Yüksek Yoğunluklu Lipoproteine Özgü Fosfolipid Akış Testi

Özet

Burada, tüm insan plazmasında veya serumunda bulunan yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) tarafından lipid donör partiküllerinden spesifik olarak uzaklaştırılan floresan fosfolipid miktarını ölçmek için protokolleri açıklıyoruz. HDL işlevselliğinin bu metriğinin, kardiyovasküler hastalık olayını öngördüğünü gösterdik.

Özet

Yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL)-kolesterolün (HDL-K) plazma seviyeleri şu anda kardiyovasküler hastalık (KVH) riskinin klinik değerlendirmesi için önemli bir ölçüttür. Plak lipidlerinin hücrelerden ve arter duvarındaki hücre dışı birikintilerden HDL aracılı olarak uzaklaştırılması, HDL'nin KVH riski ile ters ilişkisini açıklayabilecek birkaç anti-aterojenik işlevinden biridir. Hücresel kolesterolün in vitro olarak HDL aracılı olarak uzaklaştırılmasının, KVH riskinin HDL-C'den daha iyi bir göstergesi olduğu yakın zamanda kanıtlanmıştır.

HDL, farklı işlevleri yerine getiren heterojen bir parçacık popülasyonundan oluşur. Aterosklerotik plak lipidlerinin uzaklaştırılmasında rol oynayan HDL partikülleri, partikülden ayrılan ve daha sonra plak lipidlerini uzaklaştıran, çoğunlukla apolipoprotein A-I olmak üzere değiştirilebilir apolipoproteinler içerir. Yeni oluşan HDL, hem fosfolipidlerin hem de kolesterolün ABCA1 tarafından üretilen hücresel plazma zarı alanlarından HDL'den türetilen değiştirilebilir apolipoproteinler tarafından çözündürülmesi ve çıkarılmasıyla oluşturulur. Bu süreç, aterosklerotik plağın hem önlenmesinde hem de gerilemesinde kritik bir rol oynar.

Burada, daha önce KVH riskini tahmin edebildiğini gösterdiğimiz hücresiz, HDL'ye özgü fosfolipid akışı (HDL-SPE) testi için protokolü açıklıyoruz. Bu tahlil, spesifik olarak, bir lipid donör partikülünden değiştirilemeyen bir floresan fosfolipidin HDL apolipoprotein aracılı olarak çıkarılmasını ölçer. Vaka kontrol klinik çalışmalarımız, HDL-SPE testinin, genellikle radyoaktif kolesterol kullanan zahmetli ve teknik olarak karmaşık bir test olan "altın standart" hücre bazlı kolesterol akış kapasitesi testi kadar iyi ve potansiyel olarak ondan daha iyi performans gösterdiğini ortaya koymuştur.

Bu protokolün amacı, hem temel hem de klinik araştırmacıların basit, standartlaştırılmış, hücresiz, yüksek verimli bir test kullanarak lipid mobilizasyonunda HDL'nin işlevselliğini değerlendirmelerini sağlamaktır. Bu tahlil, temel araştırmacılar tarafından HDL aracılı lipid akışının altında yatan mekanizmalar hakkında fikir edinmek ve HDL işlevselliğini artıran yeni terapötik ajanları taramak için kullanılabilir. HDL-SPE ayrıca KVH risk değerlendirmesi için bir klinik laboratuvar tanı testi olarak da hizmet edebilir.

Giriş

Yüksek yoğunluklu lipoproteine özgü fosfolipid akışı (HDL-SPE) testi, HDL işlevselliğini ölçer ve (i) aterosklerotik lezyonlardan lipidlerin HDL aracılı olarak çıkarılmasının altında yatan mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi edinmek, (ii) klinik KVH risk değerlendirmesini iyileştirmek için yeni bir platform olarak hizmet etmek ve (iii) kardiyovasküler hastalığı tedavi etmek için yeni terapötikler geliştirmek için biyomedikal araştırma ve klinik tanı laboratuvarlarında kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

HDL-kolesterol (HDL-K), KVH riski^1'in önemli bir belirleyicisidir, ancak yüksek HDL-K seviyeleri (>80 mg/dL) daha yüksek KVH riski ^2,3,4,5 ile ilişkili olduğu sürece yararlılığı tehlikeye girer. Yüksek HDL-C seviyeleri, arteriyel plak lipidlerini çıkarma kapasitesi azalmış işlevsiz HDL birikimini temsil edebilir⁶.

