Yöntem makalesi

Fare Prematüre Yumurtalık Yetmezliği Modelinin Hazırlanması ve Değerlendirilmesi

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69000

⸱

19 Eylül 2025

 , 
1The First Hospital of Anhui University of Science and Technology'

Bu makalede

Özet

Bu protokol, siklofosfamid enjeksiyonu yoluyla erken yumurtalık yetmezliği fare modeli oluşturmak için bir yöntemi tanımlar. Model, insan erken yumurtalık yetmezliğinin patolojik ilerlemesini etkili, kolay ve uyarlanabilir bir şekilde kopyalayarak yüksek güvenilirlik ve maliyet etkinliği gösterir.

Özet

Erken yumurtalık yetmezliği (POI), kadın kısırlığına yol açan kritik bir durumdur ve mekanik ve terapötik araştırmalar için güvenilir hayvan modelleri gerektirir. Burada, siklofosfamid (CTX) ile indüklenen bir POI fare modeli oluşturmak ve değerlendirmek için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Düzenli östrus döngüleri olan altı ila sekiz haftalık dişi fareler seçildi ve intraperitoneal CTX enjeksiyonlarına tabi tutuldu: 1. günde 100 mg/kg'lık bir başlangıç dozu, ardından sonraki 14 gün boyunca günlük 20 mg/kg dozlar. Östrus sikluslarındaki dinamik değişiklikler, Wright boyaması ile vajinal smear sitolojisi ile izlendi. Estradiol (E2), folikül uyarıcı hormon (FSH) ve anti-Müllerian hormonun (AMH) serum seviyeleri, endokrin değişiklikleri değerlendirmek için ELISA kullanılarak ölçüldü. Yumurtalık histopatolojisi, foliküler atreziyi ölçmek için parafine gömülü kesitlerin hematoksilen-eozin (H&E) boyaması yoluyla değerlendirilirken, granüloza hücre apoptozunu saptamak için bölünmüş kaspaz-3'ün immünohistokimyasal analizi yapıldı. Sonuçlar, CTX ile tedavi edilen farelerde kızgınlık döngüselliğinin bozulduğunu, E2 ve AMH seviyelerinin önemli ölçüde azaldığını, FSH konsantrasyonlarının yükseldiğini, foliküler atrezisinin arttığını ve granüloza hücre apoptozunun arttığını göstererek başarılı POI modellemesini doğruladı. Bu model oluşturma yöntemi, kemoterapinin neden olduğu yumurtalık hasarının mekanizmasını yüksek oranda taklit edebilir ve folikül rezervinin tükenmesi ve seks hormonu bozuklukları gibi tipik patolojik özellikler sunabilir. Kemoterapinin üreme toksisitesi mekanizmasını ortaya çıkarmak, yumurtalık koruyucu ilaçları taramak ve doğurganlığı koruma stratejilerini optimize etmek için güvenilir bir deneysel platform sağlar. Üstelik bu modelin kullanımı nispeten basit, düşük maliyetli ve kısa bir üretim döngüsüne sahip, bu da onu gerçekleştirmeyi ve yaygınlaştırmayı kolaylaştırıyor. Metodoloji, görselleştirilebilir, adım adım deneysel gösterimler için JoVE'nin gereksinimleriyle uyumludur.

Giriş

Kadınlarda üreme yaşlanması bozukluğunun en yaygın şekli olan erken yumurtalık yetmezliği (POI), östrojen eksikliği semptomları ve üreme işlev bozukluğu yoluyla hastaların fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde tehlikeye atmakla kalmaz, aynı zamanda kırıklar, otoimmün bozukluklar, kardiyovasküler hastalıklar, diabetes mellitus vb. dahil olmak üzere komorbiditelerin gelişme riskini de artırır.1. Etkili ve güvenli tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bu nedenle modern tıpta kritik derecede acil bir öncelik haline gelmiştir. Klinik örneklerin sınırlı mevcudiyeti, çok faktörlü etiyoloji ve POI araştırmalarıyla ilişkili yüksek etik riskler göz önüne alındığında, sistematik mekanik araştırmaya ve güvenlik doğrulamasına izin veren güvenilir hayvan modellerinin oluşturulması vazgeçilmez hale gelmiştir.

