MALDI Yaklaşımı ile Bakteriyel Proteomik Profilleme Kullanılarak Süt Ürünlerinin Mikrobiyal Güvenliğinin Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, kültür ürünlerini MALDI-TOF MS ile birleştirerek süt ürünlerindeki mikrobiyal bileşimin hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Geleneksel kültür yöntemlerinden daha kısa bir geri dönüş süresi ile 16S rRNA dizilimi ile karşılaştırılabilir taksonomi sonuçları sunar.

Özet

Farklı süt ürünlerinde (tereyağı, mozzarella peyniri, süt, krema) mikroorganizmaların varlığının proteomik bir yaklaşım, modern kültüromikler ve gıda güvenliği kalite kontrol laboratuvarlarına hızlı bir şekilde dahil edilebilecek çeşitli numune hazırlama prosedürleri kullanılarak izlenmesi için matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS, bundan böyle "MS" olarak anılacaktır) tanımlama yöntemini kullanan bir protokol sunuyoruz. Mikrobiyal güvenliği izlemek için güvenilir ve sağlam bir araç. Mikrobiyal izolasyon adımını, yetiştirilen kolonilerin seçilmesini, numune hazırlama prosedürlerini (bozulmamış hücreler, yerinde ve tüp içi ekstraksiyon), MS analiz parametrelerinin ayarlanmasını, MS spektrumlarının (protein parmak izleri) oluşturulmasını ve toplanmasını ve son olarak MS platformunu kullanarak taksonomi elde edilmesini, ardından veri yorumlama ve görselleştirmeyi içerir. Çok sayıda çalışmayla doğrulanan bu yöntem, ticari biyokimyasal test sistemlerine kıyasla sütteki mikroorganizmaların daha güvenilir ve uygun maliyetli bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Basit protokolleri ve önemli ölçüde azaltılmış analiz süresi sayesinde laboratuvarların farklı gereksinimlerini karşılayan, gıda mikrobiyolojisinde umut verici bir gelişme olarak öne çıkıyor. Sunulan protokol, üretim süreçlerine çok uygun bir geri dönüş süresinde (TAT) güvenilir mikrobiyal tanımlama sağlayarak gıda endüstrisinin ihtiyaçlarını karşılamaktadır.

Giriş

Bu protokolün genel amacı, bakteriyel proteomik profilleme için MS kullanarak tereyağı, peynir, süt ve krema dahil olmak üzere çeşitli süt ürünlerinin mikrobiyal güvenliğini izlemek için kapsamlı bir metodoloji sağlamaktır. Modern kültüromileri optimize edilmiş numune hazırlama prosedürleriyle birleştiren bu yaklaşımın, gıda güvenliği ve kalite kontrol laboratuvarları için hızlı, güvenilir ve sağlam bir araç olması amaçlanmıştır. Bu metodolojinin oluşturulması ve uygulanmasının ardındaki mantık, standart mikrobiyal tanımlama yöntemlerinin sınırlamalarından kaynaklanmaktadır. Uzun yıllar boyunca, veterinerlik ve gıda teşhis laboratuvarları, diferansiyel kültür ortamında bakteri üremesini ve metabolizmasını inceleyen geleneksel biyokimyasal testlere ve ardından çeşitli enzimatik tahlillere güvenmiştir¹. Sıklıkla Bergey'in Determinatif Bakteriyoloji El Kitabı'ndakiler gibi standart kılavuzlara dayanan bu yöntemler nispeten ucuz ve hem nicel hem de nitel veriler üretebilse de, zahmetli ve zaman alıcıdır, kapsamlı ortam hazırlama, numune seyreltme, kaplama, inkübasyon, koloni sayımı, izolasyon ve ayrıntılı karakterizasyon adımları ^2,3 gerektirir.

