Floresan proteinleri eksprese eden hücrelerde telomer FISH ve immünofloresan gerçekleştirmek için esnek bir prosedür

Özet

Bu protokol, telomer FISH'i (doğal veya denatüre edici) immünofloresan ve/veya bir floresan proteinin görselleştirilmesi ile birleştirmek için bir yöntemi tanımlar.

Özet

Floresan in situ hibridizasyon (TelFISH) kullanarak telomerlerin görselleştirilmesi, telomer biyolojisi deneylerinde uzun zamandır önemli bir araç olmuştur. TelFISH'in immünofloresan (IF) ile birleştirilmesi, örneğin telomerlerin 53BP1 ile birlikte lokalize olduğu telomer disfonksiyonunun neden olduğu odakların belirlenmesinde de iyi bilinen bir yöntemdir (IF-TelFISH). Daha yakın zamanlarda, doğal telomer FISH (nTelFISH), bazı tümör hücrelerinde kullanılan bir telomer bakım mekanizması olan Telomerlerin Alternatif Uzatılmasını test etmek için önemli bir araç haline gelmiştir. Floresan proteinleri ifade etmek aynı zamanda hücre biyolojisinde önemli bir araçtır ve diğer yöntemlerle tespit edilemeyen proteinlerin ve yapıların görselleştirilmesine izin verir. FISH proteinleri denatüre ettiğinden, testi eksprese edilmiş bir floresan proteini (FP) ile hücrelerde gerçekleştirmek, FP sinyalinin kaybına neden olur. IF ve telomer FISH'i, FISH'ten sonra bile FP sinyalini koruyan eksprese edilmiş bir floresan proteini ile hücrelere entegre etmek için bir yöntem burada açıklanmaktadır. Çeşitli IF ve FP senaryoları ile birlikte denatüre etme ve doğal telomer FISH için alternatifler sağlanmıştır. Birlikte ele alındığında, bu protokol hem normal hem de tümör hücrelerinde telomer biyolojisini keşfetmek için esnek bir çerçeve sunar.

Giriş

Doğrusal kromozomlara sahip organizmalar iki problemle mücadele etmek zorundadır. Birincisi, son replikasyon sorunu nedeniyle, DNA her replikasyonda kromozomların uçları hafifçe aşınır. İkincisi, hücreler doğal DNA uçlarını DNA kırılmalarından ayırt edebilmelidir. Telomerler bu sorunlara bir çözüm olarak gelişti. Ribonükleoprotein telomerazın etkisiyle kromozomlar, insanlarda kısa tandem tekrarları-TTAGGG ilavesiyle uzatılır. Bu tekrarlar, kromozom ucunu hücresel DNA hasar onarım makinesinden^gizleyen shelterin kompleksi tarafından bağlanır 1. Kısa veya işlevsiz telomerler hücresel yaşlanmaya ve yaşlanma fenotiplerine yol açar², telomer krizinden kaçış ise tümör^oluşumunda önemli bir kilometre taşıdır 3. Bu nedenlerden dolayı, telomer biyolojisi insan sağlığını ve hastalıklarını anlamada özel bir ilgi alanına sahiptir.

Telomer floresan in situ hibridizasyon (FISH), interfaz hücrelerinde veya metafaz yayılımlarında telomerleri görselleştirmek için uzun zamandır önemli bir yöntem olmuştur⁴. Onlarca yıldır, telomer FISH, işlevsiz, kapaksız telomerlerin bir belirteci olan telomer disfonksiyonuna bağlı odakları (TIF'ler) tanımlamak için 53BP1 immünofloresan boyama (IF) ile birleştirilmiştir ^5,6. Benzer şekilde, telomer bakımı için Telomerlerin Alternatif Uzatılması (ALT) kullanan tümörlerin ayırt edici bir özelliği, ALT ile ilişkili PML cisimcikleri veya APB'ler⁷ oluşturmak için telomerlerin nükleer PML cisimcikleri ile ilişkilendirilmesidir. APB'ler, telomer BALIKLARINI PML IF boyama ile eşleştirerek test edilebilir. Bu nedenle, IF-FISH telomer biyolojisinde iyi bilinen bir araçtır.

Burada, IF-FISH'in kullanımı iki şekilde genişletilmiştir. İlk olarak, IF-FISH, eksprese edilmiş floresan proteinleri (FP) olan hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu, hücre biyolojisinde her yerde bulunan bir araç haline gelmiştir. Etiketli bir proteini ifade etmek, iyi antikorların bulunmadığı bir proteini görselleştirmek için tek seçenek olabilir. Örneğin, ifade edilen GFP etiketli nükleer aktin kromokoru (nAC-GFP), nükleer aktin dinamiklerini⁸ ortaya çıkarır. Bu reaktif, bir zamanlar tartışmalı bir konu olarak kabul edilen nükleer f-aktinin araştırılmasında yeni fırsatlar açtı. GFP ve mCherry gibi FP'ler tipik olarak fiksasyondan sonra floresan aktivitesini korurken, FISH hibridizasyon tamponlarındaki formamid onları karanlık hale getirecektir⁹. Bu sorunu aşmak için bu protokol, IF boyamanın ikincil adımında florofor etiketli bir anti-FP "güçlendirici" yeniliği sunar. Floroforun parlaklığı formamidden etkilenmez ve IF-FP-FISH'e izin verir.