Hücresel kolesterol akış kapasitesi (CEC) testi, HDL işlevselliğini ölçmek için geliştirilen ilk in vitro testti. Bu tahlilde, tipik olarak ³H- veya floresan Bodipy-kolesterol ile etiketlenmiş kültürlenmiş makrofajlar (fare veya insan), apoB'den yoksun plazma veya serum ile inkübe edilir. % kolesterol akışı, hücre ve ortamla ilişkili floresan/radyoaktivite miktarına göre hesaplanır ^7,8,9. CEC testinin, KVH olayının HDL-C^7'den daha iyi bir belirleyicisi olduğu gösterilmiştir. CEC testi, esas olarak hücre kültürü ve uzun süre (örn. günler) gereksinimleri nedeniyle rutin bir klinik tanı testine dönüştürülmeye uygun değildir. Ayrıca, CEC testi, doğal değişkenliği ile sınırlıdır (örneğin, farklı hücre tipleri, etiketleme teknikleri ve HDL bileşimini¹⁰ değiştiren β-lipoproteinlerin PEG tükenmesi).

Birkaç araştırma grubu, HDL fonksiyonu hakkında yeni bilgiler edinmek ve KVH riskini daha iyi değerlendirmek için klinik bir tanı testine potansiyel çeviri için araçlar olarak kullanılmak üzere hücresiz HDL kolesterol akış testleri geliştirmiştir^11,12. Bu akış testleri tipik olarak birden fazla adım içerir ve bir floresan kolesterol ile etiketlenmiş bir lipid donör partikülü kullanır ve CEC testi gibi, plazma HDL kolesterol akışını ölçmek için ya β-lipoproteinlerin tükenmesini ya da alternatif olarak, anti-apoA-I antikorları kullanılarak apoA-I içeren partiküllerin yakalanmasını gerektirir. Bu alternatif tahlillerin KVH riski ile değişen derecelerde ilişkili olduğu doğrulanmış olsa da, bugüne kadar, apoA-I döviz kurunu değerlendiren sadece bir^13'ün KVH riskini¹⁴ tahmin ettiği gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, apoA-I açık ve kapalı plazma HDL değişiminin kinetiğinin CEC¹⁵ ile bağımsız olarak ilişkili olduğu ve akut koroner sendromlu hastalarda belirgin şekilde azaldığı gösterilmiştir¹⁶. Ek olarak, birkaç HDL değiştirilebilir apolipoproteinin, in vitro^17'de ABCA1 eksprese eden hücrelerden hem kolesterole hem de fosfolipide aracılık ettiği gösterilmiştir.

HDL işlevselliğini değerlendirmek için alternatif bir yaklaşım geliştirdik¹⁸. Burada açıklanan basit, hızlı ve güvenilir tahlil, tüm insan (veya hayvan) plazma veya serum numuneleri (taze veya dondurularak çözülmüş) ve bir floresan lipid kaplı donör partikülü olmak üzere yalnızca iki bileşen gerektirir. Test, tüm plazma/serumdaki apoA-I ve diğer HDL ile ilişkili değiştirilebilir apolipoproteinlerin, lipid kaplı bir donör partikülünden¹⁸ değiştirilemeyen, baş grup etiketli bir floresan fosfatidiletanolamini (PE) çıkarma yeteneğini ölçer (Şekil 1).

