Çift Yoğunlaştırıcı Lens Sistemine sahip 200 kV Geçirimli Elektron Mikroskobu kullanarak Yüksek Kaliteli Tomografik Veri Toplama Sağlanması

Summary

Elektron tomografi, kriyobiyolojik örneklerdeki dokular içindeki organeller, hücreler ve makromoleküllerin neredeyse atomik düzeyde görüntülenmesini sağlar. Böyle bir çözünürlüğe ulaşmak için sıkı kontrollü görüntüleme koşulları gereklidir. Burada, örnek olarak iki aşamalı kondansatör lens sistemine sahip 200 kV geçirimli elektron mikroskobu kullanılarak, yüksek kaliteli elektron tomografi veri toplama sürecinin nasıl yapılacağını açıklıyoruz.

Abstract

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel organellerin ve büyük protein komplekslerinin doğal ortamlarındaki yapılarını aydınlatmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Geleneksel oda sıcaklığındaki elektron mikroskopisinin aksine, kriyo-ET radyasyon ve hazırlık kaynaklı iç yapılara verilen hasarı en aza indirir. Ayrıca, tek parçacık analizinin (SPA) aksine, kriyo-ET tekrarlayan arıtma ihtiyacını azaltır ve böylece örneklerin en özgün yapısal bilgisini korur. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlamak için kriyo-ET, TEM'in görüntüleme koşullarına da sıkı gereksinimler getirir. Kriyo-ET veri toplama verimliliğindeki sürekli iyileşmeye ve birçok yazılım platformunun ortaya çıkmasına rağmen, çoğu çözüm teskili, tedarikçiye özgü ve belirli elektron mikroskop modellerine sıkı sıkı bağlı, yüksek uygulama maliyetlerine yol açar. Bu çalışmada, açık kaynak yazılımı SerialEM'i 200 kV elektron mikroskopuna (Glacios 2 cryo-TEM) çift yoğunlaştırıcı lens sistemiyle kurduk ve yüksek kaliteli tomografik veri toplama için kapsamlı kalibrasyonlar gerçekleştirdik. Apoferritin model örneği olarak, kriyo-örnek hazırlamadan otomatik kriyo-ET veri toplamaya kadar tüm iş akışını, ardından tomogram rekonstrüksiyonu ve alt tomogram analizini tanımlıyoruz. Bu yöntem, özellikle özel yazılıma erişimi olmayan Glacios mikroskopları kullanan laboratuvarlar için kriyo-ET veri toplama için maliyet etkin ve erişilebilir bir çözüm sunar.

Introduction

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), makromoleküler komplekslerin ve hücresel organellerin doğal yapılarını in situ incelemek için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Kriyo-ET'nin tek parçacık analizine (SPA) göre büyük avantajlarından biri, aşırı arıtma adımlarından kaçınabilmesi, böylece hedef biyomoleküllerin biyolojik bağlamlarında doğal durumunu korumasıdır. Şu anda, temizlenmiş^organeller 1,2,3,4, hücre zarı levhaları, makromoleküler ^{kompleksler 5},^{virüs 6}, hücresel lameller⁷ ve doku^{kesitleri 8,9,10} dahil olmak üzere geniş bir örnek yelpazesi kriyo-ET ile incelenebilmektedir. Örnek türlerinin ve deneysel hedeflerin çeşitliliği göz önüne alındığında, veri toplama stratejileri önemli ölçüde farklılık gösterir ve hem numuneye hem de özel cihaz konfigürasyonuna dikkatlice uyarlanmalıdır.

Veri toplama, kriyo-ET iş akışında kritik bir adımdır; çünkü hem veri kalitesi hem de edinim verimliliği, doğrudan sonraki işlemeyi ve deneyin genel deneysel başarısını etkiler. Gelişen deneysel talepleri karşılamak için birkaç veri toplama platformu geliştirilmiştir. En yaygın kullanılanlar arasında ticari Tomografi ve açık kaynak yazılımı SerialEM 11,12,13 bulunmaktadır. Tomografi, düşük öğrenme eğrisine sahip son derece entegre ve kullanıcı dostu bir arayüz sunar, ancak daha az esnektir ve ticari lisans gerektirir. Buna karşılık, SerialEM hem grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı hem de script tabanlı iş akışlarını destekleyen ücretsiz, açık kaynaklı bir pakettir ve daha fazla esneklik ve genişletilebilirlik sağlar.

