Yöntem makalesi

Araştırma ve Terapi için Tasarlanmış Viral Vektörlerin Yeniden Birleştirmeye Dayalı Üretimi

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinasyon aracılı bir genetik mühendisliği yöntemi olan yeniden birleştirme, enzimatik sindirime dayanmadan hassas viral genom modifikasyonlarına olanak tanır. Bu yaklaşım, hedeflenen delesyonlar gibi temel araştırmalar ve onkolitik tedavilerde, gen terapisinde ve genetik aşılarda kullanılan tasarlanmış virüslerin geliştirilmesi için çok önemlidir ve hem araştırma hem de klinik uygulamalardaki olanakları genişletir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem temel hem de translasyonel araştırmalarda tasarlanmış viral vektörlere yönelik artan talep, rekombinant DNA virüsleri üretmek için esnek, hızlı ve ölçeklenebilir yöntemlere olan ihtiyacın altını çizdi. Kısıtlama enzimi sindirimi ve ligasyonuna dayanan stratejiler, diziye bağlı sınırlamalar ve zaman alıcı klonlama adımları ile sınırlıdır. Burada, bakteriyel yapay kromozomlarda (BAC'ler) viral genomların hassas ve kesintisiz modifikasyonlarını sağlayarak bu sınırlamaları aşan rekombinasyon aracılı genetik mühendisliği yöntemini (yeniden birleştirme) açıklıyoruz. Bu yaklaşım, kodlayan veya kodlamayan genetik elementlerin verimli bir şekilde silinmesine, eklenmesine veya ikame edilmesine izin vererek, yüksek verimli viral vektör geliştirme için güçlü bir platform sağlar. Yeniden birleştirme, işlevlerini araştırmak için viral genlerin silinmesi veya mutasyona uğraması gibi temel araştırma uygulamalarında özellikle değerlidir. Daha da önemlisi, bu metodoloji, farklı immün sistemi uyarıcı veya terapötik yükleri paralel olarak kodlayan onlarca rekombinant virüsün üretilmesini sağlar ve bu da onu yeni yapıların hızlı klinik öncesi değerlendirmesi için son derece uygun hale getirir. Bu teknoloji potansiyel olarak herhangi bir bilimsel amaç için uygulanabilirken, bu makale iki spesifik alanda yeniden birleştirme uygulamasına odaklanmaktadır: herpes simpleks virüsüne dayalı onkolitik virüslerin üretilmesi ve gen transferi için replikatif olmayan adenoviral vektörlerin geliştirilmesi. Sonuç olarak, yeniden birleştirme, viral genom mühendisliğine çok yönlü bir yaklaşım sunarak tasarımdan işlevsel testlere kadar olan süreci önemli ölçüde hızlandırır. İlgisi, gelişen araştırma ve klinik ihtiyaçları karşılamak için temel virolojiden translasyonel tıbba kadar uzanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral vektörler, genetik materyali konakçı hücrelere iletme konusundaki doğal yetenekleri nedeniyle gen terapisi, onkolitik viroterapi ve genetik aşı geliştirmede güçlü araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Virüslerin doğal tropizminden ve transdüksiyon mekanizmalarından yararlanarak hem geçici hem de uzun vadeli gen ekspresyonunu kolaylaştırırlar. Hücre dışı ortamda hayatta kalabilirler, spesifik bir hücresel reseptöre (viral tropizmi tanımlayan) bağlanabilirler ve içselleşmelerini teşvik edebilirler, konakçı hücre gen ekspresyon mekanizmasını ele geçirebilir ve kendi genlerinin ekspresyonunu yönlendirebilirler ve doğuştan gelen bağışıklık kolunun zara bağlı ve hücre içi sensörlerinden kaçabilirler 1,2. Bu şekilde, üretken bir viral enfeksiyondan sonra virüsler, hücreleri, organizmaya yeni virüsler yayan ve sonunda bir hastalığa neden olan viral soy fabrikalarına dönüştürür.

Vahşi tip virüsler, genetik mühendisliği ile biyoteknolojik bir araca dönüştürülebilir: genomları, transdüksiyon kabiliyetini korumak ve klinik bir sonuç elde etmek için kolayca manipüle edilebilir. Klinik uygulamalarına bağlı olarak, viral vektörler, replikasyon yetkin veya replikasyon yetersiz vektörler 3,4 üretmek için replikasyon yeterliliklerini (en azından kısmen) koruyacak veya ablasyona tabi tutulacak şekilde tasarlanabilir.

