Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans'ta Yaşa Bağlı Hareket Dinamiği: Bir Lyapunov Üs Analizi

915 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68955

⸱

23 Eylül 2025

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, en büyük Lyapunov üssünü (LLE) ölçerek C. elegans'ta yaşın hareket üzerindeki etkisini incelemektedir. Yaşlandıkça, C. elegans motor kontrolünde bir artış ve ardından düşüş gösterir. Sonuçlar, beş günde LLE'nin zirve yaptığını ve ardından solucanlar yaşlandıkça bir düşüş olduğunu gösteriyor.

Özet

Bu çalışma, En Büyük Lyapunov Üssünü (LLE) tahmin etmek için Dinamik Optik Kırınım (DOD) kullanarak yaşın Caenorhabditis elegans'ın (C. elegans) hareketliliği üzerindeki etkisini araştırmaktadır. Dinamik sistemlerde önemli bir ölçüm olan LLE, faz uzayındaki yörüngelerin sapma veya yakınsama oranını ölçerek sistemin dinamiklerindeki, bu durumda solucanın lokomotif davranışlarındaki öngörülebilirliği ve kaosu gösterir. 632 nm lazer ışığı, bir su sütununda yüzen solucandan kırınarak bir kırınım deseni oluşturur. Bir fotodiyot, ışığı kırınım modeli içinde tek bir noktada algılar ve solucan dalgalanırken tek boyutlu bir zaman serisini yakalar. Bu zaman serisi, tüm solucanın hareketinin bileşik bir temsili olarak hizmet eder ve hareket dinamiklerini kapsar, çünkü kırınım modelindeki bir nokta solucan üzerindeki tüm noktaların üst üste binmesidir. Zaman serisi daha sonra LLE'yi hesaplamak için daha yüksek boyutlu bir faz uzayına gömülür. C. elegans , yaşla birlikte artan ve azalan motor kontrol modelini izleyerek tipik olarak yaklaşık 14 gün yaşar. Yaşa özgü etkileri izole etmek için solucanlar her iki günde bir E. coli içeren taze agar plakalarına aktarıldı ve uygun şekilde yaşlandırılmalarından (3 ila 12 günlük) emin olundu. 13 C. elegans'tan oluşan bir kohortun analizi, LLE'nin kuluçkadan çıktıktan beş gün sonra 1,34 ± 0,03 1/s oranında zirve yaptığını ortaya çıkardı. Bu zirve, solucanların hareketinin en yüksek karmaşıklığı ve kaotik davranışı sergilediği gelişimde kritik bir noktayı ifade eder. Gözlemlenen LLE değerleri, gönüllü aktivitede yaşa bağlı değişiklikleri tanımlayan, azalan motor kontrol ve aktivite seviyelerini artan yaşla ilişkilendiren köklü bir model olan Moore denklemi ile uyumludur.

Giriş

Mikroskobik bir solucan olan Caenorhabditis elegans'ın (C. elegans) hareketi, motor nöronların kablolarının anlaşılmasını ilerletmek için incelenmiştir, çünkü bu nematod nörolojik olarak basittir ve sadece 302nöron 1 içerir. C. elegans, sadece 14 günlük bir yaşam süresi ile kolayca bakımı yapılan model bir organizmadır2. C. elegans'ta 302'nin sadece yaklaşık 72 nöronu hareket için kullanılır ve nematodun yetişkin vücudunda bulunur1. C. elegans'ın düşük boyutlu hareketi (yani, yan yana, ileri ve geri)3, onları LLE'deki aralıkları izlemek için kolay bir örnek haline getirir. Nematodların sinir sistemleri inanılmaz ölçüde anlaşılmıştır4.

Video analizi, eğrilik yarıçapı, dalgalanma frekansları ve dalga boyu5 gibi nicelikleri ölçerek C. elegans hareketinin ölçülmesine yardımcı olmuştur. Bu ölçümler, farklı ortamlarda ve çeşitli koşullar altında hareket özelliklerinin karşılaştırılmasını sağlayan kontrol değişkenleri oluşturmuştur 6,7. Bu bilgi, C. elegans8'in hareketini yönlendiren devrenin gelişen bir modelini oluşturur ve hatta solucanların9 sanal ve fiziksel dinamik simülasyonlarının oluşturulmasını sağlar.

Dinamik Optik Kırınım (DOD)10 , C. elegans'ın hareketini ölçmek için de kullanılmıştır. DOD sırasında, düşük yoğunluklu lazer ışığı canlı solucanın etrafında bükülerek Fraunhofer kırınım modeli olarak bilinen bir uzak alan kırınım modeli oluşturur. Canlı modeldeki yoğunluk dağılımı, nematod hareket ettikçe değişir. Kırınımdaki bir nokta, solucan üzerindeki tüm noktaların üst üste binmesidir, böylece kırınım modelindeki zamana bağlı yoğunluk, lokomotor dinamikleri11 hakkında bilgi içeren tek boyutlu bir zaman serisi oluşturur. Deneysel tek boyutlu zaman serilerinden hesapladığımız yaşa bağlı En Büyük Lyapunov Hareket Üssü'ne (LLE) odaklanıyoruz. Farklı gelişim aşamalarındaki LLE, yaşa bağlı diğer çalışmalarla karşılaştırılabilir ve nöral devrelerin video analizi veya DOD5 gibi çeşitli araçlar kullanılarak ölçülebilen lokomotor modellerinde ortaya çıktığını gösterir.