Kriyo-lamellerden tomografik veri toplamak benzersiz zorluklar yaratır. Yüksek kaliteli lamellerin hazırlanması zordur ve mekanik kararsızlıkları ile elektron ışınına karşı yüksek hassasiyetleri veri toplamayı daha da zorlaştırır. Bu zorlukları ele almak için Fabian Eisenstein, SerialEM'in geliştirilmiş bir geliştirilmiş PACEtomo iş^{akışı 14'ü} geliştirdi; bu da eğim serisi başına birden fazla tomogram elde etmek için ışın görüntü kaydırmasını ekleyerek odak ve takip ayarlamalarının sıklığını azaltıyor. Bu strateji, her bölümden kullanılabilir veri miktarını en üst düzeye çıkarırken gereksiz elektron maruziyetini en aza indirir. Benzer işlevsellik ticari Tomography5 yazılımında da mevcuttur.

Buna karşılık, kriyo-sabit organellerden veya membran levhalarından veri toplamak genellikle daha basittir; çünkü bu örnekler genellikle delikli karbon ızgaralarında hazırlanır ve odaklanma ve takip için geniş alan^{sunar 15,16}. Bu tür durumlarda, SerialEM'in yerleşik cryo-ET edinim iş akışları — doğrudan GUI üzerinden erişilebilen — özellikle yeni başlayanlar veya küçük laboratuvarlar için uygun olan, betik yazmadan kullanışlı bir seçenek sunar. Bununla birlikte, verimlilik açısından, mümkün olduğunda ışın görüntü kaydırmasına dayalı stratejileri öneriyoruz.

Kriyoelektron mikroskoplarının yüksek maliyeti göz önüne alındığında, cihaz kullanımını maksimize etmek için veri toplama stratejilerinin optimize edilmesi şarttır. İki aşamalı yoğunlaştırıcı lens sistemiyle donatılmış 200 kV TEM, kalın örnekler için 300 kV'luk bir cihaza göre biraz daha düşük elektron nüfuzu sağlar, ancak doğru kalibrasyon edildiğinde kriyo-ET için tam olarak kullanılabilir kalır. Ancak, paralel ışın koşullarının nispeten dar aralığı ve büyütmeler arasında sabit nokta boyutu, sistem tam olarak optimize edilmedikçe genellikle yüksek çözünürlüklü kriyo-ET için daha az uygun hale getirir.

Elektron mikroskopisi kurulumuz, tek elektron sayma yeteneği ve yüksek hızlı sürekli görüntüleme açısından önemli avantajlar sağlayan Falcon 4i doğrudan elektron algılama kamerası ile donatılmıştır. Bu dedektörün performansından tam olarak yararlanmak için TEM'in iyi optimize edilmiş görüntüleme koşullarında çalıştırılması gerekir. İki aşamalı yoğunşör sistemi kullanan TEM'ler için, paralel ışık için aydınlatma koşullarının hassas kalibrasyonu, görüntüleme kalitesini artırmada önemli bir^{faktördür 17,18}. Modern iki aşamalı kondansatör sistemlerinde, ikinci aşama kondansatör lensinin odak noktası, örnek düzlemiyle kesişen optik yolun paralel olmasını sağlamak için üst objektif lensin ön odak düzlemiyle örtüşmelidir. Doğru şekilde belirlenmiş paralel ışık koşulları, toplanan görüntülerde alt odak değerlerinin ve büyütmenin yerel konumlarda tutarlı kalmasını sağlamak için çok önemlidir.

Bu çalışmada, apoferritin model örneği olarak kullanan yüksek kaliteli bir kriyo-ET iş akışı oluşturmaya odaklandık. 200 kV iletim elektron mikroskobu sistemi ticari tomografi yazılımı için lisanslı olmadığından, bunun yerine açık kaynaklı SerialEM platformunu kurduk ve kalibre ettik. Mikroskobun iki aşamalı yoğunlaştırıcı lens sistemi için paralel ışın parametrelerini dikkatlice optimize ederek, Python betiklerine veya karmaşık yapılandırmalara gerek kalmadan, SerialEM grafik arayüzü üzerinden otomatik tomografik veri toplama sağladık. Bu yaklaşım, Glacios gibi 200 kV enstrümanlarda verimli kriyo-ET veri toplamı için kullanıcı dostu ve maliyet etkin bir çözüm sunar.

