Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

31 Ekim 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İmmobilizasyon için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak bir Drosophila larva koku alma nöronu için kalsiyum görüntüleme protokolleri sunuyoruz. Bu yöntem stabiliteyi artırarak güvenilir in-vivo ve ex-vivo deneyleri kolaylaştırır. Özel R komut dosyaları kalsiyum sinyallerini analiz ederek ayrıntılı nörofizyolojik araştırmalar için etkili bir platform sağlar.

Özet

Kalsiyum görüntüleme, nöral dinamikleri ve beyin fonksiyonlarını incelemek için çok önemlidir. Bununla birlikte, Drosophila larvalarında kalsiyumu görüntülemek için mevcut yöntemler, hareket artefaktları ve özel ekipman ihtiyaçları nedeniyle zordur. Burada, numuneleri hareketsiz hale getirmek için topikal bir doku yapıştırıcısı kullanarak üçüncü dönem Drosophila larvalarında hem in vivo hem de ex vivo kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için pratik, düşük maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, farklı deneysel koşullar altında kalsiyum değişikliklerinin ölçümlerini kolaylaştıran özel R komut dosyaları ve veri analizi için bir çerçeve sağlıyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, bir çift larva CNS nöronunda kalsiyum geçişlerini minimum hareket artefaktları ile başarıyla kaydettik ve preparatlar arasında tekrarlanabilirlik gösterdik. Yöntem, standart dönen diskli konfokal sistemlerle uyumludur ve DIY veya ticari iki fotonlu kurulumlara uyarlanabilir, böylece farklı kaynaklara sahip laboratuvarlar tarafından erişilebilir hale gelir. Bu yaklaşım, larva kalsiyum görüntüleme çalışmalarına erişilebilirliği artırabilir ve hem kokular gibi dış uyaranların hem de nöromodülatörler gibi iç uyaranların etkilerini incelemek için uyarlanabilir.

Giriş

Kalsiyum iyonları nöronal aktiviteyi modüle etmede ve uyaranlara hücresel tepkileri yönlendirmede çok önemli bir rol oynadığından, nöronlardaki kalsiyum dinamiklerini anlamak, sinirsel sinyalleşmenin ve beyin fonksiyonunun altında yatan karmaşık mekanizmaları çözmek için çok önemlidir. Nöronal kalsiyum dinamikleri, Drosophila larvası da dahil olmak üzere çok çeşitli organizmalarda kalsiyum aracılı sinyalleşmeye ilişkin gerçek zamanlı bilgiler sağlayan kalsiyum görüntüleme yoluyla izlenebilir. Drosophila larvası, davranışın altında yatan devre işlevini incelemek için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkıyor. Tam bir sinaptik çözünürlüklü beyin konektomunun üretildiği sadece üç organizmadan biridir1. Larva, hem tüm beyin hem de tek nöron seviyelerinde nöronların görüntülenmesini ve manipülasyonunu sağlayan bir dizi karmaşık araca uygundur 2,3.

Kalsiyum görüntüleme yoluyla Drosophila larva nöronlarındaki kalsiyum dinamiklerini ölçme yeteneği, sinirbilim araştırmalarını ilerletmek için çok önemli olmuştur4. Kalsiyum görüntülemedeki son gelişmeler, larvadaki tek sinapslar düzeyinde kalsiyum dinamiklerininölçülmesine izin vermiştir 5 serbest hareket eden larvalarda6 çoklu nöronal kayıtlara kadar. Kalsiyum görüntüleme, kalsiyum olaylarının tüm larvanın 4,7,8,9 doğal fizyolojik bağlamları altında yakalandığı in vivo veya simüle edilmiş fizyolojik koşullar altında korunan diseke edilmiş larva dokularında kalsiyum olaylarının kaydedildiği ex vivo olarak gerçekleştirilebilir10. Genel olarak, araştırmacılar Drosophila larvalarında nöral devrelerin, duyumların, öğrenmenin ve hafızanın ve davranışın temel mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kalsiyum görüntüleme yönteminin çeşitli yinelemelerini kullandılar 8,11,12,13,14,15,16,17 . Bununla birlikte, larva kalsiyum görüntüleme çalışmaları, özel ekipman ihtiyacı ve hareket artefaktları nedeniyle veri yorumlamadaki sorunlar nedeniyle sınırlıdır.