Replikasyon yetkin virüsler esas olarak onkolitik virüs amaçlarına yöneliktir. Genellikle antiviral savunmalarda1 eksik olan kanser hücreleri, virülans genlerinin silinmesi yoluyla tasarlanmış zayıflatılmış rekombinant virüslerin replikasyonuna izin verir. Bu virüsler, normal dokuyu korurken tümörlerde seçici olarak çoğalır. Viroloji anlayışı ilerledikçe, zayıflatılmış virüslerin yerini hem güvenliği hem de terapötik etkinliği artırmak için tasarlanmış daha kesin genom modifikasyonları almıştır.

Viral genomların cerrahi moleküler mühendisliğini gerektiren ilgi alanları arasında şunlar yer alır: i) Viral promotörlerin tümörle ilişkili promotörlerle (tümör hücrelerinde aşırı kopyalanan hücresel promotörler) değiştirildiği, böylece viral gen ekspresyonunu hastalıklı hücrelerle sınırladığı replikasyon koşullu onkolitik virüsler5. ii) Enfeksiyonu belirleyen zarf glikoproteinlerinin modifiye edilebildiği veya tümör hücrelerinde aşırı eksprese edilen proteinleri hedef alan antikor fragmanları veya ligandları ile değiştirilebildiği değiştirilmiş tropizm 6,7 olan virüsler 8,9. iii) Silahlı onkolitik virüsler. Onkolitik virüsler tarafından indüklenen tümör hücresi ölümü, inflamatuar mediatörlerin 1,10 ve tümör antijenlerinin11 salınımı ile karakterize immünojenik hücre ölümünü (ICD) tetikler. Bu sinyaller, tümör antijenlerinin bağışıklık sistemi tarafından verimli bir şekilde tanınmasını teşvik eder, sürveyansı12geri yükler ve bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri 13,14,15 ve RNA bazlı tedaviler ve aşılar 16 gibi diğer bağışıklık terapötikleri ile kombinasyonu mümkün kılar.

Bu immünoterapötik etkiyi desteklemek için, ilgilenilen transgenler viral genom içinde kodlanabilir, böylece virüsü sadece onkolitik aktivitesi için değil, aynı zamanda ilgili yüklerin yerinde üretimi yoluyla immünoterapötik potansiyelini arttırmak için de kullanır 3,7,17,18,19. Bu yükler sitokinler, kemokinler, antikorlar, intihar genleri ve antijenler 3,20 içerebilir. Viral genlerin bozulmasını en aza indirmek ve replikasyonu ve gücü korumak için viral genomun intergenik bölgelerinin tercih edilmesiyle yerleştirme hassasiyet gerektirir7. Bu nedenle, hem optimal yerleştirme bölgelerinin hem de ilgilenilen transgenlerin taranmasını sağlayan teknikler esastır.

Öte yandan, gen terapisi için veya genetik aşılar için araç olarak kullanılan replikatif olmayan virüsler bağlamında, viral vektörün transgeni (geçici veya uzun süreli) konakçı hücreye çoğalmadan iletmesi önemlidirtoksisiteyi önlemek için 21. Adenoviral vektörler, yüksek transdüksiyon verimliliği, transgenlerin sağlam ekspresyonu ve hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte etme kapasitesi ile karakterize edilir3. Bu özellikler, onları COVID-19 gibi yeni ortaya çıkan bulaşıcı hastalıkların yanı sıra gen replasman tedavileri de dahil olmak üzere genetik aşıların geliştirilmesinde sınıfında birinci yapmıştır22. Piyasaya ulaşan adenoviral vektörün en ünlü örneği, SARS-CoV-2'nin Spike proteinini kodlayan modifiye şempanze adenovirüsü ChAdOx1'e dayanan, Covishield veya Vaxzevria ticari adıyla bilinen Oxford-AstraZeneca COVID-19 aşısıdır. Kas içi yolla enjekte edildiğinde, Covishield hücrelerin içine nüfuz edebilir ve Spike proteininin ekspresyonunu indükleyerek bağışıklık sistemini ona karşı bir bağışıklık tepkisi oluşturmaya hazırlar3.