Şu anda, kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarı modelleri, POI çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. İmmünsüpresif özelliklere sahip bir alkilleyici ajan olan siklofosfamid (CTX), güçlü bir gonadotoksik bileşik olarak tanımlanmıştır. Mekanizması, hücresel proliferasyonu 2 baskılamak için DNA çapraz bağlama hasarını içerirve yumurtalık rezerv hücrelerinin apoptozuna yol açar 3,4. CTX tabanlı modeller, ilkel folikül tükenmesi, hipoöstrojenemi ve yüksek folikül uyarıcı hormon (FSH) seviyeleri dahil olmak üzere POI'nin klinik özelliklerini etkili bir şekilde özetler. Farelerde intraperitoneal CTX enjeksiyonu belirgin avantajlar sunar: hızlı peritoneal emilim yoluyla yüksek biyoyararlanım, minimum teknik değişkenlik ile standartlaştırılmış çalışabilirlik ve büyük ölçekli çalışmalar için maliyet etkinliği. Özellikle farelerin yumurtalık yapısı insanlarınkine oldukça benzer, bu da foliküler tükenmenin ve hormonal değişikliklerin dinamik olarak gözlemlenmesini kolaylaştırır. Üstelik fareler düşük maliyetlidir ve hızlı üreme oranına sahiptir, bu da büyük ölçekli numune çalışmalarının gereksinimlerini karşılar.

Bu avantajlara rağmen, CTX doz rejimlerindeki heterojenlik (örneğin, tek boluslu ve fraksiyone enjeksiyonlar) ve zamansal uygulama pencereleri, çalışmalar arasında tutarsız modelleme sonuçlarına yol açmıştır. Bu boşluğu gidermek için, farelerde POI indüksiyonu için CTX dozajını ve uygulama sıklığını optimize eden sistematik bir protokol sunuyoruz. Bu çalışma, yumurtalık rezervi tükenmesi, hormonal düzensizlik ve histopatolojik bağıntıların kantitatif değerlendirmesi yoluyla tekrarlanabilir bir model oluşturmayı ve böylece mekanik keşif ve terapötik tarama için sağlam bir platform sağlamayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd.'nin Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Etik Numarası: SDLL202502281). Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin tüm hayvan deney prosedürlerinde laboratuvar kemirgenlerinin bakımı ve kullanımına ilişkin yönergelerine uygundur. Bu deneyde kullanılan dişi C57BL/6 fareleri 6-8 haftalıktı ve spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında tutuldu. Kendilenmiş bir suş ve C57 soyunun bir alt suşu olarak, C57BL/6 fareleri siyah kürkleri ile karakterize edilir. Deneyden önce fareler, doğal sirkadiyen ritimleri taklit etmek için 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü ile kontrollü sıcaklık ve nem koşulları altında hayvan laboratuvarında bir hafta boyunca iklimlendirildi. İklimlendirme dönemi boyunca, farelere yiyecek ve suya ad libitum erişim sağlandı.

1. Hayvan hazırlama

NOT: Normal östrus döngüleri olan 6-8 haftalık 24 dişi SPF dereceli C57BL / 6 fare seçin. Pul pul dökülmüş vajinal hücrelerin yaymalarını hazırlamak için art arda 10 gün boyunca sabah 9:00'da farelerden vajinal lavaj sıvısı toplayın. Kızgınlık döngülerini gözlemleyin ve en az bir sürekli ve tam döngüye sahip fareleri seçin.

