Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Otizm Spektrum Bozukluğunda Bağışıklıkla İlişkili Moleküler Biyobelirteçlerin Veriden Bağımsız Edinim Proteomiği ve Makine Öğrenmesi Kullanılarak Belirlenmesi

564 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68949

⸱

26 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Hunan Normal University, 2Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, 3Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, 4Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, enzime bağlı bir immünosorbent tahlili ile doğrulanan, erken Otizm spektrum bozukluğu teşhisi için doğru biyobelirteçler olarak sekiz bağışıklıkla ilgili proteini tanımlayan, veriden bağımsız edinim kütle spektrometrisi ve makine öğrenimi kullanan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Bu çalışma, makine öğrenimi (ML) ile birlikte veriden bağımsız edinim (DIA) kütle spektrometrisi kullanılarak otizm spektrum bozukluğu (ASD) ile ilişkili serum protein biyobelirteçlerini tanımlamak için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. DIA, numuneler arasında tekrarlanabilirliği sağlarken, düşük bolluktaki proteinler de dahil olmak üzere serum proteomunun tarafsız, yüksek çözünürlüklü profilinin çıkarılmasını sağlar. Tanısal olarak bilgilendirici protein panellerini seçmek ve model sağlamlığını artırmak için makine öğrenimi yaklaşımları uygulandı. Analiz, OSB'li 99 çocuktan ve 70 yaş uyumlu kontrolden alınan serumu içeriyordu. Yüksek bolluktaki proteinler tükendi, peptitler standartlaştırılmış sindirim ve fraksiyonlama prosedürleri kullanılarak hazırlandı ve yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresinde DIA gerçekleştirildi. Veri işleme ve miktar tayini, fonksiyonel zenginleştirme analizine tabi tutulan diferansiyel olarak eksprese edilen proteinleri tanımladı. Bağışıklıkla ilgili sekiz protein, biyobelirteç gelişimi için güçlü adaylar olarak ortaya çıktı. Bu proteinler üzerinde eğitilmiş bir lojistik regresyon modeli, çapraz doğrulamada %95.27 doğruluk, 0.9025 Kappa değeri ve 1.000 AUC elde etti. Bu bulgular, makine öğrenimi ile birlikte DIA tabanlı proteomiklerin OSB'de biyobelirteç keşfi ve daha geniş klinik araştırmalara adaptasyon için sağlam bir çerçeve olarak potansiyelini göstermektedir.

Giriş

Otizm spektrum bozukluğu (OSB), etiyoloji ve klinik prezentasyonda heterojenlik ile karakterize erken başlangıçlı bir nörogelişimsel bozukluk grubudur. Temel özellikler arasında sosyal iletişim ve etkileşimde kalıcı eksikliklerin yanı sıra kısıtlı, tekrarlayan davranışlar, ilgi alanları veya faaliyetler yer alır. Amerika Birleşik Devletleri'nde prevalans 8 yaşındaki çocuklar arasında yaklaşık %2,3 ve yetişkinler arasında yaklaşık %2,2'dir ve halk sağlığı üzerindeki etkisinin altını çizmektedir 1,2,3,4. Genetik yatkınlıklar, immün düzensizlik ve doğum öncesi çevresel maruziyetler dahil olmak üzere risk faktörleri çeşitlidir 5,6,7. Erken tanı ve müdahale, gelişimsel sonuçları önemli ölçüde iyileştirebilir, bu da objektif ve güvenilir biyobelirteçlerin tanımlanmasını OSB araştırmalarının ana odak noktası haline getirir 8,9,10. Bu protokol, bağışıklıkla ilgili proteinleri erken ASD teşhisi için potansiyel biyobelirteçler olarak tanımlamak için veriden bağımsız edinim (DIA) proteomiği ve makine öğrenimi uygulayan daha önce yayınlanmış çalışmamıza dayanmaktadır11.

Kapsamlı çabalara rağmen, şu anda klinik OSB tanısı için spesifik ve evrensel olarak doğrulanmış hiçbir biyobelirteç mevcut değildir12. Bağırsak mikrobiyomundaki değişiklikler13, yüksek interlökin-6 (IL-6)14, beyin kaynaklı nörotrofik faktördeki (BDNF)15 değişiklikler ve glutatyon16 gibi oksidatif stres belirteçleri gibi önerilen adaylar ön hazırlık niteliğindedir ve klinik kullanım için tekrarlanabilirlikten yoksundur. Proteomik, hastalığa özgü moleküler imzaları tanımlamak için umut verici bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır ve çeşitli çalışmalar, diferansiyel olarak eksprese edilen proteinleriçin farklı biyolojik örnekleri (kan, tükürük, idrar, PBMC'ler) araştırmıştır 8,17,18,19,20,21,22 . Örneğin, Bao ve ark. Olink proteomiği tarafından tanımlanan inflamatuar proteinlerin erken OSB teşhisine yardımcı olabileceğini gösterirken (17), diğer çalışmalar ise paylaşılan proteomik ve metabolik yolların OSB'nin genetik heterojenliğine rağmen sağlam biyobelirteçler sağlayabileceğini öne sürmektedir23.

DIA kütle spektrometrisi, kapsamlı ve tekrarlanabilir protein profili oluşturma özelliğiyle giderek daha fazla ilgi görmüştür. En yoğun iyonları seçici olarak parçalayan geleneksel veriye bağlı edinimin (DDA) aksine, DIA tüm öncü iyonları önceden tanımlanmış m/z pencereleri boyunca parçalar. Bu, klinik karşılaştırmalar için önemli bir avantaj olan daha derin proteom kapsamı ve büyük kohortlar arasında gelişmiş tekrarlanabilirlik sağlar14. Kıyaslama çalışmaları, DIA'nın, özellikle düşük bolluktaki proteinler için, daha düşük çalışmalar arası varyasyon14 ile DDA'dan daha fazla ölçülebilir peptit tespit ettiğini göstermektedir.

