Method Article

Hastalıkla İlgili İntronik Varyantların Neden Olduğu Ekleme Hatalarını İncelemek için Büyük Paralel Ekleme Testi

DOI:

10.3791/68984

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, intronik varyantları toplu olarak sistematik olarak değerlendirmek için minijen yapılarını kullanan büyük paralel ekleme deneyleri (MaPSy) gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, amplikon dizilimi yoluyla hücrelerdeki varyant kaynaklı ekleme değişikliklerinin yüksek verimli analizini mümkün kılar ve bunların mRNA öncesi ekleme üzerindeki etkilerinin işlevsel değerlendirmelerini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekleme hataları, nadir görülen genetik bozukluklardan sorumlu patojenik mutasyonların %10-30'unu temsil eder. RNA ekleme, ekzonları seçici olarak birleştirerek ve intronları çıkararak, intronların içinde yer alan anahtar düzenleyici dizilerle uygun gen ekspresyonunu sağlar. 5' ekleme bölgesi ve dal bölgesi, spliceosome'un tanıma kompleksini oluşturmak için küçük nükleer RNA'larla etkileşime girerken, polipirimidin yolu ve ekleme arttırıcılar/susturucular gibi elementler, spliceosome düzeneğini düzenlemek için proteinleri toplar. İntronik varyantlardan kaynaklanan ekleme kesintilerini tahmin etmek, bu etkileşimlerin karmaşıklığı nedeniyle zordur.

Doğal insan gen varyasyonlarının %90'ını oluşturan intronik varyantlar, kanonik eklemeyi bozabilir ve hastalığa yol açabilir. Bu olasılığı araştırmak için, hasta tarafından tanımlanan intronik varyantları değerlendirmek için büyük ölçüde paralel bir ekleme testi (MaPSy) geliştirdik. Referans veya varyant dizilere sahip sentezlenmiş oligonükleotitler, promotör ve poliadenilasyon sinyallerini içeren ekleme minigenlerine bağlandı. Her yapı, ilgilenilen değişken intron-ekson bağlantı dizisini barındıran bir orta eksonu çevreleyen iki sabit ekson içeriyordu. Varyant dizilerinin hücresel ekleme verimliliği, referans muadilleriyle karşılaştırıldı ve bu da önemli bozulmaları ekleme varyantları olarak tanımlamamıza izin verdi.

MaPSy'nin sonuçları, minigen tahlilleri veya in vivo CRISPR aracılı genom düzenleme gibi ek yaklaşımlarla doğrulanabilir. Ayrıca, bozulan bağlantıların toplu analizi, birleştirme mekanizmaları ve birleştirme hatalarıyla ilişkili hastalıkların moleküler temeli hakkında daha derin bilgiler sağlayabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA ekleme, translasyon için ekzonları birleştiren ve intronları uzaklaştıran, RNA ihracatını kolaylaştıran ve nükleik asit homeostazisini koruyan çok önemli bir işlemdir. Bu sıkı bir şekilde düzenlenmiş mekanizma, zamansal ve mekansal bir şekilde çalışarak transkriptom çeşitliliğine ve karmaşıklığına katkıda bulunur1. Ekleme, 5' ekleme bölgesi (5'ss), dal bölgesi ve 3' ekleme bölgesi (3'ss) dahil olmak üzere anahtar sinyallerin yanı sıra dal bölgesinin akış aşağısındaki polipirimidin yolu ve AG dinükleotid dışlama bölgesi gibi ek düzenleyici unsurlar tarafından yönlendirilir ve bu da 3'ün tanınmasına yardımcı olur2. Mekanik olarak, U1 küçük nükleer RNA (snRNA) 5's ile eşleşirken, dal bölgesi U2 snRNA3 ile etkileşime girer. Dal bölgesinin, polipirimidin yolunun ve 3's'ün koordineli aktivitesi, U2 küçük nükleoproteinlerin (snRNP'ler) ve U2 yardımcı faktörlerinin bağlanmasını kolaylaştırır, spliceosome'u stabilize eder ve dallanma noktasını 5'lere nükleofilik saldırı için konumlandırır, böylece eklemeyi başlatır.

Dizileme teknolojilerinin hızla ilerlemesiyle birlikte, tüm genom dizilemenin maliyeti düşmeye devam ediyor ve bu da sürekli genişleyen bir insan genetik varyantları kataloğuna yol açıyor. Nadir genetik bozukluklarda hastalıkla ilişkili mutasyonların -30'unun RNA ekleme 4,5,6'yı etkilediği ve genellikle terapötik hedefler olarak hizmet edebilecek anormal gen ürünleri ürettiği tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, intronik varyantların işlevsel etkisini değerlendirmek, genellikle gereksiz ve dejenere olan ekleme sinyallerinin karmaşıklığı nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. 5' ve 3' ekleme bölgeleri nispeten iyi karakterize edilirken, dal bölgeleri, polipirimidin yolları ve diğer ekleme düzenleyici elemanları, daha yüksek ökaryotlarda önemli dizi ve konumsal değişkenlik sergiler. Büyük ölçekli haritalama çalışmaları ayrıca, tek bir intron 7,8,9,10 içinde birden fazla dal bölgesinin bulunabileceğini ve bu da intron-ekson sınır varyasyonlarının yorumlanmasını zorlaştırdığını göstermiştir.