Analitik Profil İndeksi (API), BBL Crystal, Vitek ve Biolog MicroPlates gibi ticari yarı otomatik ve otomatik sistemlerin piyasaya sürülmesi, biyokimyasal analizler kullanılarak mikrobiyal tanımlamayı kolaylaştırdı, böylece maliyetleri ve geri dönüş sürelerini azalttı. Bununla birlikte, bu sistemlerin zayıf tekrarlanabilirlik, ilgili veri tabanlarında giriş eksikliği ve suşlar arasındaki fenotipik varyasyonları belirlemedeki zorluklar, özellikle fermentatif olmayan bakteriler veya küçük biyokimyasal farklılıklara sahip bir tür içindeki suşlar için bazı dezavantajları vardır ve bu da yanlış in vitro sonuçlara yol açabilir⁴. Bu göz önüne alındığında, MS, şu anda klinik mikrobiyolojide yaygın olan ve veteriner teşhis ve süt kalitesi laboratuvarlarında dikkat çeken güçlü bir alternatif olarak gelişmiştir. Bu yaklaşım, çeşitli mikroorganizmaların tespit edilmesindeki hızı, doğruluğu ve maliyet etkinliği ile tamamlanmıştır¹. Çok sayıda çalışma, MS'in sütten mikroorganizmaların daha güvenilir bir şekilde tanımlanmasını sağladığını ve ticari biyokimyasal test sistemlerinden daha hızlı ve daha ucuz sonuçlar verdiğini göstermiştir ^5,6,7. Biyokimyasal testler cins düzeyinde veya grup düzeyinde tanımlama için yeterli olabilirken, tür düzeyinde teşhis genellikle MS veya 16S rRNA dizilimi⁸ gibi daha gelişmiş yöntemler gerektirir. Gerçekten de MS, gıda mikrobiyal izolatlarının esnek ve güvenilir bir şekilde tanımlanması için umut verici bir platform olarak kabul edilir, basit protokolleri ve önemli ölçüde azaltılmış analiz süresi ile gıda mikrobiyolojisi laboratuvarlarının çeşitli gereksinimlerini karşılar ve böylece gıda güvenliğini artırır ^4,5. Düşük reaktif tüketimi nedeniyle işletme maliyetleri minimumdur ve numune işleme, daha fazla otomasyon ve yüksek verim sağlar⁸. Bununla birlikte, bu yöntemin faydasının, doğası gereği, seçilen mikrobiyal büyüme koşullarına (kültür ortamı türü dahil) ve kullanışlılığını sınırlayan temel faktörler olarak kabul edilen bir referans veri tabanı tür kapsamına bağlı olduğu belirtilmelidir.

MS, gıda kaynaklı patojenik, laktik asit bakterileri (LAB) ve diğer fermentatif bakterileri tanımlayarak ve ayırt ederek gıda mikrobiyolojisinde önemli bir rol oynar⁹. Faydası, kültür ortamında yetiştirilen tüm mikrobiyal kolonilerin tanımlanmasını sağlayan ve koloni oluşturan birim (CFU) bilgilerinin edinilmesini kolaylaştıran modern kültüromilere kadar uzanır⁷. Bu yaklaşım, insan bağırsaklarında sunulan, diyabetik ayak enfeksiyonlarında yer alan veya idrar yolu ile bağlantılı olanlar gibi karmaşık mikrobiyal toplulukları keşfetmek için zaten başarıyla uygulanmıştır ve mikrobiyolojik uygulamalarda kültüre bağlı yöntemleri canlandırmaktadır^10,11.

Bu protokol, süt ürünlerinde mikrobiyal güvenliğin rutin değerlendirmesi için MS'i etkili bir şekilde uygulama konusunda laboratuvarlara rehberlik etmek ve endüstrinin üretim süreçlerine uygun pratik bir geri dönüş süresi (TAT) içinde güvenilir mikrobiyal tanımlama ihtiyacını karşılamak için sunulmuştur. Protokol, (1) uygun kültür ortamı seçimi (de Man, Rogosa ve Sharpe agar - MRS agar, M-17 agar, Çok Amaçlı Tween 80 agar - APT agar, Çin Mavi Laktoz agar - CBL agar, Süt Plakası Sayımı Agar - MPCA, Triptik Soya Agar - TSA) ve özel inkübasyon koşulları; (2) farklı bakteri türlerine ve laboratuvar iş akışlarına uyum sağlamak için doğrudan koloni transferi, hedefe yönelik formik asit ekstraksiyonu ve tüp içi etanol/formik asit protein ekstraksiyonu gibi seçenekler sunan, MS analizi için standartlaştırılmış numune hazırlama prosedürleri; ve (3) cihaz kalibrasyonu, optimal spektrum toplama parametrelerinin tanımlanması ve güvenli taksonomik atama için puan değeri değerlendirmesi ve tutarlılık kontrolleri dahil olmak üzere veri yorumlama yönergeleri dahil olmak üzere sistematik MS analizi. Yapılandırılmış ve doğrulanmış bir yaklaşım sağlayan bu protokol, süt endüstrisinde mikrobiyal izlemenin doğruluğunu ve verimliliğini artırmayı ve sonuçta gıda kalitesinin ve halk sağlığının iyileştirilmesine katkıda bulunmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Süt ürünleriyle ilgili bakterilerin izolasyonu