Kısıtlama enzimi tanıma bölgeleri tarafından kısıtlanmadan viral genomları değiştirmeye açık bir ihtiyaç vardır. Onkolitik virüsler arasında, Herpes Simpleks Virüsü-1 (HSV-1) tabanlı vektörler, litik yetenek, güvenlik ve büyük genom boyutu dahil olmak üzere benzersiz avantajlar sunar ve büyük transgenlerin veya çoklu genetik elementlerineklenmesine izin verir 23,24. HSV'nin ötesinde, yakın zamanda Sasso ve ark.3'te gözden geçirildiği gibi, diğer birçok virüs terapötik umut vaat etmektedir. Evrensel bir "sınıfının en iyisi" vektör yerine, farklı viral platformlar farklı terapötik ihtiyaçlara uygundur3. Şu anda, bakterilerdeki homolog rekombinasyon sistemleri veya hibrit maya-bakteri klonlaması, kısıtlama enzimlerine en yaygın alternatifler olmaya devam etmektedir, ancak bunlar zahmetli, çok adımlı ve verimsizdir25.

Ortaya çıkan bir alternatif, yakın zamanda vaccinia virüsü (VV), herpes simpleks virüsü ve adenoviral vektörler dahil olmak üzere virüslerin genomlarını tasarlamak için uygulanan CRISPR/Cas9'un kullanılmasıdır. Cas9, indel mutasyonları yoluyla gen inaktivasyonu için çekicidir, ancak genom segmentlerini silmek veya donör DNA'sı yoluyla bir transgen eklemek için birden fazla kesim gerektiğinde daha az pratik hale gelir. Ayrıca, düzenleme, gRNA tasarımı, hem viral hem de konakçı genomlarında hedef dışı etkiler ve ilgilenilen bölgelerdeki PAM dizilerine bağımlılık ile sınırlıdır25.

Bunu akılda tutarak ve HSV ve adenovirüse dayalı iki örnek aracılığıyla, bu makale, virüslerden bakteriyofajlara, karmaşık plazmitlere ve çeşitli deneysel sistemlere kadar geniş bir şekilde uygulanabilen yeniden birleştirme yöntemini göstermektedir. Yeniden birleştirme (homolog RECOMBInation aracılı genetik mühendislik), esas olarak Escherichia coli'de kullanılan ve 30 bp kadar az homoloji26 ile DNA elementleri arasındaki homolog rekombinasyonu katalize etmek için sıcaklığa bağlı bakteriyofaj rekombinasyon proteinlerinden yararlanan bir in vivo genetik mühendisliği tekniğidir. Bu yaklaşım, kısıtlama bölgelerine veya DNA boyutuna bağlı olmaksızın dizilerin hassas bir şekilde yerleştirilmesine, silinmesine veya değiştirilmesine izin verir. Bu yazıda, ısıyla indüklenebilir E. coli suşu SW102'ye dayalı bir versiyonu açıklıyoruz, ancak spesifik indüklenebilir sistemlere sahip alternatif suşlar da mevcuttur27.

Yeniden birleştirme, faj rekombinasyon mekanizmasını aktive etmek için elektrokompetan bakteri hücrelerinin kontrollü bir sıcaklık şoku yoluyla hazırlanmasıyla başlar. Uygun homoloji kollarını taşıyan DNA molekülleri daha sonra elektroporasyona tabi tutulur. Bunlar, kısıtlama sindirimi veya PCR ile üretilen çift sarmallı DNA'lar (dsDNA) veya oligonükleotitler gibi tek sarmallı DNA'lar (ssDNA'lar) olabilir. Aktif rekombinasyon proteinleri ile birlikte homolog dizilerin varlığı, istenen modifikasyona sahip yeni DNA moleküllerinin oluşturulmasını sağlar.