Derin öğrenme, birincil dizilerin ekleme yeri tanımaya 4,11,12 nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için kullanılmıştır, bu da ekleme varyantlarının ekzon ve intronların 3' bölgesine seyrek olarak uzanırken kanonik ekleme bölgelerinde kümelendiğini ortaya koymaktadır. Bu model, 5' ekleme yeri seçiminin öncelikle konsensüs dizileri tarafından belirlendiği, oysa 3' ekleme yeri tanımanın dal bölgeleri ve polipirimidin yolları gibi ek intronik elemanlara bağlı olduğu şeklindeki yerleşik anlayışla uyumludur. Bununla birlikte, mevcut modeller, özellikle intronik varyantlara odaklanmak yerine, kurucu ekleme bölgelerini alternatif veya yapay olanlardan ayırt etmek için eğitilmiştir. Sonuç olarak, bu hesaplama araçları, öncelikle ekleme bölgelerini ve eksonik ekleme varyantlarını 13,14,15,16 tanımlayarak yalnızca orta düzeyde tahmin doğruluğu gösterir. Tahmine dayalı modellere ek olarak, ekleme varyantlarını toplu olarak doğrulayabilen deneysel bir sistem, birleştirme kusurlarının tanımlanmasını ve karakterizasyonunu önemli ölçüde geliştirecektir.

Hastalıkla ilişkili intronik varyantları ekleme fenotiplerine bağlayan kapsamlı RNA dizileme verileri, düşük frekansları ve mevcut veri kümelerinden ekleme sonuçlarını tahmin etmenin zorluğu nedeniyle kıt kalmaktadır. Bu boşluğu gidermek için, ekleme varyantlarını sistematik olarak analiz etmek için yüksek verimli birleştirme testleri ve hesaplamalı modeller geliştirilmiştir. Büyük ölçüde paralel ekleme raportör tahlilleri (MaPSy), değişken dizilerin ekleme yeri seçimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır. MaPSy, 5' ve 3' ekleme bölgelerinin yakınındaki dizi varyasyonlarını birleştirerek veya sabit minijen omurgaları içindeki tüm intron-ekson bölgelerini kapsayarak, ekleme değişikliklerinin işlevsel bir değerlendirmesini sağlar. Bununla birlikte, toplu oligonükleotid sentezinin sınırlamaları nedeniyle, derin intronik varyantlar ve psödo-ekzon aktivasyonu bu yaklaşımda yakalanmaz.

MaPSy'nin sağlamlığı, 70 bağımsız ekleme minigeni kullanılarak doğrulandı ve 0.8917'lik

figure-introduction-1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MaPSy oligonükleotid (oligo) kütüphanesinin sentezi

