Hücre-ACDC Kullanılarak Çok Boyutlu Mikroskopi Verilerinin Analizi

Mikroskopi, temel bilim 1,2,3'ten ilaç keşfi ve testine ^4,5 ve hücre kültürlerinden dokulara ^6,7, organoidlere ^8,9 ve tüm organizmalara¹⁰ kadar dikkate değer bir boyut aralığında araştırma ve geliştirmenin her aşamasında biyolojik keşfi hızlandırmak için temel hale gelmiştir. Ancak bu gelişmiş mikroskopi tekniklerinin iki ana dezavantajı vardır. İlk olarak, mikroskopi verileri, özellikle birden fazla boyut (örneğin, zaman ve hacimler) elde edilirken, doğası gereği büyüktür¹¹. İkinci olarak, verilerdeki zengin biyolojik bilgilerin doğru bir şekilde çıkarılması, genellikle yapay zeka modelleri üzerine inşa edilen gelişmiş görüntü analizi çerçevelerinin konuşlandırılmasını gerektirir. Bu görev deneysel biyologlar için göz korkutucu olabilir. Bu nedenle, veri işleme, işleme ve analiz adımları, yeni keşiflerin potansiyelini azaltırken bilimsel araştırmayı büyük ölçüde yavaşlatabilir. İdeal olarak, biyogörüntü analizine yönelik yazılım çerçeveleri, ham mikroskopi dosyasının işlenmesinden segmentasyon ve izlemeye ve biyolojik içgörülerin çıkarılması için aşağı akış analizine kadar analizin her adımında kullanıcıya yardımcı olmalıdır. Uygulamada, biyogörüntü analizi için yeni yazılımların hızlı bir şekilde geliştirilmesi, olumlu bir sonuç olmakla birlikte, belirli bir analiz adımına özgü veya gelişmiş programlama uzmanlığı gerektiren dağınık bir araç ortamı yaratma yan etkisine sahip olmuştur. Bu, kullanıcıyı analiz iş akışını bir araya getirme gibi zorlu bir görevle karşı karşıya bırakır ve genellikle verilerin bir sonraki araçla uyumlu hale getirmek için birden çok kez kaydedildiği, işlendiği ve dönüştürüldüğü optimumun altında işlem hatlarıyla sonuçlanır. Ek olarak, biyogörüntü analizinin geliştirilmesi tek bir programlama diline standartlaştırılmamıştır ve birçok araç ImageJ¹² veya QuPath¹³ eklentileri (Java), Napari eklentileri (Python)¹⁴ veya Python komut dosyaları olarak geliştirilmektedir. Bazı durumlarda, bu zorlu ortam, bilim adamlarının yalnızca yavaş olmakla kalmayıp aynı zamanda insan önyargısını da beraberinde getiren ve tekrarlanabilirliği engelleyen bir süreç olan manuel analizi tercih etmelerine yol açmaktadır.

Bunu çözmek için, çok boyutlu mikroskopi verilerini analiz etmek için Python'da yazılmış açık kaynaklı GUI tabanlı bir yazılım araç seti olan Cell-ACDC (Hücre Bölünme Döngüsünün Hücre Analizi)¹⁵ geliştirilmiştir. En önemlisi, Cell-ACDC her iki segmentasyon için de (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate, vb.) çok sayıda önceden uygulanmış ve otomatik olarak kurulmuş (gerektiğinde) son teknoloji modeller sağlar.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^,27,28) ve izleme (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC, vb.19,29,30,31,32,33,34). Bu modeller, açıklamalı verileri görselleştirmek ve bilgisayar destekli manuel düzeltmeler için bir çerçeve ile tamamlanmaktadır. Ek olarak, aynı çerçevede Cell-ACDC, görüntü analizi hattının her adımı için veri işleme, işleme ve kaydetme işlemlerini otomatik olarak gerçekleştiren bir modül sağlar (Şekil 1). Daha spesifik olarak, kullanıcının örnek segmentasyonu (örneğin, tek hücreler), nesne izleme, hücre durumlarının açıklamaları (örneğin, hücre döngüsü aşaması) ve mevcut floresan kanallarının analizi de dahil olmak üzere çeşitli niceleme biçimleri gerçekleştirmesini sağlar.

Cell-ACDC'nin temel güçlü yönlerinden biri, zaman noktaları arasında tutarlılık ihtiyacı nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkaran canlı hücre hızlandırılmış mikroskopi verilerinin analizidir. Tek hücrelerin otomatik segmentasyonu ve takibi için çok sayıda model mevcut olsa da, karmaşık biyolojik soruların yanıtlanması için manuel düzeltmeler hâlâ hayati önem taşıyor. Cell-ACDC, düzeltme sürecini kolaylaştırmak için özel olarak tasarlanmış bir araç paketi sunar. Manuel ayarlama sayısını en aza indirmek için akıllı algoritmaları entegre eder. Özellikle, düzeltmeler ilgili tüm gelecek ve geçmiş çerçevelere otomatik olarak yayılır ve analiz boyunca veri bütünlüğü korunur. Modüler tasarımı ve büyüyen kullanıcı tabanı göz önüne alındığında, bu yazılımın sürekli geliştirilmesi bir önceliktir ve yeni modelleri entegre etmeye ve topluluğun gelişen ihtiyaçlarını karşılamaya odaklanan sürekli çabalar vardır.

NOT: Cell-ACDC, programlama geçmişi olmayan kullanıcılar için mümkün olduğunca açık ve sezgisel olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu, esas olarak analiz iş akışını daha küçük, takip edilmesi kolay adımlara bölerek ve araç ipuçları ve bilgi düğmeleri aracılığıyla ek bilgiler sağlayarak elde edilir. Cell-ACDC, yürütme sırası genellikle sıralı olmayan çok çeşitli adımları kapsadığından, Şekil 2'de bir karar tablosu gösterilmektedir. Aşağıdaki kılavuzda belirli bir örnek ele alınacaktır. 10. ve 11. adımlar, 3. adımda indirilen sağlanan verileri kullanmak yerine diğer verileri içe aktarmak için kullanılabilir.

1. Cell-ACDC'yi Yükleme

NOT: Cell-ACDC şu anda Python Paket Dizini (PyPI) aracılığıyla bir Python paketi olarak dağıtılmaktadır ve pip install "cellacdc[torch]" komutuyla kurulabilir.