Yeniden birleştirme moleküler klonlama teknolojisi, hassas genetik mühendisliğine olanak tanır ve seçilebilir veya seçilemeyen belirteçlerin plazmitlere, bakteriyel kromozomal DNA'ya ve bakteriyel yapay kromozomlara (BAC'ler) eklenmesi dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda uygulanır. BAC'ler, adenoviral ve HSV DNA dahil olmak üzere büyük genomik parçaların klonlanması için özellikle değerlidir ve viral vektörlerin hızlı üretimini sağlar. Translasyonel uygulamaların ötesinde, yeniden birleştirme, viral genlerin veya protein alanlarının hedeflenen silinmesine, değiştirilmesine veya değiştirilmesine izin vererek temel araştırmaları da destekler. Rekombineringin bazı sınırlamaları vardır: kısa homoloji kolları, tekrarlayan bölgelerde rekombinasyonu engeller; PCR ile güçlendirilmiş substratlar bazen mutasyonlara neden olabilir; ve hedef bölgenin sırası bilinmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeniden birleştirmenin bir ön koşulu olarak, İlgilenilen bir BAC-Genomuna sahip yetkin bir bakteri suşu (örneğin, SW102) mevcut olmalıdır. Yeniden birleştirme, istenen modifikasyona uğramış kolonileri zenginleştirmek için oldukça verimli bir yöntem olmasına rağmen, burada birinci ve ikinci adımlar olarak adlandırılan iki aşamalı bir yeniden birleştirme stratejisini açıklıyoruz (Şekil 1). İlk adımda, hem pozitif hem de negatif seçim işaretleyicilerini içeren bir ifade kaseti ilgilenilen yere yerleştirilir. İkinci adımda, bu kaset, nihai genom için amaçlanan gerçek genetik modifikasyonla değiştirilir. Bu çalışmada kullanılan seçim belirteçleri arasında ampisilin direnci (AmpR), beta-galaktosidaz aktivitesi (β-gal) ve sacB geni; Bununla birlikte, araştırma grubunun özel ihtiyaçlarına bağlı olarak, pozitif ve negatif seçim belirteçlerinin herhangi bir kombinasyonu kullanılabilir.