Protocol

1. Kriyo-örneklerin hazırlanması ve yüklenmesi

1. Vitrobot'u hazırlamak için onu açın ve sıcaklığı 10 °C'ye ayarlayın. Nem seviyesini %100'e ayarlayın. Filtre kağıdını değiştirin.
2. 300 ağlık R1.2/1.3 delikli karbon filmli Cu ızgara ızgarasını parlatma sistemine yerleştirin. Parlayan boşalma koşullarını 60 saniye boyunca 15 mA'ya ayarlayın ve 0.39 mBar vakum basıncı, negatif yük. Şebeke yüzeyini hidrofilize etmek için parlayan boşalmayı gerçekleştirin.
3. Vitrobot parametrelerini şu şekilde ayarlayın: Leke süresi: 3 saniye, Bekleme süresi: 0 saniye, Leke kuvveti: 2, Sıcaklık: 8 °C, Nem %90.
4. Sıvı azotla sarılmış etan bardakta sıvı azotla soğutularak sıvı etan hazırlayın.
5. 3 μL apoferritin örneği parlayan ızgaraya uygulanır. Numuneyi hemen sıvı etanla vitrifye edin
6. Örneği etandan sıvı azotta önceden soğutmuş bir depolama kutusuna aktarın. Kriyo-numune hazırlığı artık tamamlandı.
   DIKKAT: Sıvı azot ve etan ile çalışırken aşağıdaki güvenlik protokolleri sıkı bir şekilde takip edilmelidir: Operasyon sırasında donmayı önlemek için kişisel koruyucu ekipman (örneğin kriyojenik eldivenler ve güvenlik gözlükleri) gereklidir; Etan yoğuşmasından önce, hızlı kaynamadan kaynaklanan sıçrama önlemek için alıcı bardağın sıvı azottan arınmış olduğundan emin olun; Kullanımdan sonra, sızıntıyı önlemek için etan gazı sisteminin ana ve basınç düzenleyici vanalarını güvenli bir şekilde kapatın; Örnek hazırlığından sonra kalan etan ve sıvı azot, hazırlık odasında belirlenmiş havalandırma ekipmanlarına bertaraf edilmelidir.

2. Elektron mikroskopisi için paralel ışık koşullarının belirlenmesi

1. Paralel ışın hizasını yapmadan önce, öncelikle skopun aşağıdaki parametrelerini ayarlayın: eucentric yükseklikte aşama, odakta objektif lens, nP ışın eğimi ppX/ppY, komasız pivot noktası X/Y, koma ve damga.
2. Çapraz ızgara kullanarak, örneğin Nano prob modunda (enerji filtresiz× SA 73.000 büyütmede ve doğru odakta olduğunu doğrulayın.
3. Kırınım Modu'na geçin (kamera uzunluğu: D750 mm) ve 100 μm nesnel diyaframı takın (Şekil 1A, 1B).
4. Hedef açıklığı için Adjust sekmesine tıklayın ve çok fonksiyonlu X ve Y düğmelerini kullanarak aperturu merkezden dışa taşıyarak diyaframanın kenarının altın kırınım halkalarının üzerine örtülüp merkezi noktayı kısmen kapatmasını sağlar (Şekil 1C).
5. Objektif lensinin arka odak düzlemini Focus düğmesi ile difraksiyon odakını ayarlayarak görünüme getirin; objektif açıklığının kenarı mümkün olduğunca keskin hale getirilir (Şekil 1D).
6. Altın kırınım halkalarının genişliği en aza indirilene kadar ışın yoğunluğunu (C2 kuvveti) ayarlayın.
7. Nesnel açıklığı ortala. Kırınım kamerasının uzunluğunu sadece merkezi nokta görünene kadar artırın (Şekil 1E).
8. Stigmator panelindeki Difraksiyon sekmesine tıklayın ve çok işlevli X ve Y düğmeleriyle merkezi noktanın şeklini ayarlayın; crossover noktasının üstünde ve altında dönerek ışını dairesel hale getirin (Şekil 1F).
9. Işın yoğunluğunu merkez noktası en aza kadar ayarlayın. Bu, paralel aydınlatma koşulları oluşturacaktır. Paralel aydınlatma koşulları farklı nokta boyutlarına göre değişebileceğinden, gelecekteki deneylerde hızlı yapılandırmayı kolaylaştırmak için yaygın kullanılan her nokta boyutu için ilgili C2 ayarlarını belgeleyin.
   NOT: Veri toplama sırasında kullanılan spesifik nokta boyutu, büyütme ve C2 diyafram ayarına bağlıdır; Görüntülemenin kamera için en uygun doz oranında yapılmasını sağlamamız gerekiyor.