1. Miniforge'u kurun
   1. Yükleyiciyi Miniforge web sitesinden indirin (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Miniforge'u yükleyin: Windows için indirilen yükleyiciyi çalıştırın ve talimatları izleyin. Mac veya Linux için terminali açın ve aşağıdaki komutu çalıştırın:
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. Kurulum tamamlandıktan sonra, aşağıdaki talimatları izleyerek doğru terminali açın:
      1. Windows için Win + S tuşlarına basın, Miniforge İstemi yazın ve Enter tuşuna basın.
      2. Mac/Linux için: Terminal uygulamasını açın.
2. Sanal ortamı yönetin.
   1. İstemde, sanal bir ortam oluşturmak için aşağıdaki komutu yazın. Ardından komutu yürütmek için Enter tuşuna basın.
      conda oluştur -y -n acdc python=3.12
   2. Aşağıdakileri çalıştırarak ortamı etkinleştirin:
      conda acdc'yi etkinleştir
3. Kurma
   1. Ortam etkinken, aşağıdaki komutu çalıştırarak Cell-ACDC uygulamasını kurun:
      pip "cellacdc[torch]" yükle
   2. Kurulumdan sonra, yazılımın kurulumunu tamamlamasına izin vermek için Cell-ACDC -y'yi çalıştırın.

2. Çalışan Hücre-ACDC

1. Doğru terminali açın (bkz. adım 1.1.3).
2. Şu komutu çalıştırarak ortamı etkinleştirin:
   conda acdc'yi etkinleştir
3. Aşağıdaki komutu çalıştırarak Cell-ACDC'yi başlatın:
   Hücre-ACDC

3. Örnek verileri indirme

NOT: Örnek veriler Windows'ta "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8" konumuna ve MacOS ve Linux'ta "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8" konumuna indirilecektir. Karşılama kılavuzu görüntülenmezse, ana Cell-ACDC başlatıcı penceresinin menü çubuğunda Yardım > Hoş Geldiniz Kılavuzu'nu (Şekil 3B) seçin (Şekil 1), .

1. İndir ve hızlandırılmış bir örnekle test et'i seçin (Şekil 3B) .
2. İndirme bitene kadar bekleyin.
3. Verileri doğrudan GUI'ye yüklemeyi durdurmak için Hayır, teşekkürler'e tıklayın.

4. Veri hazırlama modülü

NOT: Veriler segmentasyondan önce hizalanabilir ve ilgi alanları (ROI'ler) seçilebilir. Bu adımlar isteğe bağlıdır ancak görüş alanı zaman içinde yer değiştirirse veya sırasıyla verilerin yalnızca bazı kısımları ilgi çekiciyse faydalıdır.

1. Veri hazırlama modülünü açmak için ana pencerede Veri hazırlama modülünü başlat... seçeneğine tıklayın (Şekil 1A, Veri ön işleme modülü).
2. Verileri içeren klasörü seçin.
   1. Mikroskopi verilerini yüklemek için yeni pencerenin araç çubuğundaki klasör simgesine tıklayın (Şekil 4A).
   2. Verileri içeren klasörü seçin, ardından Klasör Seç'e basarak seçimi onaylayın.
3. Hizalama işlemi için bir kanal seçin phase_contr kanalı seçmek için açılır menüyü kullanın. Ardından, seçimi onaylamak için Tamam'a basın (Şekil 4B).
4. Görüntü özelliklerini onaylamak için Tamam'a basın (Şekil 4C).
   NOT: Z-yığını verileriyle çalışıyorsanız, ancak segmentasyon için yalnızca bir dilim kullanılması gerekiyorsa, kaydırıcıyı kullanarak uygun z-dilimini seçin. Gerekirse seçimi diğer karelere uygulamak için araç çubuğundaki düğmeleri kullanın.
5. Hizalama işlemini çalıştırın.
   1. Araç çubuğunda da bulunan başlat düğmesine tıklayın (Şekil 5A).
   2. Hizalama işlemini başlatmak için Evet'e tıklayın.
      NOT: Hizalamayı atlamak için Hayır'ı tıklatın.
   3. Dolgu ile ilgili bilgilerin onaylandığını onaylamak için Tamam'a basın.
      NOT: Veri boyutuna bağlı olarak hizalama zaman alabilir.
   4. İşlem tamamlandıktan sonra hizalamayı bitirmek için Tamam'a basın.
6. Yatırım getirilerini ve arka plan yatırım getirilerini ayarlayın.
   1. Veri hazırlama GUI'sinin alt kısmındaki çerçeve seçimi kaydırıcısını kullanarak segmentasyon videosunun son karesine gidin.
   2. Otomatik olarak eklenen arka plan yatırım getirisini görüntü boyunca sürükleyerek veya elmasları kullanarak yeniden boyutlandırarak ayarlayın. Arka plan yatırım getirisinde hücre olmadığından emin olun. ROI'yi olduğu gibi bırakın (Şekil 5B).
      NOT: Ek yatırım getirisi tanımlamak için, kırpma yatırım getirisi ekle düğmesini (araç çubuğunda bulunur) tıklatın ve bunları görüntüleyicide seçin. Genellikle, yatırım getirisi mümkün olduğunca küçük olmalı ve ilgili çerçevelerdeki tüm ilgi alanlarını kapsamalıdır. Ancak, bu protokol dahilinde tekrarlanabilirliği sağlamak için değiştirilmemesi önerilir.
7. Seçilen ROI'leri yeni görüntü dosyalarına kırpmak için en soldaki Kırp düğmesini tıklatın.
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Kırpılmış görüntülere gerek yoksa pencere kapatılabilir. Tüm ROI'lerin ve arka plan ROI'lerinin koordinatları otomatik olarak kaydedilir ve daha sonra segmentasyon için kullanılabilir. Yatırım getirisi değiştirilmediyse, bu düğmeler hiçbir şey yapmaz. Kırpma seçenekleri arasında XY yönleri, z dilimleri veya belirli zaman aralıkları bulunur. Her düğme, kırpılacak boyutlarla etiketlenir.
8. Hizalanmış verileri kaydedin
   1. Pencere kapatma düğmesini kullanarak pencereyi kapatın (örneğin, Windows'ta sağ üst köşedeki X veya macOS veya Linux'ta sol üst köşedeki kırmızı nokta).
   2. Hizalanmış verileri kaydetmek için Evet, hizalanmış verileri kaydet'e basın.
   3. Onaylamak için Evet, hizalanmış verileri kaydet'i tekrar tıklatın.
9. Adım 4.7 atlanmadıysa ve yatırım getirisi değiştirilmediyse kırpılan verileri kaydedin.
   1. Kırpılan verileri kaydetmek için Evet, kırpılan verileri kaydet'i seçin.
   2. Kırpmayı kaydetmeyi onaylamak için Evet, kırp lütfen basın.
   3. Varsayılan klasör yolunu onaylamak için Tamam'ı tıklatın.
      NOT: Kırpılmamış verileri saklamak için farklı bir klasör seçin.
   4. Varsayılan yolun daha önce kullanılıp kullanılmadığını onaylamak için Evet, üzerine yaz'ı seçin.
   5. İşlem tamamlandıktan sonra onaylamak için Tamam'a basın.