1. Sıvı veya katı süt ürünlerinden bakteri kültürlerinin elde edilmesi
   1. Kültür ortamı seçimi
      1. Süt numunelerinden bakteri izolasyonu için, genel büyüme ortamı, Gram-negatif bakteriler için ortam, laktik asit bakterileri (LAB), spor oluşturan bakteriler ve ayrıca yavaş büyüyen veya titiz mikroorganizmalar dahil olmak üzere beklenen mikrobiyal gruplara göre kültür ortamını seçin.
         NOT: Hem baskın hem de nadir türlerin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için, birden fazla ortam paralel olarak aşılanmalıdır. Süt örneklerinden mikrobiyom analizi için bir dizi örnek ortam Tablo 1'de sunulmaktadır.
   2. Aşılama ve kaplama
      1. Süt ürününün temsili bir örneğini alın ve iyice karıştırın.
      2. 1 mL (sıvı numuneler: süt, krema, ayran) veya 1 g (katı numuneler: peynir, tereyağı) numuneyi 9 mL steril sıvı ortam (pepton suyu / %0,85 NaCl çözeltisi) içeren 15 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne aseptik olarak aktarın. Katı numuneler için, numuneyi eklemeden önce sıvı ortamı 40-42 dereceye ısıtın.
      3. Numuneyi 30-60 saniye kuvvetlice vorteksleyerek homojenize edin. Yağlı veya sert numuneler için, homojen bir süspansiyon elde edilene kadar homojenizasyona devam edin.
      4. 1 mL süspansiyon alarak ve 9 mL steril çözelti içeren ardışık tüplere aktararak bir dizi on kat seyreltme hazırlayın. Her seyreltmeyi iyice karıştırın.
         NOT: Numune tipine ve beklenen mikrobiyal kontaminasyon seviyesine bağlı olarak, ^{10-1 ila 10-6} arasında değişen seyreltmeler hazırlayın. Çoğu numune için ^10-3'e kadar seyreltmeler yeterli olacaktır; Bununla birlikte, taze süt veya mavi peyniri analiz ederken, daha fazla seyreltme hazırlamak gerekecektir. Doğru izolasyon ve koloni seçimi kolaylığı sağlamak için, optimal aşılama seyreltmesi plaka başına 30-300 koloni vermelidir. Bu aralık, bireysel kolonilerin net bir şekilde farklılaşmasına izin verir ve örtüşen büyüme riskini en aza indirerek daha sonraki analizler için kontamine olmamış ve homojen bakteri kültürlerinin elde edilmesini kolaylaştırır. Bazı işlenmiş süt ürünleri (örneğin ayran) için, doğrudan kaplama için seyreltilmemiş taze bir numune (örneğin 0,1 mL) kullanılabilir.
      5. 0.1 mL numune veya seyreltilmesini alın ve uygun agar ortamını içeren önceden hazırlanmış Petri kaplarının yüzeyine aktarın.
      6. Steril bir yayıcı kullanarak aşıyı agar yüzeyine eşit olarak yayın. Aşının 15 dakika boyunca ortama emilmesine izin verin, ardından plakaları ters çevirin.
   3. Kuluçka
      1. Aerobik İnkübasyon: İncelenen tüm numuneler için APT, M-17, CBL, MPCA ve TSA agar plakalarını aşılayın, aerobik koşullar altında 37 °C ve 30 °C'de 24 saat inkübe edin. İnkübasyon sıcaklıkları, süt ürünlerinin hem hijyenik kalitesini (genel mezofiller için 30 °C) hem de halk sağlığı güvenliğini (insan kaynaklı patojenler ve indikatör organizmalar için 37 °C) değerlendirmek için çok önemli olan farklı mikrobiyal grupların optimal büyüme gereksinimlerine göre belirlendi.
         NOT: Spor oluşturan bakterilerin yoğun büyümesi bekleniyorsa, TSA durumunda daha kısa (~ 12 saat) bir inkübasyon süresi tercih edilir.
      2. Anaerobik İnkübasyon: İncelenen tüm numuneler için MRS Agar plakalarını aşılayın, anaerobik koşullar altında 37 °C ve 30 °C'de 24-72 saat inkübe edin ve mikrobiyal büyümeyi her gün kontrol edin. İnkübasyon sıcaklıkları adım 3.1'de belirtildiği gibi belirlendi.
         NOT: Anaerobik inkübasyon koşulları, oksijeni ortadan kaldıran ve anaerobik bakterilerin büyümesi için uygun bir atmosfer sağlayan anaerobik atmosfer üreten poşetlere sahip hava geçirmez kaplara plakaların yerleştirilmesiyle sağlanabilir.
   4. Saf kültürler elde etmek
      1. İnkübasyondan sonra, plakaları inceleyin ve morfolojik özelliklerine (örn. boyut, şekil, renk, doku) göre yetiştirilen tek kolonileri seçin.
      2. Seçilen kolonileri, 1 μL mikrobiyal döngü ve aynı inkübasyon koşulları kullanarak aynı agar ortamına alt kültürleme (çizgileme) yaparak saflaştırın.