İkinci olarak, IF, ALT durumu için önemli bir tanı olan Native Telomer FISH (nTelFISH) ile birlikte gerçekleştirilir. FISH'in denatüre edilmesinde, DNA ipliklerini¹⁰ (örneğin, ısı veya alkali) eritmek için bazı yöntemler kullanılmalıdır, bu da normalde çift sarmallı olan DNA'ya prob erişimine izin verir. Buna karşılık, doğal FISH bir denatüre edici adım içermez, bu nedenle prob yalnızca zaten tek sarmallı olan DNA'ya erişebilir. Doğal telomer FISH, tümör hücrelerinde^{ALT'nin bir} başka ayırt edici özelliği olan tek sarmallı C-iplikçikli telomer tekrarlarını spesifik olarak tespit eder ^11,12. Bu testi IF-FP boyama ile birleştirmek, şu anda hedefe yönelik tümör tedavileri için güçlü bir aday olarak kabul edilen ALT'nin mekanizmasını anlamada yeni soruları ele almamızı sağlar.

Burada açıklanan protokol, IF, FP ve yerli veya denatüre telomer BALIKLARININ herhangi bir kombinasyonunu lekelemek için "kendi maceranı seç" tarzında kullanılabilir. Protokol son derece yapılandırılabilir olduğundan, zamanlama önemli ölçüde değişebilir. Genel olarak konuşursak, dört gün boyunca uygulamalı zaman gereklidir, ancak bu günler sıralı olmayabilir. Tipik bir denatüre edici FISH iş akışını tamamlamak için gereken sürenin tahminleri Şekil 1'de verilmiştir. Yerli BALIKLARIN gece boyunca hibritleştirilmesine gerek yoktur, bu nedenle tezgahta uzun bir gün mümkünse, bir gecede atılan bir adımı (2. ve 3. günü birleştirerek) potansiyel olarak ortadan kaldırılabilir.

Tipik bir konfokal mikroskop, dört renk kanalını görüntülemeyi barındıracaktır: kabaca konuşursak, mavi, yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı. Potansiyel dört renk kombinasyonunun dört örneği gösterilmiştir, ancak potansiyel permütasyonlar sonsuzdur. İki IF antikoru veya iki eksprese edilmiş FP'yi eşit başarı ile kullanmak mümkündür. Protokol basit ve sağlamdır. Kendi başına iyi IF sonuçları üreten herhangi bir antikor uygundur. Burada sadece FISH için telomer probları yer alırken, FISH'in bir sentromer probu ile denatüre edilmesi de iyi sonuçlar verir. Bu nedenle, bu protokol nükleer biyolojideki önemli soruları yanıtlamak için geniş bir esneklik sunar.

Protokol

Başlamadan önce, mikroskobu, FP eksprese eden hücre hattını ve mevcut probları ve antikorları göz önünde bulundurun. Mavi floroforlar genellikle parlak olmadığından, mavi tipik olarak DAPI gibi bir DNA lekesi için kullanılır. Gerekirse mavi sekonder antikorlar kullanılabilir. Hücreler GFP'yi eksprese ederse, AF-647 ile etiketlenmiş IF için ikincil bir antikor ile birlikte kırmızı bir florofor ile etiketlenmiş bir FISH probu kullanılabilir. Alternatif olarak, mCherry eksprese eden hücreleri görüntülemek için, AF-488 ile etiketlenmiş bir IF ikincil antikoru ve AF-647 ile etiketlenmiş bir FISH probu seçilebilir. Dört olası IF-FP-FISH kombinasyonunun örnekleri Şekil 2'de gösterilmiştir ve deneysel tasarım esnekliğini teşvik etmek için bir kılavuz olarak tasarlanmıştır. Bu yöntemler birleştirilemediği için yerli veya denatüre edici BALIK'ı seçmek önemlidir. Hücre yapışmasına izin vermek için asitle yıkama lamelleri için güvenilir bir yöntem burada yer almaktadır. Bu, kullanımdan önce herhangi bir zamanda tamamlanabilir ve steril lameller süresiz olarak saklanabilir. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Lamellerin asitle yıkanması

NOT: Kültürlenmiş hücrelerin yapışmasına izin vermek için cam lameller temizlenmeli ve asitle yıkanmalıdır. 12 oyuklu plakalarda büyüme için 18 mm'lik yuvarlak lameller idealdir. # 1 veya # 1.5 lamellerin tercih edilip edilmediğini belirlemek için mikroskopi çekirdek tesisine danışın. Lamelleri temizlemek için belirtilen süreler kritik değildir, ancak asitle yıkamaya zarar vermez.

