Yöntem makalesi

Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

DOI:

10.3791/68995

⸱

16 Eylül 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, uçucu tuz çözeltisi yıkama, hızlı sıvı nitrojen söndürme, dondurarak kurutma ve -8 °C'de depolamayı birleştirerek tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) için hücre metabolitlerini korumayı amaçlamaktadır. Metabolit profillerini korumak için sıvı nitrojen söndürmenin gerekli olduğunu, metabolik değişiklikleri önlemek için uzun süreli soğuk depolamanın en aza indirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS), hücresel metabolizmayı incelemek için vazgeçilmez bir araç haline geldi. Modern kütle spektrometresi (MS) tekniklerindeki ilerlemeler ve temel biyolojik bilimler ve insan hastalıklarında hücre heterojenliği çalışmalarına olan talep nedeniyle, laboratuvar araştırmalarında çeşitli farklı SCMS teknikleri geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Metabolitler hücre durumunu doğru bir şekilde yansıtabildiğinden, canlı hücrelerin SCMS metabolomik analizi, hücreler hakkında moleküler bilgi sağlamak için güçlü bir araç olarak kabul edilir. Bununla birlikte, canlı hücrelerin SCMS analizindeki en büyük zorluk, numune hazırlama, taşıma ve ölçüm sırasında endojen metabolit profillerinin korunmasıdır. Hücresel metabolitler hızlı bir değişime uğrar ve çevresel değişikliklere karşı oldukça hassastır, bu da onları analizden önce bozulmaya veya dönüşüme karşı duyarlı hale getirir. Bu sınırlamayı ele almak için, SCMS için hücresel metabolit bütünlüğünü korumak üzere tasarlanmış sağlam ve tekrarlanabilir bir hücre hazırlama protokolü sunuyoruz. Protokol, hücre yıkamayı uçucu bir amonyum format (AF) çözeltisi ile entegre eder, sıvı nitrojen (LN2) ile hızlı söndürme, vakumlu dondurarak kurutma ve -80 °C'de depolama. Bu yaklaşım, metabolik aktiviteyi etkili bir şekilde durdururken hücre zarı hasarını en aza indirir. Sonuçlar, hızlı hücre söndürmenin hayati önem taşıdığını göstermektedir; bununla birlikte, hücre metabolitlerini korumak için -80 °C'de saklama süresinin sınırlandırılması gereklidir. Önerilen protokol, geniş uygulamalar için diğer mevcut SCMS teknikleri için potansiyel olarak kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreden hücreye heterojenlik, özellikle hastalığın ilerlemesi, ilaç direnci ve hücresel farklılaşma bağlamlarında biyolojik sistemlerin temel bir ilkesi olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Çok hücreli organizmalarda, aynı mikro ortamdaki genetik olarak özdeş hücreler bile, transkriptomik3, proteomik4 ve en önemlisi metabolomik seviyeler5'teki farklılıklardan kaynaklanan farklı fenotipler sergileyebilir. Tek hücreli genomik ve transkriptomik son on yılda önemli bir ilgi görmüş olsa da, tek hücreli metabolomikler, metabolitlerin doğal karmaşıklığı ve hızlı dinamikleri nedeniyle nispeten az gelişmiş kalmaktadır6. Metabolitler çevresel ipuçlarına karşı oldukça hassastır, çeşitli kimyasal yapılara ve polaritelere7 sahiptir ve küçük hücre hacimlerinde8 düşük konsantrasyonlarda bulunur. Bu özellikler, tek tek hücrelerden güvenilir ölçümlerini analitik bir zorluk haline getirir. Metabolomik, bir hücrenin gerçek zamanlı fonksiyonel durumunun en yakın anlık görüntüsünü sunduğundan, metabolomu tek hücre çözünürlüğünde sağlam bir şekilde incelemek için yöntemlerin geliştirilmesi, hücresel fizyoloji ve patolojinin daha derin bir şekilde anlaşılması için gereklidir7.