Bu tahlildeki donör partikülleri, kolesterol ile kaplanmış kalsiyum silikat hidrat kristallerinden (CSH), fosfolipid fosfatidilkolin (PC) ve bir floresan PE'den oluşur. HDL partiküllerinden salınan, çoğunlukla apoA-I olmak üzere değiştirilebilir HDL ile ilişkili apolipoproteinler, donör partiküllere bağlanır ve daha sonra floresan PE dahil olmak üzere donör partikül lipidleri ile birlikte onlardan ayrılır. Bu şekilde, HDL, ancak tüm plazma/serumda bulunan diğer lipoproteinler değil, donör partiküllerinden^18,19 spesifik olarak floresan PE alır. Tüm plazma/serum, floresan lipid kaplı kalsiyum silikat hidrat (LC-CSH) donör partikülleri ve salin ile 37 °C'de 1 saat çalkalanarak inkübe edilir. LC-CSH suyun yoğunluğunun yaklaşık iki katı olduğundan, donör partiküller düşük hızlı santrifüjleme ile plazmadan kolayca ayrılır.

Klinik çalışmalarda ölçülen % PE akışı tipik olarak, bir klinik numunenin reaksiyon karışımının süpernatanında HDL tarafından elde edilen PE floresan değerinin, bir referans kontrol insan plazmasında HDL tarafından elde edilen değere bölünmesiyle normalleştirilir. Reaktif hazırlamadaki varyasyonları düzeltmek için bir referans plazmaya normalizasyon gerçekleştirilir. Araştırma uygulamaları için, süpernatan PE floresansının toplam floresansa (süpernatant PE floresan + LC-CSH floresansı) bölünmesiyle hesaplanarak % PE akışı belirlenebilir. Süpernatan floresan ölçüm değerleri, %PE Akışını hesaplamak için elektronik tablo dosyalarındaki bir şablona yapıştırılır (üçlü ölçümler için Ek Tablo 1 ve yinelenen ölçümler için Ek Tablo 2). Elektronik tabloda bu hesaplamaların gerçekleştirilmesine ilişkin talimatlar ek dosyalar olarak verilmiştir (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4, Ek Dosya 5, Ek Dosya 6, Ek Dosya 7 ve Ek Dosya 8) ve örnek bir hesaplama Ek Tablo 3 olarak verilmiştir.

Şekil 1: HDL-SPE testi. HDL'ye özgü fosfolipid akışı 96 oyuklu plakalarda test edilir. Değiştirilemeyen lissaminerhodamin etiketli fosfatidiletanolamin (LRh-PE; kırmızı membran katmanları) dahil olmak üzere lipitlerle (LC-CSH) kaplanmış salin, kalsiyum silikat hidrat kristalleri (gri) ve 30'a kadar tam plazma/serum numunesi (sarı; üç kopya halinde) 96 oyuklu plakalara yüklenir. Bir termomikserde 37 °C'de 1 saat karıştırıldıktan sonra, plakalar LC-CSH donör partiküllerini pelet haline getirmek için kısaca santrifüjlenir. Spesifik olarak LRh-PE ile etiketlenmiş HDL içeren süpernatanların alikotları, deterjan (Lh-Rh-PE'yi çözündürmek için) ve salin içeren siyah bir plakaya aktarılır. PE floresansı daha sonra bir florimetre ile ölçülür. Salin (Negatif Kontrol; NC), arka plan düzeltmesi için ve havuzlanmış sağlıklı insan plazması (Pozitif Kontrol; PC) son kuyucuk setinde numune plazması/serum yerine yüklenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Kan alımı, 2013 yılında revize edilen 1975 tarihli Helsinki Bildirgesi'nin (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/) kurallarına uygun olarak gerçekleştirilir ve bilgilendirilmiş onam ile ilgili kurumsal yönergelere uygun olmalıdır.