1. Seçim kasetini hedef bölgeye yerleştirin

  1. Gün 0
    1. LB Agar + antibiyotik (direnç geni BAC'de olan (örneğin, kloramfenikol 12.5 μg/mL) üzerinde istenen BAC'yi içeren SW102 hücrelerini çizin. Onları gece boyunca kuluçka makinesinde 32 °C'de büyütün.
      NOT: Bu aşamada yeniden birleşen genlerin indüklenmesini önlemek için 32 °C> sıcaklıklardan kaçının.
  2. 1. Gün
    1. AmpR/LacZ/SacB seçim kasetini yükseltmek için bir PCR gerçekleştirin. Seçim kasetini tavlamak ve amplifiye etmek için 3' ucunda diziyi ve 5' ucunda modifiye edilecek viral genomik bölgeye homoloji kollarını temsil eden 30-80 bp içeren ileri ve geri primerleri kullanın (Tablo 1).
      NOT: Seçim kaseti ve ek parça, uzman sağlayıcılardan sentetik yapılar olarak kolayca sipariş edilebilir. Bununla birlikte, istenmeyen rekombinasyon olaylarını önlemek için BAC (kontrol eden BAC genleri) veya viral genomda kopyalanmış promotörlerin, sonlandırıcıların veya diğer genetik elementlerin varlığından kaçınmak için özen gösterilmelidir.
    2. Agaroz jel elektroforezi ile PCR fragmanının kimliğini ve saflığını sağlayın (AmpR/LacZ/SacB kaseti 3.400 bp olduğundan, %1'lik bir agaroz jel çalıştırın) ve 260/230 ve 260/280 değerlerinin saf nükleik asit ile uyumlu olduğundan emin olun.
    3. Öğleden sonra, tek bir SW102 kolonisini 5 mL LB'ye aşılayın ve gece boyunca 32 °C'de inkübe edin.
  3. 2. Gün
    1. Gece kültürünün 1-2 mL'sini taze 100 mL LB'ye aşılayın. Üstel fazı kaçırmamak için OD600'ü düzenli olarak ölçerek bakterileri 0.55-0.7'lik bir OD600'e büyütün.
    2. İndüksiyon için 42 °C'ye kadar bir su banyosu hazırlayın ve yıkamalar için 4 °C ~250 mL steril ddH2O'ya soğutun.
    3. Kültür istenen OD'ye ulaştığında, 50 mL'yi temiz bir konik tüpe aktarın ve 42 °C'de bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin. İndüklenmemiş bir negatif kontrol ekleyin.
      NOT: Bu adım lambda kırmızı proteinlerini indükleyecektir.
    4. Tüpleri 10 dakika buzda bırakın, ardından 4 °C'de 3.200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş).
    5. Süpernatanı atın, 40 mL buz gibi soğuk, steril ddH2O ekleyin ve peleti yeniden süspanse edin (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş).
    6. 8 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin (bkz. adım 1.3.4) ve yıkama adımını (adım 1.3.5) ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatan su kadar berrak olana kadar (bulanıklıklar ve süspansiyonlar olmadan) (2-4 yıkama) yıkama adımını tekrarlayın.
    7. Son santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve peleti 200 μL buz gibi, steril ddH2O (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş) içinde yeniden süspanse edin.
    8. Yeniden süspanse edilmiş peletlerin bir kısmını (50 μL HSV-1 ve 25 μL Adeno) önceden soğutulmuş 1.5 mL tüplere (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş) aktarın. 50-400 ng saflaştırılmış PCR ürünü ekleyin (5μL'yi aşmayın). Tüpleri döndürün ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
    9. Karışımı bir önceki adımdan önceden soğutulmuş bir küvete aktarın ve 2,50 kV'da (2.500 V, 0,2 cm küvet) elektropolat yapın (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş).
    10. Elektroporasyondan sonra, bakterilerin 32 ° C'de 1.5 saat boyunca 1 mL LB içinde iyileşmesine izin verin. Temizlemek ve her şeyi toplamak için küvete 1 mL LB ekleyin.
    11. LB Agar + Ampisilin (100μg/mL), X-Gal (20 μg/mL) ve IPTG (0,5 mM) üzerine farklı miktarlarda bakteri (10, 50, 200 μL) yayın ve 32 °C'de gece boyunca (AÇIK) büyümelerine izin verin.
    12. AMP/X-Gal (adım 1.3.11'deki ile aynı konsantrasyonda) ve sükroz5 içeren plakalar hazırlayın.
  4. 3. Gün
    NOT: Bu noktada, kolonilerin büyümesi ve mavi görünmeleri beklenir, ancak sadece bakterilerin 42 ° C'de indüklendiği ve seçim kasetini içeren ek parça ile elektroporasyonun kaplandığı plakalarda. Bu kurulduktan sonra, bazı kolonilerde seçim kasetinin bütünlüğünü doğrulamak gerekir.
    1. İki veya daha fazla koloninin toplanmasını önlemek için kolonilerin <50 olduğu ON'dan plakaları tanımlayın. Birkaç koloni seçin (tipik olarak 8-10, en az bir uygun koloniyi tanımlamak için yeterlidir) ve bunları yaklaşık 50 μL H2O içinde seyreltin. Tek, mavi kolonileri 50 μL H2O içinde aşılayın ve hem negatif (LB Agar / Sükroz / Kloramfenikol) hem de pozitif (LB Agar / Ampisilin / Kloramfenikol / X-Gal / IPTG) seçici plakalar (adım 1.1.2 ve 1.3.11'deki ile aynı konsantrasyon) (Şekil 2).
      NOT: Plaka üzerinde 50 μL'nin yayıldığı 20-100 koloni bulunması beklenmektedir. Bununla birlikte, koloni sayısı daha düşükse, bu mutlaka rekombinasyonun tehlikeye girdiği anlamına gelmez.
    2. Adım 1.4.1'deki suyu 5 mL LB içinde aşılayın ve plakaları ve LB kültürünü gece boyunca 32 °C'de inkübe edin (Şekil 2).
  5. 4. Gün
    1. Yalnızca Amp/X-Gal plakalarında büyüyen ve Sükroz plakalarında büyümeyen mavi kolonileri seçin (Şekil 3). Bu pozitif klonlar için (Tablo 2), gece kültürünün 500 μL'lik bir alikotunu 50 mL taze LB'ye aktarın.
  6. 5. Gün
    1. Her pozitif klon için bir gliserol bıçağı hazırlayın ve BAC plazmidini (midiprep) ekstrakte edin ve izole edin.
    2. BAC ekstraksiyonunu takiben, rekombinasyonun doğru şekilde gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol etmek için kalite kontrol yapın. Yerleştirme bölgesinin Sanger dizilimini gerçekleştirin. Her şey doğru görünüyorsa, ikinci bölüme geçin.