DOD, birden fazla ölçekte duyarlı bir zaman serisi sağlar, çünkü girişim modeli, hareketi kullanılan dalga boyunun bir kısmına kadar çözebilir ve aynı zamanda türün plastisitesindeki (şeklindeki) büyük ölçekli değişiklikleri de hesaba katar. Bu özellik, kelebek etkisi12 olarak da bilinen, küçük değişikliklerin yörüngede üstel değişikliklere yol açtığı kaotik sistemlerde olduğu gibi, bir sistem başlangıç koşullarına duyarlı olduğunda özellikle kullanışlıdır. Bu nedenle, zaman serisini küçük değişikliklerin kaydedilmesine izin verecek bir hızda yakalamak çok önemlidir, çünkü bu değişiklikler sistem geliştikçe önemli kaymalara neden olabilir. Bir fotodiyot (PD), zaman serisini birçok pahalı yüksek hızlı kameradan daha hızlı yakalayabilir. Kırınım modelindeki uzamsal hassasiyet ve yüksek veri biriktirme hızının birleşimi, kaotik bir sistemin özünü yakalayabilir13,14.

LLE, faz uzayı yörüngelerinin üstel sapmasını tanımlar. Faz uzayı, durum değişkenleri (veya koordinatları) ve bunlarla ilişkili türevleri (veya momentumları) ile tanımlanan bir sistemin tüm olası durumlarını içerir15. Farklı yörüngeler, farklı başlangıç koşulları için sistemin evrimini tanımlar. Kaotik bir sistemde, birbirine yakın iki yörünge zaman içinde katlanarak farklılaşacaktır ve bu sapma pozitif bir LLE ile ölçülür. Fiziksel sistemlerde bu farklılık, sistemin başlangıç koşullarında belirsizliğin yayılması ve ayrıca LLE14'te belirtildiği gibi, sistemin bir süre sonra durumunun güvenilir bir şekilde tahmin edilememesi olarak kendini gösterir.

Deneysel sistemlerde durum değişkenleri genellikle bilinmez; bununla birlikte, faz uzayının topolojisi, zaman gecikmeli versiyonlarını (zaman türevlerine eşdeğer) oluşturarak Takens gömme teoremi16 kullanılarak yalnızca bir ölçülen değişkenden yeniden oluşturulabilir. Her zaman gecikmeli sürüm bir eksende temsil edilir; Birlikte, zaman gecikmeleri bir gecikme grafiği oluşturur ve bu, zaman serisi sonsuz uzunluktaysa topolojik olarak bir faz grafiğiyle aynıdır. Deneysel zaman serilerinin uzunluğu sınırlıdır ve bu nedenle yalnızca deneysel belirsizliklerle sınırlanan tahmini LLE'leri işleyebilir.

C. elegans'ın hareketi, kaosun bir göstergesi olan pozitif bir LLE10 taşır. Genç bir organizma17 yaşında hareket değişikliklerine uğrar. Daha büyük bir LLE, daha küçük bir LLE'ye kıyasla daha düşük bir öngörülebilirliği gösterir. LLE, bir organizmanın lokomotor modellerini 10,13,14 ölçmek için güvenilir bir yöntem sağlar. Nematod lokomotor özellikleri, nematodlar18 içindeki nöronlarla ilgilidir. Cohen ve ark.19'a göre, nematod hareketi motor nöronlara bağlıdır, bu da nematodun hareketindeki karmaşıklığın incelenmesinin nöronal devresiyle de ilişkili olduğunu düşündürmektedir.

Gelecekteki çalışmalar için belirsizlikleri en aza indirmek için LLE'yi yaşa göre kalibre ediyoruz. Geçmiş çalışmalar, üç ila altı günlük nematodlarda LLE'nin ortalamasını aldı13. Bu çalışma, yaşlanmayla ilişkili düşüşlerin titiz bir analizini kolaylaştırmak için nematodların yaşlarını dikkatle izledi. Ek olarak, C. elegans18'deki diğer biyolojik değişiklikleri tanımlamak için hareketteki değişiklikler araştırılmıştır. Moore denklemi, hareket20 ile ilgili yaş parametrelerini izler. Burada, Moore denkleminin, lokomotor mekanizmasının ne zaman değerlendirileceği konusunda esnekliğe izin veren, zamansal bir belirteç T olarak tanıtılan değiştirilmiş bir versiyonunu kullanıyoruz:

figure-introduction-1, (1)

burada P(t) performansı, t zamanı, a ve c ölçeklendirme parametrelerini temsil ederken, b ve d sırasıyla üstel büyüme ve düşüşün karakteristik zamanlarıdır. Moore denkleminin, organizmalar yaşlandıkça hız ve gönüllü aktivite gibi görünüşte ilgisiz niceliklerin yörüngelerini tahmin ettiği gösterilmiştir. Türler, Moore denkleminde belirtildiği gibi eğrinin şekli ile karakterize edilebilir; yani, bazı türler diğerlerinden daha erken zirveye ulaşabilir21.

Protokol

1. C. elegans veri toplama hazırlığı

  1. Nematodların yemesi için her bir Nematod Büyüme Ortamı (NGM) agar plakasına OD600 ile 0,5 mL E. coli koyun. E. coli'nin her agar plakasında kurumasını bekleyin.
  2. Yaş kontrolü amacıyla yeni C . elegans plakaları yapmak için herhangi bir biyolojik materyal tedarikçisinden bir C. elegans kontrol plakası edinin.
  3. Bir Bunsen brülöründen veya eşdeğerinden bir alev kullanarak bir platin kazmayı sterilize edin. Her tabağa koymak üzere 5-10 yetişkin vahşi tip C. elegans seçmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
  4. Yetişkinleri tabaktan almadan önce nematodların 4-5 saat yumurtlamasına izin verin. Kalan nematodları inkübe edin ve istenen günde toplamalarına izin verin.
  5. Veri toplama gününde, plastik bir üst kısım eklendiğinde herhangi bir dökülmeyi önlemek için 10 mm x 10 mm x 45 mm boyutlarında 4,5 mL'lik optik dereceli bir kuvars küveti, küvetin üst kısmının hemen altına oda sıcaklığında damıtılmış su ile doldurun. 2-3 nematod toplayın ve yavaşça küvete yerleştirin. Nematodlar küvete girdikten sonra, solucanı lazer ışınında kolayca hizalamak için küveti yan yatırın. C. elegans dibe doğru yüzebilir, ancak tamamen suya daldırıldığı sürece yüzme dalgalanmalarına devam edecektir5.