  1. Deneylerden önce farelerin 1 hafta boyunca çevreye alışmasına izin verin. Adaptasyon süresinden sonra fareleri kulak zımbası kullanarak işaretleyin. İşaretlemeden hemen sonra vücut ağırlığı ölçümlerini kaydedin.
  2. Doğal stres kaynaklı idrara çıkma gerçekleşene kadar fareleri güvenli bir şekilde kavrayın. Sırt boyun derisini sol elin başparmağı ve işaret parmağı arasında sıkıştırarak hareketsiz hale getirin. Karın bölgesini tamamen ortaya çıkarmak için fare kafasını aşağı doğru konumlandırın.
  3. Steril bir pipet ucunu bir mikro pipete yükleyin. 10 μL steril fizyolojik salin solüsyonu aspire edin. Vajinal kanal boyunca üç ardışık yıkama döngüsü gerçekleştirin. Lavaj sıvısını pipet ucunda tutun.
  4. Lavaj sıvısını cam mikroskop lamı boyunca eşit olarak dağıtın. Oda sıcaklığında tamamen havayla kuruyan slaytlar. Hücreleri korumak için %95 etanole batırarak sabitleyin. Slaytları deneysel parametrelerle kapsamlı bir şekilde etiketleyin ve işlenmediği zamanlarda 4 °C'de ışık geçirmez slayt kutularında korumalı depolama sağlayın.
  5. Wright'ın boyama protokolü
    1. Slaytları %95 etanole batırın (3-10 dakika). Damıtılmış su akışının altında iyice durulayın.
    2. Slaytları %95 etanol banyosundan geçirin (1 dakika süre).
    3. Temiz filtre kağıdı kullanarak oksitlenmiş filmi hematoksilen solüsyonu yüzeyinden kazıyın. Slaytları filtrelenmiş hematoksilin içine daldırın (5 dakika).
    4. Slaytları damıtılmış suyla durulayın. %1 HCl çözeltisine kısaca (<1 sn) daldırın. Uzun süreli damıtılmış su durulaması ile tamamlayın.
    5. Orange G ve EA50 solüsyonlarını kullanarak karışık leke hazırlayın. Karışımda leke kayar (3 dakika).
    6. Slaytları üç ardışık %95 etanol banyosundan (5 saniyelik aralıklarla) geçirin.
    7. Ksilen ile iki aşamada (her biri 2 dakika) tedavi edin.
      NOT: Ksilen buharının solunmasını önlemek için çeker ocak içinde çalıştırın. Kullandıktan hemen sonra kapları kapatın.
    8. Nötr reçine montaj ortamı kullanarak numuneleri kalıcı olarak koruyun
  6. Slaytı mikroskop altında okurken, soluk pembe sitoplazmalı ve koyu mor çekirdekli hücreleri çekirdekli epitel hücreleri, düzensiz pullu çekirdeksiz soluk pembe hücreleri keratinize epitel hücreleri ve küçük yuvarlak mavi hücreleri beyaz kan hücreleri olarak tanımlayın.
    NOT: Aşağıdaki sitolojik özelliklere göre östrus döngüsü aşamasını belirleyin: (1) Proöstrus fazı: Baskın çekirdekli epitel hücreleri. Hem tek tek hücreler hem de kümelenmiş sayfalar olarak görünür. Seyrek lökosit varlığı (%<5 görüş alanı); (2) Östrus fazı: Bol miktarda enüklee keratinize epitel hücreleri. Özellikleri: düzensiz kenarlıklı büyük düzleştirilmiş morfoloji. Lökositlerin ve çekirdekli hücrelerin neredeyse yokluğu (%<2 birleşik); (3) Metestrus fazı: Keratinize hücre popülasyonunun azalması. Ortaya çıkan lökosit infiltrasyonu. Yeniden ortaya çıkan çekirdekli epitel hücreleri (%20-%40 bileşim); (4) Diöstrus fazı: Baskın lökositler ve çekirdekli hücreler (%>80). Keratinize hücrelerin sanal yokluğu (%<1)5. Örüntü doğrulaması için Şekil 1'deki standartlaştırılmış sitolojik atlasa bakın.
  7. Verileri düzenleyin ve analiz edin ve normal kızgınlık döngülerine sahip 24 fare seçin.

2. Siklofosfamid enjeksiyonunun hazırlanması

NOT: Siklofosfamid ışığa karşı kararsızdır ve işlem boyunca karanlıkta kullanılmalıdır. Siklofosfamid toksiktir, bu nedenle operasyon sırasında koruyucu giysi, çift katmanlı nitril eldiven ve maske takılmalıdır.