Geleneksel toplu metabolomik teknikler, büyük hücre popülasyonlarındaki sinyallerin ortalamasını alır, hücresel heterojenliği maskeler ve nadir fakat önemli metabolik imzaları potansiyel olarak gizler. Buna karşılık, tek hücreli metabolomikler, bireysel hücre düzeyinde benzersiz biyokimyasal profiller ortaya çıkarır ve bu da onu kök hücre farklılaşması, ilaç yanıtları ve hastalık mekanizmaları gibi süreçleri incelemek için paha biçilmez kılar 6,9,10,11,12,13. Matris destekli lazer desorpsiyon-iyonizasyon (MALDI) MS ve ikincil iyon (SI) MS gibi kütle spektrometrisi (MS) tabanlı yöntemler, alanı ilerletmiştir, ancak canlı hücre analizini sınırlayan karmaşık hazırlık, vakum gereksinimleri ve yıkıcı iyonizasyon gibi zorluklarla karşı karşıyadır 9,14. Özellikle, enstrümantasyondaki son gelişmeler, lazer kaynaklı postiyonizasyon (t-MALDI-215) ve Orbitrap ikincil iyon kütle spektrometrisi (OrbiSIMS)16,17 ile birleştirilmiş iletim modu MALDI dahil olmak üzere en son tekniklerle sonuçlandı ve tek hücreli ve hücre altı düzeyde etiketsiz, yüksek çözünürlüklü 3D metabolik görüntülemeyi mümkün kıldı ve olağanüstü kütle doğruluğu ve uzamsal çözünürlük sundu.

Ortam iyonizasyonu MS bu sorunları ele alır. Temsili ortam SCMS teknikleri, canlı tek hücreli video kütle spektrometrisi (Video-MS)18, DESI19 ve nano-DESI20'yi içerir. Bunlar arasında, tek problu SCMS, çift kılcal sistem 21,22,23,24 kullanarak canlı hücreleri gerçek zamanlı olarak doğrudan örnekleme ve iyonize etme yeteneği ile öne çıkan tekniklerden biridir. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü, yerinde metabolik profilleme sağlarken numune bozulmasını en aza indirir ve ilaç alımı ve hücre metabolizması üzerindeki etkisi 22,25,26,27,28,29,30, çevresel tepkiler 31,32 ve metabolik heterojenlik33 çalışmalarına başarıyla uygulanmıştır. 34,35,36 tek tek hücreler arasında.

Birçok ortam SCMS yöntemi canlı hücre analizini mümkün kılarken, bireysel hücre seçimi 23,37,38 için gereken manuel kullanım nedeniyle tipik olarak düşük verimden muzdariptirler. Hücre metabolizması oldukça dinamik olduğundan, uzun süreli numune hazırlama metabolit profillerini değiştirebilir. Bunu ele almak için araştırmacılar, hücreleri39,40 izole ettikten hemen sonra söndürme teknikleri uygularlar. Söndürme, hücrelerin biyokimyasal durumunu belirli bir anda koruyarak, hızlı soğutma 41,42,43,44 veya enzim denatürasyonu 43,45,46,47 yoluyla metabolik aktiviteyi durdurur. Bu adım, doğru ve zamansal olarak alakalı metabolomik verilerin sağlanması için hayati öneme sahiptir. Etkili bir söndürme protokolü, hücre içi metabolik aktiviteyi hızlı ve kapsamlı bir şekilde durdurmalıdır. Soğuk izotonik salin48, soğutulmuş asetonitril46, soğuk metanol 44,47,48,49, buz gibi soğuk fosfat tampon çözeltisi (PBS) 43,50, LN2 43,44,51 ve hatta sıcak hava tedavileri 52 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler değerlendirilmiştir. Bunların çoğu başlangıçta toplu hücre metabolomikleri için geliştirilmiş olsa da, soğuk metanol ve asetonitril gibi bazıları Pico-ESI-MS39 ve MALDI-MS46 gibi tek hücreli tekniklere uyarlanmıştır. Etkinliklerine rağmen, her yöntemin dezavantajları vardır: organik çözücüler metabolit sızıntısına ve hücre zarlarındahasara 48,53 neden olabilir ve uçucu olmayan tuz çözeltileri, iyon baskılanmasına54, hassasiyeti azaltarak ve veri doğruluğundanödün vererek 47,55 MS'e müdahale edebilir.