1. Lameli forsepsleri yüzeyleri birbirine değmeyecek şekilde raflara yerleştirmek için lamel forseps (Şekil 3A) kullanın. Gerekirse kapasiteyi artırmak için ek lameller çapraz olarak yerleştirin (Şekil 3B). Boyama kabına birkaç rafı rahatça yerleştirin (Şekil 3C).
2. Boyama kabını su ve az miktarda deterjanla doldurun. Lamellerin bulunduğu rafları yavaşça tabağa indirin.
3. Lamelleri sabunlu suda bir külbütör veya nutatör kullanarak 30 dakika çalkalayın.
4. Lamel raflarını boyama kabından kaldırın. Sabunlu suyu atın.
5. Boyama kabını durulayın ve deiyonize su ile doldurun. Lamel raflarını temiz suya geri koyun ve 5 dakika boyunca hafifçe çalkalamak için bir külbütör üzerine yerleştirin.
6. Toplam üç durulama için durulamayı iki ek temiz deiyonize su değişikliği ile tekrarlayın.
7. Lamel raflarını boyama kabından kaldırın. Tabağa 1 N HCl ekleyin.
   DİKKAT: HCl yakıcıdır. Çeker ocakta tutun ve kişisel koruyucu ekipman kullanın. Rafa kaldırılmış lamelleri dikkatlice asit çözeltisine indirin. 1 N HCl'nin lamelleri tamamen kapladığından emin olun. Kapağı boyama kabının üzerine yerleştirin.
8. Lamelleri ve asit çözeltisini içeren boyama kabını bir banyo sonikatörünün tankına yerleştirin. 55 ° C'de 15 dakika boyunca sonikate.
9. Lamelleri gece boyunca asit banyosunda bırakın.
10. Lamel raflarını ertesi gün boyama kabından dikkatlice çıkarın. 1 N HCl'yi kurumsal güvenlik protokollerine göre atın.
11. Boyama kabını durulayın ve deiyonize su ile doldurun. Lamel raflarını temiz suya geri koyun ve 5 dakika boyunca hafifçe çalkalamak için bir külbütör üzerine yerleştirin.
12. Toplam üç durulama için durulamayı iki kez daha temiz deiyonize su ile tekrarlayın.
13. Lamel raflarını boyama kabından kaldırın. Tabağı boşaltın ve% 70 etanol ile doldurun. Lamel raflarını tabağa geri koyun ve 5 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
14. Lamel raflarını boyama kabından kaldırın. Çanağı boşaltın ve% 100 etanol ile doldurun. Lamel raflarını tabağa geri koyun ve 5 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
15. % 100 etanol içeren tabağı ve lamelleri bir doku kültürü başlığına alın. Davlumbazda, lamel raflarını tabaktan çıkarın ve kurumaya bırakın.
16. Çanağı boşaltın ve lamel raflarını tekrar üzerine koyun. Steriliteyi korumak için kapağı kapalı olarak saklayın. Boyama kabı hava geçirmez değildir; Lameller etanol içinde bırakılırsa, sonunda buharlaşacaktır. Lameller kullanılabilir durumda kalacaktır.

2. Lameller üzerine hücrelerin kaplanması

NOT: Lamelleri kullanmak pratik gerektirir. Kendinden emin olana kadar 6 oyuklu bir plaka ile başlamak daha kolaydır. 6 oyuklu bir plaka kullanırken, 12 oyuklu plakalar için verilen yıkama hacimlerini iki katına çıkarın.

1. GFP veya mCherry ile etiketlenmiş ilgilenilen proteini ifade eden sağlıklı, büyüyen hücreleri kültürleyin (birkaç kırmızı veya yeşil FP uygundur; Malzeme Tablosundaki notlara bakınız). Gösterilen örneklerde telomer bakımı için ALT kullanan U2OS osteosarkom hücreleri kullanılmaktadır.
   1. Kararlı FP ifadesine sahip geçici olarak kesilmiş hücreler veya hücre hatları kullanın. Deney ilaç tedavisi veya transfeksiyon gerektiriyorsa, lamel başına plakaya uygun hücre sayısını hesaplamak için fiksasyonda istenen birleşmeyi (tipik olarak %70-80), tedavi süresini ve hücre büyüme hızını göz önünde bulundurun.
2. Steriliteyi korumak için doku kültürü başlığında lameller hazırlayın. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL steril PBS ekleyin. Lamel forseps kullanarak, her oyuğa temiz, asitle yıkanmış bir lamel yerleştirin. Birkaç saniye boyunca elle hafifçe çalkalayın.
3. PBS'yi aspire edin. Kuyucuk başına 1 mL taze steril PBS ekleyin. Plakayı bir kenara koyun.
4. (İsteğe bağlı) Hücre yapışmasını iyileştirmek için lamelleri fibronektin ile kaplayın. Birçok yapışık hücre hattı, fiksasyondan önce en az 18 saat boyunca kaplandığında asitle yıkanmış lamellere iyi yapışacaktır. Hücreler iyi yapışmazsa veya kaplamadan hemen sonra sabitlenmesi gerekiyorsa, yapışmayı desteklemek için lameller kaplayın.
   1. Steril PBS'de 5 μg / mL'lik bir fibronektin çözeltisi hazırlayın.
   2. Lamellerden PBS'yi aspire edin. Her bir lamele yaklaşık 300 μL fibronektin solüsyonunu nazikçe uygulayın ve yüzey gerilimi tarafından tutulan bir damlacık oluşturun.
   3. 37 °C'de birkaç saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   4. PBS ile birkaç kez durulayın, lamelleri son bir PBS değişiminde tutun. Hücreleri hazırlarken plakayı bir kenara koyun.
   5. Fibronektin uygun değilse, alternatif olarak poli-L-lizin, kollajen veya jelatini düşünün.
5. Hücreleri tripsinize edin ve deneysel tasarıma ve fiksasyonda istenen hücre yoğunluğuna dayalı olarak 12 mL kültür ortamında uygun bir sayıyı seyreltin.
6. Lamellerden PBS'yi aspire edin ve oyuk başına 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
7. Hücreleri inkübatöre yerleştirin.
8. Deneysel tasarıma göre hücreleri ilaçlar, siRNA'lar veya diğer reaktiflerle gerektiği gibi tedavi edin. İstenilen izdihama kadar büyüyün.