Kültür ortamı	Uygulama	Kültür durumu
Triptik Soya Agarı (TSA)	Çok çeşitli bakterilerin yetiştirilmesi için genel ortam	30–37 °C, 24–48 saat, aerobik
Kanlı agar (BLA; %5 koyun kanı ile)	zenginleştirilmiş, hemolizin farklılaşması, Streptococcus, Listeria, Bacillus için faydalıdır	30–37 °C, 24–48 saat, aerobik
MRS agar (de Man, Rogosa ve Sharpe agar)	Lactobacillus ve diğer LAB için seçici L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus veya L. acidophilus'un büyümesini desteklemek için %1 Tween-80 ekleyin.	30 °C, 48–72 saat, anaerobik veya mikroaerofilik
M17 agar	Lactococcus, Streptococcus thermophilus için seçici	30 °C, 48–72 saat, anaerobik veya mikroaerofilik
APT agar (Çok Amaçlı Tween 80 agar)	LAB ve bazı Bifidobakteriler için seçici	30 °C, 48–72 saat, anaerobik veya mikroaerofilik
Scheadler agar	seçici ve zenginleştirici, Bifidobacterium, Clostridium dahil olmak üzere anaerobların izolasyonu	30–37 °C, 48–72 saat, anaerobik
CBL agar (Çin Mavi Laktoz agar)	koliform bakteriler ve diğer laktoz fermente eden bakteriler için diferansiyel ortam	37 °C, 24–48 saat, aerobik
Süt Tabağı Sayımı Agar (MPCA)	evrensel, toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı için	30–37 °C, 24–48 saat, aerobik

Tablo 1: Belirtilen kültür koşullarına sahip süt numunelerinin mikrobiyom analizi için önerilen ortamların listesi.