1. Floresan fosfolipid etiketli donör lipid partiküllerinin hazırlanması

1. Lipid film oluşumu
   DİKKAT: Stok çözeltilerini kimyasal bir başlıkta hazırlayın ve dağıtın. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takın. Kloroform çözeltilerini organik kimyasal atıklara, Triton X-100 çözeltilerini (plazmasız) kimyasal atıklara ve plazma içeren çözeltileri biyolojik tehlike/tıbbi atıklara atın.
   1. Bir satıcıdan kloroformda lipid stok çözeltileri satın alın veya bunları laboratuvarda yapın:
      25 mg/mL: 1,2-Dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC):
      10 mg/mL: Kolesterol
      1 mg/mL: 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(lissaminerhodamin B sülfonil) [LRh-PE]
      NOT: Vidalı kapaklı hava geçirmez cam tüpler kullanın. Teflon bantlı kapatın.
      -20 ^oC'de saklayın.
   2. İhtiyaç duyulacak LC-CSH miktarını belirleyin ve uygun sayıda cam tüp hazırlayın.
      Kimyasal bir çeker ocakta, her 10 mm 150 mm borosilikat cam tüpe aşağıdakileri ekleyin: 472 μL DMPC stok çözeltisi (17.7 μmol, 11.8 mg), 339 μL kolesterol stok çözeltisi (8.8 μmol, 3.39 mg) ve 305 μL LRh-PE (200 nmol, 0.305 mg). Karıştırmak için kısaca girdap.
   3. Kimyasal bir çeker ocakta, tüpün dibinde kuru bir lipit filmi oluşturmak için lipit karışımını bir cam tüp içinde hafif bir N₂ akışı altında 1 saat kurutun.
      NOT:_N2'nin akışı, sıvı yüzeyinde hafif bir dalgalanmaya neden olmalıdır.
   4. Günler veya haftalar boyunca birkaç 96 oyuklu plaka gerektiren tahliller için, tüplere bölünebilen veya -20 °C veya -80 °C'de saklanan kullanıma hazır LC-CSH plakaları yapmak için kullanılabilen büyük bir LC-CSH partisi yapın. Aşağıdaki 2.2.1-2.2.2 adımlarına bakın.
2. Kalsiyum silikat hidratın floresan lipid film ile kaplanması
   DİKKAT: Kalsiyum silikat hidratla çalışırken laboratuvar önlüğü, eldiven, yüz maskesi ve koruyucu gözlük takın.
   1. Kurutulmuş lipitleri içeren cam tüpe bir tartım kağıdı konisi yerleştirin. Tozu tüpün tabanına yönlendirmek için tartım kağıdı konisini kullanarak cam tüpe 80 mg kalsiyum silikat hidrat (CSH) tozu (lipid giderme reaktifi) ekleyin. Kurutulmuş lipitleri ve CSH'yi içeren cam tüpe hemen 2 mL normal salin ekleyin. Tüpün üstünü parafilm ile örtün.
   2. Lipidin büyük kısmını cam tüpün tabanından çıkarmak için elle vorteksleyin. Cam tüpü, bir girdabın tepesine tutturulmuş bir strafor platformda açılan bir deliğe yerleştirin. Güçlendirilmiş bant kullanarak tüpü girdap platformuna sabitleyin.
      NOT: Karışımın cam tüpün yaklaşık yarısına kadar yukarı çıkmasını sağlamak için girdap hızını önceden ayarlayın.
   3. 10 dakika vorteks. Vortekslemeden sonra, tüpün duvarında lipit kalmadığını doğrulayın. Gerekirse, lipit kalmayana kadar gerektiği kadar manuel olarak girdap yapın. Cam tüpteki toplam hacmi 1 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik konik plastik bir tüpe aktarın. Cam tüpün duvarlarını 3 mL ilave salinle yıkayın ve aynı 15 mL konik plastik tüpe aktarın.
3. LC-CSH yıkama
   1. Donör partiküllerini peletlemek için lipid kaplı CSH (LC-CSH) içeren 15 mL'lik plastik tüpü 4 ° C'de 935 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı uzun, çok ince bir pipet ucu kullanarak vakum aspirasyonu ile dikkatlice çıkarın.
   2. Süpernatantın tepesinden başlayın ve pipet ucunu tüpün kenarı boyunca yavaşça kaydırırken, süpernatan çıkarılırken tüpü eğin. LC-CSH'nin peletten kazara aspire edilmesini önlemek için az miktarda (≈ 200 μL) salin bırakın. Toplam hacmi 5 mL'ye getirmek için yeterli salin ekleyin.
   3. 1.3.1-1.3.2 adımlarını dört kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, son hacmi 2,5 mL'ye getirecek kadar salin ekleyin.
      NOT: LC-CSH preparatlarında 4 °C'de 2 hafta veya -20 °C veya -80 °C'de 6 aya kadar saklayın.
4. Kullanıma hazır LC-CSH plakalar için büyük parti hazırlama
   NOT: Bu yaklaşım, aynı LC-CSH partisinden tek tip reaktif bileşimine sahip ölçüm plakalarının hazırlanmasını sağlar ve böylece plakalar arası ölçüm değişkenliğini en aza indirir.
   1. Yukarıdaki 1.1.1-1.3.2 adımlarında açıklandığı gibi 12 LC-CSH tüpü (2,5 mL x 12 tüp) hazırlayın. 12 tüpün tamamının tüm içeriğini 50 mL'lik konik plastik bir tüpte (toplam 30 mL hacim) birleştirin. LC-CSH parçacıklarının homojen bir dağılımını elde etmek için dikkatlice girdap yapın ve 15 mL'lik plastik konik bir tüpe 6 mL dağıtın. Her biri 6 mL LC-CSH içeren toplam 5 plastik konik tüp elde etmek için dört kez tekrarlayın.
   2. Her tüp, 5 Kullanıma Hazır LC-CSH plakası (tek bir plakadaki 96 kuyucuğun tümü için kuyu başına 50 μL içerir) yapmak için yeterli LC-CSH sağlayacaktır. Aşağıdaki 2.2.1-2.2.2 adımlarına bakın.