3. IF-FP boyama

NOT: Protokol boyunca lamellerin kurumasına izin vermeyin. Bir elinizle pipetleme ve diğer elinizle çözeltileri aspire etmeniz önerilir, böylece lameller mümkün olduğunca kısa bir süre çözelti dışında kalır. Çözeltileri doğrudan lamel üzerine değil, kuyu duvarına nazikçe pipetleyin. Lamelleri forseps ile sıkıca ama nazikçe tutun. Bir lameli çok fazla kuvvetle kavrayarak kırmak kolaydır. Başlangıçta, kırılma durumunda mükerrer lameller için plan yapın. Tecrübe ile, kırık lameller nadir görülen bir olay haline gelir. Lameller kuru bir kuyudan alınamaz. Lamellerin alınabilmesi için tamponla örtülmesi gerekir.

1. Medyayı çıkarın ve tercih ettiğiniz sabitleyiciyi kullanarak hücreleri düzeltin. Fiksasyondan önce hücrelerin durulanması gerekli değildir. 12 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 mL veya 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 2 mL kullanın.
   1. Seçenek 1: PBS'de %4 Formaldehit kullanın.
      DİKKAT: Formaldehit toksiktir. Eldivenlerle tutun ve uygun şekilde atın. %16 metanol içermeyen formaldehit ve 10x PBS stoğu kullanarak taze hazırlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin.
   2. Seçenek 2: Sükroz (CBS) içeren hücre iskeleti tamponunda %4 Formaldehit kullanın.
      NOT: Bu tampon, hücre iskeleti yapısını korumak için tercih edilir¹³. CBS, 10 mM MES pH 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA ve 0.32 M sükroz nihai konsantrasyonuna sahiptir. Fiksatif hazırlamak için, 20 mM MES pH 6.1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA ile 2x CBS stoğu yapın. Ayrı bir 1,28 M sükroz stoğu hazırlayın. Her iki stoğu da 4 °C'de saklayın. Taze çalışma sabitleyicisi için 1 hacim %16 metanol içermeyen formaldehit, 1 hacim sükroz stoğu ve 2 hacim 2x CBS stoğunu karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin.
   3. Seçenek 3: -20 °C metanol ile sabitleyin. Nükleik asit antikor hedefleri için önerilir (ör., ssDNA, G-dörtlüleri, RNA-DNA hibritleri). -20 °C'de 5 dakika sabitleyin.
2. Sabitleyici aspire edin ve kurumsal politikalara göre atın.
3. Lamelleri PBS ile birkaç kez durulayın.
   1. DURMA NOKTASI: Sabit lameller, minimum sinyal kaybıyla birkaç gün boyunca PBS'de 4 °C'de saklanabilir. Daha uzun süre saklamak için, %100 etanole (%70 etanolde 2 dakika, %90 etanolde 2 dakika, %100 etanolde saklayın) dehidre edin, plakayı laboratuvar filmi ile kapatın ve -20 °C'de saklayın. Lameller bu şekilde haftalarca veya aylarca saklanabilir. Lekelenmeye hazır olduğunuzda, lamelleri yeniden sulandırın (%90 etanolde 2 dakika, %70 etanolde 2 dakika, PBS'de 15 dakika) ve bir sonraki adıma geçin.
4. Lamelleri PBS'de% 0.5 Triton X-100 içinde 4 ° C'de 5 dakika boyunca geçirgenleştirin. Bu adımı plakada gerçekleştirin.
5. Lamelleri PBS ile birkaç kez durulayın.
6. Nemlendirilmiş odayı hazırlayın (Şekil 3D). Haznenin altına nemli kağıt havlu yerleştirin. Boyama için bir destek oluşturmak için, bir kapağın üst kısmını, lamellere karşılık gelecek şekilde 12 oyuklu bir plakadan etiketleyin.
   1. Etiketlerin görünür kalması için kapağı laboratuvar filmiyle örtün. Sıkıca oturan bir kapakla haznenin ışık geçirmez olduğundan emin olun. Gerekirse folyo ile örtün (Şekil 3E).
7. PBS'de 75 μL'lik 100 μg/mL RNase A'yı etiketli desteğe pipetleyin. Her bir lamel nazikçe alın ve fazla tamponu çıkarmak için kenarını laboratuvar dokusuna sürün. Lamelleri RNase A damlalarına (hücre tarafı aşağı) ters çevirin. Desteği nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve kapağı kapatın. 37 °C'de 45 dakika inkübe edin.
8. 12 oyuklu plakaya taze PBS ekleyin. Lamelleri hücre tarafı yukarı bakacak şekilde plakaya geri koyun. PBS ile birkaç kez durulayın.
9. Oda sıcaklığında 30 dakika veya daha uzun süre bloke edin. RNase solüsyonunu film kaplı destekten silin. PBS'de 75 μL'lik %20'lik eşek serumu damlalarını filmin üzerine pipetleyin. Lamelleri blokaj tamponuna ters çevirin (hücre tarafı aşağı).
10. Birincil antikoru hazırlayın.
    1. Her lamel için 75 μL kullanın. Pipetleme hatasını önlemek için fazladan %10 hazırlayın.
    2. Antikoru% 5'lik eşek serumu ile seyreltin. Antikor dilüsyonlarını ampirik olarak belirleyin. 1:100 seyreltme makul bir başlangıç noktasıdır.
    3. Bloke ederken, primer antikor inkübasyonu için ikinci bir etiketli destek hazırlayın. Kapağı filmle örtün ve belirlenen noktalara 75 μL damla seyreltilmiş antikor uygulayın.
11. Blokaj adımının sonunda, lamelleri antikor damlacıklarına aktarın (hücre tarafı aşağı). Desteği nemlendirilmiş hazneye yerleştirin, kapağı kapatın ve oda sıcaklığında en az 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
12. 12 oyuklu plakaya taze PBS ekleyin. Lamelleri hücre tarafı yukarı bakacak şekilde plakaya geri koyun. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez oda sıcaklığında sallanarak yıkayın.
13. Son yıkama sırasında ikincil antikorları hazırlayın.
    1. Her lamel için 75 μL kullanın. Pipetleme hatasını önlemek için fazladan %10 hazırlayın.
    2. Floresan ikincil antikorlar ve GFP/RFP güçlendirici antikorlar için 1:400 seyreltme önerilir. Hedefle ilgili deneyime dayalı olarak gerektiği gibi ayarlayın.
    3. İkincil antikorları% 5 eşek serumu ile seyreltin. Etiketli destek üzerindeki uygun noktalara 75 μL'lik damlalar uygulayın.
14. Yıkadıktan sonra, lamelleri ikincil antikor damlacıklarına (hücre tarafı aşağı) aktarın. Kapalı nemlendirilmiş odada oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.
15. 12 oyuklu plakaya taze PBS ekleyin. Lamelleri hücre tarafı yukarı bakacak şekilde plakaya geri koyun. PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez oda sıcaklığında sallanarak yıkayın.