3. Apoferritin örnekleri için yüksek kaliteli elektron tomografi veri toplama

NOT: Bu bölüm, hem deneyimli kullanıcılar hem de yeni araştırmacılar için uygun olan yüksek verimli tomografik veri toplama için standartlaştırılmış bir prosedürü özetlemektedir.

1. Izgiyi kesip hazırlanan kriyo-örneği elektron mikroskobuna yüklemek için, O-halkayı hizalama aracına yerleştirin, hazırlanan ızgara ise O-halkanın ortasına yerleştirilir. Yay kalemi ile C-halkayı O-ring'e takarak örneği aralarına sabitleyin.
2. Autogrid'i kasetin yuvasına dikey olarak yerleştirin, iş istasyonu üzerinden nanocup'a aktarın ve ardından elektron mikroskobuna yükleyin.
3. SerialEM kullanarak tüm ızgaranın tam montajını yakalamak için SerialEM yazılımını başlatın. Düşük Doz modunu etkinleştirin. Arama modunu 115× büyütmede tanımlayın.
   NOT: Arama büyütmesi genellikle büyük alan haritaları elde etmek için kullanılır. Bu büyütme, eşleme sürecini hızlandırmak ve görüntü birleştirmesinin doğruluğunu sağlamak için mümkün olduğunca düşük ayarlanır.
4. Navigator dosyasını açın. Navigator'> montaj ve ızgaralar bölümlerine gidin > tam montajı kurun. Diyalog kutusunda, Arama Modu'nu Kullan; Resimleri bin4 formatında kaydet. Montaj Kontrolleri altındaki Başlat'a tıklayın.
5. Arama ve görüntü alanlarını kalibre etmek için, Arama modunda, çok tanınabilir bir simge noktasını bulun (Şekil 2A). Navigator'da Add Marker tuşuna tıklayın. İşaret konumuna geçmek için İşaretçeye Git'e tıklayın.
6. View (2600×) moduna geçin ve aynı simgeyi bulun. Landmark'a tıklayın. Navigator'a gidin, alanları hizalamak için Shift to Marker'a tıklayın (Şekil 2B). Diyalog kutusundaki önerilere bakıldığında, her iki büyütmeden gelen ışın kaydırmaları arama haritasındaki tüm işaretçilere atanır ve kaydırma değerleri kaydedilir (Şekil 2C).
   NOT: Görünüm büyütmesi genellikle Seçilen Alanın (SA) en düşük büyütmesine ayarlanır, böylece hem görüntü hem de Kayd aynı modda olur ve büyütme anahtarlamasında merkezleme süreci daha kolay hale gelir.
7. Görünüm ve kayıt alanlarını kalibre etmek için (Şekil 3). View modunda, oldukça tanınabilir bir simge yapıyı bulun. Kayıt (120k×) moduna geçin. Kayd modunda işareti ortalamak için fareyi kullanın.
   NOT: Kayıt büyütme ayarı, tahmini hedef çözünürlüğüne (hedef çözünürlük piksel boyutunun iki katıdır) ve örnek boyutuna bağlıdır.
8. Tekrar Görünüm moduna geçin ve fotoğraf çekin. Hedef nesneyi görüş büyütme altındaki noktayı sağ fare tuşu ile görüş alanının merkezini temsil eden nişangaha sürükleyin.
9. Defocus bölümünde Shift yanındaki Set'e tıklayarak alanları hizalayın.
10. Hedef kareni seçip tam montajda orta büyütme haritası 5.1 yakalamak için, ele geçirilecek alanı belirtmek için Çoklu Ekle tuşuna tıklayın. Bir alanı belirttikten sonra, seçimi tamamlamak için Eklemeyi Durdur tuşuna tıklayın.
11. İstediğiniz tüm alanlar için 3.10. adımı tekrarlayın. Navigator'daki her çokgen için, Öğe seçeneklerindeki Acquire (A) ve Yeni Dosya seçeneklerini kontrol edin.
12. Öğede Yeni Dosya işaretinden sonra görünen diyalog kutusunda şunları seçin: Montajlı görüntüler; Montajı çokgon üzerine yerleştir; Bir sonraki yeni dosya açılacakken dosyayı kapat. Tamam tuşuna tıklayın.