2. Veri toplama

NOT: Yaştaki belirsizlikleri en aza indirmek için zaman serisini kaydetmek için aşağıdaki prosedür her gün yaklaşık aynı saatte uygulanmalıdır.

  1. Önceki makale22'de açıklanan deneyi kurun. Solucanı daha sonra lazer ışınında ortalamayı kolaylaştırmak için iki aynalı bir periskop inşa etmek ve küveti iki ayna arasına yan yatırmak için küçük bir değişiklik uygulayın. Kamera yerine kırınım modeline bir PD yerleştirin (Şekil 1).
    1. Yukarıda belirtilen periskopu oluşturmak için aynaları dikey olarak hizalayın.
      NOT: Bu, tamamlanması gereken tek lazer hizalama çalışmasıdır.
  2. HeNe (Helyum Neon) lazeri açın ve termal dengeye (~15 dakika) ulaşması için ısınmasını bekleyin.
  3. Veri toplamaya başlamak için dijital osiloskopu başlatın. Dijital osiloskopta zaman aralığı ve bellek arabelleği parametrelerini ayarlayın. Zaman aralığını 100 s olarak ayarlayın ve saniyede en az 100 kiloörnek (kS) bellek arabelleği uygulayın.
  4. Veri toplama hızı için çözünürlüğü 1 kHz'e ve genlikleri çözmek için 12 bit'e ayarlayın, bu da küçük ölçeklerde karmaşıklığı ayırt etmeye yardımcı olur23.
  5. Zaman serisini sıfır voltta ortalamak için Otomatik AC ofsetini kullanarak osiloskopu yoğunluk salınımlarını ortalayacak şekilde ayarlayın.
  6. 2-3 nematod toplayın ve lazer ışınında en az 1 solucanı bulmak ve ortalamak daha kolay olacak şekilde damıtılmış suyla dolu bir küvete yavaşça yerleştirin. Küveti sallamayın.
  7. 2-3 nematod tutan küveti periskopa yerleştirin ve 1 nematodu lazer ışınında ortalayın.
    1. C. elegans lazer ışınında ortalandığında, periskoptan yaklaşık 50 cm uzakta bir uzak alan kırınım deseni oluşacaktır.
  8. Bir C. elegans lazer ışınını geçtiğinde fotodiyotu uzak alan kırınım modeline yerleştirin. Merkezi maksimum (iletilen lazer ışını) yerine kırılan ışığı yakalamak için PD'nin kırınım modelinde merkezin dışında konumlandırıldığından emin olun.
  9. LLE'yi güvenilir bir şekilde hesaplamak için en az 10 saniye veri toplayın; yani, kararlı bir LLE'yi hesaplamak için en az 10.000 veri noktası gereklidir.
    NOT: Daha az veri noktası, yapay olarak dalgalanan bir LLE ile sonuçlanır.
  10. Yukarıdaki veri toplamayı her gün için 9-15 kez tekrarlayın. Günün aynı saatinde 3-12 günlük yaşlar için veri toplayın.

3. Veri analizi

NOT: Veri analizi için, zaman serisi bir gecikme grafiği16 kullanılarak faz uzayına gömülür ve ardından yörüngelerin sapmasını hesaplayarak LLE'yi tahmin edin.

  1. Zaman serisini dikkatlice inceleyerek nematodun lazer ışınının içinde serbestçe yüzdüğü zaman serisindeki bölümleri seçin. Şekil 2A , en az 20 s'lik sürekli bir sinyale sahip uygulanabilir bir zaman serisini göstermektedir.
  2. Düşük sinyal-gürültü oranı için zaman serisini tarayın (Şekil 2B). Küvette solucan olmadan bir zaman serisi kaydederek gürültü seviyesini belirleyin. Zaman serisindeki özellikler, sadece genlik değil, gürültü seviyesinin iki katından fazla olmalıdır.
  3. İlgili zaman serisinden doymuş verileri hariç tutun (Şekil 2C). Yararlı bilgiler elde etmek için çok fazla veri doymuşsa, yukarıdaki Veri Toplama bölümüne dönün, 2.7.1 ile 2.9 arasındaki adımları tekrarlayın ve fotodiyotu merkezi maksimumdan uzaklaştırarak yoğunluk seviyesini ayarlayın.
  4. tarafından verilen ortalama frekansı belirleyin
    figure-protocol-1(2)
    burada f frekanstır ve P güç spektrumudur (Şekil 3). Bu, Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) kullanılarak hesaplamalı olarak yapılabilir ve ardından frekansların ortalaması alınabilir. Birçok hesaplama programı, bir veri kümesinin ortalama frekansını hesaplamak için yerleşik bir işleve sahiptir.
  5. Bir zaman geciktirme yöntemi kullanarak faz uzayının topolojisini yeniden yapılandırın. Bir X zaman serisi seçin ve yörüngeleri çözmek için zaman serisini τ zaman gecikmesi kadar geciktirin (Şekil 4). Optimum zaman gecikmesi, karşılıklı bilgi (MI)24'teki ilk yerel minimumun belirlenmesiyle belirlenir:
    figure-protocol-2(3)
    burada N nokta sayısıdır, Xi X zaman serisindeki bir noktadır, Xi+τ ise aynı zaman serisinde zaman gecikmeli bir noktadır. p(Xi), Xi noktasının meydana gelme olasılığıdır ve p(Xi+τ), Xi+τ'nin meydana gelme olasılığıdır. p(Xi, Xi+τ), hem Xi zaman serisinin hem de gecikmeli X i+τ zaman serisinin çakışan ortak olasılığı25'tir.
  6. Şekil 5'te gösterildiği gibi, MI grafiğinde 0,140 ila 0,240 s (140 ve 240 veri noktası) arasındaki ilk minimumu belirleyin. Gecikme için kesin bir sayı yoktur; Birincil amaç, sapmayı belirlemeye yetecek kadar faz yörüngelerini çözmektir.
  7. Önceki adımda MI en aza indirilerek belirlendiği gibi, Xi zaman serisini ve τ ile gecikmeli sürümlerini kullanın.
  8. Gömme boyutunu belirleyin. En uygun gömme boyutu, yanlış en yakın komşuların (FNN) minimumda stabilize olduğu en düşük boyuttur (Şekil 6)26. Abarbanel ve ark.27,28 tarafından geliştirilen yöntemi kullanın.
  9. Dinamik sistemi bir faz uzayında yeniden yapılandırmak ve yakındaki yörüngelerin zaman içindeki sapmasını izlemek için Rosenstein algoritmasını29 kullanın. Özellikle, LLE'yi hesaplamak için MATLAB forumu30'da yayınlanan Merve Kızılkaya'nın MATLAB rutinini kullanın. Bu rutin şu girdiyi gerektirir: zaman serisi, çekicinin ortalama frekansı, zaman gecikmesi τ, zaman serisi için veri toplama hızı ve sapmaya uyacak aralık.
  10. LLE tahminlerinin belirsizliğini azaltmak için yukarıdaki prosedürü 9-15 veri kümesi için tekrarlayın. Her gün için LLE'lerin ortalamasını alın ve ardından Moore eğrisine uyun (Şekil 7).