2. Seçim kasetini istediğiniz değişiklikle değiştirin

  1. Gün 0
    1. Pozitif klonu LB agar üzerine çizin. Gece boyunca 32 °C'de inkübe edin.
  2. 1. Gün
    1. Eklemeyi/modifikasyonu güçlendirmek için bir PCR gerçekleştirin. Seçim kasetini tavlamak ve yükseltmek için 3' ucunda diziyi ve 5' ucunda adım 1.3.1'de kullanılan aynı 30-80 bp homoloji kollarını içeren ileri ve geri primerleri kullanın (Tablo 1).
    2. Agaroz jel elektroforezi ile PCR fragmanının kimliğini ve saflığını ve 260/230 ve 260/280 değerlerinin saf nükleik asit ile uyumlu olmasını sağlayın.
    3. Tek bir koloniyi 5 mL LB'ye aşılayın ve gece boyunca 32 °C'de inkübe edin.
  3. 2. Gün
    1. 2 mL gece kültürünü 100 mL LB'ye aktarın ve OD600 0.55-0.7'ye (~2.5-3 saat içinde) ulaşana kadar 32 °C'de büyütün. İndüksiyon için 42 °C'ye kadar bir su banyosu hazırlayın ve yıkamalar için 4 °C ~250 mL steril ddH2O'ya soğutun.
    2. İstenilen OD'ye ulaşıldığında, 50 mL kültürü konik bir tüpe aktarın ve λ-faj rekombinasyon proteinlerini indüklemek için 42 °C su banyosunda 15 dakika inkübe edin. İndüklenmemiş kontrol olarak 32 °C'de 50 mL'lik bir tüp daha tutun.
    3. Isı indüksiyonundan sonra tüpleri 10 dakika buz üzerine koyun.
    4. 4 °C'de 3.200 × g'da 8 dakika santrifüjleyin (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş).
      NOT: Bu noktadan itibaren, SW102 hücre yeterliliğini korumak için buz üzerinde çalışın.
    5. Süpernatanı çıkarın ve peleti hafifçe döndürerek 40 mL önceden soğutulmuş su ile yeniden süspanse edin.
    6. 0-4 °C'de 3.200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    7. Yıkama adımını (adım 2.3.5) bir kez tekrarlayın.
    8. Süpernatanı çıkarın ve peleti 100 μL su içinde yavaşça yeniden süspanse edin.
    9. Yeniden süspanse edilmiş peletlerin bir kısmını (50 μL HSV-1 ve 25 μL Adeno) önceden soğutulmuş 1.5 mL tüplere (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş) aktarın. 50-400 ng saflaştırılmış PCR ürünü ekleyin (5 μL'yi aşmayın). Tüpleri döndürün ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
    10. Karışımı bir önceki adımdan önceden soğutulmuş bir küvete aktarın ve 2,50 kV'da (hem 42 °C indüklenmiş hem de indüklenmemiş) elektropolat yapın.
    11. Hücrelerin 5 mL LB ortamında 32 °C'de 4-5 saat çalkalayarak iyileşmesine izin verin.
      NOT: Geri kazanım süresi, kaset değişiminden sonra artık SacB proteininin bozulmasına izin vermek için ilk yeniden birleştirme adımından daha uzundur.
    12. Sükroz, X-Gal ve IPTG içeren LB agar Petri kaplarına farklı miktarlarda (50, 200, 500 μL) kültür koyun (adım 1.1.2 ve 1.3.11'deki ile aynı konsantrasyon). Gece boyunca 32 °C'de inkübe edin.
  4. 3. Gün
    1. İstenen modifikasyonu taşıyan fragman ve seçim kaseti ile başarılı bir şekilde rekombinasyona uğramış pozitif klonları belirleme olasılığını artırmak için önemli sayıda koloniyi (20-100) tarayın. Koloni PCR kullanarak birinci seviye bir tarama gerçekleştirin. Izgaralı bir Petri kabı kullanın; belirli bir kadrandan kolonileri seçin ve etiketleyin (Şekil 4).
      NOT: Özellikle etkili bir yaklaşım, bir primerin hedef bölgenin dışında (viral genom üzerinde) ve diğerinin rekombine fragman içinde tavlandığı bir çift primerin kullanılmasını içerir (Şekil 5).
    2. PCR amplionunun varlığını ve boyutunu agaroz jel (%1,5) ile kontrol edin.
    3. Doğru kadrandan pozitif klonları seçin ve 100 mL LB ile aşılayın. Gece boyunca 32 °C'de inkübe edin.
  5. 4. Gün:
    1. Plazmidi bakteri kültürlerinden çıkarmak için bir midiprep yapın.
    2. Plazmidi kısıtlama enzimleriyle sindirin ve sindirim modelini analiz etmek için bir agaroz jeli çalıştırın.
    3. Sindirim paterni doğruysa, viral genomun değiştirilmiş bölgesini dizilemeye devam edin.
    4. Rekombinant klonların moleküler kimliğini sağladıktan sonra, viral partiküllerin transfeksiyonu ve kurtarılması ile devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IL12 kodlayan onkolitik Herpes virüsünün üretilmesi
Bu çalışmanın giriş bölümünde ana hatlarıyla belirtildiği gibi, rekombinenin potansiyel bir uygulaması, immünoterapötik potansiyellerini arttırmak amacıyla immünostimülatif transgenlerin onkolitik virüslerin genomuna eklenmesidir. Aşağıda, HSV-1'e dayalı bir onkolitik vektör kullanan böyle bir uygulamanın bir örneğini sunuyoruz. Spesifik olarak, bu çalışma, HSV-1 genomunun Us1-Us2 bölgesi içindeki intergenik bir lokusa bir transgen eklemesinin etkisi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu "RECOMBINEERING" (homolog RECOMBInation aracılı genetik mühendislik) protokolü iki aşamalı bir strateji kullanır: birincisi, bir seçim kasetinin ilgilenilen genomik lokusa entegrasyonu ve ikincisi, bu kasetin istenen modifikasyonla değiştirilmesi (Şekil 1).