5. Segmentasyon için en iyi modeli ve parametreleri bulma

NOT: Cell-ACDC, en iyi segmentasyon parametrelerini bulmak için gerçek zamanlı geri bildirime sahip bir GUI sunar (Şekil 6). Genel olarak, bu modeller, her biri kendi belgelerine sahip üçüncü taraflarca sağlanır. En iyi segmentasyon modelini ve en uygun parametrelerini belirlemek kullanıcının sorumluluğundadır ve kullanıcılar daha fazla bilgi için denedikleri ilgili modelin belgelerini kontrol etmelidir.

1. Ana pencerede GUI'yi Başlat... seçeneğine tıklayın (Şekil 1A, Modülü görselleştirin ve düzeltin).
2. Örnek verileri yükleyin.
   1. Klasör seçim menüsünü açmak için yeni pencerenin araç çubuğundaki klasör simgesine tıklayın.
   2. Verileri içeren klasörü seçin, ardından seçimi onaylamak için Klasör Seç'e basın.
3. Görselleştirme için bir kanal seçin. Segmentasyon için phase_contr kanalı seçmek için açılır menüyü kullanın, ardından onaylamak için Tamam'ı seçin.
4. Verileri yüklemeyi bitirin.
   1. Varsayılan segmentasyon maskesi adını onaylamak için Tamam'a basın.
   2. Görüntü özelliklerini onaylamak için Yüklenen Konumlar için Tamam'a tıklayın.
   3. Ek floresan verilerinin yüklenmesini önlemek için Hayır'ı seçin.
5. Mod seçicide (Şekil 6, "Mod seçici"), Segmentasyon ve İzleme modunu seçin.
6. En iyi ön işleme ayarlarını bulun.
   1. Şu yöne rotayı ayarla Görüntü > Ön işleme... özel ön işleme penceresini açmak için üst menü çubuğunda (Şekil 7A).
   2. Açılır menüden Sıcak Pikselleri Kaldır'ı veya istediğiniz başka bir ön işleme adımını seçin.
   3. Bir adımın ayarlarını başlatmak ve değiştirmek için dişli simgesini kullanın. Adım ve kullanılabilir parametreler hakkındaki bilgileri görüntülemek için bilgi düğmesini kullanın. Ayarları değiştirmeden bırakın.
   4. Bir adım daha eklemek için artı simgesini kullanın.
   5. Yoğunlukları Yeniden Ölçeklendir'i seçin ve 5.6.1 ve 5.6.2 adımlarını tekrarlayarak ayarları onaylayın.
   6. Adımların etkilerini gerçek zamanlı olarak görmek için önizleme onay kutusunu işaretleyin.
   7. Tüm çerçevelere uygula'yı tıklatın (Şekil 7B).
   8. Kaydetme işlemini başlatmak için Önceden işlenmiş verileri kaydet'e basın.
   9. Varsayılan adı onaylamak için Tamam'a basın.
   10. Ön işleme tarifi penceresini kapatın.
7. En iyi segmentasyon ayarlarını bulun.
   1. Üst şeritte Segment > Segment görüntülenen çerçeveyi seçin, ardından YeaZ_v2'ı seçin (Şekil 8A).
   2. İstenirse YeaZ_v2 indirmek için Tamam'a basın.
      NOT: İndirme işlemi birkaç dakika sürebilir. İlerleme durumu konsol penceresinde görüntülenir. Yanıt vermese bile indirme sırasında GUI'yi kapatmayın.
   3. Varsayılan parametreleri değiştirmeden bırakın.
      NOT: Çoğu parametrede ayrıntılı rehberlik sağlayan bilgi düğmeleri bulunur.
   4. İşlem sonrası segmentasyon parametrelerini kontrol ederek son işlemeyi etkinleştirin (Şekil 8B).
   5. Tamam'a tıklayarak parametreleri kabul edin.
      NOT: Segmentasyon, modelin karmaşıklığına, görüntü boyutuna ve bilgisayar özelliklerine bağlı olarak biraz zaman alabilir. Özellikle Cellpose sürüm 4 çok yavaş olabilir.
   6. Otomatik segmentasyonu etkinleştirme hakkında soru sorulursa Hayır'ı seçin.
   7. Segmentasyonun iyi çalıştığını doğrulayın.
   8. Segmentasyon parametrelerini yeniden açmak için 5.7.1 adımını tekrarlayın.
   9. Segmentasyon sonuçları beklendiği gibiyse, Tüm parametreleri tarif dosyasına kaydet'e basın. Aksi takdirde, segmentasyon parametrelerini değiştirin ve 5.7.4 ile 5.7.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
   10. Segmentasyon tarifine test adını vermek için metin girişini kullanın.
   11. Adı kabul etmek için Tamam'ı tıklatın.
   12. İş akışını kaydetmeyi bitirmek için Tamam'a basın.
   13. Parametre seçim ekranını kapatın.
8. GUI penceresini kapatma
   1. GUI penceresini kapatın.
   2. Kapatmadan önce kaydetmemek için Hayır'a basın.

6. Segmentlere ayırma ve izleme (toplu işleme)

1. Segmentasyon modülünü başlat... ana pencerede tıklayın (Şekil 1A, "Segment ve izleme" modülü).
   1. Örnek verileri seçin. Verileri içeren klasörü seçmek için Cell-ACDC'nin klasör seçicisini kullanın, ardından seçimi onaylamak için Klasör Seç'e basın.
2. Toplu işleme için parametreleri seçin.
   1. Segmentasyon için kanal olarak phase_contr_preprocessed kanalı seçin. Seçimi onaylamak için Tamam'a basın.
      NOT: Bazı modeller giriş olarak ek bir kanal kullanır. Bu kanal daha sonra diğer segmentasyon parametreleri ayarlanırken seçilebilir.
   2. Tamam'a tıklayarak görüntü özelliklerini onaylayın.
3. Segmentasyon modeli ayarlarını yapın.
   1. Segmentasyon için kullanılması gereken model olarak YeaZ_v2'i seçin, ardından Tamam'a tıklayarak seçimi onaylayın.
   2. Önceden kaydedilmiş tarifi yüklemek için Kaydedilmiş tarifi yükle... düğmesine tıklayın.
   3. Listeden segmentation_recipe_test.ini seçin, ardından Tamam'ı tıklatarak seçimi onaylayın.
   4. Tamam'a basarak başarılı yükleme mesajını kapatın.
   5. Tamam'ı seçerek parametreleri onaylayın.
4. Diğer segmentasyon ayarlarını onaylayın.
   1. Segmentasyon dosyasının varsayılan adını kabul etmek için Tamam'a basın.
   2. Görüntünün tamamının bölümlere ayrılması gerektiğini onaylamak için Hayır'ı seçin.
   3. Durdurma çerçevesini timelapse'ın son çerçevesi olarak ayarlamak için Tamam'ı seçin.
5. İzleme ayarlarını yapın. Kullanılacak izleme yöntemi olarak YeaZ'yi seçin, ardından Tamam'a basarak seçimi onaylayın.
6. Segmentasyon ve izleme yordamını çalıştırın.
   1. Segmentasyon ve izleme işlem hattını çalıştırmak için Şimdi çalıştır'a tıklayın.
      NOT: Bu, görüntü boyutuna, model karmaşıklığına ve bilgisayar özelliklerine bağlı olarak birkaç saat sürebilir. Test çalışmalarında, test verilerinin YeaZ_v2 ile segmentasyonu, GPU'su olmayan bir cihazda yaklaşık 2 dakika sürdü.
   2. Segmentasyonu tamamlamak için Tamam'ı tıklayın.