Sonuçlar

LLE'yi yaşa karşı ölçerken, çekicinin frekansı, MI ve FNN gibi genellikle karmaşık dinamik sistemlerle ilişkilendirilen diğer miktarları da ölçtük. 3. günden 12. güne kadar yaş çalışması verilerini topladık. Solucanlar, elle ele alınamayacak kadar küçük ve 3 günlük olmadan olgunlaşmamıştır. 12 günde solucanlar yaşlanır ve nöronal devreleri bozulduğu ve sinir sistemleri azaldığı için zar zor hareket ederler31.

Rosenstein algoritması, gömülü yörüngedeki her nokta için en az bir ortalama periyot aralığında komşu bir nokta seçer. İki komşu yörüngedeki iki nokta arasındaki ayırma vektöründen başlayarak (Şekil 8), algoritma sapmanın gelişimini izler. Yörüngelerin ayrılması, sistemin32 kaotik doğası nedeniyle başlangıçta katlanarak artar ve daha sonra yörünge sınırlı olduğu için plato yapar. Zaman içindeki ortalama sapmanın logaritmasının çizilmesi, yörüngelerin ayrılmasını izler (Şekil 8 ve Şekil 9). Doğrusal en küçük karelerin eğimi, düzleşmeden önce eğrinin ilk kısmına sığar ve sistemin LLE33'ü için güvenilir bir tahminle sonuçlanır. En küçük kareler sığdırma aralığının ve uyumun kendisinin seçiminde belirsizlik olduğunu unutmayın. Başlangıç koşullarına duyarlılık, çekici üzerinde sapma izlenirken doğrusal uyum bölgesinin salınımlı bir davranış sergilemesine neden olur. Her yaş grubu için ortalaması alınan solucanlar arasındaki biyolojik varyasyon, önceki bir yayında10 gösterildiği gibi, tek bir deneme için doğrusal LLE uyumundaki değişkenlikten daha ağır basmaktadır.

Zaman serisi (Şekil 2A), tepe ve çukurların, yüzme frekansı, şekli ve yönelimindeki değişiklikler gibi solucanın hareketinin yönleriyle çakıştığını göstermektedir. Zaman serisi periyodik değildir; Zaman serisindeki salınımlar asla tekrarlanmaz, ancak yoğunluk olarak sınırlı kalır. Frekans sabittir ve hafifçe dalgalanır, bu da frekanstaki karmaşıklığı ve sınırlılığı gösterir. Şekil 10 , solucan yaşlandıkça yüzme frekanslarında azalma eğilimini göstermektedir ve bu eğilim 12. günde bozulmaktadır. Çoğu solucan için ortalama frekans 12. günden sonra atlar. Bu muhtemelen sinir devresinin bozulduğunun bir göstergesidir. Buna karşılık, MI'nın ilk minimumu tarafından belirlenen ortalama gecikme τ, döngü uzadığı için popülasyon yaşlandıkça artar (Şekil 11).

Bizim durumumuzda MI, iki gecikmeli zaman serisi arasındaki istatistiksel örtüşmeyi temsil eder. MI minimum ise, yörüngeler arasında minimum örtüşme vardır. Teorik olarak, kaotik yörüngeler asla örtüşmez; Bununla birlikte, pratikte, sınırlı anlamlı rakamlar ve bazı deneysel gürültülerle, bazı noktalar bazı toleranslar24 içinde örtüşecektir. MI'yı en aza indirerek çakışma olasılığını en aza indirmeyi hedefliyoruz. Minimize edilmiş bir MI ile önemli ölçüde daha büyük bir MI arasındaki fark Şekil 4'te gösterilmektedir.

Gömme boyutu, yanlış en yakın komşular (FNN'ler) tarafından belirlenir. FNN'lerin sayısı, 3 veya 4 boyutlarını gömmek için %5 veya daha az FNN ile düzleşir. Şekil 6'da, nematodların yaşı, solucanın ömrünün neredeyse sonuna geldiği 12. gün dışında, gömme boyutunu etkilemez.