Kullanılan seçim belirteçleri arasında ampisilin direnci (AmpR), beta-galaktosidaz (β-gal) ve sacB bulunur. AmpR, antibiyotik direncine dayalı seçimi mümkün kılar, β-gal mav...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak ilgili mali veya mali olmayan çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma şu kişiler tarafından desteklenmiştir: PRIN 2022-MUR İtalya, Hibe 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Ulusal Gen Terapisi ve RNA Teknolojisine Dayalı İlaçlar Merkezi. PNRR PE13 Ortaya Çıkan Bulaşıcı Hastalıklarda Karşılanmamış İhtiyaçları Ele Alan Tek Sağlık Temel ve Translasyonel Araştırma Eylemleri. Yazarlar, özel DNA'lar sağladığı için Geneart sentez hizmetine teşekkür eder. Yazarlar ayrıca bu çalışmanın başarıyla tamamlanmasına katkıda bulunan Michele Veneruso'ya da içten şükranlarını sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AmpisilinherhangiherhangiMoleküler Sınıf
Oligo'nun Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		herhangiherhangiHPLC saflaştırılmış
Oligo için amplofy AmpR/LacZ/SacB  kaset: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTATTTTTC		herhangiherhangiHPLC saflaştırılmış
IPTGherhangiherhangiMoleküler Sınıf
LB agar
LB orta
Phusion Hot Start II Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz Termo BilimselF549S
Il12'yi yükseltmek için Rev oligo: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		herhangiherhangiHPLC saflaştırılmış
Rev oligo'dan amplofy AmpR/LacZ/SacB 'ye; kaset: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		herhangiherhangiHPLC saflaştırılmış
SacB/AmpR/LacZ seçim kasetiBu el yazması--
SakarozherhangiherhangiMoleküler Sınıf
BAC-HSV-1 veya BAC-Adv ile SW102Bu el yazması--
TriptonherhangiherhangiMoleküler Sınıf
Sihirbaz SV JeliPromegaA9281 Serisi
X-galherhangiherhangiMoleküler Sınıf
Maya özüherhangiherhangiMoleküler Sınıf