  1. Temel oligo yapısı: 155-nuncleotid (nt) havuzundaki her bir oligoyu, 35-nt'lik bir eksonik dizi ve 80-nt'lik bir intronik dizi içerecek şekilde tasarlayın ve her iki uçta 20-nt ortak hazırlama dizileri ile çevrili 115-nt'lik gene özgü bir bölge oluşturun (Şekil 2A).
  2. Varyant koleksiyonu: Motif bütünlüğünü korumak ve eklemeyi etkileyen düzenleyici bölgelere odaklanmak için aşağıdaki intronik varyantları toplayın:
    3'lerden -78 ila +10 nt
    5'lerden -3 ila +30 nt
    NOT: Klinik varyantlar ClinVar19'dan, dbSNP20'deki düşük frekanslı girişlerden, ilgili yayınlardan ve ek klinik veritabanlarından kaynaklanabilir. Genom koordinatları, varyantları istenen genomik bölgelerle kesiştirmek için kullanılabilir (örneğin, BEDTools21 kullanılarak). Toplu sentez için oligo havuzu içindeki boyut değişkenliğini en aza indirmek için yalnızca tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) ve 15 nt'nin altındaki küçük eklemeler/silmeler (indeller) seçilmelidir.
  3. Temel minijen yapısı: Ekleme bağlantı yapısını korumak için, her bir minigen omurgası üç ekson içerir: EGFP fragmanlarını kodlayan iki sabit dış ekson (pGint, Addgene Plazmid #24217'den) ve insan CAMTA2'nin ekson 15'inden türetilen bir orta ekson (Şekil 2B). Hem CAMTA2 fragmanını hem de pGint'i BamHI ve SalI kısıtlama enzimleri ile sindirin ve CAMTA2 fragmanını EGFP ekzonları arasında pGint'e bağlayarak pGint-CAMTA2 üç ekzon minigenleri oluşturun (Ek Dosya 1).
    NOT: Orta ekson, yani CAMTA2 ekson 15, hedef hücrelerde eksprese edildiğinde bir ara ekleme verimliliği sergilemelidir. Bu özellik, dengeli bir temel sağladığı ve değişken etkilerden dolayı ekleme verimliliğindeki hem artışların hem de azalışların tespit edilmesine olanak tanıdığı için önemlidir.
  4. Hazırlama bölgesi tasarımı: Ekleme bölgesi dizisini kitaplığın her iki ucuna ekleyin, böylece her bir oligo, orta ekson/intron içinde amaçlanan yerleştirme bölgesi ile örtüşen ~20-nt yan diziler içerir (Şekil 2A).
    NOT: Oligo havuzu birden fazla minijen yapısı için tasarlanmışsa, birden fazla hazırlama bölgesi dahil edilebilir.
  5. Barkod tasarımı: İntronik varyantlar için, genotipleri eklenmiş ürünlerden ayırt etmek için eksonik barkodlar gereklidir, çünkü intronik diziler ekleme sonrasında kaybolur. Barkod dizileri (yani barkod etkisi) nedeniyle herhangi bir ekleme değişikliğini önlemek için, barkodları ekzonların içinde, ekleme bölgelerinden uzağa (yani, eksonik hazırlama bölgesinin hemen yanına) distal olarak yerleştirin.
    NOT: Mümkün olduğunda varyant başına birden fazla barkod kullanılması önerilir. Gerekli barkod uzunluğu kütüphanenin karmaşıklığına bağlıdır. Mesela:
    Bir referans alel yalnızca bir varyantla eşleşirse 1 nt'lik bir barkod yeterlidir.
    Bir referans alel altı farklı varyantla eşleşirse 2 nt'lik bir barkod tercih edilir.
    Tek bir referans alel ile yakından ilişkili birden fazla varyanta sahip kütüphaneler (örneğin, yalnızca bir nükleotid ile farklılık gösteren) analizin karmaşıklığını artırabilir.
  6. Oligoların sıralanması: Oligoları, her bir varyant bağlantı referans aleliyle birlikte eşleştirilmiş olarak FASTA dosya formatında sıralayın.
    NOT: Birden fazla varyanta sahip bağlantılar için, bağlantı başına yalnızca bir referans aleli gereklidir. Havuzlanmış dizi sentezi hizmetleri GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) ve Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis) gibi şirketlerden edinilebilir. Sentez uzunluğu, kütüphane kapasitesi ve maliyetler sağlayıcıya ve bölgeye göre değişiklik gösterebilir.

figure-protocol-1
Şekil 2: MaPSy için oligo ve ekleme minigen tasarımı. (A) İntronların 3' veya 5' ucunun havuzlanmış oligo sentezi için tasarım. Diyagramlar, 155-nt oligoların temel yapısını göstermektedir. Oligo sentezinin gerçek kapasitesi, üretim için seçilen şirkete bağlıdır. (B) MaPSy minigenlerinin tasarımı. Bir üç ekzon minigeni (ii), pGint plazmitinden (i) modifiye edildi ve ekleme sinyal varyasyonlarını (iii) tanıtmak için ekleme bölgeleri, havuzlanmış oligolarla değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. MaPSy kütüphanesi DNA şablonlarının oluşturulması