LN2 ani dondurma, biyolojik araştırmalarda56 yaygın olarak kullanılır, çünkü uçucu olmayan tuzları geride bırakmadan hücresel metabolizmayı hızla durdurur ve bu da onu SCMS için iyi bir seçim haline getirir. Bununla birlikte, SCMS57,58 için sorunlu olan hücre zarlarına zarar verebilir. Bu hasarı azaltmak için, bazı çalışmalarda hızlı filtrasyon, soğuk NaCl yıkama ve hızlı devirli metabolitlerin53,59 tutulmasına yardımcı olan LN2 dondurmayı içeren bir yöntem kullanılmıştır. Yine de bu yöntem, tek tek hücrelerin izole edilmesindeki zorluklar ve tuz kalıntılarından kaynaklanan potansiyel matris etkileri nedeniyle SCMS için ideal değildir. -80 °C'de depolama başka bir yaygın koruma yöntemidir, ancak tek hücreli metabolit profilleri üzerindeki etkileri belirsizliğini korumaktadır. Birden fazla temel adımı birleştirerek bu sınırlamaları ele almak için daha önce çalışmalar bildirmiştik: hücreler önce uçucu, MS uyumlu bir AF çözeltisi ile yıkanır, daha sonra LN2 ile söndürülür, vakumla dondurularak kurutulur ve düşük sıcaklıkta (-80 ° C) saklanır60. Mevcut yaklaşım, hücre hasarını ve metabolit bozulmasını en aza indirerek daha doğru SCMS ölçümlerine olanak tanır. Bu çalışma, sağlam SCMS teknikleri için bu hücre hazırlama yönteminin benimsenmesini teşvik etmeyi amaçlayan deneysel ayrıntılara odaklanmıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her adımı sertifikalı bir Sınıf II biyogüvenlik laboratuvarında ve steril koşullarda gerçekleştirin. Bu çalışmada model sistem olarak HCT-116 hücre hattı kullanılmış ve hücreler tam kültür ortamında kültürlenmiştir. Vekiller ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü

  1. Tam ortam hazırlayın. McCoy'un 5A ortamını %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile destekleyin. 37 °C'ye ısıtın.
  2. Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde %5CO2 ile inkübe edin. Birleşmeyi günlük olarak izleyin ve kültürler ~%80 birleşmeye ulaştığında geçişi izleyin.
  3. Hücreleri geçin (~2 günde bir).
    1. Ortamı aspire edin ve 5 ml 1x PBS ile bir kez durulayın.
    2. Kültür kabına 2 mL %0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için 37 °C'de 3 dakika inkübe edin.
    3. 8 mL önceden ısıtılmış tam ortam ekleyerek ve hücreleri dağıtmak için hafifçe pipetleyerek tripsini nötralize edin.
    4. 1 mL süspansiyonu 9 mL taze tam ortama aktarın.
    5. Hücreleri sayın.
      NOT: Hücreler, üreticinin talimatlarına göre bir TC20 Otomatik Hücre Sayacı kullanılarak sayılmıştır. Tripan mavisi veya diğer boyama maddeleri kullanılmadı.
  4. Lamellerdeki tohum hücreleri.
    1. Hücreleri ~1 × 106 hücre/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
    2. Bireysel 18 mm'lik cam lamellerin 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirilmesi gerekir.
      NOT: Cam lamellerin hücre kültürü için kullanılmadan önce otoklavlanması gerekir.
    3. 2 mL tam ortam ve 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin (~2 × 105 hücre/kuyu).
    4. Hücre bağlanmasına izin vermek için hücreleri gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Hücrelerin normal büyüme durumunda olduğundan emin olmak için, hücrelerin morfolojisini ve büyüme durumlarını (mikroskop kullanarak) rutin olarak kontrol edin ve potansiyel mikoplazma kontaminasyonunu inceleyin (bir mikoplazma tespit kiti kullanarak).

2. Amonyum format (AF) çözeltisi ile hücre yıkama

NOT: Her seferinde yeni AF solüsyonu hazırlayın.

  1. AF yıkama tamponunu hazırlayın. 0,45 g amonyum format tartın ve 50 mL LC/MS dereceli suda çözün. Amonyum formatın nihai konsantrasyonu 0,14 M'dir (%0,9 a/a).
    NOT: Çözeltiyi kullanana kadar buz gibi soğuk (0-4 °C) tutun.
  2. 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 2 mL soğuk AF solüsyonu ekleyin.
  3. Lamelleri durulayın. Yapışık hücreler içeren her bir lamel kuyusundan nazikçe kaldırmak için bir çift steril forseps kullanarak ve ardından kısaca (2-3 s) 2 mL soğuk %0.9 amonyum format (AF) çözeltisi ile önceden doldurulmuş ayrı bir kuyuya yerleştirin. Durulama işlemini tekrarlayın.
    NOT: Yıkama adımı sırasında hücrelerin bozulmasını önlemek için hücre durulamasını çok nazikçe gerçekleştirin.

3. Sıvı nitrojen (LN2) ile hücre söndürme

  1. AF ile durulanan her lamel (hücreler yukarı bakacak şekilde) alüminyum folyo kabın içindeki Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Kriyojenik dereceli eldivenler, koruyucu gözlükler ve laboratuvar önlüğü giyin. Tüm LN2 işlemlerini iyi havalandırılmış bir alanda gerçekleştirin. Alüminyum folyo, LN2 söndürme için bir kabı katlamak için kullanılabilir.
  2. Lamellerin üzerine yavaşça 10-20 mL sıvı nitrojen dökün ve tam kaplama sağlayın.
  3. Kalan sıvı nitrojeni boşaltmak için Petri kabını hemen cımbızla eğin.
    NOT: Artık yıkama neminden büyük buz kristali oluşumunu önlemek için bu işlemi birkaç saniye içinde tamamlayın.