2. MS analizi için bakteri numunelerinin hazırlanması

1. Başlamadan önce MALDI matris çözeltisini hazırlayın
   NOT: En yaygın kullanılan matris bileşiği HCCA, α-Siyano-4-hidroksisinnamik asittir. Bu bileşik ışığa duyarlıdır, bu nedenle matrisi karanlık kaplarda veya ışıktan uzakta hazırlayın ve saklayın.
   1. Solvent karışımını aşağıdaki oranları kullanarak hazırlayın: %50 asetonitril (HPLC sınıfı), %47,5 su (HPLC sınıfı) ve %2,5 trifloroasetik asit (TFA).
   2. Matrisi çözücü karışımında yaklaşık 10 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar (veya doygunluğa kadar - çözünmemiş kristaller görünür kalana kadar) çözün.
   3. Çözelti berrak değilse (kristaller kalırsa), berrak bir sıvı elde etmek için çözeltiyi santrifüjleyin veya filtreleyin (örneğin, 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi aracılığıyla).
      NOT: Az sayıda buz çözme döngüsü koşuluyla buzdolabında kısa süreliğine saklamaya izin verilir.
2. MS kullanarak bakterileri tanımlamak için 3 numune hazırlama prosedüründen birini kullanın:
   1. Doğrudan Koloni Transferi - Çoğu Gram-negatif bakteri gibi iyi büyüyen, parçalanmaya dirençli olmayan bakterilerle uğraşırken bu en basit ve en hızlı yöntemi kullanın.
      1. Steril bir halka veya kürdan kullanarak, yetiştirilen koloninin az bir miktarını (~1 μL) MALDI plakasındaki bir noktaya aktarın.
      2. İnce, eşit bir tabaka oluşturmak için bakteri materyalini doğrudan MALDI hedef plakası üzerinde belirlenmiş bir noktaya sürün.
      3. Kuruduktan sonra, lekeyi 1 μL HCCA matris çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   2. Hedefte Formik Asit Ekstraksiyonu - Hücre duvarları ek işlem yapılmadan proteinlerin salınmasını zorlaştıran, tanımlanması zor bakteriler (örn. Gram-pozitif, maya) için kullanın.
      1. Tek kullanımlık bir mikrobiyal halka veya steril kürdan kullanarak tek bir bakteri kolonisinden az miktarda bakteri biyokütlesi alın.
      2. İnce, eşit bir tabaka oluşturmak için bakteri materyalini doğrudan MALDI hedef plakası üzerinde belirlenmiş bir noktaya sürün.
      3. Bulaşan bakteri materyalini 1 μL% 70 formik asit çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında havayla kurutun.
      4. Kuruduktan sonra, lekeyi 1 μL HCCA matris çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   3. Tüp İçi Protein Ekstraksiyonu (Etanol/Formik Asit Yöntemi) - Bazı Gram pozitif bakteriler, mayalar ve mikobakteriler dahil olmak üzere tanımlanması zor mikroorganizmalar için bu yöntemi kullanın.
      1. Steril bir halka veya sürüntü kullanarak, 1-3 tam koloniyi bir agar kültür plakasından 300 μL steril su içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      2. Nihai etanol konsantrasyonunu yaklaşık %75'e ayarlamak için 900 μL mutlak etanol ekleyin. Birkaç saniye karıştırın veya girdap yapın.
      3. Numuneyi 15.000 x g'da (oda sıcaklığı) 2 dakika santrifüjleyin.
      4. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice atın.
         NOT: Mukus suşları durumunda, 4 °C'de ek santrifüjleme önerilir.
      5. Pelet tüpünü, kalan tüm etanol buharlaşana kadar (5-10 dakika, oda sıcaklığı) açık bırakın.
      6. Kurutulmuş hücre peletine 20-50 μL %70 formik asit (FA) ekleyin. Pelet tamamen yeniden süspanse edilene kadar pipetleyerek veya vorteksleyerek karıştırın.
         NOT: Hacim, biyolojik materyal miktarı ile orantılı olmalıdır.
      7. Formik asit süspansiyonuna eşit hacimde asetonitril (ACN) ekleyin. Dikkatlice karıştırın.
      8. 15.000 x g'da 2 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin.
      9. Süpernatanın 1 μL'sini MALDI hedef plakası üzerinde belirlenmiş bir noktaya aktarın.
      10. Lekenin oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin.
      11. Kurutulmuş numune noktasını 1 μL α-Siyano-4-hidroksisinamik asit (HCCA) matris çözeltisi ile kaplayın.
      12. MS analizinden önce matrisin oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin (Şekil 1).
          NOT: %70 Formik Asit: Aşındırıcı; yanıklara neden olur. Çeker ocakta tutun. Asetonitril: Yanıcı ve zehirlidir. Alevlerden uzak tutun ve solumaktan/temastan kaçının. Trifloroasetik Asit (TFA): Güçlü, aşındırıcı ve uçucu; cilt/göz temasından ve solumaktan kaçının. Daima laboratuvar önlüğü, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve koruyucu gözlük takın. Solunmasını önlemek için tüm reaktifleri çeker ocakta tutun. Cilt ve göz temasından kaçının; açık alevlerden uzakta çalışın. Asidik ve organik solvent atıklarını, uygun şekilde bertaraf edilmek üzere açıkça etiketlenmiş, uyumlu kaplarda toplayın.