  1. Oligo havuzunu aldıktan sonra ilk amplifikasyon
    1. Oligo havuzunun alınması üzerine, oligoları çift sarmallara dönüştürmek için Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz kullanarak 100 μL'lik bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile tasarlanmış yan hazırlama bölgeleri ile oligo kitaplığının 10-50 ng'sini amplifiye edin (LibF ve LibR primerleri Tablo 1'de, termocycler ayarları Tablo 2'de).
    2. PCR ürünlerini saflaştırma kolonlarını kullanarak temizleyin. Ayrıntılı olarak, PCR ürününü kolon membranına bağlayın, ardından kalan primerleri, tuzları ve polimerazı çıkarmak için p etanol içeren tamponlarla yıkayın. Son olarak, saflaştırılmış PCR ürününü düşük tuzlu tampon veya nükleaz içermeyen su kullanarak ayrıştırın.
    3. Jel elektroforezi ile amplifiye edilmiş oligo boyutunu doğrulayın. Saflaştırılmış PCR ürününün 5 μL'sini 1× TAE tamponunda (40 mM Tris bazı, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA, pH 8.0) hazırlanan %1.5'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.
      NOT: Aşırı amplifikasyonu ve PCR yanlılığını önlemek için PCR amplifikasyon döngülerini 15 ile sınırlayın. Tipik olarak hedef üründen daha büyük olan ikincil bir bulanık bant, oligo havuzu içinde aşırı amplifikasyonu ve eksik tavlamayı gösterebilir. PCR ürünlerinin bir kısmını saklayın ve devam etmeden önce kalite ve hata oranlarını değerlendirmek için oligo havuzunu sıralayın (durma noktası).
  2. MaPSy ekleme minigenlerinin yapımı - İlk PCR.
    1. Omurga fragmanları: İki ana PCR fragmanı için kaynak olarak 0,5 ng pGint-CAMTA2 plazmit omurgası kullanın
      1. PCR Ürün 1: CMV promotörünü, birinci ekzonu (N-terminal EGFP) ve ilk intronun bir kısmını amplifiye edin (Tablo 1 ve Tablo 2).
      2. PCR Ürün 3: Orta eksonun bir kısmını (CAMTA2 ekson 15), ikinci intronu, üçüncü eksonu (C-terminal EGFP) ve SV40 poliadenilasyon sinyalini amplifiye edin (Şekil 3, Tablo 1 ve Tablo 2).
    2. Kütüphane amplikonu: PCR Ürün 2: 3'ün kütüphanesi için, PCR Ürünü 1 ve PCR Ürünü 3'ün iç uçlarıyla eşleşecek şekilde her iki uçta örtüşen dizilerle kütüphane amplikonlarını güçlendirin ve CAMTA2 ekson 15'in 3'ünde verimli entegrasyona izin verin (Şekil 3, Tablo 1 ve Tablo 2).
      NOT: 5'in kütüphanesi için, orta ekson bağlantısının 5' ucunu kütüphane dizisi ile değiştirin.
  3. PCR'den sonra, adım 2.1.2'deki gibi saflaştırma kolonlarını kullanarak tüm ürünleri temizleyin. Şablon vektörden kontaminasyonu önlemek için, istenen ürünleri agaroz jel ekstraksiyonu ile PCR1 ve PCR3'ten saflaştırın. Spesifik olarak, elektroforezden sonra, hedef PCR ürününü içeren ~ 100 mg agaroz jeli çıkarın ve bağlama tamponunda çözün. Çözünmüş jel çözeltisini kolon membranına bağlayın, ardından standart PCR saflaştırma protokolüne devam edin.
  4. MaPSy ekleme minigenlerinin yapımı - Örtüşme uzatma PCR'si: Üç ana parçayı (PCR Ürünü 1, kitaplık amplikonu ve PCR Ürünü 3; şablon olarak her biri ~ 20 ng kullanın) tam uzunlukta bir ekleme minigenine bağlamak için bir veya sıralı örtüşen PCR turları gerçekleştirin ( Tablo 1'de en dış primerler CAMGFPF ve CMVGFPR ve Tablo 2'de termocycler ayarlarını kullanın).
    NOT: Nihai ürün, CMV promotörünü ve oligonükleotid kütüphanesinden türetilen ilk 3'lere sahip üç ekzon içerir ve hücre bazlı deneyler için transfeksiyona hazırdır.
  5. Montajın ardından, PCR saflaştırma kolonlarını kullanarak tam uzunluktaki DNA şablonlarını temizleyin. Jelde spesifik olmayan bantlar gözlenirse, adım 2.3'te istenen tam uzunluktaki ürünü tam olarak izole etmek için jel ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    NOT: Kitaplıktaki oldukça benzer diziler montajın tamamlanmamasına neden olabilir. Tek bir PCR reaksiyonunda tam montaj zorsa, sıralı örtüşen PCR'ler (iki parçadan başlayıp ardından üçüncüyü ekleme) denenebilir. PCR özgüllüğünü geliştirmek için, tavlama sıcaklığını ayarlamayı veya karmaşık şablonlar için bağlanma özgüllüğünü geliştirmek üzere temaslı PCR uygulamayı düşünün. En az dört bağımsız deney gerçekleştirmek için yeterli MaPSy yapısı hazırlayın. Bazı oligonükleotitler verimli bir şekilde amplifiye edilemeyebilir ve eksik montajlara (durma noktası) neden olabileceğinden, dizi bütünlüğünü doğrulamak için yeni nesil dizileme için her yapının küçük bir kısmını saklayın.