4. Vakumda hücre dondurarak kurutma

  1. Çözülmeyi önlemek için LN2 söndürmeden hemen sonra dondurarak kurutun.
    NOT: 100 mm'lik bir Petri kabını barındıran düz bir platform oluşturmak için SpeedVac'ın rotorunu çıkarın.
  2. Kriyojenik eldivenler ve yalıtımlı cımbız kullanarak, LN2 soğutulmuş lamellerin bulunduğu Petri kabını vakum yoğunlaştırıcı haznesine yerleştirin.
  3. Standart vakum ayarlarını kullanarak işlem yapın ve görünür LN2 buharlaşana ve lameller kuru görünene kadar 5-7 dakika devam edin. Kurutulmuş lameller LN2 kalıntısı ve buz kristalleri içermemelidir.

5. -80 °C'lik bir dondurucuda hücre saklama

  1. Kabı bir kağıt havluyla sarın ve 48 saat boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
  2. Sakladıktan sonra, Petri kabını içeren lamel parçalarını hemen ~10 dakika boyunca oda sıcaklığındaki bir desikatöre aktarın. Lamelleri kurutucudan çıkarmadan önce yoğunlaşmış don veya lamellerdeki suyun tamamen kaybolduğundan emin olun.
    NOT: Lamellerin hızlı bir şekilde desikatöre aktarılması yoğuşmayı en aza indirir; Küçük yüzey ıslanması bile kurumuş metabolitleri çözebilir.
  3. AF yıkamadan sonra numuneleri iki gruba ayırın (Grup 1 ve Grup 2). Aşağıdaki işleme protokollerini uygulayın.
    Grup 1: LN2 söndürme → dondurarak kurutma → SCMS analizi (depolama yok).
    Grup 2: LN2 söndürme → dondurarak kurutma → -80 °C'de 48 saat depolama → SCMS analizi.
  4. Aşağıda açıklandığı gibi SCMS analizine devam edin.
    NOT: Farklı koşullar kullanılarak daha fazla hücre grubu hazırlanabilir. Grup 1 ve Grup 2, genel protokolleri göstermek için kullanılır.

6. Tek problu imalat ve SCMS kurulumu

NOT: Tek prob, yerleşik prosedürlere 21,24,60,61 uygun olarak üretilmiştir ve burada yalnızca kısa protokoller sağlanmıştır.

  1. Bir lazer çektirme kullanarak çift delikli kuvars iğnesini çekin ve ~10 μm'lik bir uç oluşturun. Kaynaşmış silika kılcal damarı ve nano-ESI yayıcıyı çift delikli kuvars iğneye yerleştirerek bir Tek prob monte edin. Tüm bileşenleri hızlı sertleşen epoksi ile bir cam kızağa sabitleyin.
  2. Tekli probu XYZ aşamasına monte edin. Tek probu dijital mikroskobun altına yerleştirilmiş motorlu bir XYZ manipülatörüne takın.
  3. SCMS analizi için kurulumu bir kütle spektrometresine bağlayın.
  4. Bir şırınga pompası tarafından verilen 150 nL/dak akış hızında ekstraksiyon çözücüsü olarak %0,1 formik asit içeren asetonitril (%≥99,9) kullanın.
  5. MS parametrelerini ayarlayın.
    Pozitif iyon modu: m/z 200-1500, +2,9 kV, kütle çözünürlüğü 120 k (m/z 200'de).
    Negatif iyon modu: m/z 70-900, -2,1 kV, kütle çözünürlüğü 120 k (m/z 200'de).
    NOT: Negatif iyonlar genellikle pozitif iyonlardan daha düşük m/z aralığında tespit edildiğinden, bu iki iyon modu için farklı m/z aralıkları kullanılabilir. Ek MS ayarları arasında 100 ms maksimum enjeksiyon süresi, bir mikro tarama, standart otomatik kazanç kontrolü (AGC), tam tarama modu (MS analizi için), 10-35 Normalleştirilmiş Çarpışma Enerjisi (NCE) ile daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) (MS/MS analizi için) ve iyon transfer tüpü sıcaklığı için 320 °C bulunur. Sinyal stabilitesini ve tek hücre tespitini izlemek için her tarama/zaman noktasında bir toplam iyon kromatogramı (TIC) oluşturuldu.