Burada, üçüncü dönem Drosophila melanogaster larvalarında hem in vivo hem de ex vivo kalsiyum görüntüleme için uygun maliyetli ve kolay uygulanabilir bir metodoloji sunuyoruz. İnhibitör bir koku alma devresi nöronu18,19 olan Keystone-LN'de, in vivo kalsiyum görüntülemeyi sergilemek için tüm larva preparatlarında ve ex vivo kalsiyum görüntülemeyi sergilemek için diseke edilmiş larva beyinlerinde kalsiyum dinamiklerini görüntülüyoruz. Bütün larvalar ve diseke edilmiş beyinler, görüntüleme koşullarımız altında yaklaşık 10-15 dakika boyunca canlı ve duyarlı kalır ve numune başına birden fazla uyaran denemesinin elde edilmesine izin verir. Doku canlılığını korurken ve deneysel değişkenliği azaltırken tüm larvaları veya doku örneklerini hareketsiz hale getirme zorluğunun üstesinden gelmek için, biyouyumlu bir siyanoakrilat topikal doku yapıştırıcısı olan GLUture'ın kullanımını optimize ettik.

Agaroz gömme veya sabitleme gibi geleneksel larva immobilizasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yapışkan bazlı yaklaşım, doku canlılığını korurken hareket artefaktlarını azaltır20,21; İki fotonlu görüntüleme sistemlerine kıyasla, dönen disk kurulumu enstrümantasyon maliyetlerini düşürür ve kaynakları sınırlı laboratuvarlar için erişilebilirliği artırır. Son olarak, veri analizleri için özel olarak geliştirilmiş R komut dosyalarıyla birlikte basit görüntüleme yaklaşımlarını açıklıyoruz. Yaklaşımımız larva kalsiyum görüntüleme çalışmalarına erişilebilirliği artırabilir ve hem kokular gibi dış uyaranların hem de nöromodülatörler gibi iç uyaranların etkilerini incelemek için uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Üçüncü dönem Drosophila larvalarının kalsiyum görüntüleme için hazırlanması

  1. Sinekleri standart sinek yemi üzerinde tutun ( Malzeme Tablosuna bakınız) 25 °C'de, P-60 bağıl nem (RH) ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ile.
  2. İlgilenilen nöron(lar)da ('X') nöron tanımlaması için Kırmızı Floresan Proteini (RFP) ve GCaMP6f'yi (kalsiyum göstergesi) eksprese etmek için, X-Gal4 hattının bakire dişilerini UAS-GCaMP6f ve UAS-tdTomato22 taşıyan erkeklerle çaprazlayın.
    NOT: Bu çalışma için, Keystone-Gal4 hattı, larva beynindeki tek bir çift inhibitör lokal nöronda (Keystone-LN'ler) tdTomato ve GCaMP6f ekspresyonunu yönlendirmek için kullanıldı18,19.
  3. Erkek ve dişi sineklerin çiftleşmesine ve 48 saat yumurtlamasına izin verdikten sonra yetişkinleri taze bir şişeye aktarın.
  4. Üçüncü dönem larvalarını (yumurtlamadan yaklaşık 120 saat sonra) 'lik bir sakaroz çözeltisi üzerinde yüzdürerek çıkarın. Yüzen larvaları 1.000 mL'lik bir cam behere aktarmak için bir P1000 mikropipet kullanın.
  5. Beherdeki suyu her seferinde 800 mL taze damıtılmış su ile değiştirerek larvaları 3-4 kez yıkayın. Protokolün geri kalanına geçmeden önce larvaların 10 dakika dinlenmesine izin verin.