figure-protocol-2
Şekil 3: Kütüphane yapımının iş akışı. (A) Örtüşen PCR'de kullanılan primerler (ayrıca bakınız Tablo 1). (B) Örtüşen PCR prosedürü. Kısaca, oligo havuzları ve ekleme minigenlerinin diğer kısımları 25 PCR döngüsü ile amplifiye edildi. Promotörü ve ilk ekzonu (PCR ürünü 1) içeren fragman, 20 amplifikasyon döngüsü kullanılarak PCR'nin üst üste bindirilmesiyle oligo havuzuna (PCR ürünü 2) dikildi. Daha sonra, dikişli ürün (PCR ürünü 1+2), nihai yapıyı (PCR ürünü 1+2+3) elde etmek için 20 amplifikasyon döngüsü kullanılarak 3. ekson ve poliadenilasyon sinyalini (PCR ürünü 3) içeren parçaya dikildi. Bu rakam Chiang ve ark.'nın17 izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

MaPSy-kütüphane astarının yapımınot
CMVGFPFCCGCCATGCATTAGTTATTAATAGPCR ürünü 1
Kütüphane2CAGGTCTTCAGGCCCCAGCCPCR ürünü 1
LibFGGCTGGGGCCTGAAGACCTGPCR ürünü 2
KütüphaneAAGGCGCACATGACCCCGGGPCR ürünü 2
LibF2CCCGGGGTCATGTGCGCCTTPCR ürünü 3
CMVGFPRGGACAAACCACAACTAGAATGCPCR ürünü 3
Amplikon dizilimi için MaPSy kütüphanesi PCR primeri
P7-Lib0FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGAAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTCTCTCTGTAGT
P5-Lib1RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCTCTCTCTGTAGT
Doğrulama astarı
Lib0F (Kitaplık doğrulaması)AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (Kitaplık doğrulaması)CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan primerler.

PCR reaksiyon karışımı
BileşenHacim
ddH2O13,4 μL
5x HF Tamponu4 μL
10 mM dNTP'ler0,4 μL
İleri astar 10 μM0,5 μL
Ters astar 10 μM0,5 μL
cDNA'sı1 μL
Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz0,2 μL
PCR programını çalıştırın (20 μL reaksiyon)
TempSaatDöngü
İlk Denatürasyon98°C1 dakika1
Denatürasyon98°C30 sn.10–20
Tavlama65°C30 sn.
Uzantı72°C30 sn.Denatürasyona geri dön
Son uzatma72°C5 dk1
Tutmak4°CTutmakTutmak

Tablo 2: Termocycler ayarları.

3. Memeli hücrelerinden ekleme minigenlerinin ekspresyonu ve geri kazanımı

  1. Hücre kültürü: 37 °C'de fetal sığır serumu (FBS), 100 ünite/mL penisilin ve streptomisin ve %5 CO2 içinde 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) HEK293T hücrelerini koruyun.
  2. Ekleme minigenlerinin transfeksiyonu:
    1. Plaka 5 × 10 Transfeksiyondan 24 saat önce 6 oyuklu plakalarda 2 mL ortamda5 HEK293T hücre.
    2. 1-2 μg MaPSy yapılarına sahip transfekte hücreler, üreticinin protokolüne göre 3.75 μL transfeksiyon reaktifi ile 5 dakika önceden inkübe edilir. Başarılı transfeksiyon, eklenmiş kitaplıktan EGFP sinyallerinin varlığı ile gösterilir.
    3. Transfeksiyondan 24 saat sonra 250 μL Trizol (veya eşdeğeri) kullanarak hücreleri lize edin.
  3. RNA ekstraksiyonu: Üreticinin protokolünü izleyerek bir RNA miniprep kiti kullanarak toplam RNA'yı çıkarın. Spesifik olarak, Trizol'deki RNA'yı kolon zarlarına bağlayın, tuzları, proteinleri ve diğer safsızlıkları gidermek için p etanol içeren tamponlarla yıkayın ve saflaştırılmış RNA'yı düşük tuzlu tampon veya nükleaz içermeyen su kullanarak ayrıştırın.
    DİKKAT: Trizol (veya eşdeğeri) oldukça aşındırıcı ve toksiktir. Maruz kalma ciddi kimyasal yanıklara, kalıcı yara izlerine ve böbrek yetmezliğine yol açabilir.
    NOT: RNA, TRIZOL'de (veya TOOLS'un TOOLSmart RNA çıkarıcısı gibi eşdeğer bir Trizol bazlı reaktifte) -80 °C'de bir yıla kadar (durma noktası) saklanabilir. Saflaştırılmış RNA, donma-çözülme döngüleri en aza indirilirse (durma noktası) -80 °C'de iki yıla kadar saklanabilir.
  4. Ters transkripsiyon: Üreticinin protokolünü izleyerek rastgele heksamerlerle ters transkriptaz kullanarak 2 μg toplam RNA'dan cDNA hazırlayın. Spesifik olarak, tavlamaya izin vermek için RNA'yı oda sıcaklığında 50 μM rastgele heksamerlerle 10 dakika inkübe edin ve ardından 55 °C'de 10 dakika ters transkripsiyon gerçekleştirin.
    NOT: cDNA -20 °C'de bir yıla kadar saklanabilir (durma noktası).
  5. Eklenmiş minigenlerin amplifikasyonu: Eklenmiş minigenler için spesifik hazırlama dizilerini kullanarak PCR gerçekleştirin (Tablo 2). Ürünü bir agaroz jel üzerinde görselleştirmek için gereken minimum döngü sayısını kullanın.
    NOT: Jel üzerinde eklenmemiş ve eklenmiş ürünlerin karışık bantları görünmelidir. DNA türlerinin karışık popülasyonu nedeniyle bantlar dağınık görünebilir (Şekil 4A).
  6. PCR ürününü adım 2.1.2'deki gibi saflaştırma kolonlarını kullanarak temizleyin.
  7. Dizileme adaptörlerinin eklenmesi: Dizileme adaptör dizilerini amplikon uçlarına eklemek için son bir PCR turu gerçekleştirin. NextSeq platformunda dengeli floresan tespiti sağlamak için amplikonların sonuna 0-3 rastgele nükleotid ekleyin (Tablo 1).
  8. PCR ürününü adım 2.1.2'deki gibi saflaştırma kolonlarını kullanarak temizleyin.