7. Tek problu SCMS deneyleri

  1. İki lamel (Grup 1 ve Grup 2) Tek problu SCMS kurulumunun 21,24,61 motorlu XYZ aşamasına birlikte yerleştirin.
  2. Parti etkilerini en aza indirmek için, hücreleri mikroskop altında rastgele seçin.
  3. Pozitif ve negatif iyon modu kütle spektrumlarını elde edin. Aynı Tek prob, solvent akış hızı ve iyonizasyon voltajı ile grup başına birden fazla (örneğin, ~30) hücreyi analiz edin.
    NOT: Veri karşılaştırılabilirliğini sağlamak için her deney için aynı Tek prob, solvent akış hızı ve iyonizasyon voltajlarını kullanın. Orbitrap'i satın almadan önce günlük olarak kalibre edin. Hem MS hem de MS/MS analizleri tek hücre düzeyinde gerçekleştirilebilir. Hedeflenmemiş analizlerde metabolit profilleri ve geçici etiketler çalışmaları için doğru m/z değerleri elde etmek için MS verilerini toplayın. Hedeflenen analizde moleküler tanımlama için seçilen iyonların MS/MS analizini gerçekleştirin. Veriler, uyumlu bir veri toplama ve yorumlama yazılımı kullanılarak elde edildi.

8. Veri analizi

  1. Özel bir R betiği kullanarak ham SCMS verilerini önceden işleyin. Ön işleme adımları, arka plan ve gürültü giderme ve iyon yoğunluğunun TIC 11,12,23'e normalleştirilmesini içerir.
  2. Python paket ms_deisotope kullanarak SCMS verilerini ayrıştırın.
  3. Şirket içi Python betiği60 kullanarak tepe hizalaması gerçekleştirin. Gruplama için 0,01 m/z bölme genişliği kullanın. Tepe hizalaması için 0,01 m/z veya 5 ppm'lik bir kütle toleransı kullanın.
  4. MetaboAnalyst 6.062 kullanarak istatistiksel veri analizi gerçekleştirin. Bir t-testi yapın ve bir ısı haritası oluşturun (nispi metabolit seviyeleri için). Seçme T-testi/ANOVA'da ilk 100'ü kullan karşılaştırmadan anlamlı bir farkla (p < 0,05) düşükten yükseğe doğru p değerlerine göre sıralanmış ilk 100 metaboliti oluşturmak için. Bu en iyi 100 metaboliti kullanarak bir ısı haritası çizin.
  5. İnsan Metabolom Veritabanına (HMDB63) karşı doğru m/z değerlerini ve MS/MS spektrumlarını arayın. MS veritabanı aramasında 10 ppm'lik bir kütle toleransı kullanın.
    NOT: LipidMaps64 gibi diğer veritabanları, veritabanı araması için kullanılabilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, hücre yıkama, hızlı hücre söndürme, vakumla kurutma ve -80 °C'de depolamayı entegre eden bir metodolojiyi açıklamaktadır (Şekil 1). Spesifik olarak, bu yaklaşım, SCMS analizinden önce hücrelerin metabolomik durumunu korumak için tasarlanmıştır. Bu protokolün etkinliği, hücrelerin iki farklı koşul altında hazırlanmasıyla test edildi: taze söndürülmüş ve kurutulmuş hücreler (Grup 1, kontrol görevi görür) ve söndürülmüş, kurutulmuş ve -80 °C'de depolanmış hücreler (Grup 2). Her grup, hem pozitif hem de negatif iyon modlarında Tek problu SCMS yöntemi kullanılarak analiz edildi. Gruplar arasında metabolomik profillerdeki farklılıkları değerlendirmek için Temel Bileşen Analizi (PCA) ve ısı haritası görselleştirmesi kullanıldı.

Pozitif iyon modundaki PCA sonuçları (Şekil 2A), Grup 1 ve Grup 2'nin benzer genel metabolit profillerine sahip olduğunu ortaya koymuştur. Grup 1 ve Grup 2'nin neredeyse aynı profilleri, hücreler kurutulmadan önce uygun şekilde söndürülürse, 48 saat boyunca -80 °C'de depolamanın metabolomu önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. Negatif iyon modunda (Şekil 2B), karşılaştırılabilir bir model gözlenir, ancak Grup 2 biraz daha belirgin görünmektedir - potansiyel olarak spesifik metabolit sınıfları arasındaki iyonizasyon farklılıkları nedeniyle, örneğin, fosfatidilkolinler pozitif modda daha iyi tespit edilirken, yağ asitleri negatif modda daha verimli bir şekilde iyonlaşır60. Bu varyasyona rağmen, her iki modda da Grup 1 ve 2 arasındaki tutarlı kümeleme, entegre söndürme-kurutma-depolama protokolünün metabolik bütünlüğü koruduğu sonucunu desteklemektedir.