Şekil 1: MS tekniği ile bakteri izolatlarının tanımlanması için uygun bir numune hazırlama prosedürünün seçilmesi sürecini görselleştiren bir karar ağacı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. MS tekniği kullanılarak spektrum edinimi ve mikrobiyal tanımlama

1. Kalibrasyon
   NOT: MS'de doğru kütle tayini için, bilinmeyen numuneleri analiz etmeden önce, cihazı uygun standartları kullanarak kalibre edin. Güvenilir tanımlama için uygun cihaz kalibrasyonu çok önemlidir.
   1. MALDI hedef plakası üzerinde 1 μL aşağıdakileri içeren kalibratör noktaları hazırlayın: (a) 3,6-17 kDa kütle aralığını kapsayan bir Escherichia coli DH5 alfa özü içeren Bakteriyel Test Standardı (BTS) (MBT Biotyper için); (b) 3,6-17 kDa kütle aralığını kapsayan E. coli ATCC 25922 protein özütü, ribonükleaz ve miyoglobin içeren Mikrobiyoloji Kalibratörü (EXS2600 sistem için). Kurumuş kalibratör noktalarının kurumasını bekleyin ve numune hazırlamaya benzer şekilde 1 μL HCCA matris çözeltisi ile kaplayın.
   2. Hazırlanan numuneleri ve kalibrant noktalarını içeren MALDI hedef plakasını cihaza yükleyin. Kalibrasyon modunu (otomatik) kullanarak kalibrant noktaları için analiz çalıştırın.
   3. Kütle doğruluğunun belirtilen kütle aralığında (2-20 kDa) kabul edilebilir sınırlar içinde (100 ppm) olduğundan emin olmak için kalibrasyonu doğrulayın.
2. Spectra alımı
   NOT: Cihaz kalibre edildiğinde, hazırlanan her numune noktasından kütle spektrumları elde edilir.
   1. Genel edinme parametreleri
      1. Kütle spektrometresini doğrusal pozitif iyon modunda çalıştırın.
      2. Kütle algılama aralığını 2.000-20.000 m/z (2-20 kDa) arasında ayarlayın.
   2. Aşağıdaki cihaza özgü ayarları kullanın
      1. İyon kaynağı voltajları: 20 kV'da iyon kaynağı 1 (IS1), 18 kV'da iyon kaynağı 2 (IS2), 9 kV'da lens voltajı. Hızlanma gerilimi 25 kV'a kadar çıkabilir.
      2. Dedektör voltajı: Yaklaşık 2,65 kV'a ayarlayın.
      3. Darbeli iyon ekstraksiyon ayarları: 100 ns, gecikmeli ekstraksiyon süresi 230 ns'de sabitlenmiştir.
      4. Lazer güç ayarları: tipik olarak gerekli minimum gücün %40-%65'i arasında değişen en iyi spektrum kalitesini (sinyal sayısı ve sinyal yoğunlukları göz önüne alındığında) elde etmek için manuel olarak ayarlayın.
      5. Spektrum başına atış sayısı: iyi sinyal-gürültü oranına (S/N) sahip bir toplam spektrum oluşturmak için her noktanın farklı bölgelerinden yeterli sayıda lazer atışı elde edin→ (a) her noktanın 4 farklı bölgesinden 50 atışlık adımlarla alınan ortalama 200 atış veya (b) 500 atış adımında elde etme - AutoXecute modunu kullanarak hedef noktanın on farklı konumundan 50 atış.
   3. Örnek ölçüm stratejisi
      1. İzolat başına birden fazla nokta ölçün (izolat başına en az 2 nokta).
      2. Bulguların tutarlılığını ve doğruluğunu sağlamak için her nokta için çoğaltılmış spektrumlar elde edin → numune başına belirli sayıda toplam spektrum hedefleyin (numune başına 4 spektrum en az → teknik kopya).
         NOT: Biyolojik kopyalar elde etmek için biyolojik numuneleri (en az 3) tabi tutun.

4. Mikroorganizma tanımlama ve veri analizi

NOT: Organizma tanımlaması, elde edilen protein profilinin (mikroorganizmanın spesifik protein "parmak izi") bir referans veri tabanı ile karşılaştırılmasıyla gerçekleşir ve hem sinyal konumu hem de yoğunluğun elde edilen korelasyonu, incelenen organizmanın karşılık gelen referans mikroorganizma ile eşleştirildiği güven seviyesini tanımlayan bir eşleştirme değeri oluşturmak için kullanılır. İşlenmiş spektrumları referans veritabanlarıyla karşılaştırarak mikroorganizmaları tanımlayın.