2. Üçüncü dönem Drosophila larvaları için açlık protokolü (aç ve aç olmayan koşullar test ediliyorsa)

  1. 6 cm'lik Petri kaplarına küçük bir kare laboratuvar mendili yerleştirerek iki besleme odası hazırlayın. Aç olmayan koşullar için 350 μL 0,2 M sükroz çözeltisi ekleyin; aç koşullar için 350 μL damıtılmış su ekleyin.
  2. Her besleme odasına eşit sayıda yıkanmış larva aktarın. Larvaların oda sıcaklığında 2 saat boyunca sakaroz (aç kalmamış) veya damıtılmış su (aç) ile beslenmesine izin verin.

3. İn-vivo kalsiyum görüntüleme

NOT: Doku yapıştırıcısını içeren tüm deneyler standart laboratuvar güvenlik uygulamaları kullanılarak yapılmalıdır. Nitril eldivenler, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük veya yüz siperi dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (KKD) gereklidir; Siyanoakrilat ile ekzotermik reaksiyonlar nedeniyle pamuklu eldivenlerden kaçınılmalıdır. Yapıştırıcının cilt, göz veya mukoza zarlarıyla temasından kaçının. Cildin yapışması durumunda, bölgeyi ılık, sabunlu suya batırın ve nazikçe ayırın; Gözün maruz kalması durumunda ≥5 dakika ılık suyla yıkayın ve derhal tıbbi yardım alın. Kürlenmiş yapıştırıcı yandığında tahriş edici dumanlar çıkarabileceğinden, yapıştırıcı açık alevden ve yüksek ısıdan uzak tutulmalıdır. Yapıştırıcıyı ≤30 °C'de, nemden ve doğrudan güneş ışığından uzakta, kullanılmadığı zaman sıkıca kapatılmış bir kapta saklayın.

  1. Kalsiyum görüntüleme tamponunu aşağıdaki bileşimle hazırlayın: NaCl 110 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 1.2 mM, MgCl2 0.8 mM, D-glukoz 10 mM ve HEPES 10 mM. Kullanılmadığı zaman 4 °C'de saklayın.
    NOT: 110 mM NaCl içeren modifiye salin, larva CNS diseksiyonu ve görüntüleme için yaygın olarak kabul edilen bir formülasyondur ve elektrofizyoloji ve görüntüleme çalışmalarında kullanılan tipik aralığa (≈108-128 mM NaCl) 23,24,25,26 girer.
  2. 24 x 50 mm (1,5 mm kalınlığında) mikroskop kapak camında, bir şırıngadan dağıtılan vazelin kullanarak bir kuyu oluşturun.
  3. Kapak camının ortasına küçük bir damla topikal doku yapıştırıcısı (` 2-oktil ve @ n-bütil siyanoakrilat) yerleştirin. Yapıştırıcıyı bir cam çubuk kullanarak ince, düzgün bir tabaka halinde eşit şekilde yayın.
  4. Tek bir larvayı bir fırça veya ince tel kullanarak yapıştırıcının üzerine dikkatlice aktarın. Larvanın ventral tarafını yapıştırıcının üzerine hafifçe bastırın. Larvanın tamamen hareketsiz olduğundan emin olarak yapıştırıcının kurumasını bekleyin.
  5. Larva hareketsiz hale getirildikten sonra, kapak camını ters mikroskop aşamasına yerleştirin (Şekil 1A).