Bu ilerlemelere dayanarak, yüksek bolluktaki proteinlerin tükenmesini takiben OSB'li 99 çocuktan ve 70 kontrolden alınan serum örneklerine DIA bazlı proteomik analiz uyguladık. Bulgularımız, bağışıklıkla ilgili proteinlerin erken ASD teşhisi için moleküler belirteçler olarak potansiyelini vurgulamakta ve titiz metodoloji11 ile birleştirildiğinde biyobelirteç keşfinde DIA bazlı proteomiklerin değerini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü ve protokol Changsha Anne ve Çocuk Sağlığı Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı; Deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Otizmli çocukların DSM-5 ile tanımlanması

  1. Tıbbi geçmiş ve arka plan bilgilerinin toplanması
    1. Gelişim tarihi
      1. Dil, sosyal ve motor beceri ilerlemesi dahil olmak üzere hastanın erken gelişimi hakkında bilgi toplayın.
      2. Herhangi bir gelişimsel gecikmeyi veya anormalliği (örneğin, dil gecikmesi, sosyal etkileşimde zorluklar) not edin.
    2. Aile öyküsü
      1. Ailede otizm veya diğer nörogelişimsel bozukluklar öyküsü olup olmadığını sorun.
    3. Mevcut işlevsel seviye
      1. Hastanın öğrenme, iş, sosyal etkileşimler ve bağımsız yaşam becerileri dahil olmak üzere günlük yaşamdaki performansını değerlendirin.
  2. DSM-5 tanı kriterlerini kullanma
    1. Sosyal iletişim ve sosyal etkileşimde kalıcı eksiklikler
      1. Aşağıdaki üç ölçütten en az ikisinin karşılandığından emin olun:
        1. Sosyal-duygusal karşılıklılıktaki eksiklikler - normal göz teması, yüz ifadeleri veya beden dili eksikliği ve yaşa uygun arkadaşlıklar veya ilişkiler kurmada zorluk arayın.
        2. Sözsüz iletişimsel davranışlardaki eksiklikler - duyguları iletmek için jestleri, yüz ifadelerini veya ses tonunu kullanmadaki zorlukları ve başkalarından gelen sözsüz ipuçlarını sınırlı bir şekilde anlamayı arayın.
        3. İlişkileri geliştirme, sürdürme ve anlamadaki eksiklikler - farklı sosyal bağlamlara uyum sağlamada zorluk ve akranlara ilgi eksikliği veya yaratıcı oyunlara katılamama arayın.
    2. Kısıtlı, tekrarlayan davranış, ilgi alanları veya faaliyet kalıpları
      1. Aşağıdaki dört ölçütten en az ikisinin karşılandığından emin olun:
        1. Basmakalıp veya tekrarlayan motor hareketler (örneğin, el çırpma, vücut sallama veya tekrarlayan nesne kullanımı).
        2. Aynılıkta ısrar veya ritüelleştirilmiş davranış kalıpları - rutindeki küçük değişiklikler yerine aşırı sıkıntı arayın.
        3. Son derece kısıtlı, sabit ilgi alanları - belirli konulara veya faaliyetlere anormal derecede yoğun odaklanma arayın.
        4. Duyusal girdiye karşı hiper veya hiporeaktivite - sesler, ışıklar veya dokunma gibi duyusal uyaranlara atipik tepkiler arayın.
  3. Semptom başlangıcı ve şiddetinin değerlendirilmesi
    1. Semptomların zamanlaması - semptomların erken çocukluk döneminde (tipik olarak 3 yaşından önce) mevcut olduğunu doğrulayın, daha sonra daha belirgin hale gelseler bile.
    2. Semptomların etkisi-semptomların sosyal, mesleki veya diğer önemli işlevsellik alanlarında önemli bozulmaya neden olduğunu doğrulayın.
    3. Önem düzeyleri
      NOT: DSM-5'e göre, OSB şiddeti üç seviyeye ayrılır (Ek Tablo S1).
      1. Hastanın sadece hafif desteğe ihtiyacı varsa seviye 1 olarak sınıflandırın.
      2. Hastanın önemli bir desteğe ihtiyacı varsa (orta) seviye 2 olarak kategorize edin.
      3. Hastanın çok önemli bir desteğe ihtiyacı varsa (şiddetli) seviye 3 olarak sınıflandırın.
  4. Diğer olası nedenlerin dışlanması
    1. Tıbbi muayene Benzer semptomlara neden olabilecek diğer durumları (örn. genetik sendromlar, işitme bozuklukları, zihinsel engeller) dışlamak için gerekli tıbbi değerlendirmeleri (örn. genetik testler, beyin görüntüleme) yapın.
    2. Komorbidite değerlendirmesi: Komorbid durumların (örneğin, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu, anksiyete bozuklukları, depresyon, epilepsi vb.) varlığını değerlendirin.