7. Segmentasyon ve izleme hatalarının düzeltilmesi

NOT: Genel olarak, bir öncekine kıyasla geçerli çerçevede eksik olan hücreler sarı bir kontur ve kimlik ile gösterilir. Yeni algılanan hücreler kırmızı bir kimlik ve kalın bir konturla görünür. Kayıp olarak kabul edilen hücreler yeşil bir kontur ve kimlikle gösterilir.

1. Ana pencerede GUI'yi Başlat... seçeneğine tıklayın (Şekil 1A, "Görselleştir ve düzelt" modülü).
2. Örnek verileri yükleyin.
   1. Yeni pencerenin araç çubuğundaki klasör simgesine tıklayın.
   2. Verileri içeren klasörü seçin, ardından seçimi onaylamak için Klasör Seç'e basın.
3. Görselleştirme için bir kanal seçin. Kanal phase_contr_preprocessed seçmek için açılır menüyü kullanın, ardından onaylamak için Tamam'ı seçin.
4. Segmentasyon maskesi adını seçin. Önceki adımda oluşturulan segmentasyon dosyasını yüklemek için Seçileni yükle'yi seçin.
5. Veri yükleme işlemini tamamlayın.
   1. Yüklenen Pozisyonlar için Tamam'a tıklayarak görüntü özelliklerini onaylayın.
   2. Ek floresan verilerinin yüklenmesini önlemek için Hayır'ı seçin.
6. Segmentasyon ve İzleme modunu seçmek için mod seçiciyi (Şekil 6, "Mod seçici") kullanın.
   NOT: Görüntülenen ek açıklamaları değiştirmek için GUI'nin altındaki onay kutularını kullanın. Sol ve sağ görüntüler farklı açıklamalar görüntüleyebilir.
7. Gerçek zamanlı bir izleyici seçin. Menü çubuğunda (Şekil 6, "Menü çubuğu"), İzleme > Gerçek zamanlı izleme algoritmasını seç'e gidin ve istediğiniz gerçek zamanlı izleyiciyi seçin. Tomurcuklanan maya için Cell-ACDC veya Cell-ACDC 2 adımını veya diğer organizmalar için Cell-ACDC simetrik bölünmesini kullanın.
8. Segmentasyonu ve izlemeyi düzeltin.
   1. Çerçeveler arasında gezinmek için sol ve sağ ok tuşlarını kullanın.
   2. Kare 10'a gidin.
   3. Manuel tomurcuk ayırma aletini etkinleştirmek için S tuşuna basın.
   4. Hücre 1'in segmentasyon maskesini otomatik olarak bölmek için sağ tıklamayı kullanın.
   5. 14. kareye gidin.
   6. Fırçayı etkinleştirmek için B tuşuna basın.
   7. Farenin sol düğmesini kullanarak tomurcuk için eksik segmentasyon maskesini çizin.
   8. Segmentasyon ve izleme hatalarını düzeltirken sonraki kareleri gözden geçirin. Mevcut araçları kullanın (Şekil 6, "Araç çubuğunu düzenle"). En azından 42. kareye kadar düzeltin.
      NOT: Çoğu araçta, işlevlerini açıklayan bir araç ipucu bulunur. Araç ipucunu görüntülemek için bir aracın üzerine gelin.

8. Hücre döngüsü açıklamaları

NOT: Bu adıma yalnızca tüm ilgilenilen çerçeveler için segmentasyon ve izleme düzeltmelerini tamamladıktan sonra geçin. Hücre bölünme türüne (simetrik, örneğin memeli hücreleri veya asimetrik, örneğin tomurcuklanan maya) bağlı olarak doğru açıklama modunu kullanın. Örnek veriler için "Asimetrik olarak bölünen hücreler", adım 8.1'e bakın. Adım 8.2, simetrik bölme hücreleri için genel iş akışını açıklar.