4. Ex-vivo kalsiyum görüntüleme

  1. Larva diseksiyon tamponunu aşağıdaki bileşimle hazırlayın: NaCl 110 mM, KCl 5.4 mM, CaCl2 0.3 mM, MgCl2 0.8 mM, D-glukoz 10 mM ve HEPES 10 mM. Kullanılmadığı zaman 4 °C'de saklayın.
  2. Ishimoto ve Sano10 tarafından tarif edildiği gibi beyin diseksiyonlarını inceleyin. Kısaca, bir fırça veya ince bir tel kullanarak, tek bir larvayı, altta Silikon Elastomer tabakalı 3,5 cm'lik bir Petri kabına aktarın.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında, larvayı ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve beyni bulun. Diseksiyon makası kullanarak, larvanın ön ucunun yaklaşık üçte biri kadar bir kesim yapın. Ağız kancalarında bir kesim daha yapın. Vücut ve ağız kancalarını çıkarırken beyni koruyun (Janelia Flylight Protokolü27'den uyarlanmıştır).
  4. Ventral korddan motor nöron içeren sinir kümesini tanımlayın. Forseps kullanarak beyni disseke edilen larvaların geri kalanından nazikçe çekin. Beyindeki fazla dokuyu kesin.
    NOT: Beyin kırılgan olduğu için hafifçe aşırı güç kullanmak doku hasarına neden olabilir.
  5. Adım 3.2 ila 3.3'te açıklandığı gibi kalsiyum görüntüleme için doku yapıştırıcısı ile bir mikroskop kapak camı hazırlayın.
  6. Bir P10 mikropipet kullanarak, diseke edilmiş beyni Petri kabından 5 μL diseksiyon solüsyonu ile dikkatlice aspire edin. Beyni yavaşça yapıştırıcının üzerine atın. Yapıştırıcı kurumadan önce, beyni dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin (iki beyin lobu aşağı bakacak ve dorsal ventral kord yukarı bakacak şekilde).
  7. Bir P200 mikropipet kullanarak, 100 μL kalsiyum görüntüleme tamponunu kapak camındaki hareketsizleştirilmiş larva beyni üzerine aktarın.
  8. Kapak camını beyinle birlikte ters çevrilmiş mikroskobun üzerine yerleştirin, dönen bir disk konfokal tarayıcı modülüne ve kalsiyum görüntüleme için bir CCD kameraya bağlayın (Şekil 1B).
    NOT: Ex-vivo preparatlar için, yapıştırıcı hala ıslakken beyni doğru yönlendirdiğinizden emin olun. Optimum görüntü kalitesi için beyni, ROI mikroskop hedefine en yakın olacak şekilde konumlandırın ve ROI'nin yakınında fazla yapıştırıcı uygulamaktan kaçının.

5. Görüntüleme protokolü

  1. Konfokal mikroskobu kullanarak kalsiyum görüntüleme yazılımını açın. GFP lazer (uyarma 488 nm, yoğunluk p, emisyon 525 nm/50 m, OD8) ve RFP lazer (uyarma 561 nm, yoğunluk P, emisyon 610 nm/75 m, OD8) arasında filtre geçişi ile 10x/1,4 NA objektif kullanarak görüntüler yakalayın. Pozlamayı 100 ms ile 1.000 ms arasında, kazancı karşılık gelen pozlama değerinin P'sinde ve görüntü yakalama sırasında 2'lik bir gruplama faktörü ayarlayın.
  2. Mikroskobu 10x büyütmeye ayarlayın ve beyni parlak alan aydınlatması altında bulun.
  3. RFP lazeri ile tdTomato sinyalini arayarak ilgilenilen nöronu tanımlayın (uyarma 561 nm'ye ayarlanmıştır).
    NOT: Doğru pozlama değerini ayarlamak için doygunluğu seçin ve gamayı azaltın.
  4. İlgilenilen bölge (ROI) belirlendikten sonra, GCaMP488f sinyallerini yakalamak için GFP lazere (uyarma 6 nm'ye ayarlanmış) geçin. Her iki kanalın yığın görüntülerini yakalamadan önce hem tdTomato hem de GCaMP sinyallerinin birlikte lokalize olduğundan emin olun.
    NOT: Floresansı en üst düzeye çıkarmak için tdTomato ve GCaMP6f yığın kayıtları için görüntü ayarlarını yapın.
  5. tdTomato ve GCaMP6f sinyallerinin iki ayrı zaman serisi kaydını aynı anda 0,5 kare/sn hızında (toplam 2 dakika) yakalayın.
    NOT: Diseke edilen larva beyni, bu tamponlama koşulları altında yaklaşık 10 dakika canlı kalır; Bu süreden sonra sinyaller bozulacaktır.
  6. Örnek görüntülenmeye hazır olduğunda, tdTomato ve GCaMP6f sinyallerinin iki ayrı zaman serisi kaydını aynı anda 0,5 kare/sn hızında (toplam 2 dakika) yakalayın.
    NOT: Diseke edilen larva beyni, bu tamponlama koşulları altında yaklaşık 10 dakika canlı kalır; Bu süreden sonra sinyaller bozulacaktır.
    NOT: Kantitatif analiz yaparken, doğrusal yoğunluk ölçeklendirmesini korurken lazer gücünü artırmanızı ve dedektör pozlama kazancını gerektiği gibi ayarlamanızı öneririz.