2. DIA kütle spektrometresi analizi için numune hazırlama

  1. Etik uyum ve numune toplama
    1. Otizm Spektrum Bozukluğu (ASD) tanısı alan 3-7 yaş arası çocukların ebeveynlerinden veya yasal vasilerinden bilgilendirilmiş onam alın.
    2. Hastaları, otizm için Amerikan DSM-5'te belirtilen tanı kriterlerine göre 1 ila 3 arasında şiddet seviyelerine göre sınıflandırın (adım 1.3.3).
    3. Katılımcılardan serum örnekleri toplayın. Protein bozulmasını önlemek için tüm numunelerin kan alındıktan sonraki dört saat içinde işlendiğinden emin olun. İşleme sırasında numuneleri buz üzerinde tutun.
  2. Yüksek bolluktaki proteinlerin uzaklaştırılması
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek numune başına 60 μL serumdan yüksek bolluktaki proteinleri tüketmek için ticari bir kit kullanın. Kısaca, tükenme kolonunu bağlayıcı tamponla dengeleyin, serum örneğini yükleyin ve yerçekimi akışı altında kolondan geçmesine izin verin. Düşük bolluktaki protein fraksiyonunu içeren akışı toplayın.
    2. Bir BCA testi kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçün. Çözelti içi sindirimden önce tüm numuneleri 0.5-1.0 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona normalleştirin. Sonraki analiz için her numunenin en az 100 μg protein içerdiğinden emin olun.
  3. Protein sindirimi
    NOT: Protein sindirimi, Wisniewski ve ark.24 tarafından tanımlanan FASP yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi.
    1. İndirgenmiş sisteini bloke etmek için deterjan, Ditiyotreitol (DTT) ve İyodoasetamid (IAA) UA (Üre tamponu) tamponuna ekleyin.
    2. Protein süspansiyonunu tripsin ile gece boyunca 37 °C'de 50:1 oranında sindirin.
  4. Peptit Tuzdan Arındırma, Temizleme ve Yüksek pH Ters Faz Fraksiyonlama
    1. Çözünmeyen kalıntıları gidermek için peptit karışımlarını °C'de 15 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin.
    2. Adsorpsiyon kayıplarını en aza indirmek için süpernatanı (sindirilmiş peptitler içeren) yeni bir düşük bağlı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. . %100 metanol (20 μL) ile ön koşullandırma yaparak ve suda (tampon A; 20 μL) %0,1 (h/h) trifloroasetik asit (TFA) ile dengeleyerek C18 mikro kolonlarını (C18 reçinesi ile paketlenmiş) hazırlayın.
    4. Peptit örneğini mikro kolona yükleyin. Tuzları, deterjanları ve peptidik olmayan kirleticileri gidermek için kolonu 20 μL tampon A ile yıkayın.
    5. Saflaştırılmış peptitleri% 0.1 TFA içeren 20 μL% 80 asetonitril ile seyreltin.
    6. Ayrıştırılan peptitleri bir santrifüjlü vakum yoğunlaştırıcı kullanarak vakum altında kurutun. Kurutulmuş peptitleri daha fazla kullanana kadar -8 derecede saklayın.
    7. LC-MS/MS analizinden önce kurutulmuş peptitleri %0.1 formik asit içinde sulandırın.
    8. 2.4.8.Doğru ölçüm için triptofan ve tirozin kalıntılarının katkılarını hesaba katarak, bir spektrofotometre kullanarak 280 nm'de (OD280) absorbansı ölçerek peptit konsantrasyonunu ölçün.
      Yüksek pH'lı ters fazlı HPLC kullanarak peptit karışımlarını parçalara ayırmak için, 0,3 mL/dak akış hızına sahip bir HPLC sisteminde bir C18 kolonu (3,5 μm, 2,1 x 150 mm), mobil faz A: suda 10 mM amonyum format, pH 10 (amonyum hidroksit ile ayarlanmış), mobil faz B: %90 asetonitril içinde 10 mM amonyum format, pH 10 kullanın. ~60 dakika boyunca numune başına 60 fraksiyon toplamak için bir gradyan elüsyon gerçekleştirin.
    9. Fazlalığı azaltmak için her üç fraksiyonu birleştirin, böylece numune başına 20 havuzlanmış fraksiyon elde edilir. Aşağı akış analizi için havuzlanmış her fraksiyonu vakum altında kurutun .
      NOT: Elde edilen peptit fraksiyonları artık nano-LC-MS/MS analizi için hazırdır.

3. DIA kütle spektrometresi analizi için başvuru

  1. DIA kütle spektrometresi analizi
    1. Veriye Bağlı Edinim (DDA) Peptitini HPRP fraksiyonundan iRT standart peptitlerle yükseltin ve bunları kolonlu bir nano-HPLC sistemi üzerinde ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) kullanarak ayırın (75 μm x 150 mm; 2 μm C18 boncuk, 120 Å) mobil faz A ile 300 nL/dak akış hızında: suda %0.1 formik asit, mobil faz B: %95 asetonitril içinde %0,1 formik asit.
    2. Peptitleri 60 dakika boyunca aşağıdaki gibi ayarlanmış doğrusal bir tampon B gradyanı ile seyreltin: 0 - 2 dakika, %2 ila %5 tampon B arasında doğrusal gradyan; 2 - 42 dakika, %5 ila %20 tampon B arasında doğrusal gradyan; 42 - 50 dakika, %20'den %35'e kadar doğrusal gradyan tampon B; 50 - 52 dakika, %35'ten %90'a kadar doğrusal gradyan tampon B; 52 - 60 dk, tampon B %90'da tutuldu.
    3. Ayrıştırılan peptitleri referans alınan kütle spektrometresinde analiz edin. HCD parçalanması için anket taramasından (350 - 1500 m/z) en bol bulunan öncü iyonları dinamik olarak seçerek, veriye bağlı bir top20 yöntemi kullanarak MS verilerini elde edin.
    4. Cihazı peptit tanıma modu etkinken çalıştırın. Kütle kalibrasyonu için dahili standart olarak 445.120025 Da'lık bir kilit kütlesi kullanın. MS/MS taraması için m/z 200'de 70.000 ve m/z 200'de 17.500 çözünürlükte tam MS taramalarını elde edin. Maksimum enjeksiyon süresini MS için 50 ms ve MS/MS için 30 ms, normalleştirilmiş çarpışma enerjisini 28, izolasyon penceresini 1,6 Th ve dinamik dışlama süresini 30 s olarak ayarlayın.
  2. Veriden bağımsız edinim (DIA) için LC-MS/MS analizi
    1. Her numunedeki peptitleri iRT ile eşit ve ayrı ayrı artırın.
    2. Bir nano-HPLC sistemi ile birleştirilmiş dört kutuplu bir kütle spektrometresi üzerinde LC-MS/MS gerçekleştirin. LC koşulunu yukarıdaki DDA yöntemiyle aynı şekilde ayarlayın. 3E6 AGC hedefi ve 30 ms enjeksiyon süresi ile 60.000 çözünürlükte 400 ila 1.200 m/z arasında bir anket taraması gerçekleştirin. 20 m/z izolasyon penceresi ve 1E6 AGC hedefi ve 50 ms enjeksiyon süresi ile 15.000 çözünürlükte DIA MS/MS taramalarını elde edin. Normalleştirilmiş çarpışma enerjisini 30 olarak ayarlayın.
    3. Tam MS ve DIA taramalarının spektrumlarını sırasıyla profil ve centroid tiplerinde kaydedin.
  3. Sıra veritabanı araması
    1. DIA yazılımını kullanarak DDA MS verilerini analiz edin2.
    2. MS verilerini, 11 iRT peptit dizisinden oluşan proteinlerle süslenmiş UniProtKB insan veritabanına (toplam 186.532 giriş, 10/2019'da indirildi) göre arayın.
    3. Sindirim enzimi olarak tripsini seçin. Veritabanı araması için maksimum iki kaçırılan bölünme bölgesini ve öncü iyonlar için 4,5 ppm ve fragman iyonları için 20 ppm'lik kütle toleransını tanımlayın. Sisteinlerin karbamidometilasyonunu protein N-terminalinin sabit bir modifikasyonu ve asetilasyonu olarak ve Metiyonin oksidasyonunu veritabanı araması için değişken modifikasyonlar olarak tanımlayın.
    4. Veritabanı arama sonuçlarını filtreleyin ve bunları sırasıyla peptit spektrumu uyumlu ve protein seviyelerinde %<1 yanlış keşif oranı (FDR) ile dışa aktarın.
  4. Ham veri işleme gerçekleştirin
    1. DIA MS verilerini analiz edin, arama sonuçlarından spektral bir kitaplık oluşturmak için DIA yazılımı [34, 35] ile analiz edildi. Arama için varsayılan ayarları ve bekletme süresi tahmini için dinamik iRT'yi kullanın. MS/MS taraması için parazit düzeltmesinin etkinleştirildiğinden emin olun.
    2. Sonuçları peptit düzeyinde %<1 FDR ile dışa aktarın.