2. Plazma/serum örneklerinin floresan fosfolipid etiketli donör lipid partikülleri (LC-CSH) ile inkübasyonu

1. Hemen kullanım için ayrı plakalar.
   1. Numune setinin test edilmesi için gerektiği kadar kuyucuk kullanarak 0,3 mL'lik 96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 75 μL salin pipetleyin. Üçlü negatif kontrol (NC) kuyucuklarına 100 μL salin ve çift pozitif kontrol (PC) kuyucuklarına 75 μL salin pipetleyin (Şekil 2). Dağıtmak için çok kuyulu bir pipet kullanın.
   2. LC-CSH'yi dağıtmadan önce, 15 mL'lik plastik stok tüpünü her biri 10 saniye olmak üzere 3 kez vorteksleyin. Tek bir kuyucuklu pipet kullanarak, tuzlu su içeren kuyucukların sağ tarafı boyunca 50 μL LC-CSH dağıtın. Her biri 50 μL'yi yalnızca 3 kuyucuğa hızla dağıtın. LC-CSH'yi sonraki 3 kuyuya dağıtmadan önce girdap protokolünü tekrarlayın.
      NOT: Bu prosedür, kendiliğinden çökelen ağır LC-CSH'nin homojen bir şekilde süspanse edilmesini sağlamak ve böylece her kuyucuğa eşit miktarların dağıtılmasına izin vermek için kritik öneme sahiptir.
   3. 96 oyuklu plakayı, kuyucukların sol tarafı şimdi sağa gelecek şekilde 180° döndürün. Kuyunun sağ tarafı boyunca 25 μL plazma/serum numunesi pipetleyin (Şekil 2). PC kuyucukları için 25 μL referans standart insan normolipidemik plazma/serumu ekleyin. Test için kuyu başına toplam hacim 150 μL'dir.
      NOT: Bu prosedür, kuyucukların zıt tarafları boyunca dağıtıldıkları için plazma / serumun LC-CSH ile çapraz kontaminasyonunu önler.
   4. Plakayı yapışkan filmle sıkıca kapatın. Sızdırmaz 96 oyuklu plakayı karanlıkta 1 saat boyunca 37 °C'de 1200 rpm'de bir termomikserde inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra plakayı termomikserden çıkarın ve buza koyun. Donör partiküllerini peletlemek için plakayı 4 °C'de (transfer reaksiyonunu durdurmak için) 935 g'da 2 dakika santrifüjleyin.
2. Kullanıma hazır LC-CSH plakalar
   1. Kullanım için, donmuş Kullanıma Hazır plakaları (plaka hazırlama için adım 1.4.1-1.4.2'ye bakın) soğukta (4 °C ila 10 °C) 2 saat (veya gerekirse gece boyunca) çözdürün. Tüm malzemeyi (125 μL) bir araya toplamak için 4 °C'de 935 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Kuyuların içindekileri sıçratmamak için yapışkan filmi dikkatlice çıkarın.
   2. 25 μL plazma/serum numuneleri, salin ve referans insan plazmasını üç kopya halinde Kullanıma Hazır plakanın uygun kuyucuklarına (Şekil 1) buz üzerinde dağıtın ve yapışkan filmle kapatın. Kapalı 96 kuyucuğu karanlıkta 1 saat boyunca 37 °C'de 1200 rpm'de bir termomikserde inkübe edin. Plakayı termomikserden çıkarın ve buzun üzerine koyun. Plakayı 4 °C'de (transfer reaksiyonunu durdurmak için) 935 × g'da (donör partiküllerini peletlemek için) 2 dakika santrifüjleyin.