4. Yeniden sabitleme ve dehidrasyon

1. Yeniden fiksasyon için PBS'de% 4 formaldehit hazırlayın. İlk sabitleme için metanol kullanılmış olsa bile bu adım için formaldehit kullanın. Son PBS yıkamasını çıkarın ve hücreleri hafifçe sallayarak 15 dakika boyunca yeniden sabitleyin.
2. Sabitleyiciyi aspire edin ve kurumsal politikalara uygun olarak atın.
3. Lamelleri PBS ile birkaç kez durulayın.
4. Lamelleri kurutun ve hibridizasyona hazırlanmak için havayla kurutun:
   1. % 70 etanol içinde 2 dakika inkübe edin.
   2. % 90 etanolde 2 dakika inkübe edin.
   3. % 100 etanolde 2 dakika inkübe edin.
   4. %100 etanolden sonra, yönlendirmeyi korumak için lamelleri hücre tarafı yukarı bakacak şekilde etiketli filtre kağıdına yerleştirin. FISH probunu hazırlarken tamamen kurumaya bırakın.

5. BALIK (SEÇENEK 1): DENATÜRE EDİLEN BALIKLAR

1. İki folyo desteği hazırlayın (bkz. Şekil 3F).
   1. Dört katman oluşturmak için bir parça alüminyum folyoyu dörde katlayın. Donuk tarafın dışa baktığından emin olun.
   2. Katlanmış folyoyu 12 oyuklu bir plakanın kapağının içine sığacak şekilde kesin. Bir laboratuvar mendili kullanarak, folyoyu kapağın iç kısmına sürtün, böylece kapağın çıkıntıları folyo üzerine bir desen kabartabilir. Bu, sonraki adımlar sırasında lamellerin birbirine kaymasını önleyen çıkıntılar oluşturacaktır.
   3. Bu tür iki destek hazırlayın. Daha sonraki deneylerde silinebilir ve tekrar kullanılabilirler.
2. 10 μM probunu 1:50 oranında hibridizasyon tamponunda (% 70 deiyonize formamid, 10 mM Tris, pH 7.4,% 0.5% 10× Roche bloke etme çözeltisi) seyreltin. Her lamel için bu seyreltilmiş probdan 75 μL kullanın ve pipetleme kaybını telafi etmek için fazladan %10 hazırlayın. Son prob konsantrasyonu 200 nM olmalıdır.
3. Bir ısı bloğunu 90 °C'ye ve bir termodöngüleyiciyi 85 °C'ye önceden ısıtın.
4. Lamelleri denatüre edin: Havayla kurutulmuş lamelleri hücre tarafı yukarı bakacak şekilde hazırlanan folyo desteklerden birinin üzerine yerleştirin. Folyoyu yavaşça termodöngüleyici bloğuna yerleştirin ve kapağı kapatın. Denatüre etmek için 5 dakika inkübe edin.
5. Eşzamanlı olarak, seyreltilmiş probu ısı bloğunda 90 °C'de 5 dakika ısıtın.
6. Denatüre edilmiş probun 75 μL damlasını hazırlanan ikinci folyo desteğinin üzerine pipetleyin. İyi şekillendirilmiş damlacıklara izin vermek için folyonun donuk tarafının yukarı baktığından emin olun. Parlak taraf yukarıdaysa, prob yayılır ve yüzey gerilimini kaybeder.
7. Denatüre lamelleri prob damlalarının üzerine ters çevirin ve hücre tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
8. Folyo desteğini prob ve lameller ile 85 °C'ye ayarlanmış termodöngüleyici bloğa aktarın ve 5 dakika inkübe edin. Aktarıma yardımcı olması için bir spatula kullanın. Lamellere çarpmaktan veya kaymaktan kaçınmak için dikkatli hareket edin.
9. Folyoyu lameller ile hareket ettirin ve nemlendirilmiş bir odaya doğru sondalayın. Kapakla örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

6. BALIK (SEÇENEK 2): Yerli BALIK

1. 10 μM probunu 1:200 oranında hibridizasyon tamponunda (%70 deiyonize formamid, 10 mM Tris, pH 7.4, %0.5 × Roche bloke etme çözeltisi) seyreltin. Son prob konsantrasyonu 50 nM'dir. Lamel başına 75 μL kullanın ve pipetleme hatasını önlemek için fazladan %10 hazırlayın.
2. Film kaplı destek üzerinde belirlenen noktalara 75 μL damla seyreltilmiş prob uygulayın.
3. Denatüre lameller 75 μL'lik prob damlalarının üzerine ters çevirin ve hücre tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
4. Desteği nemli bir odaya yerleştirin ve kapağı kapatın. Oda sıcaklığında en az 45 dakika inkübe edin. Tercih edilirse inkübasyon bir geceye kadar uzatılabilir.