4. Diferansiyel protein analizi

  1. http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70'da katlama değişimi (FC) ile birlikte Student's t-testini kullanarak hipotez testi gerçekleştirin.
    1. Bulut platformunda oturum açın ve Hipotez Testi Analizi aracına gidin. Önceden işlenmiş protein miktar belirleme veri dosyasını yükleyin (örneğin, CSV veya TXT formatı).
    2. Parametre ayarlarında, istatistiksel yöntem olarak Student's t-test'i ve p değeri 0,05'< anlamlılık eşiğini seçin. Katlama değiştirme eşiğini FC > 1,5 veya FC < 1/1,5 olarak tanımlayın. Analizi Çalıştır'a tıklayın ve sonuçların oluşturulmasını bekleyin.
    3. Her protein için p değerleri, log2(FC) ve önem durumunu içeren çıktı dosyasını indirin.
      NOT: Bu çift kriterli yaklaşım, istatistiksel anlamlılığı biyolojik alaka düzeyi ile dengeleyerek diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlerin (DEP'ler) sağlam bir şekilde tanımlanmasını sağlar.

5. Sinyal yolu analizi

  1. Volkan grafiği görselleştirmesi
    1. http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63'daki araca ve ardından volkan grafiği aracı sayfasına gidin.
      1. Bölüm 4'teki DEP analiz sonuç dosyasını yükleyin.
      2. Görselleştirme parametresini yapılandırın: X ekseni: log2(Katlama Değişikliği) - değişimin yönünü gösterir; Y ekseni: -log10(p-değeri) - istatistiksel anlamlılığı yansıtır; Renk kodlaması: Kırmızı : önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş proteinler (p < 0.05 ve FC > 1.5); Mavi : önemli ölçüde aşağı regüle edilmiş proteinler (p < 0.05 ve FC < 0.667); Gri : anlamlı olmayan proteinler (P ≥ 0.05 veya 1/1.5 ≤ FC ≤ 1.5).
      3. Görüntü Oluştur'a tıklayın ve yüksek çözünürlüklü görüntüyü (PDF/SVG formatı) yayınlanmak üzere indirin.
  2. Hiyerarşik kümeleme ısı haritası
    1. Şu adresteki araca gidin http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
      1. Kümeleme ısı haritası aracına erişin.
      2. Filtrelenmiş DEP ifade matrisini karşıya yükleyin.
      3. Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Normalleştirme yöntemi: ölçek farklılıklarını ortadan kaldırmak için satır bazında Z-puanı; Mesafe metriği: Öklid mesafesi; Kümeleme yöntemi: tam bağlantı hiyerarşik kümeleme; İsteğe bağlı: Örnek gruplandırmaya bağlı olarak sütun ve/veya satır kümelemeyi etkinleştirin.
      4. Isı haritasını oluşturmak için Çalıştır'a tıklayın.
      5. Isı haritasını yayına hazır bir görüntü olarak indirin ve kaydedin.
        NOT: Isı haritası, numuneler arasındaki protein ekspresyon modellerinin benzerliğini ve farklılığını görsel olarak temsil eder.
  3. GO işlevsel açıklama ve zenginleştirme analizi
    1. Gerekli R paketlerini yükleyin ve yükleyin:
      kitaplık(clusterProfiler)
      kütüphane(org. Hs.eg.db)
      kütüphane(ggplot2)
    2. Protein kimliklerini (örneğin, Uniprot veya gen sembolleri) Entrez ID'lerine dönüştürün:
      entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = "UNIPROT", toType = "ENTREZID", OrgDb = org. Hs.eg.db)
    3. GO zenginleştirme analizi gerçekleştirin:
      go_enrich <- enrichGO(gene = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = "GİRİŞİM", ont = "BP")
    4. Nokta grafiklerini kullanarak sonuçları görselleştirin:
      1. nokta grafiği(go_enrich, gösterKategori = 20)
        Formül:
        Zengin Faktör = (a/b) / (c/d)
        Nerede:
        a = terime açıklamalı DEP sayısı;
        b = toplam DEP sayısı;
        c = terime açıklamalı arka plan proteinlerinin sayısı;
        d = toplam arka plan protein sayısı.
  4. KEGG yolu açıklaması ve zenginleştirme analizi
    1. KEGG zenginleştirme analizi yapın:
      kegg_enrich <- enrichKEGG(gen = entrez_ids$ENTREZID, organizma = "var")
    2. KEGG yolu sonuçlarını görselleştirin:
      barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
    3. Yayın biçimlendirmesi için ggplot2 kullanarak grafikleri özelleştirin.