LLE'nin yörüngesi, 5 günde bir zirve ile Moore eğrisini (Şekil 7) takip eder, bu da en öngörülemeyen (ve muhtemelen karmaşık) hareketin C. elegans yeni olgunlaştığında meydana geldiğini gösterir. Şekil 7'de, 3. günden 12. güne kadar olan LLE'lerin grafiği, 5 günde zirve yapan doğrusal bir artışı ve ardından 5. günden sonra bir düşüşü göstermektedir. Şekil 10'daki hata çubukları, ortalama 4,34'ün standart sapmasını temsil eder ve biyolojik türler içindeki çeşitlilik ve LLE tahmini dahil olmak üzere çeşitli faktörleri yansıtır. Solucanlar arasındaki varyasyon, LLE uygulama rutinindeki belirsizliklerden daha ağır basma eğilimindedir. 5. ve 7. günler gibi günler arasındaki değişkenlik örtüşmez, bu nedenle veriler açıkça ayırt edilebilir. LLE'lerin yaşla birlikte eğilimi, diğer canlı organizmalarda hafıza ve hareket üzerindeki yaş etkilerini tanımlayan önceki bir çalışma18'deki Moore denklemiyle yakından eşleşir.

Tablo 1'deki LLE'ler tutarlıdır ve yaşla birlikte yavaş yavaş artan ve ardından azalan bir eğilim göstermektedir. Değerler, DOD10 ve video analizi34,35 kullanılarak daha önce yayınlanmış sonuçlarla tutarlıdır.

figure-results-1
Şekil 1: Deneysel uzak alan kırınım kurulumu (ölçeğe göre çizilmemiştir). Direksiyon aynaları bir periskop oluşturur. C. elegans'ı içeren küvet, direksiyon aynalarının arasına yerleştirilir. Lazer ışını solucan tarafından kırılır ve ikinci direksiyon aynası aracılığıyla PD'ye doğru ilerler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yoğunluk zaman serisi. DOD zaman serisi, nematod lazer ışınında (A) veri analizi için uygun bir zaman serisi ile hareket ettikçe yoğunluk dalgalanmalarını gösterir. (B) Bu zaman serisi, 11 ile 30 s arasındaki aralığın sinyal göstermediğini gösterir; Daha kısa sabit genlikler öncelikle dağınık ışıktan kaynaklandığından yalnızca sistemin gürültü seviyesini gösterir. (C) Bu zaman serisinde birkaç doymuş veri örneği vardır. Her veri noktası, grafikte tepe ve dip noktalarında kesilen ve düzleşen önemli bir artışı temsil eder. Bu örnekte, yoğunluk 45 ila 50 s arasında -100 ila 100 AU arasında değiştiğinden sivri uçlar düzleşir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Güç spektrumu. Güç spektrumu yaklaşık 0.95 Hz'de bir maksimum gösterir. Çekici üzerindeki yörüngelerdeki frekans değiştiği ve asla tam olarak tekrar etmediği için frekanslar yayılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: 9 günlük bir solucanın aynı zaman serisinin iki farklı gecikmesine sahip 3B gecikme grafiklerine gömülü deneysel veriler. Bu zaman serisi, hareketin kaos teorisiyle tutarlı sınırlı bir çekici olduğunu göstermektedir. (A) Yörünge, ilk yerel minimum (MI ≈ 2.11) kullanılarak çözülür ve yaklaşık 0.183 sn'lik (183 veri noktası) bir gecikme verir. Görünür yörünge geçişleri, iki boyutlu bir uzaya yapılan bir projeksiyonun sonucudur. (B) Bu gecikme grafiği, noktalar ayırt edilemeyecek kadar birbirine yakın olduğundan ve sapma göstermediğinden, 0,002 s'lik (2 veri noktası, (MI > 7)) uygunsuz bir gecikmeyle çözülmeden kalır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Karşılıklı bilginin üstel azalması. MI'daki ilk minimum, faz yörüngesini çözmek için bu özel durumda veri kümesinin gecikmesini 0.161 s'de (161 veri noktası) belirler. Bu gecikme, çekiciyi faz uzayında yeniden yapılandırmak için zaman serisi değerini kaydırır. Gecikmenin yalnızca yörüngeleri çözmeye yetecek kadar ilk minimuma yakın olması gerekir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Sırasıyla 3, 5, 9 ve 12. günlerdeki ortalama gömme boyutları. Her günün gömme boyutları arasındaki belirli farkı göstermek için gömme boyutunun büyütülmüş bir görünümü kullanılır. Sadece 12. gün kayda değer bir fark gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: 3. ve 12. günler arasındaki tahmini LLE'lerin ortalaması. LLE 5 günde zirve yapar. Nematodlar, 5 güne kadar olgunlaşmamışlıktan olgunluğa geçişle tutarlı bir büyüme yörüngesi sergiler. Bu 5 günden sonra nematodlar ayrışmada bir düşüş yaşarlar. Belirsizlikler, solucanlar arasındaki varyasyonların hakim olduğu ortalamanın standart sapmasının ölçüleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Kaos teorisinde mevcut olan farklılığın tasviri. Pozitif bir LLE, başlangıçta yakın yörüngelerin zaman içinde ayrılmasına neden olacaktır. t bir zaman aralığıdır, d ıraksamadır ve x(t) faz uzayında bir noktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Logaritmik ölçekte faz yörüngesi sapması. Tahmini LLE, çekicinin 0,96 ile 1,01 s arasındaki sınırlılığı nedeniyle düzleşmeden önce yükselen bölgedeki doğrusal uyumun (1,08 1/s) eğimidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10: Her gün için ortalama ortalama sıklık. 12. gün ortalaması, hareketi yönlendiren nörolojik sinyallerde önemli bir değişikliği gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11
Şekil 11: Her gün için ortalama gecikme. MI, ortalama olarak 3. ve 6. günler arasında daha düşük gecikmelere yol açarken, 7. ve 12. günler arasında daha yüksek bir ortalama gecikme ortaya çıkar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yaş (gün)Veri Kümesi SayısıLLE (1/sn)Ortalamanın Standart Sapması (1/s)
3111.140.02
4151.200.03
5131.340.03
6111.230.02
7101.160.03
8121.130.02
9121.070.02
1091.000.03
1190.960.03
1290.920.02