6. Veri işleme ve analizi

  1. tdTomato ve GCaMP6f sinyal yığınlarını açın ve ImageJ (NIH)28'e aktarın.
  2. Doğru ilgi alanını (ROI) belirlemek için, ortak yerelleştirmeyi doğrulamak üzere tdTomato ve GCaMP6f sinyallerini birleştirin. Doğrulamadan sonra tdTomato ve GCaMP6f kanallarını ayırın.
  3. Üst menüde Eklentiler | Yeni'ye tıklayın ve yeni bir makro başlatmak için Makrolar'a tıklayın. Ardından, özel yatırım getirisi tabanlı makroları ImageJ'ye aktarın. GCaMP6f yığınını seçin ve kalsiyum analizi için Çalıştır'a basın.
  4. Özel bir ImageJ makrosu (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging) kullanarak floresan sinyallerini işleyin. Makro önce maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturur, StackReg eklentisini (Katı Kayıt modu)29 kullanarak hareket düzeltmesi gerçekleştirir ve ağartma düzeltmesi uygular.
  5. Kullanıcıların manuel olarak geniş bir yatırım getirisi elde etmesine olanak tanıyan manuel yatırım getirisi seçimi talep eden bir "İşlem Gerekli" açılır penceresi görünecektir. Analize devam etmek için Tamam'ı tıklatın. Hareket düzeltmesini gerçekleştirmek için, çerçeveler arasında yerel uzamsal ve ROI şeklini korurken doğru hareket düzeltmesi için dikdörtgen kutunun tüm çerçevelerdeki tüm yatırım getirisini kapsadığından emin olun.
    NOT: Kayıtlar StackReg kullanılarak ImageJ'ye kaydedildi. Düzlem içi hareket büyük olduğunda (kümülatif XY yer değiştirmesi 1 μM >) veya eksenel Z-kayması odak kaybına yol açtığında, kayıt güvenilmez hale geldi veya numune görüntüleme penceresinden tamamen kayboldu. Bu nedenle, aşırı sürüklenme veya azalan kalsiyum sinyalleri (%>30) gösteren numuneler otomatik olarak etiketlendi ve nöronal aktivitenin doğru ölçümlerini sağlamak için aşağı akış analizinden çıkarıldı. Bu eşikler, kalsiyum görüntüleme çalışmalarında yaygın olarak uygulanan kalite kontrol uygulamalarıyla tutarlıdır 30,31,32,33. Dışlama ayrıca, analizler için yalnızca güvenilir uyarana bağlı kalsiyum geçişlerine sahip kararlı kayıtların kullanılmasını sağlamıştır.
  6. Analiz için, piksel otokorelasyonu tarafından yönlendirilen manuel olarak tanımlanmış dairesel ROI'lerden floresan izlerini çıkarın; bu yatırım getirileri tüm kilit taşı nöron alanını kapsayacaktır.
    1. İki florofor için ham floresan yoğunluğu verilerini çıkarın: GCaMP6f/GFP ve tdTomato/RFP, ImageJ'deki (v1.54p) özel makroları kullanarak (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, bkz.