6. ROC eğrisi analizi kullanılarak proteinlerin ilk taraması

  1. Veri hazırlama : Otizm spektrum bozukluğu (ASD) ve kontrol gruplarından tanımlanan tüm diferansiyel olarak eksprese edilen proteinleri (DEP'ler) içeren proteomik veri setini yükleyin. Veri kümesinin her iki grup için de protein ekspresyon değerlerini içerdiğinden ve ASD ve kontrol örneklerini gösteren net etiketler içerdiğinden emin olun.
  2. ROC eğrisi analizi gerçekleştirin.
    1. Her protein için Alıcı Çalışma Karakteristiği (ROC) eğrisi analizi yapmak için R'deki pROC paketini kullanın.
    2. Eğri Altındaki Alanı (AUC) hesaplayarak her proteinin ASD ve kontrol grupları arasında ayrım yapma yeteneğini değerlendirin.
      AUC = 0.5: Ayrımcılık yok (rastgele şansa eşdeğer).
      0.7 ≤ AUC < 0.8: Kabul edilebilir ayrımcılık.
      0.8 ≤ AUC < 0.9: Mükemmel ayrımcılık.
      AUC ≥ 0.9: Olağanüstü ayrımcılık.
      NOT: EAA, ASD grubundan rastgele seçilen bir bireyin, kontrol grubundan rastgele seçilen bir bireyden daha yüksek bir protein seviyesine sahip olma olasılığını temsil eder. Daha yüksek bir EAA, daha iyi tanısal performansı gösterir ve 0,8'in üzerindeki değerler genellikle biyobelirteç çalışmalarında klinik olarak anlamlı kabul edilir.
    3. Tüm proteinler için EAA değerlerini kaydedin.
  3. Aday biyobelirteçleri seçin.
    1. Aday biyobelirteçler olarak EAA'sı 0,7'den büyük olan proteinleri tanımlayın.
    2. Daha fazla analiz için aday biyobelirteçlerin listesini dışa aktarın.
  4. Sonuçları görselleştirin.
    1. En iyi performans gösteren proteinler için ROC eğrilerinin görselleştirmelerini oluşturmak için R'deki ggplot2 paketini kullanın.
    2. Netlik sağlamak için AUC değerlerini olay örgüsü açıklamalarına ekleyin.

7. Rastgele Orman kullanılarak ikincil tarama

  1. Giriş verilerini hazırlayın.
    1. Rastgele orman analizi için girdi olarak ROC analizinden elde edilen aday biyobelirteçlerin listesini kullanın.
    2. Veri kümesinin, örnekleri temsil eden satırlar ve protein ekspresyon değerlerini temsil eden sütunlarla uygun şekilde biçimlendirildiğinden emin olun.
  2. Rastgele Orman modelini eğitin.
    1. R'deki randomForest paketini kullanarak rastgele orman algoritmasını uygulayın.
    2. Ağaç sayısını (ntree) 500 olarak ve her bölmede rastgele örneklenen değişken sayısını (mtry) toplam özellik sayısının kareköküne ayarlayın.
    3. Belirli bir özellik kaldırıldığında model doğruluğundaki azalmayı ölçen MeanDecreaseAccuracy ölçümünü kullanarak özelliğin önemini değerlendirin.
    4. R'deki randomForest paketini kullanarak rastgele bir orman modeli eğitin:
      R. kütüphanesi(randomForest)
      # Örnek: protein seviyelerini kullanarak tahmin grubu (örneğin, ASD ve kontrol)
      rf_model <- rastgeleOrman(x = protein_data,
      y = as.faktör(grup),
      önem = TRUE, # Özellik önemini hesaplamak için gereklidir
      ntree = 500) # Ağaç sayısı
    5. importance() fonksiyonunu kullanarak özellik önem metriklerini ayıklayın:
      R. importance_scores <- önem(rf_model)
    6. MeanDecreaseAccuracy değerlerini alın ve azalan düzende sıralayın:
      R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "Ortalama Azaltma Doğruluğu"]
      importance_rank <- sort(mean_dec_acc, azalan = TRUE)
    7. Yerleşik varImpPlot() işlevini kullanarak özellik önemini görselleştirin:
      R. varImpPlot(rf_model, main = "Özellik Önemi (Doğrulukta Ortalama Azalma)")
      NOT: MeanDecreaseAccuracy metriği, her özelliğin modelin tahmine dayalı performansı için ne kadar önemli olduğunu yansıtır. Çıkarıldıktan sonra doğrulukta büyük bir azalma, yüksek öneme işaret eder. Bu yaklaşım, gruplar arasında en güçlü ayrımcı güce sahip proteinlere veya genlere öncelik verilmesine yardımcı olduğundan, biyobelirteç keşfi için özellikle yararlıdır.
    8. Raporlama veya aşağı akış analizi için önem puanlarını dışa aktarın:
      R. importance_table <- data.frame(
      Özellik = isimler(importance_rank),
      Ortalama Azaltma Doğruluğu = importance_rank
      )
      write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", satır.adlar = YANLIŞ)
    9. Proteinleri MeanDecreaseAccuracy puanlarına göre sıralayın.
    10. Sonraki modelleme için en önemli özellikler olarak en yüksek MeanDecreaseAccuracy puanlarına sahip ilk 15 proteini seçin.
    11. Daha fazla doğrulama için bu proteinlerin listesini dışa aktarın.
      NOT: Düşük MeanDecreaseAccuracy değerlerine sahip proteinler, çıkarılırsa model performansı üzerinde minimum etkiye sahip olabilir.
    12. Seçilen proteinlerin, özellikle de OSB'de yer alan bağışıklık fonksiyonları veya yolaklarla ilgili olanların biyolojik ilgisini vurgulayın.