Şekil 2: Reaktiflerin çapraz kontaminasyon olmadan kuyucuklara dağıtılması. Plazma/serum ve LC-CSH'yi kuyucukların karşıt duvarlarına dağıtın. LC-CSH'nin ilk dağıtımından sonra plaka 180° döndürülürse çapraz kontaminasyon en aza indirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Floresan fosfolipidin plazma/serum HDL'ye akışının ölçümü

1. Siyah plakaya aktarma ve floresan ölçümü
   1. LC-CSH peletini rahatsız etmemek için yapışkan filmi dikkatlice çıkarın.
      NOT: Pelet bozulması meydana gelirse, tekrar santrifüjleyin.
   2. Floresan ölçümleri için 96 oyuklu reaksiyon plakasından 50 μL süpernatantı 96 oyuklu siyah polistiren düz tabanlı plakanın kuyucuklarına aktarın. Çok kuyulu bir pipet kullanın.
      NOT: Herhangi bir LC-CSH'yi aspire etmeyin. Böyle bir durumda kuyuya tekrar enjekte edin ve tekrar santrifüjleyin.
   3. Bir rezervuarı normal tuzlu su ile doldurun. Çok kuyulu bir pipet kullanarak her kuyucuğa 50 μL salin ekleyin.
   4. 125 mL'lik plastik bir Erlenmeyer şişesinde 10 mL %10 Triton X-100 stok çözeltisine 90 mL damıtılmış su ekleyerek %1 TX-100 hazırlayın. Bir rezervuarı %1 Triton-X 100 ile doldurun.
   5. Her bir kuyucuğa oda sıcaklığında 100 μL %1 Triton X-100 ekleyin ve çok kuyulu bir pipet kullanarak 2-3 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek karıştırın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. Kabarcıkları 3 mL'lik bir transfer pipetinden gelen havayla patlatın.
   6. Lissaminerhodamin floresansını florimetre ile ölçün (540 nm uyarma / 600 nm emisyon).
2. %PE akışının hesaplanması
   1. PE akış hesaplaması
      1. %PE akışı = ([Toplam Süpernatan Plazma veya Serum FLU - Süpernatan NC FLU]/Toplam FLU)) × 100
         GRİP = floresan birimleri; NC = negatif kontrol. Kuyu başına floresansı ölçmek için 150 μL'lik süpernatan reaksiyon karışımının sadece 50 μL'si kullanıldığından, aşağıdaki gibi düzeltilmesi gerekir:
      2. Toplam süpernatan FLU/kuyu = 50 μL (siyah plaka) ölçülen FLU × 3
      3. 150 μL reaksiyon karışımı/kuyusu başına toplam FLU = 50 μL LC-CSH tarafından yayılan toplam FLU.
         NOT: LC-CSH floresansı aşağıda açıklandığı gibi hesaplanır (adım 4.2.5).
   2. Normalleştirilmiş %PE akış hesaplaması
      1. Farklı koşullar altında gerçekleştirilen tahliller arasındaki varyasyonu düzeltmek için normalleştirilmiş %PE akışını kullanın (yani, farklı günlerde yapılan deney, parti farklılıkları).
      2. Normalleştirilmiş %PE akışını hesaplamak için bu formülü kullanın:
         Normalleştirilmiş %PE Akışı = Numune süpernatantı %PE akış değeri (FLU)/pozitif referans kontrol süpernatantı %PE akışı FLU değeri.
      3. Referans kontrol olarak normal lipid profiline sahip sağlıklı donörlerden alınan aynı havuzlanmış insan plazmasını kullanın. Bu değer hem numune hem de referans için aynı olduğu için Toplam süpernatan FLU/kuyu hesaplamasına gerek yoktur.
      4. Üç kopyalı numuneler için, adım 3.1.6'da elde edilen ham verileri elektronik tabloya yapıştırın (Ek Tablo 1). Yinelenen örnekler için, adım 3.1.6'da elde edilen ham verileri elektronik tabloya yapıştırın (Ek Tablo 2).