    2. Görüş alanı boyunca 20 x 20 piksel yatırım getirisi ve 10 piksel adım boyutu olan bir kayan pencere uygulayın. Her ROI için makro şunları hesaplayacaktır: (1) tüm karelerdeki yoğunluk, (2) temel dalgalanma farkı (yani, ilk 10 karedeki maksimum ve minimum yoğunluk değerleri arasındaki fark) ve (3) maksimum kareden kareye yoğunluk değişimi (ΔF). 10 birimden daha az yoğunluk dalgalanmaları gösteren ROI'ler ortadan kaldırılacak ve daha fazla analiz için yalnızca en keskin ΔF değerleri seçilecektir.
    3. Aşağıdaki yöntemleri kullanarak floresan izlerini normalleştirin:
      1. Fmax ve Fmin normalleştirme: Aşağıdaki formülü kullanarak normalleştirilmiş Δ'yi hesaplayın:
        figure-protocol-1
        F'nin her zaman noktasındaki ham floresan olduğu yerde, Fmin minimum floresanstır (başlangıç) ve Fmax kayıt sırasındaki maksimum floresandır.
      2. ΔF/F 0 normalleştirme: Ek olarak, aşağıdaki formülü kullanarak Fo (taban çizgisi) her kaydın ilk 10 karesi tarafından belirlendiği ΔF/Fo normalleştirmesini gerçekleştirin:
        figure-protocol-2
        Burada Ft , t zamanındaki floresanstır ve F0 , ilk 10 kareden hesaplanan temel değerdir.
  7. GCaMP6f sinyallerini çıkardıktan sonra, sol tıklayın ve Tümünü Seç, Kes ve Yapıştır tüm değerleri yeni bir Excel elektronik tablosuna aktarmak için. Üst menü çubuğunda Veri | Metinden Sütunlara. Bir "Metinden Sütuna" sihirbazı açılır penceresi görünecektir. 1. adımda Sınırlanmış'ı seçin ve ardından İleri'ye tıklayın. 2. adımda, Sınırlayıcılar'ın altında Sekme ve Virgül'ü seçin ve ardından İleri'yi tıklatın. 3. adımda Son'u seçin.
    İSTEĞE BAĞLI: Normalleştirilmiş kalsiyum sinyallerini çizmek için Fnorm_FminFmax vurgulayın ve Dağılım Grafiği'ni seçin.
  8. Aşağıdakileri içeren bir .csv dosyası arayın: (1) ham floresan değerleri F, (2) ΔF/Fo ve (3) Fnorm (normalleştirilmiş floresan yoğunluğu). Nihai veri kümesini dört sütun halinde düzenleyin: (1) zaman (çerçeveler), (2) örnek koşul (aç veya beslenmiş), (3) çoğaltma kimliği (bireysel örnek) ve (4) normalleştirilmiş yoğunluk (0'dan 1'e ölçeklendirilmiş Fnorm değerleri).
  9. Son olarak, özel R komut dosyalarını kullanarak R'de veri analizi ve görselleştirme gerçekleştirin (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Özel R betiğini yeni bir R projesine aktarın. Analizi çalıştırmadan önce ggplot2, dplyr ve readr dahil olmak üzere gerekli R paketlerinin yüklendiğinden ve güncellendiğinden emin olun.
    2. Özel R betiğinin 1. satırından başlayarak, kalsiyum analizini gerçekleştirmek için Sürekli çalıştır'a basın. Ayrıca çıktının, ilk 30 kare, 60 kare ve zaman serisi kaydının tüm kareleri için normalleştirilmiş kalsiyum yoğunluğunu gösteren ısı haritalarını ve normalleştirilmiş yoğunlukların medyanını göstermek için kutu grafiklerini içerdiğinden emin olun.
    3. Mann-Whitney U testini kullanarak normalleştirilmiş kalsiyum yoğunluğunun önemini değerlendirin.