4. Amplikon dizilimi ve analizi

  1. Kısa okuma dizilimi: PCR amplikonlarını, bir çekirdek tesis veya ticari hizmet aracılığıyla Illumina Miseq, Novaseq veya eşdeğerini kullanarak 150 çift uçlu dizilemeye tabi tutun.
  2. Hizalama:
    1. Bir referans genom oluşturun: Her benzersiz genotipi ayrı bir kromozom olarak etiketleyerek sentetik bir "referans genom" oluşturun. Referans genom, amplikonlar içinde bulunan sentetik ekzonları ve intronları içerir.
    2. Sıralama okumalarını hizalayın: HISAT222,23 kullanarak eşleştirilmiş uç okumalarını referans genoma hizalayın, eklemeye özgü öğeleri kontrol etmek için parametreleri ayarlayın (komut satırı ayrıntıları için Ek Dosya 2'ye bakın).
    3. Yüksek kaliteli okumaları seçin: SAM'i BAM formatına dönüştürün, yüksek kaliteli okumalar için filtreleyin (eşleme kalitesi ≥60) ve ardından BAM dosyalarını24 sıralayın ve dizine ekleyin (komut satırı ayrıntıları için Ek Dosya 2'ye bakın).
    4. Ekleme bağlantılarını tanımlayın ve bağlantı okumalarını hesaplayın: Hizalanmış BAM dosyasındaki CIGAR dizelerinden ekzon atlama olaylarını çıkararak ekleme bağlantı kullanımını ölçün. "N" işlemlerine dayalı olarak bağlantı kapsayan okumaları tanımlayın ve ekleme modellerini değerlendirmek için bağlantı koordinatı ve şerit başına toplam okuma sayılarını belirleyin (komut satırı ayrıntıları için Ek Dosya 2'ye bakın).
    5. Kanonik ekleme yerlerini sınıflandırın: Ek yerlerini, açıklamalı GT-AG bağlantılarıyla eşleşiyorlarsa kanonik olarak sınıflandırın.
      NOT: Nadir durumlarda, MaPSy'deki referans aleller kanonik olmayan ekleme bölgelerini kullanabilir. Belirlenen ekleme yeri konumunu kapsayan bağlantı noktaları olmayan okumalar, eklenmemiş okumalar olarak korunur.
  3. Ekleme varyantlarını belirlemek için istatistiksel analiz: Okumaları üç gruba ayırın:
    (1) eklenmiş ve eklenmemiş okumalar;
    (2) tüm eklenmiş okumalar arasında kanonik ve kanonik olmayan;
    (3) kanonik ve kanonik olmayan artı eklenmemiş okumalar.
    Varyantların ekleme verimliliği ve doğruluğu üzerindeki etkisini değerlendirmek için iki taraflı bir Fisher's exact testi ve ardından yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi (Tablo 3) gerçekleştirin.
  4. Yüksek güvenilirlikli ekleme varyantları için filtre: Dört tekrarda q değeri 0,05'ten düşük olan 100 okuma sayısını aşan her iki referans/varyant çiftini de anlamlı olarak sınıflandırın. Ardından, %>5 eklenmemiş ve kanonik olmayan okumalara, yüksek güvenilirlikli ekleme varyantlarına sahip referans veya varyant aleli ile 2 kat olasılık oranı değişikliği olan adayları düşünün (Şekil 4B).
OkurEklenmişEklenmemiş ve/veya Kanonik Olmayan
Referansab
Varyantcd

Tablo 3: Fisher'ın kesin testi için ikişer ikişer tablo.