13. Yeni diyalog kutusunda şunları seçin: Görüntüyü kaydırmak yerine aşamayı taşıyın; Düşük Doz modunda Görüntü parametrelerini kullanın. Görüntüyü belirtilen konuma kaydedin.
14. Orta büyütme haritasını yakalamak için Navigator menüsünden Items at Acquire tuşuna tıklayın. Aşağıdaki seçenekleri kontrol edin: Görüntü veya montaj edinip kaydet; Navigator haritası oluşturun.
15. Birincil Eylem ile ilgili bölümünde, görüntü yakalamak için Görünüm Kullan modunu işaretleyin. Birincil öncesi veya sonrası görevler bölümünde, Kabaca Ötantriklik (Kaba Ötantriklik) seçeneğini kontrol edin. Orta büyütme haritasını yakalamaya başlamak için GIT tuşuna tıklayın.
16. Orta büyütme haritasında noktaları seçmek için. Navigator arayüzünde orta büyütme haritasını açın. Add Point (Nokta Ekle) tuşuna tıklayın ve haritadaki Hedef Nesnelere sol tıklayın.
17. İstenilen tüm puanlar için tekrarlayın. Tüm noktaları seçtikten sonra, seçimi tamamlamak için Stop Add tuşuna tıklayın.
18. Diyafram hizalanması için, mikroskop arayüzünde doğrudan hizalamalar kullanarak nP Beam eğimini ppX/ppY ve komasız Pivot Noktası X/Y'yi ayarlayın; böylece görüş alanında ışın noktası sallanmasını en aza indirebilirsiniz.
19. SerialEM script kütüphanesinden (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47) bir script kullanarak akort kapsamı gerçekleştirin.
20. Tomografi veri toplamayı başlatmak için, Navigator arayüzünde ROI'yi bulun ve Tilt Serisi'ni kontrol edin. Diyalog kutusunda Frames Images; Veri depolama yerini seçin.
21. Ayarlar diyalogunda -50° ile 50° arasında bir derece aralığı ayarlayın. Temel artışı 2.5°, başlangıç açısını 0° ve Doz-simetrik şemayı etkinleştirin.
    NOT: Eğime başına doz, eğim açısı aralığı ve eğim adımı genellikle aşağıda belirtilen prensipleri takip eder: Toplam doz yaklaşık 100 e⁻/Ų olarak tutulur. Eğim aralığı, en yüksek eğim açısında bile numunenin büyük ölçüde engellenmeden kalmasını ve yeterli elektron iletimi ile görüntülemeye olanak sağlamasını sağlamak için seçilir. Eğim aralığı nispeten büyükse (örneğin ±60°'nin üzerinde), eğim adımı 3°'ye ayarlanabilir. Daha küçük eğim aralığı için (örneğin yaklaşık ±50°), eğim adımı 2,5° veya 2°'ye düşürülerek toplam dozun yaklaşık 100 e⁻/Ų civarında kalmasını sağlar. Bu özellikle, radyasyon hasarının 300 kV mikroskoplara göre daha belirgin olduğu 200 kV mikroskoplar için önemlidir; bu nedenle aşırı toplam dozdan kaçınmak önemlidir.
22. Işın Yoğunluğu veya Pozlama Kontrolü bölümünde, ışın yoğunluğunu Sakla seçeneğini kontrol edin. Defocus hedefini -3 μm olarak ayarlayın ve Otomatik Odaklama frekansını eğime başına bir kez ayarlayın.
23. Otomatik hizama görüntü boyutunun %60'ından fazlasını kaydırırsa Stop seçeneğini işaretleyin, Öncesi ve Sonrası İzlemeyi ayarlayın.
24. Veri toplamaya başlamak için Navigator'da Items at Acquire tuşuna tıklayın. Ana eylemde, otomatik odaklamada Cycle defocus hedefi, drift wait ve TS kontrol edin.
25. Odaklanma aralığı -3.5 ile -4.5 μm arasında, 4 adımda ayarlanır. General altında, ucundaki Kapalı kolon vanalarını etkinleştirin. Birincil öncesi veya sonrası görevler bölümünde, Birincil öncesi öğeye ve İnce Ötantrikliğe Yeniden Hizalama özelliğini etkinleştirin.