Isı haritası analizi, iki gruptaki ilk 100 metabolitin nispi bolluğunu göstererek PCA bulgularını daha da doğruladı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, ilk 100 metabolit, her iki iyon modunda da Grup 1 ve Grup 2 arasında oldukça tutarlı bolluk modelleri sergiler. Birkaç metabolit kümesindeki küçük varyasyonlar iyonizasyon verimliliği veya metabolit stabilitesindeki farklılıkları yansıtabilse de, büyük kaymalar veya gruba özgü kümelenme gözlenmez. Bu sonuçlar toplu olarak, söndürme-kurutma-depolama iş akışının hücresel metabolomik profilleri yüksek doğrulukla koruduğunu ve bu da onu ortam SCMS uygulamaları için çok uygun hale getirdiğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: LN2 söndürmenin ve -80 °C'de 48 saatlik depolamanın tek hücrelerdeki metabolit profillerini nasıl etkilediğini araştıran tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) analizi için genel iş akışı. (A) Hücreler, amonyum formatlı (AF) çözelti kullanılarak tohumlandı, inkübe edildi ve durulandı. (B) İki hücre grubu hazırlandı - Grup 1: hücreler yıkandı, söndürüldü ve depolanmadan anında SCMS deneyleri için dondurularak kurutuldu; Grup 2: hücreler yıkandı, söndürüldü, dondurularak kurutuldu ve -80 ° C'de saklandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: (A) pozitif iyon modunda ve (B) negatif iyon modunda deney gruplarındaki HCT-116 hücrelerinden SCMS verilerinin Temel Bileşen Analizi (PCA). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Çeşitli koşullar altında hazırlanan tek HCT-116 hücrelerinde tespit edilen ilk 100 metabolitin nispi seviyelerini gösteren, (A) pozitif iyon modu ve (B) negatif iyon modu için sunulan ısı haritaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoldeki kritik bir adım, enzimatik aktiviteyi önemli ölçüde azaltan ve devam eden metabolik süreçleri durduran AF ile yıkamanın ardından LN2 kullanılarak canlı hücrelerin derhal söndürülmesidir. Ek olarak, söndürmeden önce hücrelerin AF ile yıkanması, iyon yoğunluğunu arttırdı ve matris etkilerini azalttı, bu da SCMS duyarlılığını artırmak için bir hazırlık adımı olarak dahil edilmesini destekler. Mevcut çalışmalarda, farklı gruplardaki hücreler (yani, Grup 1 ve Grup 2), biyolojik varyanslarını en aza indirmek için aynı başlangıç partisi kullanılarak kültürlendi. 48 saatlik depolama süresi seçilmiştir, çünkü ek büyüme süresine sahip hücreler (Grup 1), depolanmış hücrelerle karşılaştırmalı SCMS analizi için uygun hücre yoğunluklarını (örneğin, hücre agregatlarını önlemek için) koruyabilir (Grup 2). Bununla birlikte, taze kurutulmuş ve depolanmış numuneler arasındaki karşılaştırmalarda hala önemli metabolik değişiklikler gözlemlendiğinden, 48 saat bile olsa soğuk depolamaya güvenirken dikkatli olunması gerekir (Grup 1'e karşı. Grup 2). Gerçek çalışmalarda, hücre ve doku örnekleri genellikle -80 °C'lik bir dondurucuda daha uzun süreler (örneğin haftalar ve aylar) saklansa da, metabolitlerdeki değişiklikleri en aza indirmek için saklama süresinin kısaltılması önerilmektedir.

Bu nedenle sorun giderme, kurutma ve SCMS analizi arasındaki süreyi en aza indirmeye odaklanmalı ve buz çözme koşullarının yoğuşmayı veya kısmi rehidrasyonu önlemesini sağlamalıdır. Numune geçişleri sırasında kalan su içeriği ve su yoğunlaşması, hücreleri kısmen yeniden hidrate edebilir ve metabolitleri65 bozan hidroliz, oksidasyon ve proteoliz gibi enzimatik ve kimyasal reaksiyonları mümkün kılarak metabolit bileşiminde yapay değişikliklere yol açabilir. İyice kurutulmuş numuneler bu süreçleri etkili bir şekilde durdurur ve moleküler bütünlüğü korur66. Nemsiz bir kuruma ortamının sağlanması ve SCMS'ye hızlı geçiş, bu tuzaklardan kaçınmanın anahtarıdır.