5. Doğrulama

  1. Doğrulama için minigen ekleme:
    1. Oligo sentezi ve amplifikasyonu: Seçilen MaPSy aday dizilerinin DNA oligolarını ayrı ayrı sentezleyin (örneğin, Entegre DNA Teknolojileri ile). Daha sonra, tasarlanan yan dizileri kullanarak oligoları, High-Fidelity DNA Polimeraz kullanılarak PCR ile çift sarmallar halinde amplifiye edin (Tablo 2).
    2. Minijen klonlama: Hem elde edilen PCR ürünlerini hem de pGint-CAMTA2'yi BbsI ve SmaI ile sindirin ve sindirilmiş ürünü DNA ligazları ile bağlayın.
    3. Transfeksiyon: Elde edilen yapıları, adım 3.2.2'de bir transfeksiyon reaktifi kullanarak HEK293T hücrelerine transfekte edin.
    4. RNA ekstraksiyonu: Adım 3.3'te açıklandığı gibi transfekte edilmiş hücrelerden RNA'yı çıkarın.
    5. Ters transkripsiyon: Rastgele heksamerler kullanarak ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gerçekleştirin.
    6. Ekleme izoform amplifikasyonu: Minigenin ilk iki eksonunu hedefleyen primerlerle ekleme izoformlarını amplifiye edin (Lib0F ve Lib0Rl, Tablo 1, Tablo 2'deki termocycler ayarları). Amplifiye edilmiş ürünleri elektroforez ile çözün ve Gel Doc Sistemini kullanarak görselleştirin.
    7. Niceleme: ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD)25,26 kullanarak her bir ekleme izoformunun sinyal yoğunluğunu ölçün. Alternatif olarak, PCR ürünlerinin yoğunluğunu ve moleküler ağırlığını ölçmek için eGENE HDA-GT12 yüksek performanslı nükleik asit analizörünü kullanarak DNA Tarama Kitini kullanın.
    8. İzoform ekstraksiyonu ve onayı: Adım 2.3 olarak agaroz jel ekstraksiyonu ile her izoformu izole edin ve normal ekleme, intron dahil etme ve ekson atlama için değerlendirme yaparak PCR ürünlerinin bir çekirdek tesis veya ticari hizmet aracılığıyla Sanger dizilimi ile ekleme sonucunu onaylayın.
  2. Çoklu ekzon ekleme minigenleri:
    1. MaPSy sonuçlarını doğruladıktan sonra, ilgilenilen varyantı seçin ve gözlemlenen ekleme kusuru için daha genomik bir bağlam sağlamak üzere genomik DNA'dan (gDNA) üç ila beş ekzon klonlayın.
    2. Hedef bölgede istenen dizi değişikliğini barındıran minijen yapılarını bir araya getirmek için mutajenizan primerler ve örtüşen PCR kullanarak bölgeye yönelik mutajenez gerçekleştirin.
      NOT: Yan intronlar klonlama için çok uzunsa, uygun bir ekleme bağlamı sağlamak için her bir ekleme bölgesi için intronik dizinin yaklaşık 300 nt'sini koruyun.
    3. Hücre bazlı ekleme testini yukarıda 5.1'de açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  3. Hücresel doğrulama: Hücrelerdeki ekleme etkisini doğrulamak için, uygun bir hücresel modelde seçilen varyantların sırasını değiştirmek için şablon tabanlı CRISPR düzenlemeyi kullanın.
    NOT: Mümkün olduğunda, ekleme modelini doğrudan değerlendirmek için belirli varyantı taşıyan insan numunelerini kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MaPSy yapılarının hücresel eklenmesini takiben, hem eklenmiş hem de eklenmemiş ürünler bir karışım olarak bulunur. Kitaplığın boyut çeşitliliği ve kanonik olmayan ekleme potansiyeli nedeniyle, her iki ürün türü de bir jel üzerinde biraz dağınık görünebilir. 3' ucunu hedefleyen yapılarda, kısmi adenoviral diziler içeren ikinci intron çok sağlam bir şekilde eklenme eğilimindedir (Şekil 4A).