1. Asimetrik olarak bölünen hücreler
   NOT: Tomurcuklanan maya gibi organizmalar için tomurcuklar annelere atanabilir. Her iki nesnenin de aynı çerçevede bulunması gerekir. Varsayılan olarak, tomurcuklanan maya için ek açıklamalara dayalı olarak beklenen hücre döngüsü aşaması gösterilir. Tomurcukların hücre döngüsü aşaması kırmızı renkte, diğer tüm nesnelerinki ise beyaz renkte görüntülenir. Anneler tomurcuklarına kesikli, sarı bir çizgi ile bağlanır.
   1. Mod seçiciyi kullanarak Hücre döngüsü analizini etkinleştirin (Şekil 6, "Mod seçici").
   2. İstendiğinde Evet, kare 1'e git'i seçin.
   3. Çerçeveler arasında gezinmek için sol ve sağ ok tuşlarını kullanın.
   4. 41. kareye gidin. İstendiğinde Hücre Döngüsü Ek Açıklama tablosunun başlatılmasını kabul etmek için Tamam'ı tıklatın.
   5. Bağlantıyı ayırmak ve hücre bölünmesi olayına açıklama eklemek için Hücre 1'e veya tomurcuğuna sağ tıklayın.
   6. İlgili tüm kareler görüntülenene kadar devam edin. Mevcut araçları kullanarak otomatik ana tomurcuk atamalarındaki hataları düzeltin (Şekil 6, "Araç çubuğunu düzenle").
   7. Mevcut araçlar
      NOT: Anne-Tomurcuk İlişkilendirmesini Kes/Yeniden Bağla aracı dışındaki bu araçlar, özelleştirilebilir bir kısayol kullanılarak veya araç çubuğundaki ilgili düğmelere basılarak etkinleştirilebilir.
      1. Tomurcuğu Anneye Ata (A): Tomurcuğu Anneye Ata aracını etkinleştirin. Tomurcuk üzerinde farenin sağ düğmesini basılı tutun. İlgili ana hücreye sürükleyin ve fare düğmesini bırakın.
         NOT: Tomurcukların annelere otomatik olarak atanması yanlış olduğunda bu aracı kullanın.
      2. Bilinmeyen Geçmişe Açıklama Ekle (U): Bilinmeyen Geçmişe Açıklama Ekle aracını etkinleştirin. Bilinmeyen bir geçmişe sahip olarak açıklama eklenmesi gereken hücreye tıklamak için farenin sağ düğmesini kullanın.
         NOT: Bilinmeyen bir geçmişe sahip hücrelere manuel olarak açıklama eklemek için bu aracı kullanın ve otomatik çıkarımın yetersiz olduğu durumlarda soy belirsizliklerini düzeltmeye yardımcı olun.
      3. Hücre döngüsü açıklamasını yeniden başlatma
         NOT: Hücre döngüsü açıklama algoritmasını geçerli kareden itibaren yeniden çalıştırmak için bu seçeneği kullanın. Bu, segmentasyon/izleme verilerinde yapılan son düzeltmeler veya güncellemelerle tutarlılık sağlar.
      4. Anne-tomurcuk ilişkisini kesme/yeniden bağlama: Başka bir aracın seçilmediğinden emin olun. İlişkilendirmeyi kesmek için mevcut bir anne-tomurcuk çiftine sağ tıklayın veya bağlantıyı yeniden kurmak için tekrar sağ tıklayın.
2. Simetrik bölünen hücreler
   NOT: Bu özellik beta testi aşamasındadır ve yakında resmi olarak yayınlanacaktır. Tek bir ana hücreye iki veya daha fazla yavru hücre atamak mümkündür. Potansiyel ana hücreler, önceki çerçevede bulunan ancak mevcut çerçevede bulunmayan hücrelerdir, potansiyel yavru hücreler ise mevcut çerçevede yeni ortaya çıkan hücrelerdir.
   1. Normal bölümü etkinleştirin: Mod seçiciyi kullanarak soy ağacı (Şekil 6, "Mod seçici").
   2. İstendiğinde Evet, kare 1'e git'i seçin.
   3. Çerçeveler arasında gezinmek için sol ve sağ ok tuşlarını kullanın.
   4. Otomatik anne-kız atamalarındaki hataları mevcut araçlarla düzeltin (Şekil 6, "Araç çubuğunu düzenle").
   5. İstendiğinde değişiklikleri yay tıklatarak yayın.
   6. Mevcut araçlar
      NOT: Bu araçlar, kısayol veya araç çubuğundaki ilgili düğmeler kullanılarak etkinleştirilebilir.
      1. Yeni bir Hücre Kimliği için anneyi bulun (F): Yeni Bir Hücre Kimliği için Anne Bul aracını etkinleştirin. Aday ana hücreler arasında geçiş yapmak için yeni hücreye sağ tıklayın. Adaylar arasında geriye doğru geçiş yapmak için Shift + Sağ tıklayın .
         NOT: Bir yavru hücrenin annesini atamak veya değiştirmek için bu aracı kullanın.
      2. Bilinmeyen anneyi ayarla (U): Bilinmeyen Anneyi Ayarla aracını etkinleştirin. Annesi bilinmeyen hücreye sağ tıklayın .
         NOT: Bir hücrenin annesini manuel olarak bilinmeyen olarak belirlemek için bu aracı kullanın.

9. Verileri kaydetme

1. Üst şeritte Dosya > Kaydet'e gidin.
2. İstediğiniz ölçümleri seçmek için Ölçümleri ayarla... öğesine tıklayın.
3. mCitrine metriklerinin veya istediğiniz diğer ölçümlerin yanındaki onay kutusunu işaretleyin.
4. Onaylamak için Tamam'a tıklayın.
5. Ölçümleri kaydetmek için Evet'e tıklayın.
6. Ölçümlerin kaydedilmesi gereken çerçeveyi onaylamak için Tamam'ı tıklatın.
7. Veri birleştirme hakkında sorulduğunda Hayır'ı tıklatın.

10. Veri yapısını oluşturun

NOT: Bu bölüm, mikroskopi verilerinin segmentasyon ve izleme için hazırlanmasını tartışmaktadır. Bu, "Örnek verileri indirme" bölümünde indirilen tanıtım verileri kullanıldığında atlanabilir. Oluşturulacak veri yapısı Şekil 9'da özetlenmiştir.

1. Mikroskopi dosyasını/dosyalarını boş bir klasöre yerleştirin.
   NOT: .czi (Zeiss), .lif (Leica) ve .nd2 (Nikon) gibi mikroskopi formatlarının yanı sıra tek .tif ve .png dosyaları desteklenir.
2. 0 modülüne tıklayın . Veri yapısı oluşturun... ana pencerede (Şekil 1A, "Veri yapısı oluştur" modülü).
3. BioIO veya Fiji Makrosu'nu seçin.
   1. Windows kullanılıyorsa, BioIO Kullan'a tıklayın, MacOS ve Linux kullanıcıları için ise Fiji Makrosu Kullan'ı seçin.
      NOT: Aşağıda, Windows'un kullanıldığı varsayılmaktadır.
   2. BioIO'yu yüklemeniz istenirse, yüklemek için Tamam'a basın.
   3. Mikroskopi dosya düzenlemesini seçin. Açılır menüyü kullanarak mikroskopi dosyaları düzenlemesiyle eşleşen seçeneği seçin, ardından onaylamak için Tamam'a basın.
4. Kaynak ve hedef klasörleri ve veri yükleme stratejisini seçin
   1. Dosyaların boş bir klasörde olduğunu onaylamak için Bitti'ye basın.
   2. Dosyayı/dosyaları içeren klasörü seçmek için Cell-ACDC'nin klasör seçicisini kullanın.
   3. Bir klasör seçmek için Klasör Seç'e basın.
   4. Hedef klasörle aynı klasörü seçmek için Klasör Seç'e tekrar basın.
      NOT: Ham mikroskopi dosyası silinmez.
   5. Evet, tüm pozisyonu bir kerede yükle'yi seçin.
5. Bir BioIO alt paketi yüklemeniz istenirse, yüklemek için Tamam'a basın.
6. Giriş dosyası için meta verileri ayarlayın.
   1. Meta verileri düzeltin.
      NOT: Kanal adı alanlarının yanındaki küçük göz simgesine tıklayarak "Boyut sırası"nı iki kez kontrol edin. Ham dosyadan yüklenemeyen diğer meta veriler vurgulanır.
   2. Meta verileri onaylamak için Tamam'a basın.
   3. Boyutların sırasını onaylamak için Evet'e basın.
7. İşlemin bitmesini bekleyin.
8. İşlem bittiğinde pencereyi kapatmak için Evet'e basın.
   NOT: Veri yapısının oluşturulması, veri boyutuna bağlı olarak saatler sürebilir.