Bu yöntemin metabolit profillerini korumadaki başarısına rağmen, sınırlamalar devam etmektedir. Yöntem, vakumlu kurutma sistemine ve -80 °C'lik bir dondurucuya erişim gerektirir ve uzun süreli depolama için tam olarak etkili değildir. Ayrıca, oda sıcaklığında hızlı kurutma, metabolitleri geçici olarak korurken, LN2 söndürmenin yerini tutmaz. Suyun eksik uzaklaştırılması ve numunenin işlenmesi sırasında rehidrasyon riski nedeniyle depolamayla ilgili değişiklikler meydana gelebilir. Bu sınırlamalar, daha uzun depolama veya daha yüksek verim isteniyorsa yöntemin iyileştirilmesi ihtiyacını vurgulamaktadır.

Bu çalışmada bildirilen protokoller, ortam SCMS'si için tek hücreli metabolomun korunmasına yönelik basitleştirilmiş ve etkili bir yaklaşım sunmaktadır. Ayrıntılı kriyoprotektanlar veya yerinde dondurma gerektiren yöntemlerin aksine, iş akışımız mevcut ortam iyonizasyon teknikleriyle kolayca uyumludur ve esnek numune alma ve analiz zaman çizelgelerine izin verir. Hücre yıkama, söndürme, kurutma ve kısa süreli depolamanın metabolomik doğrulukta önemli bir kayıp olmadan entegrasyonu, kütle spektrometrelerine isteğe bağlı erişimi olmayan laboratuvarlar için pratik bir çözüm sunar. Bu yaklaşım, tek hücreli sistem biyolojisi, kanser metabolizması, ilaç yanıtı heterojenliği ve nadir hücre popülasyonlarının metabolik fenotiplenmesi konularındaki araştırmaları ilerletmek için güçlü bir potansiyele sahiptir. Bu protokollerin, özellikle ortam iyonizasyonuna dayalı SCMS platformları için geniş uygulanabilirliği, onları tek hücreli analitik teknikler alanına önemli bir katkı haline getirmektedir. Gelecekteki çalışmalarda, bu protokoller daha geniş bir hücre tipi çeşitliliğine uyum sağlayacak şekilde uyarlanabilir ve geliştirilebilir. Ek numune hazırlama adımlarıyla (örneğin, matris uygulaması), işlenen hücreler potansiyel olarak diğer SCMS teknikleri (örneğin, MALDI ve SIMS) ile analiz edilebilir ve daha fazla sayıda hücrenin (örneğin, yüksek oranda birleşen hücreler) analizi için daha yüksek uzamsal çözünürlük ve verim sunar. Sonuçlar ayrıca, bu söndürme-kurutma-depolama protokollerinin, hücreleri nakliyeye (örneğin, kuru buz kaplarında) hazırlamak için potansiyel olarak kullanılabileceğini ve farklı konumlarda işbirlikçi SCMS çalışmalarına izin verdiğini göstermektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (2305182), Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R01AI177469) ve Chan Zuckerberg Girişimi tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender'da (https://BioRender.com/yqn5isk) oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
-80 &derece; C dondurucuEppendorf Yeni BrunswickU700 SerisiNumune hazırlama
AsetontrileThermoFisher Bilimsel240744SCMS deney kurulumu
Amonyum formatı ThermoFisher Bilimsel401152500Numune hazırlama
Lamel 18 mmVMR mikro kapak camı48380046Hücre kültürü
Dijital stereomikroskopShenzhen D& F ŞirketiSüper gözler T004Analiz
Çift delikli kuvars boru, 1.120"x0.005"x12"Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2ÇTek problu üretim
Epoksi reçineDevconParça No. 20945Tek problu üretim
Formik asitWard'ın Bilimi 470301-120 500 mLSCMS deney kurulumu
Füzyon silika kapiler, ID: 40 µ m, OD: 100 &mikro; mPolimikro TeknolojilerTSP040105Tek problu üretim
Erimiş silika kapiler, ID: 50 µ m, OD: 150 &mikro; mPolimikro Teknolojiler1068150015SCMS deney kurulumu
Cam lameller, 18 mmVWR 48380046Hücre kültürü
HyClone Sentetik serum (FBS)Hidrolik klonSH3006603Hücre kültürü
Kuvöz HeraCell (Heraeus)Hücre kültürü
Lazer çektirmeSutter Enstrüman A.Ş.P-2000 ModeliTek problu üretim
LED UV lambasıFoshan Liang Ya Diş EkipmanlarıLY-C240 SerisiTek problu üretim
McCoy'un 5A'sı Gibco 2537128Hücre kültürü
Mikro birlikIDEX Sağlık & Bilim LLCM-539 SerisiSCMS deney kurulumu
Değiştirilmiş FAIMS pro arayüzü Termo Balıkçı 98100-20046Analiz
MycoAlert PLUS Mikoplazma Tespit KitiLonzaLT07-703 SerisiHücre kültürü
Optik kart Thorlabs A.Ş., NewtonAnaliz
Optima LC/MS sınıfı su (Fisher Chemical, ABD)ThermoFisher BilimselW6500 SerisiNumune hazırlama
Orbitrap Exploris 240 kütle spektrometresi ThermoFisher BilimselSCMS deney kurulumu
Penisilin/StreptomisinGibco15140-122Hücre kültürü
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)VWR0780-50LHücre kültürü
SpeedVac Konsantratörü (Savant)ThermoFisher Bilimsel SPD111 VNumune hazırlama
Şırınga Pompası (SKE10)Chemyx Inc.80561SCMS deney kurulumu
Şırınga, 250 &mikro; LHamilton1725LTN250ULSCMS deney kurulumu
TC20 Otomatik Hücre SayacıBio-Rad Laboratuvarları 1450102EDUHücre sayısı
Doku Kültürü Kabı, 100mmFisher bilimsel FB012924Hücre kültürü
Tripsin-EDTAThermoFisher Bilimsel25200-072Hücre kültürü
USB dijital mikroskop ("Scorpio" 500 Zoom)Chinavasion, Toptan Satış Ltd.Analiz
UV kürleme reçinesiPrime DişÜrün No. 006.030Tek problu üretim
Xcalibur yazılımıThermoFisher Bilimsel
XYZ aşaması (CONEX-MFACC)Newport ŞirketiAnaliz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).
  3. Kanter, I., Kalisky, T. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).