7. Yıkama ve montaj

NOT: Optimum montaj ortamı, mikroskop objektifinin sayısal açıklığına bağlıdır. Öneriler için yerel mikroskopi çekirdek tesisine danışın. Uygun bir seçim, kırılma indisi 1.52 olan NucBlue özellikli ProLong Glass olabilir. Bununla birlikte, eldeki mikroskoba bağlı olarak alternatif bir montaj ortamı daha uygun olabilir.

1. Lamelleri yıkamak için 12 oyuklu plakaya geri koyun. Onları hücre tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevirin.
2. 3× 10 dakika% 70 formamid / 10 mM Tris, pH 7.5 içinde yıkayın.
   DİKKAT: Formamid toksiktir; kurumsal politikalara göre atın.
3. TNT'de 3× 5 dakika yıkayın (0.05 M Tris / 0.15 M NaCl /% 0.05 Tween-20, pH 7.5).
4. PBS'de birkaç kez durulayın. Montaj ortamında bir DNA lekesi yoksa, son yıkamada DAPI eklemeyi düşünün. DAPI ile lekelemek için PBS'ye 300 nM DAPI ekleyin, lamellere uygulayın ve 5 dakika inkübe edin. DAPI çözümünü kurumsal yönergelere göre atın.
5. Bir damla montaj ortamı kullanarak lamellerin cam kızaklara monte edin. Lameli damlanın üzerine ters çevirin: hücre tarafı aşağı.
6. Görüntülemeden önce montaj ortamının gece boyunca kürlenmesine izin verin.

Sonuçlar

Bu protokolden elde edilen tipik sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir. Düzgün bir şekilde yürütülürse, hücre morfolojisi iyi korunacak ve floresan sinyaller parlak olacaktır. Telomer FISH'in denatüre edilmesi, her bir telomeri temsil eden her çekirdekte düzinelerce punktadan oluşan bir model ortaya çıkarmalıdır (bkz. Şekil 4, Örnek 1 ve 2). Telomer odakları neredeyse sadece çekirdekte bulunmalıdır, ancak sitoplazmik telomer boyaması bazen, özellikle ALT hücre hatlarında meydana gelir. Ortaya çıkan telomer sinyalleri son derece parlak olma eğilimindedir, öyle ki telomer sinyalinin diğer algılama kanallarına sızmasına karşı önlem almak için özen gösterilmelidir. ALT hücre hatlarında, telomerler genellikle PML^{cisimcikleri 14'te} kümelenir ve bu da normalde beklenenden daha az odak ile sonuçlanır. Bu kümelenme Şekil 4, Örnek 2'de gözlemlenebilir.

Telomer bakımı için ALT kullanan hücre hatlarında, doğal telomer FISH, ALT ^11,12'nin ayırt edici özelliği olan telomerik ssDNA'yı tespit eder. Her çekirdeğin telomer ssDNA'ya sahip olması veya tek bir çekirdekte az sayıda punktadan fazlasının bulunması beklenmez (bkz. Şekil 4, Örnek 3 ve 4). Doğal telomer FISH sinyali, denatüre eden telomer FISH kadar parlak olmayacaktır. Osteosarkom hücre hattı U2OS, doğal FISH için iyi bir pozitif kontroldür. Telomer ssDNA'sının, telomeraz tarafından tutulan telomerlere sahip hücre hatlarında gözlenmesi beklenmemektedir.

Hem denatüre edici hem de doğal BALIK için, güçlü nükleolar floresan artifakttır. Aşırı bir nükleolar sinyal gözlenirse, taze bir RNase A çözeltisi kullanmayı veya RNase A tedavisini^15'i uzatmayı deneyin (Protokol adımı 3.8). Bilinmeyen ALT durumuna sahip hücreleri kullanan yerel telomer FISH deneyleri için, algılama ayarlarını kalibre etmek için U2OS gibi pozitif bir ALT hücre hattı kullanılır.

IF-FP-FISH deneylerinde FP'lerin gözlemleri, doğrulama için canlı hücre görüntüleme deneyleri ile kolayca karşılaştırılabilir. Tutarsızlıklar gözlenirse, sabitleme koşullarını değiştirmeyi deneyin. CSB tamponunda sabitleme (Protokol Adımı 3.1.2), hücresel yapıları korumak için faydalı olabilir ve daha doğru FP lokalizasyonunu ortaya çıkarır¹³.

İmmünofloresan boyama, ilgilenilen proteine göre büyük ölçüde değişir. IF sonuçları, FISH protokolünün ilgilenilen proteinin lokalizasyonu ve yoğunluğu üzerindeki etkisini değerlendirmek için FISH olmadan hazırlanan numunelerle karşılaştırılmalıdır. Genel olarak, IF-FP-FISH deneyleri odakların sayımı için uygundur, ancak yoğunluklar nicel olmayabilir⁶.