11. Veri ön işleme yardımcı programları

NOT: Analize geçmeden önce görüntüleri işlemek için çeşitli seçenekler ana pencerede mevcuttur. Bu araçlara erişmek için, ana pencerenin menü çubuğundaki Yardımcı Programlar açılır menüsüne gidin (Şekil 1B, "Yardımcı Programlar"), Görüntü ön işlemenin üzerine gelin ve ardından kullanılması gereken seçeneği seçin. İki örnek:

1. Kanalları birleştir: İki veya daha fazla görüntü kanalını birleştirmek için bunu kullanın.
   NOT: Örneğin, iki floresan kanalının ortalaması alınabilir.
2. Görüntüleri yeniden boyutlandırın: Çok büyük görüntü veri kümelerinin boyutunu küçültmek için bunu kullanın.
   NOT: Bu, işlem süresini önemli ölçüde hızlandırabilir ve çoğu durumda segmentasyon kalitesi üzerinde çok az etkisi vardır veya hiç etkisi yoktur.

12. Sorun Giderme

1. Cell-ACDC kilitlenirse, Sorunlar sekmesine gidip yeşil Yeni sorun düğmesine tıklayarak Cell-ACDC GitHub sayfasında bir hata raporu oluşturun. Sorunu teşhis etmek ve çözmek için gereken tüm ilgili ayrıntıları eklemek için sağlanan şablonu izleyin. Alternatif olarak, #cell-acdc etiketini kullanarak image.sc forumda yardım istemekten veya ilgili yazarlardan biriyle iletişime geçmekten çekinmeyin. Çoğu durumda, özellikle bir paketi yükledikten sonra, yazılımı yeniden başlatmak sorunu çözebilir.
2. Cell-ACDC donarsa veya yanıt vermezse, ilerleme güncellemeleri için konsolu kontrol edin. Özellikle Cellpose sürüm 4 gibi hesaplama açısından yoğun modeller kullanıldığında veya büyük veri kümeleri işlenirken uzun segmentasyon süreleri normaldir. Cell-ACDC yanıt vermiyorsa, daha fazla talimat için adım 12.1'e bakın.
3. Otomatik segmentasyon yanlış bir şekilde arka plan içeriyorsa, bir ön işleme adımının arka planı aşırı yumuşatıp yumuşatmadığını kontrol edin. Birçok segmentasyon modeli ham (önceden işlenmemiş) görüntüler üzerinde eğitilir ve arka planda yeterli doku olmadığında düşük performans gösterebilir.

Tümör sferoidlerinde 3 boyutlu nükleer hacim ölçümü

Otomatik 3D mikroskopi (z-yığınları), bilim adamlarının organoidler gibi karmaşık çok hücreli sistemleri görselleştirmesine olanak tanır. Morfolojik ve floresan sinyal özelliklerini tek hücre düzeyinde ölçmek için genellikle 3 boyutlu hücre segmentasyonu gerekir. Aşağıdaki örnek, Cell-ACDC'nin nükleer boyama kanalından binlerce hücre içeren organoidlerdeki çekirdekleri nasıl bölümlere ayırabildiğini ve hacimlerini nasıl ölçebildiğini göstermektedir (Ref.9'dan alınan veriler). Segmentasyon, Ref.9'da eğitilen ve yayınlanan özel bir Cellpose modeli kullanılarak gerçekleştirildi. Eğitilen Cellpose modeli, Cellpose v2 için model parametreleri seçilirken GUI'de ağırlıklar dosya yolu sağlanarak doğrudan Cell-ACDC'de kullanılabilir. Segmentasyon, tüm görüntüleri toplu olarak işlemek için Cell-ACDC'nin ikinci modülü kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 1A, "Segment ve izleme" modülü). Daha sonra sonuç üçüncü modül GUI'sinde görselleştirildi (Şekil 1A, "Görselleştir ve düzelt" modülü). Bu modül, birden fazla açıklama seçeneğiyle (örneğin, konturlar, üst üste bindirilmiş segmentasyon maskeleri veya metin kimlikleri) binlerce tek nesneyi görselleştirmek için optimize edilmiştir. 3D maskelerden alınan ölçümler hesaplandıktan sonra, mevcut tüm ölçümler doğrudan GUI'de belgelendi. Bunlara üst menü çubuğuna (Şekil 6, "Menü çubuğu") gidilerek, Ölçümler menüsü seçilerek ve ardından Ölçümleri ayarla...'ya gidilerek erişilebilir. Açılır iletişim kutusu, kullanıcıların bilgi düğmelerinden ölçüme özel bilgiler almasına ve hangi ölçümlerin kaydedileceğini seçmesine olanak tanır. Şekil 10'daki temsili sonuçlar için, nesnedeki toplam voksellerin piksel boyutunun karesi ve voksel derinliği ile çarpılmasıyla hesaplanan her nesnenin hacmi olan "cell_vol_fl_3D" kullanılmıştır. Bu özellikler ya mikroskopi ham dosyasından otomatik olarak çıkarılır ya da kullanıcı tarafından sağlanır. Bu GUI'den ölçümlerin hesaplanması, ham görüntülerin yüklenmesini gerektirir. Bu nedenle, süreci kolaylaştırmak ve toplu işlemeyi etkinleştirmek için, ölçümler Ölçümler alt menüsüne ve ardından bir veya daha fazla deney için ölçümleri hesaplayarak Yardımcı Programlar menüsünden (Şekil 1B, "Yardımcı Programlar") da hesaplanabilir. Son olarak, nükleer hacim dağılımı temsili bir sonuç olarak çizildi (Şekil 10). Bu analiz, muhtemelen segmentasyon artefaktlarından dolayı küçük çekirdeklerin önemli bir kısmını ortaya koymaktadır. Segmentasyon maskesinden küçük nesneler filtrelenerek kolayca çıkarılabilirler. Aynı zamanda, çok büyük çekirdekler, segmentasyon sırasında birleştirilmiş çekirdeklerden kaynaklanıyor olabilir. Artefaktları tanımlamak ve hücre boyutu hakkında ek biyolojik bilgiler çıkarmak için her zaman nesnelerin (örneğin, tek hücreler) hacim dağılımının çizilmesi önerilir.

Hızlandırılmış mikroskopi verilerinin ölçülmesi

Hızlandırılmış mikroskopi ile hücresel dinamikler tek hücre düzeyinde doğrudan gözlemlenebilir. Hücre segmentasyonunun yanı sıra, zamansal dinamiklerin çıkarılması, hücre izleme ve hücre soyağacı açıklaması dahil olmak üzere ek analizler gerektirir. Bu analiz aşamalarının birbirine bağımlılığı nedeniyle, işlem hattının başlarında ortaya çıkan hatalar sonraki adımlara yayılabilir. Sonuç olarak, segmentasyon, izleme ve açıklama hatalarının sürekli görselleştirilmesi ve düzeltilmesi gereklidir. Aşağıdakiler, Cell-ACDC'nin bu görevlerin üstesinden gelmek için uygun olduğunu göstermektedir. İki farklı model organizmanın iki veri seti seçildi: 1) tomurcuklanan maya (iki histon H2B proteininin, Htb1 ve Htb2'nin mCitrin ile etiketlendiği Ref.35'ten DCY001-1 suşu) ve 2) fare embriyonik kök hücreleri (mESC'ler, Ref.22'den alınan veriler).