  4. Newman, J. R., et al. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  5. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  6. Yang, Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  7. Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).
  8. By B Alberts, D. B., Lewis, J., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).
  9. Zhang, L., Vertes, A. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  10. Duncan, K. D., Fyrestam, J., Lanekoff, I. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).
  11. Lan, Y., Zou, Z., Yang, Z. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).
  12. Renmeng Liu, Z. Y. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).
  13. Chen, Z. Y., et al. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).
  14. Ibanez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  15. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  16. Passarelli, M. K., et al. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).
  17. Suvannapruk, W., et al. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).
  18. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).
  19. Zhang, H., Shi, X., Lu, H., Li, L. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).
  20. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  21. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).
  23. Bhusal, D., Wije Munige, S., Peng, Z., Yang, Z. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).
  24. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).
  25. Pan, N., et al. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).
  26. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  27. Lan, Y., Chen, X., Yang, Z. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).
  28. Chen, X., Sun, M., Yang, Z. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).
  29. Sun, M., Chen, X., Yang, Z. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).
  30. Bensen, R. C., et al. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).
  31. Liu, R., Zhang, G., Sun, M., Pan, X., Yang, Z. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).
  32. Nguyen, T. D., et al. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).
  33. Liu, R., et al. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).
  34. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  35. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  36. Chen, X., Peng, Z., Yang, Z. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).
  37. Bergman, H. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  38. Portero, E. P., Nemes, P. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).
  39. Zhang, X. C., et al. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).
  40. Guo, S., Zhang, C., Le, A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).
  41. Buziol, S., et al. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).
  42. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  43. Wang, T. X. Y. G., Zhuang, Y., Wang, G. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).
  44. Hernandez Bort, J. A., et al. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).
  45. House, R. R. J., et al. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).
  46. Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).
  47. Sellick, C. A., et al. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).
  48. Dietmair, S., Timmins, N. E., Gray, P. P., Nielsen, L. K., Kromer, J. O. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).
  49. Faijes, M., Mars, A. E., Smid, E. J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).
  50. Pabst, M. G. J., et al. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).
  51. Lorenz, M. A., Burant, C. F., Kennedy, R. T. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).
  52. Wahrheit, J., Heinzle, E. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).
  53. Volmer, M., Gettmann, J., Scholz, S., Buntemeyer, H., Noll, T. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).
  54. Richard King, R. B., Fernandez-Metzler, C., Cynthia Miller-Stein, A. T. O. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).
  55. Dunn, W. B. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).
  56. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).
  57. Krismer, J., et al. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).
  58. Ye, D., et al. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).
  59. Volmer, M., et al. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).
  60. Wije Munige, S., Bhusal, D., Peng, Z., Chen, D., Yang, Z. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).
  61. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).
  62. Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  63. Wishart, D. S., et al. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).
  64. Conroy, M. J., et al. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
  65. Pinu, F., Villas-Boas, S. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).
  66. Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cresel MetabolitlerH cre S nd rmeAmonyum Formatla Y kamaVakumlu Dondurarak KurutmaK tle Spektrometrisi AnaliziMetabolit Korumastatistiksel Veri Analizi

İlgili makaleler