MaPSy deneylerinde, hastalıkla ilgili varyantların yaklaşık -30'u değişmiş e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MaPSy yapısındaki içsel EGFP sinyali, ekson atlamanın floresan tabanlı tespitini sağlar. Orta ekson veya intronlardaki dizi ekson atlamayı teşvik ediyorsa, birinci ve üçüncü eksonların ligasyonu, FACS tarafından saptanabilen bir EGFP sinyali üretir, bu da bunu ekson atlamayı etkileyen varyantları tanımlamak ve ekleme varyantlarının mikroskopi tabanlı görselleştirilmesini kolaylaştırmak için değerli bir yöntem haline getirir13. Bununla birlikte, burada açıklanan am...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için finansman desteği, Kariyer Geliştirme Ödülü, Multidisipliner Sağlık Bulutu Araştırma Programı, Academia Sinica'nın Grand Challenge Tohum Hibesi (AS-CDA-108-M03, AS-PH-109-01-3 ve AS-GCS-113-L03), Tayvan Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri Kariyer Geliştirme Ödülü (NHRI-EX112-10908BC) ve Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nin Mükemmel Genç Akademisyen Araştırma Hibeleri ve Ta-You Wu Anma Ödülü, Tayvan (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 ve 108-2118-M-001-013-MY5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Direct-zol RNA MiniPrep Plus kitiZymo AraştırmasıR2072 Serisi
Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)Thermo Fisher Bilimsel11965084
Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermo Fisher Bilimsel26140079
L-GlutaminThermo Fisher BilimselA2916801 
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher BilimselL3000015
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher Bilimsel15140122
pGint plazmidiAddgene24217
Phusion Yüksek Kaliteli DNA PolimerazThermo Fisher BilimselF530L Serisi
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28706
QIAquick PCR Arıtma Kiti Qiagen28106
QIAxcel DNA Tarama Kiti (2400)Qiagen929004
SuperScript IV ters transkriptazThermo Fisher Bilimsel18090010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baralle, F. E., Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (7), 437-451 (2017).
  2. Gooding, C., et al. A class of human exons with predicted distant branch points revealed by analysis of AG dinucleotide exclusion zones. Genome Biol. 7 (1), R1(2006).
  3. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annu Rev Biochem. 89, 359-388 (2020).
  4. Jaganathan, K., et al. Predicting splicing from primary sequence with deep learning. Cell. 176 (3), 535-548.e24 (2019).
  5. Lim, K. H., Ferraris, L., Filloux, M. E., Raphael, B. J., Fairbrother, W. G. Using positional distribution to identify splicing elements and predict pre-mRNA processing defects in human genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11093-11098 (2011).
  6. Calabrese, C., et al. Genomic basis for RNA alterations in cancer. Nature. 578 (7793), 129-136 (2020).
  7. Mercer, T. R., et al. Genome-wide discovery of human splicing branchpoints. Genome Res. 25 (2), 290-303 (2015).
  8. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Res. 27 (4), 639-649 (2017).
  9. Pineda, J. M. B., Bradley, R. K. Most human introns are recognized via multiple and tissue-specific branchpoints. Genes Dev. 32 (7-8), 577-591 (2018).
  10. Zeng, Y., et al. Profiling lariat intermediates reveals genetic determinants of early and late co-transcriptional splicing. Mol Cell. 82 (24), 4681-4699 (2022).
  11. Xiong, H. Y., et al. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347 (6218), 1254806(2015).
  12. Cheng, J., et al. MMSplice: modular modeling improves the predictions of genetic variant effects on splicing. Genome Biol. 20 (1), 48(2019).
  13. Chong, R., et al. A multiplexed assay for exon recognition reveals that an unappreciated fraction of rare genetic variants cause large-effect splicing disruptions. Mol Cell. 73 (1), 183-194.e8 (2019).
  14. Rosenberg, A. B., Patwardhan, R. P., Shendure, J., Seelig, G. Learning the sequence determinants of alternative splicing from millions of random sequences. Cell. 163 (3), 698-711 (2015).
  15. Jian, X. Q., Boerwinkle, E., Liu, X. M. In silico tools for splicing defect prediction: a survey from the viewpoint of end users. Genet Med. 16 (7), 497-503 (2014).
  16. Riepe, T. V., Khan, M., Roosing, S., Cremers, F. P. M., 't Hoen, P. A. C. Benchmarking deep learning splice prediction tools using functional splice assays. Hum Mutat. 42 (7), 799-810 (2021).
  17. Chiang, H. L., et al. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 29 (11), 1043-1055 (2022).
  18. Gupta, A. K., et al. Degenerate minigene library analysis enables identification of altered branch point utilization by mutant splicing factor 3B1 (SF3B1). Nucleic Acids Res. 47 (2), 970-980 (2019).
  19. Landrum, M. J., et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D862-D868 (2016).
  20. Sherry, S. T., Ward, M. H., Sirotkin, K. dbSNP-database for single nucleotide polymorphisms and other classes of minor genetic variation. Genome Res. 9 (8), 677-679 (1999).
  21. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  22. Kim, D., Landmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  23. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 37 (8), 907-915 (2019).
  24. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), giab008(2021).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Lind, R. Open Source Software for Image Processing and Analysis: Picture this with ImageJ. Open Source Software in Life Science Research. , Woodhead Publishing. Cambridge. (2012).
  27. Huang, A. C., et al. SpliceAPP: an interactive web server to predict splicing errors arising from human mutations. BMC Genomics. 25 (1), 600(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

Related Articles