Bu iki veri kümesi, Cell-ACDC'de bulunan iki açıklama modunu vurgular: asimetrik ve simetrik (yani, simetrik sitokinez veya "normal") hücre bölünmesi. Bölünme modu farklı olduğundan, iki organizma farklı bir izleme ve açıklama çerçevesi gerektirir.

Asimetrik bölünmede, ana hücre büyüyen ve sonunda ayrılarak yavru hücre haline gelen bir tomurcuk oluşturur. Bölünmeden sonra, ana hücre orijinal hücre kimliğini korur ve nesil sayısı bir artarken, yavru hücreye yeni bir hücre kimliği atanır ve nesil numarası bir olarak ayarlanır. Tomurcuklanma aşaması, hücre döngüsünün S/G2/M aşamalarına karşılık gelir ve Cell-ACDC'de bu şekilde açıklanır. Bu açıklama seçenekleri, tomurcuklanan mayadaki hücre döngüsüyle ilgili tipik biyolojik soruların yanıtlanmasına yardımcı olur.

"Simetrik" bölünme durumunda (örneğin, memeli hücreleri), ana hücre iki yavru hücreye bölünür. Ana hücre, yani kimliği, bölünme üzerine kaybolur ve iki yavru hücre yeni kimlikler alır. Ek olarak, yavru hücrelerin nesil sayısı ana hücreye göre bir artar. Cell-ACDC ayrıca ana kimliği, kök kimliğini (bir soyun başlangıcındaki orijinal ata hücresi) ve kardeş kimliğini de takip eder.

Her iki açıklama modu için de, düzeltmenin otomatik olarak geçmiş ve gelecekteki tüm ilgili zaman noktalarına yayıldığı açıklama hatalarını düzeltmek için yenilikçi bir çerçeve geliştirildi. Görselleştirme, açıklama ve düzeltme üçüncü modül GUI'sinde gerçekleştirildi (Şekil 1A, "Görselleştir ve düzelt" modülü ve Şekil 6). Veri kümesi 1'deki hücreleri segmentlere ayırmak ve izlemek için faz kontrast kanalına YeaZ_v226 modeli uygulanırken, nükleer (histon) kanal için StarDist25 modeli kullanıldı. Ardından, yardımcı programı kullanarak İzleme ve köken > Hücre altı nesneleri izleyin ve/veya sayın (Şekil 1B, Yardımcı Programlar menü çubuğu), Cell-ACDC her çekirdeğe karşılık gelen hücrenin Hücre Kimliğini atayarak hücre ve çekirdek maskelerinden oluşturulan tablolar arasında tutarlılık sağladı.

Veri kümesi 2 için DeepSea22 segmentasyon modeli kullanıldı. Her üç model de Cell-ACDC'de halihazırda mevcut olup, çeşitli segmentasyon modellerini yazılıma entegre etmenin avantajını göstermektedir.

Segmentasyon ve izleme hataları düzeltildikten sonra, hücre soyağaçlarına açıklama eklendi, sayısal özellikler hesaplandı ve aşağı akış analizi gerçekleştirildi. Veri kümesi 1 için, sütun TaYFP_amount_autoBkgr ve bölümlere ayrılmış çekirdek sayısı (Şekil 11A) zamana karşı çizildi. "TaYFP" nükleer kanalın adıdır. "amount_autoBkgr", epifloresan görüntülerden ekstrakte edilen toplam hücresel protein miktarının bir göstergesidir36. Her hücre maskesindeki ortalama floresan yoğunluğu ile arka plan medyanı arasındaki farkın hücre alanıyla (piksel cinsinden) çarpımı olarak hesaplanır. Burada, arka plan medyanı, hücre olarak bölümlere ayrılmayan tüm piksellerden hesaplanır. Beklendiği gibi, H2B miktarı tomurcuk çıkışında artmaya başlar (Şekil 11A-ii) ve nükleer bölünmeden önce sabit bir değere ulaşır (Şekil 11A-iii). Histon proteinlerinin miktarının hücre döngüsüne bağlı olması beklendiğinden, bu histon protein homeostazında önemli bir kalite kontrolüdür. Ek olarak, zaman içindeki çekirdek sayısının çizilmesi, histon protein miktarlarının kabaca nükleer bölünme civarında maksimuma ulaştığını doğrular.

Veri kümesi 2 için, hücre bölünmesi geçiren seçilen bir hücre için zaman içindeki hücre alanı çizildi. Beklendiği gibi, hücre alanı maksimum değere ulaşana kadar artar (Şekil 11B-i). Daha sonra hücre büzüldükçe hücre bölünmesine kadar azalır (Şekil 11B-ii). Son olarak, iki yavru hücre için döngü yeniden başlar. Bu, önerilen başka bir analizdir, çünkü hücre döngüsü boyunca hücre boyutu değişikliklerini kontrol etmek, hücrelerin beklendiği gibi büyüdüğünü ve bölündüğünü (veya belirli mutantlar söz konusu olduğunda olmadığını) doğrulamak için gereklidir.

