G., et al. Rg1 prevents myocardial hypoxia/reoxygenation injury by regulating mitochondrial dynamics imbalance via modulation of glutamate dehydrogenase and mitofusin 2. Mitochondrion. 26, 7-18 (2016).
  2. Liu, J., et al. Rhein protects the myocardiac cells against hypoxia/reoxygenation-induced injury by suppressing GSK3β activity. Phytomedicine. 51, 1-6 (2018).
  3. Yang, H., Wang, C., Zhang, L., Lv, J., Ni, H. Rutin alleviates hypoxia/reoxygenation-induced injury in myocardial cells by up-regulating SIRT1 expression. Chem Biol Interact. 297, 44-49 (2019).
  4. Liang, W., Guo, J., Li, J., Bai, C., Dong, Y. Downregulation of miR-122 attenuates hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced myocardial cell apoptosis by upregulating GATA-4. Biochem Biophys Res Commun. 478 (3), 1416-1422 (2016).
  5. Zhang, R. -Y., Qiao, Z. -Y., Liu, H. -J., Ma, J. -W. Sonic hedgehog signaling regulates hypoxia/reoxygenation-induced H9C2 myocardial cell apoptosis. Exp Ther Med. 16 (5), 4193-4200 (2018).
  6. Chen, H., Zhang, R. -Q., Wei, X. -G., Ren, X. -M., Gao, X. -Q. Mechanism of TLR-4/NF-κB pathway in myocardial ischemia reperfusion injury of mouse. Asian Pac J Trop Med. 9 (5), 503-507 (2016).
  7. Wang, R., et al. Leonurine alleviates LPS-induced myocarditis through suppressing the NF-κB signaling pathway. Toxicology. 422, 1-13 (2019).
  8. Luo, M., et al. Ginsenoside Rg1 attenuates cardiomyocyte apoptosis and inflammation via the TLR4/NF-κB/NLRP3 pathway. J Cell Biochem. 121 (4), 2994-3004 (2020).
  9. Yoon, S., et al. NF-κB and STAT3 cooperatively induce IL6 in starved cancer cells. Oncogene. 31 (29), 3467-3481 (2012).
  10. Yu, H., Lin, L., Zhang, Z., Zhang, H., Hu, H. Targeting NF-κB pathway for the therapy of diseases: mechanism and clinical study. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 209(2020).
  11. Bu, Y., et al. Targeting NF-κB RelA/p65 phosphorylation overcomes RITA resistance. Cancer Lett. 383 (2), 261-271 (2016).
  12. Xu, Y., Sun, Z. Molecular basis of Klotho: from gene to function in aging. Endocr Rev. 36 (2), 174-193 (2015).
  13. Urakawa, I., et al. Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23. Nature. 444 (7120), 770-774 (2006).
  14. Degaspari, S., et al. Altered KLOTHO and NF-κB-TNF-α signaling are correlated with nephrectomy-induced cognitive impairment in rats. PLoS One. 10 (5), e0125271(2015).
  15. Teocchi, M. A., Ferreira, A. ÉD., de Oliveira, E. P. L., Tedeschi, H., D'Souza-Li, L. Hippocampal gene expression dysregulation of Klotho, nuclear factor kappa B and tumor necrosis factor in temporal lobe epilepsy patients. J Neuroinflammation. 10 (1), 53(2013).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Feng, X., Luo, Q., Wang, H., Zhang, H., Chen, F. MicroRNA-22 suppresses cell proliferation, migration and invasion in oral squamous cell carcinoma by targeting NLRP3. J Cell Physiol. 233 (9), 6705-6713 (2018).
  18. Benoist, L., et al. Stimulation of P2Y11 receptor protects human cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and involves PKCε signaling pathway. Sci Rep. 9 (1), 11613(2019).
  19. Zhang, J. -J., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits nuclear factor-κB pathway activation, and regulates adhesion, migration, invasion and apoptosis of endometriotic stromal cells. Mol Hum Reprod. 17 (3), 175-181 (2011).
  20. Zeng, Y., et al. Klotho inhibits the activation of NLRP3 inflammasome to alleviate lipopolysaccharide-induced inflammatory injury in A549 cells and restore mitochondrial function through SIRT1/Nrf2 signaling pathway. J Physiol Investig. 66 (5), 335-344 (2023).
  21. Jin, M., et al. Klotho ameliorates cyclosporine A-induced nephropathy via PDLIM2/NF-κB p65 signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun. 486 (2), 451-457 (2017).
  22. Wu, C., et al. The function of miR-199a-5p/Klotho regulating TLR4/NF-κB p65/NGAL pathways in rat mesangial cells cultured with high glucose and the mechanism. Mol Cell Endocrinol. 417, 84-93 (2015).
  23. Kwon, H. -J., et al. Stepwise phosphorylation of p65 promotes NF-κB activation and NK cell responses during target cell recognition. Nat Commun. 7 (1), 11686(2016).
  24. Shi, H., Berger, E. A. Characterization of site-specific phosphorylation of NF-κB p65 in retinal cells in response to high glucose and cytokine polarization. Mediators Inflamm. 2018, 3020675(2018).
  25. Chen, G., et al. α-Klotho is a non-enzymatic molecular scaffold for FGF23 hormone signalling. Nature. 553 (7689), 461-466 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Klotho Aşırı EkspresyonuNF-KappaB Sinyal YoluH9C2 HücreleriWestern BlotAkış SitometrisiHücre CanlılığıPro-İnflamatuar SitokinlerMiyokardiyal İskemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.