4. LC-CSH standart eğrisi

NOT: LC-CSH standart eğrisi, kuyu başına LC-CSH alikotunda bulunan PE floresan sinyali miktarını hesaplamak için kullanılır. Tipik olarak 50 μL LC-CSH/kuyu kullanılır. Bu değer, reaksiyon karışımında bulunan Toplam FLU'ya (bkz. adım 3.2.1) normalize edilmiş bir numunede HDL'ye %PE akışını hesaplamak için kullanılabilir.

%PE akışı = ((süpernatant numune floresan birimleri [FLU] - süpernatan salin FLU)/(toplam LC-CSH FLU)) x 100.

1. LC-CSH'nin seri seyreltilmesi
   1. Stok LC-CSH'nin 10 kat ve 100 kat seyreltmelerini hazırlayın (1.1.1-1.3.3 adımlarında hazırlandığı gibi):
      10 kat seyreltme: 100 μL LC-CSH + 900 μL %1 Triton X-100
      100 kat seyreltme: 100 μL 10 kat seyreltilmiş LC-CSH + 900 μL %1 Triton X-100
   2. Standart eğri için 10 ve 100 kat seyreltilmiş LC-CSH'nin üç kopya numunelerini 96 oyuklu bir inkübasyon plakasına dağıtın (bkz. Şekil 3).
   3. 200 μL'lik bir nihai hacme getirmek için LC-CSH içeren kuyucuklara yeterli hacimde %1 Triton X-100 ekleyin (bkz.
2. Floresan ölçümü için LC-CSH'nin çözündürülmesi
   1. Plakayı yapışkan filmle kapatın ve 1200 rpm'de çalkalayarak 24 °C'de 1 saat inkübe edin. Santrifüj plakası 4 °C'de 935 × g'da 2 dakika. Yapışkan filmi dikkatlice çıkarın.
   2. Çok kuyulu bir pipet kullanarak numuneleri 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Çok kuyulu bir pipet kullanarak floresan ölçümleri için kuyu başına 100 μL LC-CSH'yi 96 oyuklu siyah polistiren düz tabanlı bir plakaya aktarın.
   3. Çok kuyulu bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa oda sıcaklığında %100 Triton-X kuyucuk başına 1 μL ekleyin. 2-3x yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
   4. Floresansı bir florimetre ile ölçün (540 nm uyarma/600 nm emisyon).
   5. Florimetre kullanılarak ölçülen floresan değerlerini, Ek Dosya 3'te gösterildiği gibi Ek Tablo 1'deki Doğrusal Regresyon Analizi şablonuna yapıştırın. Standart eğri ölçüm plakasındaki LC-CSH'nin nihai konsantrasyonları Tablo 2'de gösterilmektedir.

Şekil 3: LC-CSH standart eğrisi için plaka. Seri olarak seyreltilmiş LRh-PE etiketli LC-CSH, gösterildiği gibi 96 oyuklu bir plakaya dağıtılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Son Konsantrasyon	10 kat Seyreltilmiş	100 kat Seyreltilmiş	%1 Triton X-100	Toplam
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Deterjan	Hacim
(μL/kuyu)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tablo 1: LC-CSH standart eğrisi için inkübasyon plakasının kuyucuklarına eklenen reaktiflerin hacimleri.