7. Atık bertarafı ve dekontaminasyonu

  1. Deneylerden sonra, akan su altında aletlerden ve yüzeylerden büyük kalıntıları temizleyin, ardından p etanol veya çamaşır suyu ve ardından steril su ile dezenfekte edin. Dezenfekte edilmiş bir yüzey üzerinde çalışın ve eldiveni çıkardıktan sonra ellerinizi yıkayın; Laboratuvarda yemek yemeyin veya içmeyin.
  2. Larva dokusunu ve kontamine tek kullanımlık malzemeleri atmadan önce biyolojik tehlike torbalarına ve otoklava koyun.
  3. Tamamen kürlenmiş yapışkan atıkları genel çöp kutusuna atın; Kürlenmemiş yapıştırıcı ve kontamine tek kullanımlık malzemeler, kapalı, etiketli bir tehlikeli kimyasal atık kabında toplanmalıdır.
  4. Tüm kesici aletleri (bıçaklar, iğneler, kırık cam) delinmeye karşı dayanıklı bir kesici alet kabına koyun.
  5. Yanıcı çözücüleri (etanol, aseton) etiketli, yanıcı atık kaplarında toplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Larva kalsiyum görüntüleme yaklaşımımızı göstermek için, bunu Drosophila larvalarının hem in-vivo hem de ex-vivo preparatlarına başarıyla uyguladık (Şekil 2 ve Şekil 3, Video 1, Video 2, Video 3 ve Video 4). Larva beyninde18,19 tek bir Keystone-LN çiftinde GCaMP6f ve Td-Tomato eksprese eden üçüncü dönem Drosophila larv...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, üçüncü dönem Drosophila melanogaster larvalarında hem in vivo hem de ex-vivo kalsiyum görüntüleme için bir yaklaşım açıklıyoruz. Drosophila larvasında inhibitör bir lokal nöron olan Keystone-LN'de kalsiyum dinamiklerini görüntüledik. Keystone-LN kalsiyum dinamiklerini tüm larva preparatlarında (in vivo) ve larva beyninin diseke edilmiş preparatlarında (ex vivo) ölçtük (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu deneyler için laboratuvarının dönen diskli konfokal mikroskobunu bize sunan Dr. Jeffrey Harper'a minnettarız. Sinek hattının hediyesi için minnettarız: w; UAS-GCaMP6f/CyO, ağla; Dr. Jung Hwan Kim'den UAS-tdTomato . Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı'nın 2341202 ve 2129234 numaralı ödül numaraları altındaki fonlarıyla desteklenmiştir. Şekil 1 , Biorender kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fly Stocks & Bakım
Nutrifly sinek mamasıGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoDr. JH Kim 'den hediye;
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Açlık için reaktifler protokolü
6 cm Petri kabıGenesee Scientific32-106G
SakarozMillipore SigmaS0389-500G
Görüntüleme ve Disseksiya Tamponu için Reaktifler
Kalsiyum klorürJ.T. Baker, Avantor BilimleriJT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-GlikozThermo Fisher ScientificA16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Hidroksietil)-1-piperazinil]-etansülfonik asitJ.T. Baker, Avantor BilimleriJT4018-1CAS: 4018-01, 100g
Magnezyum klorürVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
Potasyum klorürThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
Sodyum klorürEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
Diseksiyon için Araçlar ve Reaktifler
Diseksiyon TamponuMetin içinde sunulan kompozisyon
Olympus Petri Kabları, 60 x 15mm havalandırmalıGenesee Scientific32-105
Sylgard 184 Elastomer TabanıElektron Mikroskopi Bilimleri24236-10A
Sylgard 184 Elastomer Bazlı Kürleme AjanıElektron Mikroskopi Bilimleri24236-10B
Cimbizler Stili 5, EMSElektron Mikroskopi Bilimleri78320-5
Vannas Yay Makası - 3mm Kesici KenarGüzel Bilim Araçları15000-00
Görüntüleme ve Montaj Ekipmanları/Reaktifler
Konfokal Tarayıcı modülüYokogawaCSU-W1Mikroskopa bağlı
Görüntüleme TamponuMetin içinde sunulan kompozisyon
Ters MikroskopLeica MicrosystemsDMi8 Dönen disk konfokal tarayıcı modülü ve CCD kameraya bağlı
Mikroskop Kapak Camı, 24mm x 50mm, #1.5 KalınlıkGlobe Scientific Inc.1415-15
MWI Veteriner GLUTURE Topikal YapıştırıcıFisher ScientificNC0632797
Saf VazelinWalgreens912556
Kamuya Açık Kaynaklara Bağlantılar
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Janelia Flylight protokol videosuhttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Kaynaklar

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Drosophila LarvasıIn Vivo GörüntülemeEx Vivo GörüntülemeDönen Disk KonfokalHareket DüzeltmeGCaMP6f FloresansıDoku İmmobilizasyonuROI Analizi
Üçüncü Dönem Drosophila melanogaster Larvasında Bir Koku Alma Devresi Nöronunun İn-vivo ve Ex-vivo Kalsiyum Görüntülemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.