Tablo 1: Yaş çalışmasının her günü için veri kümesi sayısı ve ortalama LLE. LLE'ler, DOD aracılığıyla toplanan önceki verilerle tutarlıdır ve Şekil 7'den Moore eğrisinin artan ve azalan yörüngesini gösterir. Verilerin her günü için 9-15 veri seti toplandı. Veri kümeleri, kas bozulmasının ve nöronal düşüşün doğası gereği solucanlar yaşlandıkça düşüş eğilimi gösterdi ve bu da hareketin azalmasına neden oldu.

Tartışma

kategorize ettik C. elegans LLE'yi farklı yaşlarda değerlendirerek, yüzme frekansı, karşılıklı bilgi (MI) ve yanlış en yakın komşular (FNN) gibi parametrelerle desteklenen hareket, her biri sistemin dinamik özellikleri hakkında ek bilgiler sunar. Bu sistemin deterministik ve doğrusal olmayan özellikleri, vekil veri yöntemleri ve yineleme grafikleri36 kullanılarak incelenmiştir.

Yaşlanmanın hareket üzerindeki etkilerini ölçmek için DOD'u kullanmak, geleneksel mikroskopiyi tamamlayıcı bir tekniktir. Mikroskobik türlerin görsel olarak incelenmesinin yerini tutmaz; Geleneksel tekniklerin ötesinde hareketi ölçmek için tutarlı ve etkili bir yol sağlar. DOD video analizini atladığından, kırınım yoğunluk dağılımını doğrudan Fourier uzayına eşlediğinden, hesaplama iş yükünün bir kısmı doğası gereği optik teknik tarafından yönetilir. Kırınım sırasında optik alanın üst üste binmesi tüm mikroskobik türleri izler. İdeal olarak çözünürlük, kullanılan ışığın dalga boyu λ (bu durumda 632 nm) tarafından yönetilir. Dalga boyunun bir kısmının kayması bile yoğunlukta bir değişikliğe neden olacaktır. Bu nedenle çözünürlük, fotodetektörün menzili ve çözünürlüğünün yanı sıra lazerin gücü tarafından yönetilir. Örneğin, dedektör iki voltaj arasında dalgalanan bir zaman serisi sinyali algılarsa, Vmin ve Vmaxve çözünürlük n bit ise (bkz. Protokol adım 2.4), o zaman maksimum çözünürlük λ/n veya bizim durumumuzda 632 nm/12'dir. Teorik olarak, bu yöntem şeklini değiştiren herhangi bir cisme uygulanabilir; ancak DOD özellikle mikroskobik türler için çok uygundur çünkü uygun dalga boylarına sahip ucuz lazerler kolaylıkla bulunabildiğinden ve uygun maliyetlidir.

Net ve tutarlı bir kırınım modeli sağlamak için solucan dikkatlice izlenmeli ve yüzerken lazer ışınının içinde ortalanmalıdır. Solucan hizadan çıkarsa, sinyal bozulabilir veya tamamen kaybolabilir. Fotodiyot doygunluğu sorunlarını azaltmak ve stokastik gürültüyü azaltmak için, lazer yoğunluğunu azaltmak için bir nötr yoğunluk filtresi kullanılır. Bu filtreleme, fotodiyotun dinamik aralığının korunmasına yardımcı olur ve kaydedilen zaman serilerinde aşırı doygunluğu önler. Bununla birlikte, veri kalitesini korumak için aşırı doygunluk veya düşük sinyal-gürültü oranları sergileyen verilerin herhangi bir bölümü nihai analizin dışında tutulur.

Yüzme frekansındaki bir sapma, kaosun13 yerleşik bir erken belirteci olan sürekli bir frekans spektrumu üretir. Ortalama frekans ile MI arasındaki ters ilişki, bir döngünün yaklaşık 1/8'inin, sinüzoidal bir dalga biçimini analiz etmek için gereken çözünürlüğe benzer şekilde, LLE'yi tahmin etmek için yörüngeyi yeterli doğrulukla çözdüğünü göstermektedir.

Şekil 6'daki 3 ve 4 numaralı gömme boyutları etrafındaki FNN'lerin düşük yüzdesi, hem C. elegans hareketinde hem de optik sistemde düşük gürültü seviyeleri anlamına gelir. Bununla birlikte, 12 günlük solucanlarda, FNN'lerin yüzdesi biraz artar, ancak %5'in oldukça altında kalır, bu mutlaka gerçek gömme boyutundaki bir artıştan dolayı değil, muhtemelen yaşlanan organizmalarda nöral bozulmaya atfedilen lokomotor sinyaldeki artan gürültü nedeniyle34,37.