1. Spektrum işleme
   1. Spektrum işleme için uygun yazılımı kullanın: (a) MALDI Biotyper sistemleri için flexAnalysis veya (b) EXS2600 sistemleri için EX-Accuspec.
   2. Yumuşatma algoritması olarak bir Savitzky-Golay yöntemi uygulayın (genişlik 2 m/z, 10 döngü).
   3. TopHat algoritmasını kullanarak arka plan gürültüsünü gidermek için taban çizgisi düzeltmesi yapın (S/N eşiği = 2, TopHat filtre genişliği 0,2 Da ).
   4. Tepe algılama algoritması olarak bir ağırlık merkezi modu kullanın (S/N eşiği = 2 ).
2. Veritabanı karşılaştırması ve puan yorumlama
   1. Bilinmeyen izolatların işlenmiş kütle spektrumlarını MALDI mikrobiyal tanımlama platformuna yükleyin. Daha sonra tanımlamayı çalıştırın.
      NOT: Bu çalışmalarda aşağıdaki yazılımlar kullanılmıştır: Biotyper sürüm 4.1.100, Ex-Accuspec sürüm V1. MALDI Biotyper yazılımı söz konusu olduğunda, en iyi eşleşme güvenilirliğini sağlamak için ham spektrumlardan ana spektrumların (MSP'ler) oluşturulması önerilir.
   2. Tanımlama sonuçlarını üretici standart eşiklerine göre değerlendirin.
      NOT: MALDI Biotyper ve EXS2600 için puan değerleri şunlardır:
      2.300-3.000: yüksek olasılıkla türlerin tanımlanması;
      2.000-2.299: güvenli cins tanımlaması, olası tür tanımlaması;
      1.700-1.999: olası cins tanımlaması;
      0.000-1.699: güvenilir tanımlama değil.
      MALDI Biotyper platformundan elde edilen tanımlama sonucunun değerlendirilmesi sırasında, Tutarlılık Kategorileri kullanılarak bulguları destekler: A- Türler Tutarlı → en iyi eşleşme ve benzer şekilde yüksek puan değerine (>1.999) sahip diğer tüm eşleşmeler aynı türe işaret eder; B - Cins Tutarlı → en iyi eşleşme ve benzer puan değerlerine (1.700 - 1.999) sahip diğer eşleşmeler aynı cinsi işaret eder, ancak tür düzeyinde farklılık gösterebilir; C- Tutarlılık yok → tür veya cins düzeyinde tutarlılık için gereklilikler karşılanmamıştır.

Sonuçlar

Kültüromik yaklaşım
Kültüromik yaklaşım, diğerlerinin yanı sıra nadir, yetiştirilmesi zor veya daha önce tanımlanmamış türlerin¹² izole edilme şansını artırmak için mikroorganizma yetiştirme koşullarını maksimum düzeyde çeşitlendirmeyi amaçlayan bir stratejidir. Bu, çeşitli örneklerde, örneğin gıda örneklerinde bulunan mikrofloranın biyolojik çeşitliliğinin çok daha geniş bir resmini elde etmeyi mümkün kılar. Uygulanan kültüromik yaklaşımın etk...

Tartışma

Süt ürünlerinin mikrobiyal tanımlanmasına yönelik protokol, hız, güvenilirlik ve maliyet etkinliği konusunda optimum fikir birliğini sağlayarak geleneksel yöntemlere göre önemli bir ilerleme sunuyor. Bununla birlikte, protokol içindeki bazı önemli adımlar dikkatli bir dikkat gerektirmektedir. İlk olarak, izolasyon ve kültürleme aşaması temeldir. Kültür ortamı ve inkübasyon koşulları, beklenen mikrobiyal çeşitlilik ve yük ile eşleşmelidir. Saf kültürlerin elde edilmesi çok önemlidir, gene...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%70 formik asit	Chempur	115676307
Asetonitril	Merck KGaA	1.00014.1011
APT agar	Merck KGaA	1.10453.0500
Bakteriyel Test Standardı	Bruker Daltonik GmbH	8255343
CBL Agar (Çin Mavi Laktoz Agar)	Merck KGaA	1.02348.0500
Columbia Blood agar	Oksoid	CM0331B
M17 agar
Süt Tabağı Sayı Agar (MPCA)	Oksoid	cm0681
MRS agar (de Man, Rogosa ve Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 hedefi cilalı çelik BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Peptone suyu	Sigma-Aldrich	70179
Scheadler agar	Sigma-Aldrich	91019
Koyun kanı	Biomaxima	SL0160-100
Trifluroasetik asit	Sigma-Aldrich	T6508
Triptik Soya Agar (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Su	Merck KGaA	1.15333.2500
α-Siyano-4-hidroksisinamik asit	Bruker Daltonik GmbH	8201344