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers (Basel). 12 (11), 3407(2020).
  2. Froechlich, G., et al. The common H232 STING allele shows impaired activities in DNA sensing, susceptibility to viral infection, and in monocyte cell function, while the HAQ variant possesses wild-type properties. Sci Rep. 13 (1), 19541(2023).
  3. Sasso, E., et al. New viral vectors for infectious diseases and cancer. Semin Immunol. 50 (1), 101430(2020).
  4. Ma, C. C., Wang, Z. L., Xu, T., He, Z. Y., Wei, Y. Q. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019. Biotechnol Adv. 40 (3-4), 107502(2020).
  5. Sasso, E., et al. Replicative conditioning of herpes simplex type 1 virus by survivin promoter, combined to ERBB2 retargeting, improves tumour cell-restricted oncolysis. Sci Rep. 10 (1), 4307(2020).
  6. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. Int J Mol Sci. 22 (2), 477(2021).
  7. De Lucia, M., et al. Retargeted and multi-cytokine-armed herpes virus is a potent cancer endovaccine for local and systemic anti-tumor treatment. Mol Ther Oncolytics. 19 (1), 253-264 (2020).
  8. Sasso, E., et al. One-step recovery of scFv clones from high-throughput sequencing-based screening of phage display libraries challenged to cells expressing native claudin-1. Biomed Res Int. 2015 (1), 703213(2015).
  9. Rusciano, G., Sasso, E., Capaccio, A., Zambrano, N., Sasso, A. Revealing membrane alteration in cells overexpressing CA IX and EGFR by surface-enhanced Raman scattering. Sci Rep. 9 (1), 1832(2019).
  10. Lin, D., Shen, Y., Liang, T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 156(2023).
  11. Troise, F., et al. Prime and pull of T cell responses against cancer-exogenous antigens is effective against CPI-resistant tumors. Mol Ther Oncolytics. 32 (1), 200760(2024).
  12. Shalhout, S. Z., Miller, D. M., Emerick, K. S., Kaufman, H. L. Therapy with oncolytic viruses: progress and challenges. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 160-177 (2023).
  13. Sasso, E., et al. Massive parallel screening of phage libraries for the generation of repertoires of human immunomodulatory monoclonal antibodies. MAbs. 10 (7), 1060-1072 (2018).
  14. Vetrei, C., et al. Novel combinations of human immunomodulatory mAbs lacking cardiotoxic effects for therapy of TNBC. Cancers (Basel). 14 (1), 121(2021).
  15. Zambrano, N., et al. High-throughput monoclonal antibody discovery from phage libraries: challenging the current preclinical pipeline to keep the pace with the increasing mAb demand. Cancers (Basel). 14 (5), 1325(2022).
  16. Froechlich, G., Sasso, E. We ARE boosting translation: AU-rich elements for enhanced therapeutic mRNA translation. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102531(2025).
  17. Gentile, C., et al. Generation of a retargeted oncolytic herpes virus encoding adenosine deaminase for tumor adenosine clearance. Int J Mol Sci. 22 (24), 13521(2021).
  18. Finizio, A., et al. Integrating system biology and intratumor gene therapy by trans-complementing the appropriate co-stimulatory molecule as payload in oncolytic herpes virus. Cancer Gene Ther. 31 (9), 1335-1343 (2024).
  19. Tripodi, L., et al. Systems biology approaches for the improvement of oncolytic virus-based immunotherapies. Cancers (Basel). 15 (4), 1297(2023).
  20. Wang, H., et al. Cytokine-armed oncolytic herpes simplex viruses: a game-changer in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 12 (5), e008025(2024).
  21. D'Alise, A. M., et al. Adenovirus encoded adjuvant (AdEnA) anti-CTLA-4, a novel strategy to improve adenovirus based vaccines against infectious diseases and cancer. Front Immunol. 14 (1), 1156714(2023).
  22. Wold, W. S., Toth, K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 421-433 (2013).
  23. Goins, W. F., Huang, S., Cohen, J. B., Glorioso, J. C. Engineering HSV-1 vectors for gene therapy. Methods Mol Biol. 1144 (1), 63-79 (2014).
  24. De Chiara, A., et al. Peptide nucleic acid-mediated circularization of target RNA as tool to inhibit translation. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142230(2025).
  25. Wang, L., Chen, Y., Liu, X., Li, Z., Dai, X. The application of CRISPR/Cas9 technology for cancer immunotherapy: current status and problems. Front Oncol. 11 (1), 704999(2022).
  26. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4 (2), 206-223 (2009).
  27. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33 (4), e36(2005).
  28. Zhang, W., et al. High-throughput cloning and characterization of emerging adenovirus types 70, 73, 74, and 75. Int J Mol Sci. 21 (17), 6370(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Viral Genom M hendisli iBakteriyel Yapay KromozomlarRekombinant DNA Vir sleriOnkolitik Vir slerHerpes Simpleks Vir sAdenoviral Vekt rlerGen TransferiY ksek Kapasiteli Vekt r Geli tirme

İlgili makaleler