8. Nihai biyobelirteç seçimi için sonuçları birleştirin.

NOT: R'nin şu paketlerle yüklendiğinden emin olun: pROC, randomForest ve ggplot2. Proteomik veri kümesinin analizden önce önceden işlendiğinden ve normalleştirildiğinden emin olun. Aday biyobelirteçlerin ve görselleştirme grafiklerinin listelerini referans için ayrı dosyalar olarak kaydedin.

  1. Bulguları bütünleştirin.
    1. Çakışan proteinleri belirlemek için ROC analizinden ve rastgele orman taramasından elde edilen sonuçlara çapraz referans verin.
    2. Her iki analizde de son derece güvenilir aday biyobelirteçler olarak görünen proteinlere öncelik verin.
    3. Seçilen biyobelirteçlerin sağlamlığını doğrulamak için bir tane dışarıda bırakma çapraz doğrulama (LOOCV) gibi ek doğrulama adımları gerçekleştirin.
    4. Kombine biyobelirteç setinin tahmin doğruluğunu değerlendirmek için lojistik regresyon modellerini kullanın.
    5. ggplot2 paketini kullanarak son biyobelirteç seti için ROC eğrileri ve hassas geri çağırma grafikleri oluşturun.
    6. Seçilen biyobelirteçlerin tanısal potansiyelini göstermek için AUC ve hassas geri çağırma değerleri gibi ölçümleri ekleyin.

9. Çift yönlü özellik seçimi

  1. Verileri hazırlayın ve modeli tanımlayın.
    1. Protein ekspresyon değerlerini ve karşılık gelen etiketleri (örneğin, ASD ve kontrol) içeren veri kümesini yükleyin. Veri kümesinin önceden işlendiğinden ve normalleştirildiğinden emin olun.
    2. Başlangıç modelini tanımlayın: Sınıflandırma için bir binom ailesi ile genelleştirilmiş doğrusal model (GLM) kullanın.
    3. Özellik seçimi sırasında modelleri karşılaştırmak için değerlendirme ölçümü olarak AIC'yi kullanın.
  2. İleri özellik seçimi gerçekleştirin.
    1. Yalnızca kesişim terimini içeren boş bir modelle başlayın.
    2. AIC'deki en büyük azalmaya bağlı olarak her seferinde bir özellik ekleyin.
    3. Her eklemeden sonra AIC değerini kaydedin. AIC'de daha fazla azalma gözlenmediğinde durun.
  3. Geriye doğru özellik seçimi gerçekleştirin.
    1. Mevcut tüm özellikleri kullanarak bir modeli eğitin.
    2. AIC'deki en küçük artışa bağlı olarak her seferinde bir özelliği kaldırın.
    3. Her kaldırma işleminden sonra AIC değerini kaydedin. AIC'de daha fazla azalma gözlenmediğinde durun.
    4. İleri ve geri adımları birleştirin.
  4. İleri ve geri seçim arasında geçiş yapın.
    1. Bir tur ileri özellik seçimi gerçekleştirin, ardından hemen bir tur geri özellik seçimi yapın. AIC'de daha fazla iyileşme gözlenene kadar bu işlemi tekrarlayın.
    2. Alternatif yaklaşım: Geriye doğru özellik seçimiyle başlayın, ardından ileriye doğru özellik seçimi gerçekleştirin. Daha önce kaldırılan unsurları modele geri eklemenin etkisini değerlendirin.
  5. Seçilen özellikleri sonlandırın.
    1. Seçilen özelliklerin son listesini ve bunlara karşılık gelen katsayıları dışa aktarın (Ek Şekil S1).

10. Bir tane dışarıda bırakma yöntemiyle lojistik regresyon kullanılarak çift yönlü özellik seçiminin çapraz doğrulanması

NOT: R'nin şu paketlerle birlikte yüklendiğinden emin olun: şapka işareti, pROC ve ggplot2. Proteomik veri seti analizden önce önceden işlenmeli ve normalleştirilmelidir. Karışıklık matrisini, ROC eğrisini ve model özetini referans için ayrı dosyalar olarak kaydedin.