Şekil 1: Tahmini sürelere sahip örnek iş akışı. Primer antikor inkübasyonu gece boyunca gerçekleştirilirse ek bir gün gerekebilir. Yerli BALIK söz konusu olduğunda, 2. ve 3. günler bazen birleştirilir, ancak bu, daha uzun bir tezgah süresi ile sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dört renkli görüntüleme ile kullanılan başarılı deneysel kombinasyon örnekleri. Örnek 1 ve 2, denatüre telomer FISH'i gösterirken, 3 ve 4 yerel FISH'i kullanır. Bu protokolün, iki hedef proteinin immün olarak boyanması (Örnek 1), bir FP ve bir IF boyasının birleştirilmesi (Örnek 2 ve 4) veya iki FP'nin (Örnek 3) yararlı olduğunu unutmayın. Bu deneyler için temsili sonuçlar Şekil 4'te verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bu protokolde kullanılan ekipman. (A) Lamel forseps. Lamelleri işlemek için düz forseps kullanılabilirken, açılı lamel forsepsleri işi çok daha kolay hale getirir. (B) Yıkama için rafa kaldırılmış lameller. Düz bir şekilde rafa koymanın yanı sıra, kapasiteyi artırmak için lamellerin de bitişik oluklar arasında açılı olduğunu unutmayın. (C) Bir boyama kabında dört raf lamel. Bir cam boyama kabı düzinelerce raflı lamel tutar ve HCl asit yıkamasına karşı dayanıklıdır. (D) Hazırlanmış bir nemlendirilmiş oda. Dış kısım, floroforları koruyarak karanlık bir ortam oluşturmak için folyo ile kaplanmıştır. Alt kısımdaki nemli kağıt havlular nem sağlar. (E) Mühürlü nemlendirilmiş oda. Kurumayı önlemek için sıkı oturan bir kapak gereklidir. (F) Alüminyum folyo desteğinin yapılması. Kesilmiş folyo üzerine kabartma çıkıntıları, denatüre etme adımı sırasında lamellerin birbirine kaymasını önlemeye yardımcı olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: IF, FISH ve ifade edilen FP'ler dahil olmak üzere dört kanallı görüntüleme deneylerinin temsili sonuçları. Paneller, Şekil 2'de açıklanan deneylerin gerçek sonuçlarını göstermektedir. DAPI DNA'yı boyar, nAC-GFP nükleer f-aktini, TelFISH ve TRF2-mCherry telomerleri işaretler, PML immün boyama nükleer PML cisimciklerini işaretler ve nTelFISH telomerik ssDNA'yı ortaya çıkarır. Tüm hücreler U2OS osteosarkom hücreleridir. Görüntüler, süper çözünürlük özelliğine sahip konfokal bir mikroskopta elde edildi. Örnek 1 görüntüleri lazer taramalı konfokal mikroskopi ile elde edildi; diğer tüm görüntüler Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu ile elde edildi. Tüm ölçek çubukları 5 μM'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

IF-FISH kullanılarak yapılan deneyler, telomer stresi veya ALT ^5,6,16'nın tespiti için bir test olarak telomer alanında uzun süredir bir dayanak noktası olmuştur. Burada, protokol bir floresan proteini içerecek şekilde genişletilir. Ek olarak, doğal telomer FISH seçeneği, ortogonal bir ALT testi¹¹ olarak sunulmaktadır. Bu protokolün gerçekleştirilmesi kolaydır ve güvenilir bir şekilde tatmin edici sonuçlar verir.

Antikor damlacıkları veya PNA probları ile lameller üzerinde çalışarak, bu protokol tutumlu olacak şekilde tasarlanmıştır. Damlacıkların kullanılması değerli reaktifleri korur. Buna karşılık, odacıklı kaydıraklar gibi alternatifler pahalıdır ve daha az esneklik sunar. Lamelleri kullanmak, yeterlilik geliştirmek için pratik gerektirirken, maliyet tasarrufu, zaman yatırımını değerli kılar. 75 μL'den büyük reaktif damlacıklarının tavsiye edilmediğine dikkat edilmelidir. Daha büyük damlacıklar, lamellerin kaymasına neden olur ve sonuçları iyileştirmez.

nAC-GFP'nin ekspresyonu, Şekil 4'te görüldüğü gibi nükleer f-aktin^8'in görselleştirilmesi için vazgeçilmez bir araçtır. Önemli biyolojik soruları yanıtlamaya yardımcı olabilecek birçok başka etiketli reaktif mevcuttur. Örneğin, FUCCI plazmid sistemi hücre döngüsünü görselleştirmek için kullanılabilir ve bu protokol kullanılarak telomer FISH¹⁷ ile birleştirilebilir. Hücre döngüsünü test etmek için farklı bir yaklaşım, hücre döngüsü bilgisini elde etmek için PCNA kromozoşunu kullanabilir¹⁸. Sorulan soruya bağlı olarak, birçok FP etiketli reaktif ticari olarak temin edilebilir.

Burada, bu protokol telomer FISH ile gösterilmiştir, ancak aynı konsantrasyonda bir PNA probu kullanılarak sentromer FISH ile de başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Örneğin, FAM etiketli bir sentromer probunu Cy3 etiketli bir telomer probu ile çoğullamak mümkündür. Protokolün tek lokuslu DNA FISH ile çalışma olasılığının düşük olduğunu vurgulamak önemlidir. Tek bir lokusu araştırmak için, numunenin proteaz sindirimi gereklidir ve bu sindirim, IF veya FP tespiti¹⁹ ile açıkça uyumsuzdur. Bununla birlikte, IF ve mRNA FISH'in benzer bir yaklaşımla birleştirilmesinde başarı elde edilmiştir; Açıkçası, bu senaryoda RNase tedavi adımı atlanmalıdır.