Geliştirme boyunca LLE'deki değişiklikler, hareketteki kaos derecesinin yaşa göre değiştiğini ve Moore denklemindeki tahminlerle yakından eşleştiğini göstermektedir. Yaşamın erken dönemlerinde LLE'de bir zirve, ebeveyn bakımının yokluğunda nöromüsküler işlevselliği hızla geliştirmesi gereken C. elegans gibi R-seçilmiş türlerin özellikleriyle tutarlıdır. Özellikle, uzun menzilli nöronal bağlantıların %70'i, solucan yetişkin boyutunun yalnızca %20'si olduğunda oluşur37,38. Buna karşılık, insanlar gibi K-seçilmiş türler, ebeveyn yatırımıyla desteklenen daha yavaş nörolojik gelişim sergiler ve bu da gecikmiş ancak daha karmaşık motor kalıplara neden olur. Bu farklılıklar, türler arasında en yüksek LLE'nin zamanlamasına yansır.

C. elegans'ın yaklaşık 14 günlük kısa yaşam döngüsü, dört larva aşaması2 boyunca ilk iki gün boyunca hızlı gelişme ile, onu özellikle hareketteki en yüksek karmaşıklığı incelemek için uygun hale getirir. Önceki çalışmalar, hareketteki yaşa bağlı değişiklikleriaçıklamak için nöronal yapı düşüşüne 34,39 odaklanırken, çalışmamız bu fiziksel değişiklikleri sistemin altında yatan kaotik dinamiklere bağlamaktadır. DOD'un doğrusal olmayan dinamiklerle entegrasyonu, birden fazla uzunluk ölçeğinde hassas niceliksel karakterizasyona olanak tanıyarak davranışın nöronal itici güçlerine ilişkin yeni bakış açıları sunar. Gelişim aşamaları boyunca sürekli olarak pozitif olan LLE, lokomotor sistemde kaotik davranışın varlığını güçlü bir şekilde destekler.

Bu çalışma, C. elegans'ta yaşa bağlı davranış değişikliklerini incelemek için yeni bir metodolojik çerçeve sunar, böylece motor düşüşün biyolojik ve dinamik bağıntılarına ilişkin mevcut anlayışı genişletir. Ayrıca, LLE'nin yaşa bağlı nörolojik değişiklikler için hassas bir biyobelirteç olarak kullanımını doğrular ve LLE'nin yaşlanmadan etkilenen lokomotor dinamiklerin güvenilir bir nicel ölçüsü olduğunu gösterir.

DOD, mikroskobik organizmalardaki hareket ve kaosu ölçmek için güçlü, invazif olmayan bir yöntemdir ve en iyi şekilde video analizinin yerine geçmekten ziyade tamamlayıcı olarak görülür. Mevcut uygulamasında, deney, genç solucanlar güvenilir kırınım sinyalleri veremeyecek kadar küçük olduğundan, nematodların en az üç günlük olmasını gerektiriyor. Kırınım modelindeki tek bir noktadan çıkarılan tek boyutlu zaman serisi, organizmanın vücudu boyunca lokalize dinamikleri gizleyebilen uzamsal bilgiyi zorunlu olarak sıkıştırır. Çok kanallı yaklaşımlar, kırınım alanı boyunca parametre tutarlılığını doğrulayarak bu sınırlamanın giderilmesine yardımcı olur, ancak ince mekansal heterojenlikler yine de gözden kaçabilir. LLE'nin doğru tahmini ayrıca yeterince uzun, gürültüsüz zaman serilerinin elde edilmesine bağlıdır; Solucanın ışından dışarı çıkması veya çevresel dalgalanmalar gibi pratik zorluklar veri kalitesini tehlikeye atabilir ve LLE değerlerine olan güveni azaltabilir. Tüm deneysel yöntemlerde olduğu gibi, LLE uydurma sırasındaki ölçüm gürültüsü ve öznel kararlar, tekli ölçümler için tipik olarak yaklaşık %15 içinde kalan ek belirsizlik getirir.

Gelecekteki çalışmalar, LLE'nin çeşitli deneysel koşullar altında ölçülmesine odaklanacak ve modellenmiş ve ölçülen LLE'ler arasında karşılaştırmalar yapılmasına olanak sağlayacaktır. Bu, karmaşık motor kontrolün zaman içinde nasıl ortaya çıktığına ve bozulduğuna dair anlayışımızı derinleştirebilecek öngörücü nörolojik modellerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Ayrıca, bu biyolojik sistemin deterministik doğasını tekrar doğrulamak için Entropi-Karmaşıklık düzlemini hesaplamak gibi diğer hesaplama yöntemlerini keşfederek bulgularımızın tutarlılığını keşfetmeye devam edeceğiz40.

Açıklamalar

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Mali destek için Vassar Koleji'ne ve Lucy Maynard Somon Araştırma Fonu'na teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Kathleen Susman, Dr. Juan Merlo ve Dr. Susannah Zhang'a bu araştırmanın tüm aşamalarında içgörülerini ve yardımlarını sağladıkları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 Ön Yüzey Alüminyum AynaThorlabsPF10-03-F01
632 nm HeNe LazerNewportLGX1Herhangi bir kırmızı ışık lazeri
Boş Petri KabıCarolina971632Nematod büyüme agarını döktüğümüz plastik petri kapları
Escherichia coli K12, Yaşayan, Bakteriyofaj Ev SahibiCarolina124500C. elegans için besin kaynağı olarak kullanılmıştır; OD600
Leica S9i MikroskobuLeica MicrosystemsLED2500Diseksiyon Mikroskobu
ÇakmakBic çakmaklarHer solucanı seçmeden önce ve sonra kazmayı sterlize etmek için kullanılan herhangi bir sterilizasyon aracı
MATLABMathWorksMATLAB forumunda Merve Kizilkaya tarafından hazırlanan Rosenstein Algoritma-Rutini
Nematod Büyüme AgarıCarolina173520Hazırlanmış Medya Şişesi, 135 mL
FotodiyotThorlabsDET36A350-1100 nm Si Yanlı Dedektör
Picoscope5204Pico TeknolojisiS.376PC Osiloskopu www.picotech.com
Platin SeçimC. elegans kapmak için kullanılırdı; Küçük, el yapımı bir seçme ve cam elde taşınan parça ve platin kepçe ile hazırlanmış bir seçmadır.
Quartz CuvetteStarna Hücreleri21/G/5İçine C. elegans koymak için damıtılmış su ile dolduruldu