  1. Verileri hazırlayın ve modeli tanımlayın.
    1. GLMSTEP/bothFitModel.txt dosyasından protein ekspresyon değerlerini ve karşılık gelen etiketleri (örneğin, ASD ve kontrol) içeren veri kümesini yükleyin. Veri kümesinin önceden işlendiğinden ve normalleştirildiğinden emin olun.
    2. Sınıflandırma için bir binom ailesine sahip genelleştirilmiş doğrusal model (GLM) kullanarak ilk modeli tanımlayın.
    3. Çapraz doğrulama sırasında model performansını değerlendirmek için doğruluk ve Kappa katsayısını değerlendirme ölçümleri olarak kullanın.
  2. Bir dışarıda bırakma çapraz doğrulaması gerçekleştirin.
    1. Bir tane dışarıda bırakma çapraz doğrulamasını (LOOCV) uygulamak için R'deki şapka paketini kullanarak çapraz doğrulamayı başlatın.
    2. Seçilen sekiz özelliği kullanarak lojistik regresyon modelini sığdırın.
    3. Çapraz doğrulamanın her yinelemesi için doğruluğu ve Kappa katsayısını kaydedin.
  3. Çapraz doğrulama sonuçlarını analiz edin.
    1. Sonuçları özetleyin.
      NOT: LOOCV sürecinin sonuçları şöyle görünecektir (bu çalışmada olduğu gibi): Genelleştirilmiş Doğrusal Model, 169 örnek, 8 öngörücü, 2 sınıf: 'A', 'B', Yeniden Örnekleme: Bir Dışarıda Bırak Çapraz Doğrulama, Örneklem büyüklüklerinin özeti: 168, 168, 168, 168, 168, 168, ... , Yeniden örnekleme sonuçları: Doğruluk Kappa 0.9526627 0.9024531.
    2. Metrikleri yorumlayın.
      NOT: Burada model 0,9527'lik bir doğruluk ve 0,9025'lik bir Kappa katsayısı elde etti, bu da tahmin edilen ve gözlemlenen sonuçlar arasında mükemmel bir uyum olduğunu gösteriyor.
      1. Modelin tahmin gücünü ölçmek için Kappa katsayısına bakın. Kappa katsayısı -1 ile 1 arasında değişir, burada 0 rastgele tahmini ve 1 mükemmel uyumu gösterir.
        NOT: Bu çalışmada 0,9025 olan Kappa değeri, modelin güçlü tahmin gücünü yansıtmaktadır.
  4. Model katsayılarını değerlendirin.
    1. Her bir özelliğin katkısını anlamak için lojistik regresyon modelinin katsayılarını inceleyin. Modelin uygunluğunu doğrulamak için sıfır sapmayı, artık sapmayı ve AIC'yi değerlendirin.
      NOT: Örneğin, bu çalışmada, 168 serbestlik derecesinde Boş sapma: 2.2928e+02, 160 serbestlik derecesinde Artık sapma: 2.2378e-07, AIC: 18, Fisher Puanlama yineleme sayısı: 25 elde ettik.
  5. Sonuçları görselleştirin.
    1. Modelin tahmine dayalı performansını görselleştirmek için bir karışıklık matrisi oluşturun.
    2. Modelin sınıflandırma performansını değerlendirmek için Alıcı Çalışma Karakteristiği (ROC) eğrisini çizin.
    3. Sonuçları yorumlayın s. Modelin sınıflandırma performans endeksini elde etmek için eğrinin altındaki alanı (AUC) hesaplayın.
      NOT: ROC eğrisi, gerçek pozitif oran ile yanlış pozitif oran arasındaki dengeyi gösterir. Eğrinin altındaki alan (AUC) 1'e yakın olmalıdır, bu da mükemmel sınıflandırma performansını gösterir. ROC eğrisi, modelin farklı eşiklerdeki gerçek pozitif oranındaki ve yanlış pozitif oranındaki değişiklikleri yansıtır. AUC değeri ne kadar büyük olursa, modelin performansı o kadar iyi olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çalışmaya OSB'li 99 çocuk ve dengeli cinsiyet dağılımına sahip 70 yaş uyumlu kontrol (3-7 yaş) dahil edildi (Ek Tablo S2). Serum, standart protokoller kullanılarak gece boyunca aç kaldıktan sonra toplandı: kan, serum ayırıcı tüplere çekildi, oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmasına izin verildi, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjlendi. Süpernatan alikotlandı ve daha sonraki işlemlere kadar -80 °C'de saklandı. Yüksek bolluktaki proteinler ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede açıklanan protokol, veriden bağımsız edinim (DIA) kütle spektrometrisi ve makine öğrenimi tekniklerini kullanarak otizm spektrum bozukluğunda (ASD) bağışıklıkla ilişkili moleküler biyobelirteçleri tanımlamak için kapsamlı bir yaklaşımın ana hatlarını çizmektedir. Protokoldeki önemli adımlar, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlarken, aynı zamanda değişiklik veya sorun gidermenin gerekli olabileceği alanları da vurgular (Tablo 2).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Merkez laboratuvarın tüm üyelerine ve bu projeye yardımcı olanlara teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler ve KimyasallarAsetonitril (HPLC Sınıfı)Fisher BilimselA18-50 Cep Telefonu
Reaktifler ve KimyasallarAmonyum bikarbonat (NH? HCO?)Sigma-Aldrich38939
Reaktifler ve KimyasallarAmonyum formatıSigma-Aldrich90265
Reaktifler ve KimyasallarSığır Serum Albümini (BSA)Thermo Fisher Bilimsel23212
Reaktifler ve KimyasallarDitiyotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
Reaktifler ve KimyasallarFormik asit (%0,1)Thermo Fisher Bilimsel28905
Reaktifler ve Kimyasallarİyodoasetamid (IAA)Sigma-AldrichI1149
Reaktifler ve KimyasallarMetanol (HPLC Sınıfı)Fisher BilimselA452-4 Serisi
Reaktifler ve KimyasallarTrifloroasetik asit (TFA)Sigma-AldrichT6508 Serisi
Reaktifler ve KimyasallarÜreSigma-AldrichU5378 Serisi
Kitler ve Özel ReaktiflerBCA Protein Test KitiThermo Fisher Bilimsel23227
Kitler ve Özel ReaktiflerC18 Sep-Pak KartuşlarıSularWAT023590
Kitler ve Özel ReaktiflerC18 StageTips (ev yapımı)3M Empore™
Kitler ve Özel ReaktiflerYüksek Bollukta Protein Tükenme KitiMillipore Sigma122642
Kitler ve Özel ReaktifleriRT Standart PeptitlerBiognosys AG
Kitler ve Özel ReaktiflerLizozim ELISA KitiWuhan Güzel Biyoteknoloji A.Ş. Ltd.
Kitler ve Özel ReaktiflerTripsin/LysC Enzim KarışımıPromegaV5071 Serisi
EkipmanMerkezkaçEppendorf Belediyesi5430R Serisi
EkipmanEasy-nLC 1200 SistemiThermo Fisher Bilimsel
EkipmanNanodrop Bir SpektrofotometreThermo Fisher BilimselND-BİR-W
EkipmanQ Exactive HF-X Kütle SpektrometresiThermo Fisher Bilimsel
EkipmanSpeedVac YoğunlaştırıcıThermo Fisher BilimselSPD131DDA
EkipmanEşleştirme Kovalı Rotor SantrifüjüÇeşitli
EkipmanWaters XBridge BEH130 SütunuSularC18, 3.5 μ m, 2.1× 150 mm
EkipmanAgilent 1260 HPLC SistemiGilent1260 Sonsuzluk II
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarBiyoiletken (R paketleri)bioconductor.org
Yazılım ve Çevrimiçi Araçlarşapka işareti (R paketi)CRANcaret_6.0-93
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarclusterProfiler (R paketi)Biyoiletken4.0.5
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarDIA-NNDIA-NN yazılımısürüm 1.8
Yazılım ve Çevrimiçi Araçlarggplot2 (R paketi)CRAN3.4.0
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarMaksimum MiktarMax Planck Enstitüsü1.6.17
Yazılım ve Çevrimiçi Araçlaromickits.comOmiKits Bulut Platformuhttp://www.omickits.com
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarpROC (R paketi)CRAN1.18.0
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarrandomForest (R paketi)CRAN4.7-1.1
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarSpektronot Pulsar XBiognosys AG17
Yazılım ve Çevrimiçi AraçlarUniProtKB İnsan Veritabanıuniprot.orgSürüm 2019_10
Diğer MalzemelerDüşük Bağlamalı Mikrosantrifüj TüpleriEppendorf Belediyesi30120094
Diğer MalzemelerSerum Ayırıcı Tüpler (SST)BD Biyolojik Bilimler367988
Diğer Malzemeler3M Empore™ C18 Diskler3 milyon