4. Apoferritinin subtomogram ortalaması

1. Warp¹⁹ kullanarak hareket düzeltmesi ve CTF tahmini gerçekleştirin. AreTomo3²⁰ kullanılarak tomografik eğim-seri hizalama yapıldı.
2. Warp kullanarak tomografik rekonstrüksiyon ve dekonvolüsyoner gerçekleştirin. PyTom²¹ kullanarak şablon tabanlı parçacık seçme işlemi yapılabilir.
3. İlk iyileştirmeyi RELION 5²² ile gerçekleştirin. M²³ kullanarak yüksek çözünürlüklü iyileştirme yapın.
4. Sekiz eğim serisi işlenerek nihai yapıyı belirleyin, ardından 5.939 parçacık seçilir ve yinelemeli iyileştirme yapılır, nihai çözünürlük 2.8 şelde edilir (Şekil 4).

Results

Kesin paralel ışın hizalamasından sonra, SerialEM'in grafik arayüz fonksiyonunu kullanarak apoferritin için tomografi veri topladık. Warp, AreTomo, PyTom, RELION ve diğer ilgili yazılımlarla yapılan sonraki işlemler, 2.8 şçözünürlükte nihai bir yapı elde etti. Bu çözünürlük, verilerimizin yüksek kalitesini yeterince gösteriyor ve subtomogram ortalamasıyla nispeten yüksek çözünürlükte ulaşılabilen bir seviyeye ulaşıyor. Şekil 4'te gösterildiği gibi, hizalanan ve yeniden oluşturulan sonuçlar (Şekil 4A) apoferritinin genel mimarisini ve mekansal dağılımını açıkça göstermektedir. Subtomogram ortalaması, sekiz hizalanmış ve yeniden oluşturulmuş eğik serisinden çıkarılan parçacıklar üzerinde yapıldı ve 2.8 şçözünürlükte bir yapı elde edildi (Şekil 4B). İlgili Fourier kabuğu korelasyonu (FSC) eğrisi Şekil 4C'de sunulmaktadır.