Şekil 1: Hücre-ACDC modülleri. (A) Ana Cell-ACDC fırlatıcısından başlatılabilen 4 ana modüle genel bakış. Mikroskopi verilerini bölümlere ayırdıktan, izledikten ve açıklama ekledikten sonra, sayısal özellikler üçüncü modülden ("Görselleştir ve düzelt") veya (B) üst menü çubuğundaki Yardımcı Programlar menüsünden hesaplanabilir. "Yardımcı Programlar", kullanıcı girişi olmadan birden çok veri kümesinde otomatik olarak çalışabilen rutinlerdir. Ölçümleri hesaplamanın yanı sıra, diğer yardımcı programlar arasında birden fazla çıktı tablosunun tek bir tabloda birleştirilmesi, hücre altı nesnelerin izlenmesi ve görüntü ön işleme yer alır. Cell-ACDC, herhangi bir sayıda ek kanalla 2D, 3D (z-yığını veya hızlandırılmış) ve 4D verileri (zaman içinde z-yığınları) destekler. Sayısal özelliklere sahip çıktı tablosu daha sonra aşağı akış analizi ve biyolojik keşif için kullanılabilir (Şekil 10 ve Şekil 11). Bu amaçla, Cell-ACDC GitHub sayfasında, çıkış tablosundan elde edilebilecek çizim örneklerini içeren Jupyter not defterleri mevcuttur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hücre-ACDC karar akış şeması. Veri kümesi türüne ve analiz gereksinimlerine bağlı olarak kullanılacak modülü özetleyen bir akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Örnek verileri indirin. (a) Hoş Geldiniz Kılavuzunu açın. (B) Protokolü çoğaltmak için gereken örnek verileri indirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Veri hazırlama için verileri yükleyin. (A) Verileri veri hazırlama GUI'sine yükleyin. (B) Yüklenecek kanalı seçin. (C) Görüntü meta verilerini düzenleyin ve onaylayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Veri hazırlama işlemini çalıştırın. (A) İşlemi başlatın. (B) Konum yatırım getirileri (kırpma için) ve arka plan yatırım getirileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Sonuçları görselleştirmek ve düzeltmek için üçüncü modül GUI'si. Vurgulanan öğelerle birlikte üçüncü modül GUI'sinin ekran görüntüsü ( Şekil 1A'da "görselleştirin ve düzeltin"). Araç çubuklarındaki düğmelerin çoğunda, söz konusu işlevin nasıl kullanılacağını açıklayan bir araç ipucuna (fare imlecini düğmenin üzerine getirerek erişilebilir) sahip olduğunu unutmayın. Mod seçici 5 mod arasında geçiş yapmak için kullanılabilir: "Görüntüleyici", "Segmentasyon ve İzleme", "Hücre döngüsü analizi" (asimetrik olarak bölünen hücreler için), "Normal bölünme: Soy ağacı" (simetrik olarak bölünen hücreler için, örneğin, memeli hücreleri) ve "Özel açıklamalar". Diğer GUI'lerde genellikle bir araç çubuğu veya menü çubuğunun bulunduğunu unutmayın (örneğin, "Veri ön işleme" modülü, Şekil 1). Düzenle araç çubuğu , segmentasyon ve izleme hatalarını düzenlemek ve düzeltmek için kullanılabilecek tüm işlevleri içerir (örneğin, fırça, silgi, düzenleme kimliği vb.). Yüklenen görüntü, farklı açıklama seçeneklerine ihtiyaç duyulduğunda (örneğin, sol görüntüde hücre döngüsü bilgisi ve sağ görüntüde kimlikler) yararlı olan iki panelli bir görünümde görüntülenir. Sağdaki görüntü de kapatılabilir (görüntüye sağ tıklayın ve Yansıtılmış görüntüyü göster seçimini kaldırın). Her görüntü paneli, yoğunluk seviyelerini hızlı bir şekilde ayarlamak için yan tarafta bir LUT kaydırıcı içerir. Kullanıcı, LUT kontrolüne sağ tıklayarak yoğunluk görüntüleri için farklı renk haritaları seçebilir. Ek olarak, sağ tarafta, segmentasyon etiketlerinin renginin yoğunluk görüntülerinin üzerine bindirilmesi için bir LUT seçici vardır ( Segm. maskeleri adı verilen açıklama seçeneği). Soldaki görüntü için açıklama seçeneklerinin sol tarafında, otomatik kaydetme, yazı tipi boyutu vb. gibi bazı ayarları kontrol etmek için ek geçişler vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Ana GUI'de ön işlemeyi görselleştirin. (A) Ön işleme diyaloğunu açın. (B) Protokolde kullanılan parametrelerle ön işleme diyaloğu başlatıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Ana GUI'de segmentasyon çıktısını görselleştirin. (A) Bir segmentasyon modeli seçin. (B) Segmentasyon parametrelerini ayarlayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Cell-ACDC'nin gerektirdiği klasör yapısı. Cell-ACDC ile çalışmak için verilerin belirli bir klasör yapısında düzenlenmesi gerekir. Cell-ACDC bu yapıyı otomatik olarak oluşturmak için bir modül sağlarken, bu yapının nasıl görünmesi gerektiğini anlamak önemlidir. İlk olarak, tüm dosyalar Görüntüler adlı bir klasörün içinde olmalıdır. Ardından, hepsinin "basename_" olarak adlandırılan aynı adla başlaması gerekir. Gerekli minimum dosya kümesi, tek kanallı bir TIFF dosyası (2B, 3B z-yığını veya 3B+zaman) ve "_metadata.csv" ile biten bir CSV dosyasıdır. Bu dosya, ilk sütun Açıklama ve ikinci sütun değerler olarak adlandırılan iki sütunlu bir tablo olmalı ve sırasıyla çerçeve ve z dilimi sayısı için en az SizeT ve SizeZ girişleri içermelidir. Bir görüntü dosyasında z dilimleri yoksa, SizeZ 1 olarak ayarlanmalıdır. Aynısı, SizeT'nin 1 olması gereken hızlandırılmış görüntüler için de geçerlidir. Bir CSV dosyası olan giriş, virgülle ayrılmış tek bir Açıklama, değer satırıdır, örneğin, SizeZ,1. Birden çok kanal için, kanal başına bir TIFF dosyası oluşturulmalıdır. Görüntüler klasörü daha sonra "Position_1" adlı bir klasörün içine yerleştirilmelidir. Birden fazla pozisyona izin verilir ve bunların ardışık bir numara ile adlandırılması gerekir. Cell-ACDC modüllerinden herhangi birine veri yüklerken, kullanıcı belirli bir Konum klasörünü veya tüm deney klasörünü seçebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Tümör organoidlerinin 3 boyutlu miktar tayini. Cell-ACDC'nin üçüncü modül GUI'sine yüklenen temsili bir tümör organoidinin (9'dan veriler) ekran görüntüsü (solda), segmentasyon maskelerini vurgulayan kırmızı konturlu örnek z-dilimleri (ortada) ve 3D segmentasyon maskelerinden hesaplanan hücre hacmi dağılımının histogramı (sağda). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Hızlandırılmış mikroskopi verilerinin nicelleştirilmesi. (A) Cell-ACDC'nin üçüncü modül GUI'sine yüklenen tomurcuklanan maya hücrelerinin hızlandırılmış mikroskopi verilerinin ekran görüntüsü (solda) ve temsili bir hücre döngüsünde (sağda) zaman içinde histon H2B protein miktarı ölçümü. Yakınlaştırılmış görüntüler, örnek hücreyi ve tomurcuğunu (beyaz oklar) hücre döngüsünün başlangıcında (i), tomurcuk çıkışında (ii) ve nükleer bölünmede (iii) gösterir. Veriler Chatzitheodoridou ve ark.35'ten alınmıştır (B) Hücre-ACDC'nin üçüncü modül GUI'sine yüklenen fare embriyonik kök hücrelerinin hızlandırılmış mikroskopi verilerinin ekran görüntüsü (solda) ve hücre alanı (μm2) hücre bölünmesi geçiren temsili bir hücrenin zamanının bir fonksiyonu olarak çizilir. Yakınlaştırılmış görüntüler, örnek hücreyi ve kızlarını bölünmeden önce maksimum hücre alanında gösterir (i), iki yavru hücreye bölünme (ii) ve bölünmeden sonra son analiz edilen kare (iii). Veriler Zargari ve ark.22,33'ten alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.