Kaynaklar

  1. Ophir, Y., Rosenberg, H., Tikochinski, R., Dalyot, S., Lipshits-Braziler, Y. Screen time and autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. JAMA Netw Open. 6 (12), e2346775(2023).
  2. He, S., Zhou, F., Tian, G., Cui, Y., Yan, Y. Effect of anesthesia during pregnancy, delivery, and childhood on autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. J Autism Dev Disord. 54 (12), 4540-4554 (2024).
  3. Alkhonezan, S. M., Alkhonezan, M. M., Alshayea, Y., Bukhari, H., Almhizai, R. Factors influencing the lives of parents of children with autism spectrum disorder in saudi arabia: A comprehensive review. Cureus. 15 (11), e48325(2023).
  4. Larson, C., Thomas, H. R., Crutcher, J., Stevens, M. C., Eigsti, I. M. Language networks in autism spectrum disorder: A systematic review of connectivity-based fmri studies. Rev J Autism Dev Disord. 12 (1), 110-137 (2025).
  5. Kodak, T., Bergmann, S. Autism spectrum disorder: Characteristics, associated behaviors, and early intervention. Pediatr Clin North Am. 67 (3), 525-535 (2020).
  6. Zwaigenbaum, L., et al. Early intervention for children with autism spectrum disorder under 3 years of age: Recommendations for practice and research. Pediatrics. 136 (Suppl 1), S60-S81 (2015).
  7. Whitehouse, A. J. O., et al. Effect of preemptive intervention on developmental outcomes among infants showing early signs of autism: A randomized clinical trial of outcomes to diagnosis. JAMA Pediatr. 175 (11), e213298(2021).
  8. Ngounou Wetie, A. G., et al. A pilot proteomic analysis of salivary biomarkers in autism spectrum disorder. Autism Res. 8 (3), 338-350 (2015).
  9. Mota, F. S. B., et al. Potential protein markers in children with autistic spectrum disorder (asd) revealed by salivary proteomics. Int J Biol Macromol. 199, 243-251 (2022).
  10. Corbett, B. A., et al. A proteomic study of serum from children with autism showing differential expression of apolipoproteins and complement proteins. Mol Psychiatry. 12 (3), 292-306 (2007).
  11. Hu, E., et al. Data independent acquisition proteomics and machine learning reveals that proteins associated with immunity are potential molecular markers for early diagnosis of autism. Clin Chim Acta. 573, 120238(2025).
  12. Shen, L., et al. Biomarkers in autism spectrum disorders: Current progress. Clin Chim Acta. 502, 41-54 (2020).
  13. Yap, C. X., et al. Autism-related dietary preferences mediate autism-gut microbiome associations. Cell. 184 (24), 5916-5931.e17 (2021).
  14. Zhang, H., et al. The use of data independent acquisition based proteomic analysis and machine learning to reveal potential biomarkers for autism spectrum disorder. J Proteomics. 278, 104872(2023).
  15. Francis, K., et al. Brain-derived neurotrophic factor (bdnf) in children with asd and their parents: A 3-year follow-up. Acta Psychiatr Scand. 137 (5), 433-441 (2018).
  16. Bjorklund, G., et al. The impact of glutathione metabolism in autism spectrum disorder. Pharmacol Res. 166, 105437(2021).
  17. Bao, X. H., et al. Olink proteomics profiling platform reveals non-invasive inflammatory related protein biomarkers in autism spectrum disorder. Front Mol Neurosci. 16, 1185021(2023).
  18. Ngounou Wetie, A. G., et al. Comparative two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of the salivary proteome of children with autism spectrum disorder. J Cell Mol Med. 19 (11), 2664-2678 (2015).
  19. Suganya, V., Geetha, A., Sujatha, S. Urine proteome analysis to evaluate protein biomarkers in children with autism. Clin Chim Acta. 450, 210-219 (2015).
  20. Shen, L., et al. Itraq-based proteomic analysis reveals protein profile in plasma from children with autism. Proteomics Clin Appl. 12 (3), e1700085(2018).
  21. Shen, L., et al. Proteomics study of peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) in autistic children. Front Cell Neurosci. 13, 105(2019).
  22. Mesleh, A., et al. Blood proteomics analysis reveals potential biomarkers and convergent dysregulated pathways in autism spectrum disorder: A pilot study. Int J Mol Sci. 24 (8), 7443(2023).
  23. Yang, J., et al. Association between plasma proteome and childhood neurodevelopmental disorders: A two-sample mendelian randomization analysis. EBioMedicine. 78, 103948(2022).
  24. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  25. Wu, Y., et al. Quantitative proteomics analysis of serum and urine with dia mass spectrometry reveals biomarkers for pediatric obstructive sleep apnea. Arch Bronconeumol. 61 (2), 67-75 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

mm n Biyobelirte lerSerum ProteomuProtein Biyobelirte leriDiferansiyel Protein EkspresyonuFonksiyonel Zenginle tirmeLojistik Regresyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.