Şekil 1: İkinci kondensör lens sistemi kullanılarak paralel aydınlatma koşullarının belirlenmesi. (A) Diyafram olmadan Kırınım Modunda kırınım desenleri. (B) 100 μm objektif açıklık yerleştirildikten sonra kırınım desensi. (C) Kenar keskinliğini daha iyi görselleştirmek için diyafram merkezinden kaydırma. (D) Objektif ve C2 lens akımlarını ayarlayarak odaklanmış diyafram kenarı ve optimize edilmiş kırınım halkaları. (E) Stigmator paneli ile düzeltme gerektiren eliptik merkezi kırınım noktası. (F) Optimize paralel aydınlatmayı gösteren dairesel ve en düşük merkezi kırınım noktası. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Aramadan (115×) Görünüm (2600×)'e kadar yüksekten düşükten büyütme hizalama süreci. (A) Kırmızı okun deliğin kenarında konumlandırıldığı arama modu görüntüsü. (B) İşaretçiyi (kırmızı ok) (A)'daki nesne konumuna yerleştirdiği görüntü modu görüntüsü. Navigatorda Shift to Marker seçeneği tıklanır. (C) Açılır pencerede, her iki büyütmeden gelen ışın kaymaları Arama haritasındaki tüm işaretçilere atanır ve kaydırma değerleri kaydedilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Görünüm (2600×) ile Kayıt (120k×) arasında yüksekten düşükten büyütme hizalama süreci. (A) Kayıt modunda, hedef nesne görüş alanının merkezinde konumlandırılır (kırmızı kesik daire hedef nesneyi vurgular). (B) Hedef nesnenin kırmızı nişangah ile hizalanmadığı Görünüm modunda çekilen görüntü (kırmızı kesik daire hedef nesneyi ve kırmızı nişangahı vurgular). (C) Hedef nesne, sağ tıklayarak ve hareket ettirerek kırmızı nişangahın ortasına çekilir, ardından Shift düğmesinin yanında bulunan Set düğmesine basılır (kırmızı kesik kutu düğmeyi vurgular). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Apoferritinin yapı belirlemesi. (A) Yapısal görüntüleme. Son subtomogram ortalamasının yerel çözünürlük haritası. Doku tekiz görünüyor; tüm görüş alanında birbirine yakın düzenlenmiş, tekrarlayan nano ölçekli özellikler var. (B) Mekânsal olarak çözülen nicel eşleme. Aynı veya ilgili nanoyapılı bir bölgenin sahte renkli, dairesel haritası. Renkler, aşağıdaki renk ölçeğinde gösterilen sayısal değerlere karşılık gelen mavi/yeşilden sarı/kırmızıya kadar değişir (yaklaşık 2,5 ila 3,5 oran rastgele birimler). Heterojen renk dağılımı, örnek genelinde ölçülen bir özellikte (örneğin, yükseklik, kalınlık, kırılma indeksi veya mekanik/optik yanıt) mekânsal değişimi gösterir. (C) Küresel spektral veya fonksiyonel karakterizasyon. Çözünürlük tahmini için kullanılan Fourier kabuk korelasyonu (FSC) eğrisi. 2.8 Å'nin nihai çözünürlüğü, kesik çizgiyle FSC = 0.143 olarak gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Kriyo-numune hazırlama ve elektron tomografi veri toplama prosedürleri, belirli örnek tipine uyarlanmalıdır. Burada tanımlanan deneysel strateji, biyolojik makromoleküller, protein kompleksleri ve küçük organeller için oldukça uygundur. Bu örnekler doğrudan elektromanyetik ızgaralara vitrifikasyon yapılabilir ve nispeten küçük kalınlıkları verimli elektron iletimi ve yüksek kontrastlı görüntülerin elde edilmesini sağlar. İdeal olarak, örnek kalınlığı 200 nm'yi geçmemelidir.

Dalmış donmuş örneklerde, kristal buz oluşumunu en aza indirmek için genellikle 10 μm'den küçük yan boyut tercih edilir; bu da yapısal bütünlüğü tehlikeye atabilir. Daha büyük örneklerde, yüksek basınçlı dondurma veya tampon içine gliserol gibi kriyoprotektanların dahil edilmesi buz^{çekirdeklenmesini geciktirebilir 23}. Ancak, TEM için kalınlık gereksinimlerini karşılamak için genellikle daha fazla inceltme gereklidir. Mevcut inceltme yöntemleri arasında, odaklı iyon ışını (FIB) frezeleme²⁴, hassasiyeti ve minimum hasarı nedeniyle en yaygın olanıdır ve yüksek çözünürlüklü kriyo-ET için uygun lameller üretir.

Lamella veri toplama sırasında, lamella kullanımını maksimize etmek kritik öneme sahiptir. Işın-görüntü kaydırma ediniminin uygulanması, tekrarlayan odaklama ve takip adımlarına olan ihtiyacı azaltarak veri toplama verimliliğini artırabilir. Burada ayrıntılı olarak açıklanmasa da, bu teknik PACEtomo metodolojisinde kapsamlı şekilde açıklanmıştır.