Çözünmüş	Tuzlu	Toplam	Eklendi	Ölçülen
LC-CSH	Hacim	Hacim	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/kuyu)	(μL/kuyu)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tablo 2: LC-CSH standart eğrisi için ölçüm plakasının kuyucuklarına eklenen reaktiflerin hacimleri.

Sonuçlar

Analitik yöntemler

Yukarıda belirtildiği gibi, HDL-SPE numune analizleri, aşağıda gösterildiği gibi farklı uygulamalar için değiştirilebilir. Araştırma örnekleriyle çalışmalar yapılmadan önce, gerekli tekniklere hakim olmak için ilk olarak LC-CSH standart eğrisi doğrulaması, tekrarlanabilirlik ve plazma konsantrasyonu testleri yapılır. İlk olarak, LC-CSH preparatlarının kalitesini değerlendirmek için LC-CSH standart eğri analizini gerçekleştir...

Tartışma

HDL-C, kardiyovasküler hastalık (KVH) riskini ve dolayısıyla lipid düşürücü veya diğer potansiyel önleyici tip tedavilere olan ihtiyacı klinik olarak değerlendirmek için kullanılan önemli bir belirleyicidir¹. HDL'nin in vitro hücresel kolesterol akışındaki işlevinin, kardiyovasküler hastalık vakasının HDL-C^7'den daha iyi bir belirleyicisi olduğu gösterilmiştir. Ne yazık ki, bu hücresel tahlil, tahlili gerçekleştirmek için yoğun zam...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokkolin	Avanti Araştırmaları	850345	14:0 PC (DMPC) Kloroform Soluiton
1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin rodamin B sülfonil) (amonyum tuzu)	Avanti Araştırmaları	810150-C	Kloroform Çözeltisi LRh-PE
Yapışkan Film	Applied Biosystems	4306311	MicroAmp Şeffaf Yapıştırıcı Film
Bay Corporation Yüksek Yoğunluklu Teflon Bant 1/2 inç x 520	Tıbbi Test Çözümleri	86732
Borosilikat cam tüpler 20 mm ve keskin; 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Santrifüj	Termo Bilimsel	Sorvall X Pro Serisi
Kloroform	Sigma-Aldrich	366927	HPLC için uygundur, ≥ 99.8%
Kolesterol Tozu	Sigma-Aldrich	C8667	3β-Hidroksi-5-kolestine, 5-Kolester-3β-ol
Glassine Tartı Kağıdı	Cole-Palmer	UX-01338-02	LC-CSH kullanımı için
Kuluçka levhası	USA Scientific	1402-9700	TempPlate 96 Kuyu Yarı Etek 0.2mL PCR Plakaları
Lipid Çıkarma Ajanı (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Ölçü levhası	Greiner bio-one	655076	Microplate, PS, 96-kuyruklu, F-BOTTOM (BACA KUYUSU), SIYAH; FLUOTRAC, MED BINDING
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Versiyon 2507
MultiFlex Pipet Uçları	Fisher Scientific	50-550-206	LC-CSH yıkamaları sırasında aspiraitant süpernatantı için
Çok etiketli plaka okuyucu	Perkin Elmer	1420-050	Victor3 Wallac1420 Çok Etiketli Sayacı
Normal Salin	Quality Biological	114-055-101	Çoklu kullanım için
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Girdap sırasında cam tüp üstünü kapatmak için
Polikabonat Erlenmeyer Matlakları	Fisher Scientific	10-041-8	%10 Triton-X çözümü için
Birikmiş insan plazması (kan türetilmiş) Li Heparin)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Referans plazma, pozitif kontrol (PC) & nbsp;
Surfact-Amps X 100	Termo Bilimsel	28314	%10 Triton X-100, damıtılmış suyla 10 kez seyreltin
Termomikser	Eppendorf	5382000023	96 kuyululu termobloklu Termomikser C
Termomikser Akıllı Blok	Eppendorf	5306000006	96-well SmartBlock
Transfer pipetleri (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Kuyunun üstündeki kabarcıkları çıkarmak için
Vortex mikser	Daigger	3030A	Üstteki cam tüp için ayakkabı