Son olarak, doğal telomer FISH'in hızla ALT durumu^20,21 için önemli bir test haline geldiği açıktır. Popülasyon tabanlı²² olan ALT için C-çemberi testinin aksine, doğal telomer FISH, hücresel düzeyde bir ALT okuması sağlayarak ALT dinamiklerindeki değişikliklerin hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Doğal telomer FISH'i IF ve FP ekspresyonu ile birleştirerek, ALT mekanizmasına ilişkin önemli bilgiler ortaya çıkarılabilir. Zamanla, bu içgörülerin telomer bakımı için ALT'ye dayanan tümörler için hedefe yönelik terapötiklere yol açacağını umuyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 % Ara-20	Biyo-Rad	1610781	Çözüm bulanıksa atın.
10x PBS	Gibco	70011044	Fiksatif ve diğer tamponları hazırlamak için post-fiksasyon kullanın
12 oyuklu hücre kültürü plakaları	Nunc	150628
%16 metanol içermeyen formaldehit	Termo Bilimsel	28908
5 M sodyum klorür	Millipore Sigma	S6546 Serisi
Yapışık hücreler, örneğin U2OS osteosarkom hücreleri	ATCC	HTB-96 Serisi
Nemlendirilmiş hazne için hava geçirmez kutu	Mepal	106415032500	Herhangi bir uygun hava geçirmez kutu işe yarayacaktır, ancak düz olmayan tabanlı kutulara dikkat edin.
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
alüminyum folyo	Fisher Bilimsel	01-213-100
Uygun hücre kültürü ortamı, örneğin McCoy'un 5A'sı	Gibco	16600082	U2OS için %15 FBS ekleyin
Sentromer probu (FAM)	PNA Biyografisi	F3001 Serisi	Birkaç florofor mevcuttur
ChromoTek Nükleer Aktin-Kromobody plazmidi (TagGFP)	Protein teknolojisi	ACG-N
Lamelli kuvvetlendiriciler	Güzel Bilim Araçları	11251-33
Lamel rafları	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Davetli	D21490	İsteğe bağlı, montaj ortamının DNA lekesi içermemesi durumunda
Eşek serumu	Jackson İmmünoaraştırma	017-000-121
EGTA	Biyo-Dünya	40520008	0,5 m çözelti pH 8,0
etanol	Warner-Graham	200 Kanıt
Fetal Sığır Serumu	Gibco	A5670801
Fibronektin	Millipore Sigma	F0635 Serisi	İsteğe bağlı lamel kaplaması için
formamid	Millipore Sigma	47671-250ML-F
Alman cam lameller	Warner Insruments	64-0714	CS-18R15 (#1.5 Kalınlık, bunun mikroskobunuz için uygun olduğunu onaylayın)
GFP Güçlendirici	Protein teknolojisi	gb2AF488	GFP/mClover/YFP/Venus ve diğerlerini tanır.  Kapsamlı bir liste için ürün bilgilerine bakın
Kapaklı cam boyama kabı	Millipore Sigma	900203
Dijital Zamanlayıcılı Isıtmalı Ultrasonik Temizleyici	Branson	CPX-952-218R Serisi	Bu banyo sonikatör modeli ısı içerir ancak yapılandırılabilir güç veya yoğunluğa sahip değildir.
Hidroklorik asit	Millipore Sigma	258148	Konsantre HCl 12 N.  1 N HCl için 220 mL deiyonize suya 20 mL konsantre HCl ekleyin
Magnezyum klorür çözeltisi	Millipore Sigma	63069	1 M Çözüm
MES	Millipore Sigma	475893
metanol	Millipore Sigma	179337
Parafilm	ABD Bilimsel	3023-4526
Potasyum klorür	Millipore Sigma	P9541
Birincil antikor  fare anti-PML	Santa Cruz	SC-377390
Birincil antikor  tavşan anti-53BP1	Novus	NB100-904 Serisi
Birincil antikor  tavşan anti-PML	ABklonal	A1184 Serisi
NucBlue ile Camı Uzatın	Davetli	P36981
RFP Güçlendirici	Protein teknolojisi	rb2AF568	mRFP/mCherry/mKate2/mPlum'u tanır.  Kapsamlı bir liste için ürün bilgilerine bakın
RNAse A	Millipore Sigma	RNASEA-RO
Roche engelleme çözümü	Millipore Sigma	11096176001
ikincil antikor, örneğin AF488 anti-fare	Davetli	A-11001	Veya benzeri
ikincil antikor, örneğin AF594 anti-tavşan	Davetli	A-11012	Veya benzeri
ikincil antikor, örneğin AF647 anti-fare	Davetli	A-21235 Serisi	Veya benzeri
spatula	Fisher Bilimsel	10257402
Steril PBS	Gibco	14190144	Lamelleri hazırlamak için
Sakaroz	Millipore Sigma	S0389
TelC probu (Cy3)	PNA Biyografisi	F1002 Serisi	Birkaç florofor mevcuttur
TelG probu (AF647)	PNA Biyografisi	F1014 Serisi	Birkaç florofor mevcuttur
Tris Tabanı	Millipore Sigma	648311	Suda 1 M çözelti hazırlayın, HCl kullanarak pH'ı ayarlayın
triton X-100	Millipore Sigma	X100
Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısı	Gibco	25200072
Zeiss Elyra mikroskobu	Zeiss		Veya benzeri