Şu anda tomografik veri toplama için popüler yazılım seçenekleri arasında Tomografi (Thermo Fisher Scientific) ve SerialEM bulunmaktadır. Tomografi, özelleştirme konusunda sınırlı esnekliğe sahip ticari bir çözümdür; SerialEM, Colorado Üniversitesi Boulder'dan David Mastronarde tarafından geliştirilen, script tabanlı otomasyonu destekleyen açık kaynaklı bir yazılımdır. Ancak, SerialEM'in yeteneklerinden tam anlamıyla yararlanmak önemli bir öğrenme eğrisi gerektirir. Bu çalışmada, SerialEM'in arayüzünü kullanan, betik yazma veya Python tabanlı yapılandırmalara olan ihtiyacı ortadan kaldırırken gece boyunca gözetimsiz veri edinmesini mümkün kılan sade bir iş akışı sunuyoruz.

Bu yöntemle tomografik veri toplama sırasında karşılaşılan sıkça karşılaşılan zorluklardan biri, yanlış takip olmasıdır; bu da eksik açılarla eksik eğim serilerine yol açabilir veya sonraki hizalanmayı karmaşıklaştırabilir. Bu sorunları azaltmak için, izleme parametreleri örnek kontrastı ve eğime aşaması kararlılığına göre optimize edilmelidir. Etkili stratejiler arasında, görüntü netliğini sağlamak için takip pozisyonlarındaki pozlama süresinin ayarlanması, takip ve odaklama pozisyonlarının fiziksel olarak ayrılarak birikimli radyasyon hasarını azaltmak ve aşama stabilitesi zayıf olduğunda takip büyütmesinin azaltılması yer alır; böylece güvenilir desen uyumu sağlanır. Bu ayarlamalar topluca, çeşitli deneysel koşullarda sağlam takip performansı elde etmek için gereklidir. Bu çalışmada apoferritini model örnek olarak kullanıyoruz. Paralel ışığı test etmek ve düzeltmek öncülü altında, SerialEM'in yerleşik fonksiyonlarını kullanarak kriyo-ET için yüksek kaliteli veri topluyoruz ve ferritin örnekleri üzerinde subtomogram hesaplamaları yapıyoruz, nihai yapıyı 2.8 Å'da elde ediyoruz.

Bu yöntem, yüksek çözünürlüklü kriyo-ET için 200 kV elektron mikroskoplarının uygulanabilirliğini artırmak amacıyla geliştirilmiştir. Böyle bir çözünürlüğe ulaşmak temelde yüksek kaliteli görüntüleme verilerinin elde edilmesine bağlıdır ve bu da hassas aydınlatma koşullarını gerektirir. Bu amaçla, kritik bir hazırlık adımı olarak doğru paralel aydınlatma hizasını gerçekleştirdik. Burada tarif edilen hizalama prosedürü, Thermo Fisher Scientific Talos Arctica ve Glacios gibi iki kondansatörlü lens sistemiyle donatılmış TEM'ler için özel olarak tasarlanmıştır. Üçüncü kondansatör lensli (C3) cihazlardan farklı olarak, bu sistemler paralel aydınlatma koşulunu C2 lensinin tek ve spesifik bir uyarılma değeriyle sınırlar. Bu doğal kısıtlama, kaynak görüntüyü üst objektif lensin ön odak düzleminde konumlandırmak için elektron ışınının olağanüstü hassas hizalanmasını gerektirir - bu, optimal görüntüleme performansı için ön koşuldur. Sonraki veri işleme sonuçları, bu hizalama sonrası, test edilen örnekler için bu 200 kV mikroskopla elde edilen veri toplama kalitesinin, genellikle 300 kV bir cihazdan beklenenle neredeyse karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM niti ızgarası	Najingdingxin	M04240922A	kriyo-numune hazırlamada kullanılır
apoferritin	Biortus	BP17854-00A	kriyo-numune hazırlamada kullanılır
Çapraz ızgara ızgara	Agar Scientific	AGS106	paralel ışık koşullarını belirlemek için kullanılır
Glacios2	Thermo Fisher	9959084	TOMO veri toplama için kullanılıyor
2 numaralı filtre kağıdı, 55 mm	Whatman	10311807	Lekeli kağıt
PELCO EBASİGLOW	TED PELLA	91000-01020	Parlayan deşarjı için kullanılır
Quantifoil Cu ızgarası	Quantifoil	N1-C14nCu30-01	kriyo-numune hazırlamada kullanılır
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher	230101164	kriyo-numune hazırlamada kullanılır