Kaynaklar

  1. Zhen, M., Samuel, A. D. C. elegans locomotion: small circuits, complex functions. Curr Opin Neurobiol. 33, 117-126 (2015).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , http://www.wormbook.org (2015).
  3. Gjorgjieva, J., Biron, D., Haspel, G. Neurobiology of Caenorhabditis elegans locomotion: where do we stand. Bioscience. 64 (6), 476-486 (2014).
  4. Boyle, J. H. C. elegans locomotion: an integrated approach. , https://core.ac.uk/download/pdf/43059.pdf (2009).
  5. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20982-20987 (2008).
  6. Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J Exp Biol. 210 (13), 2383-2389 (2007).
  7. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).
  8. Barbulescu, R., Mestre, G., Oliveira, A. L., Silveira, L. M. Learning the dynamics of realistic models of C. elegans nervous system with recurrent neural networks. Sci Rep. 13 (1), 467(2023).
  9. Sarma, G. P., et al. OpenWorm: overview and recent advances in integrative biological simulation of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1758), 20170382(2018).
  10. Zanetti, R. F., Canavan, K. L., Zhang, S. G., Magnes, J. Multichannel measurements of C. elegans largest Lyapunov exponents using optical diffraction. Appl Opt. 62 (29), 7812-7818 (2023).
  11. Magnes, J., et al. Live C. elegans diffraction at a single point. Open J Biophys. 8, 155-162 (2018).
  12. Lorenz, E. N. The predictability of hydrodynamic flow. Trans N Y Acad Sci Ser II. 25 (4), 409-432 (1963).
  13. Magnes, J., et al. Chaotic markers in dynamic diffraction. Appl Opt. 59 (22), 6642-6650 (2020).
  14. Strogatz, S. H. Nonlinear dynamics and chaos: with applications to physics, biology, chemistry, and engineering. , Westview Press. Boulder, CO. (2001).
  15. Nolte, D. D. Introduction to modern dynamics: chaos, networks, space and time. , Oxford University Press. Oxford. (2015).
  16. Takens, F. Detecting strange attractors in turbulence. , Springer. Berlin. (1981).
  17. Murakami, H., et al. Manipulation of serotonin signal suppresses early phase of behavioral aging in Caenorhabditis elegans. Neurobiol Aging. 29 (7), 1093-1100 (2008).
  18. Marck, A., et al. Age-related changes in locomotor performance reveal a similar pattern for Caenorhabditis elegans, Mus domesticus, Canis familiaris, Equus caballus, and Homo sapiens. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 72 (4), 455-463 (2017).
  19. Cohen, N., Sanders, T. Nematode locomotion: dissecting the neuronal-environmental loop. Curr Opin Neurobiol. 25, 99-106 (2014).
  20. Moore, D. H. A study of age group track and field records to relate age and running speed. Nature. 253 (5489), 264-265 (2020).
  21. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  22. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction. J Vis Exp. (68), e4412(2012).
  23. Tzepos, D., Trader, O., Magnes, J. 16th Chaotic Modeling and Simulation International Conference, , https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-031-60907-7 (2024).
  24. Fraser, A., Swinney, H. Independent coordinates for strange attractors from mutual information. Phys Rev A. 33, 1134-1140 (1986).
  25. Starmer, J. The StatQuest illustrated guide to machine learning!!!: triple bam. , StatQuest Publications. (2022).
  26. Kizilkaya, M. MATLAB routine. , https://www.mathworks.com/matlabcentral (2020).
  27. Abarbanel, H. D. I., Kennel, M. B. Local false nearest neighbors and dynamical dimensions from observed chaotic data. Phys Rev E. 47, 3057-3068 (1993).
  28. Kizilkaya, M. False nearest neighbor algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37239-minimum-embedding-dimension (2020).
  29. Rosenstein, M. T., Collins, J. J., De Luca, C. J. A practical method for calculating largest Lyapunov exponents from small data sets. Physica D. 65 (1-2), 117-134 (1993).
  30. Kizilkaya, M. Largest Lyapunov exponent with Rosenstein's algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/38424-largest-lyapunov-exponent-with-rosenstein-s-algorithm (2020).
  31. Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
  32. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  33. Giordano, N. J., Nakanishi, H. Computational physics. , Upper Saddle River, NJ. (2006).
  34. Olsen, A., Vantipalli, M. C., Lithgow, G. J. Using Caenorhabditis elegans as a model for aging and age-related diseases. Ann N Y Acad Sci. 1067 (1), 120-128 (2006).
  35. Ahamed, T., Costa, A. C., Stephens, G. J. Capturing the continuous complexity of behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat Phys. 17 (2), 275-283 (2021).
  36. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  37. Kennel, M., Brown, R., Abarbanel, H. Determining embedding dimension for phase-space reconstruction using a geometrical construction. Phys Rev A. 45, 3403-3411 (1992).
  38. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  39. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  40. Rosso, O. A., Larrondo, H. A., Martin, M. T., Plastino, A., Fuentes, M. A. Distinguishing noise from chaos. Phys Rev Lett. 99 (15), 154102(2007).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lokomosyon Dinami iDinamik Optik DifraksiyonYa a Ba l LokomosyonN ral Devre AnaliziNematod SenkronizasyonuDifraksiyon Deseni AnaliziFaz Uzay G mmeY zme Frekans
Caenorhabditis elegans'ta Yaşa Bağlı Hareket Dinamiği: Bir Lyapunov Üs Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.