  1. 10 mL steril saline 200 mg steril farmasötik dereceli siklofosfamid tozu ekleyin. 20 mg/mL'lik bir siklofosfamid çözeltisi elde etmek için iyice karıştırın. Bir porsiyonu hemen kullanmak üzere ayırın; geri kalanıyla ek konsantrasyonlar hazırlayın.
  2. 200 μL 20 mg/mL stoğu alüminyum folyoya sarılmış 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 1 mL toplam hacme ulaşmak için 800 μL steril salin ekleyin. 4 mg/mL çözelti elde etmek için 30 saniye vorteks karıştırın. 14 özdeş alikot hazırlayın (her biri 1 mL). Tüm alikotları -20 °C'de dikey bir rafta saklayın.

3. Siklofosfamid solüsyonunun enjekte edilmesi

NOT: Bilgisayarlı bir sistem kullanarak 24 fareyi üç kohorta randomize edin: (1) BOŞ: Tedavi yok (n = 8); (2) NS: Tuzlu su kontrolleri (n = 8); (3) POI: Siklofosfamid grubu (n = 8). Farelere her sabah saat 9:00'da enjekte edin. POI grubu için, ilk gün intraperitoneal olarak 100 mg/kg siklofosfamid solüsyonu enjekte edin ve ardından sonraki 14 gün boyunca sürekli olarak 20 mg/kg siklofosfamid solüsyonu enjekte edin. NS grubuna intraperitoneal olarak eşit hacimde normal salin enjekte edin ve BALNK grubunu tedavi edilmeden bırakın. Her enjeksiyondan önce tüm fareleri her gün tartın ve enjeksiyondan sonra bulaşmak için vajinal pul pul dökülmüş hücreleri toplayın.

  1. Forseps ile izoflurana batırılmış bir pamuk topunu sızdırmaz bir kaba yerleştirin. 10 saniyelik inhalasyon anestezisi için fareyi kabın içine yerleştirin.
    NOT: İzofluran, belirli toksisite ve tahrişe sahip uçucu bir anesteziktir. Operasyonlar, kurumsal olarak onaylanmış protokollere uygun olarak iyi havalandırılan bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
  2. Enjeksiyon hacmini hesaplayın: Vücut ağırlığı (g) × 5 = μL. Sağ alt kadranı %75 etanol çubukla dezenfekte edin. 26 G'lik bir iğneyi 30-45° açıyla (eğim yukarı yönde) yerleştirin. "Pop" hissine kadar karın duvarından 5 mm ilerleyin. 50 μL/s hızında çözüm sağlayın.
  3. Artık sıvıları ve kontamine ekipmanı "IŞIĞA DUYARLI ATIK" etiketli ışık geçirmez atık kaplarına koyun. İzoflurana batırılmış pamuk toplarını, açık TEHLİKELİ ATIK etiketleri ile yapıştırılmış, belirlenmiş kapalı kaplara atın.
  4. Dondurulmuş 4mg/mL alikotları 37 °C'lik bir su banyosunda (3 dakika) çözdürün. Günlük dozu yeniden hesaplayın: Vücut ağırlığı (g) × 5 = μL. Şırıngayı yüklemeden önce çözeltinin berraklığını doğrulayın.

4. Serum koleksiyonu

NOT: 15 günlük siklofosfamid çözeltisi enjeksiyonundan sonra, tüm farelerin kalbinin tepesinden kan alın. Serumu elde etmek için santrifüjleyin. Kontrol grubundaki ve NS grubundaki farelerden diöstrus fazı sırasında numune alınmalıdır. POI grubu farelere, diöstrus içinde olduğu doğrulanan kontrol/NS grubu farelerle eşleştirilmiş zaman uyumlu örnekleme tabi tutuldu.

  1. Fareyi uyuşturmak
    1. Fareyi, izofluranla doyurulmuş bir pamuk topu içeren şeffaf, hava geçirmez bir odaya yerleştirin.
    2. Farenin davranışını gözlemleyin. Düzeltme refleksinin kaybı (hafifçe sırtüstü çevrildiğinde duruşun kendi kendine düzeltilememesi) yeterli anestezi indüksiyonunu gösterir. Bu işlem tipik olarak 2-3 dakika gerektirir.
    3. Fareyi kaptan çıkarın. Sol elinizle başını sabitleyin ve işaret parmağınızla üst göz kapağına hafifçe bastırın. Sağ elinizde steril bir pamuklu çubuk tutun, 1-2 mm çapında bir miktar toplamak için eritromisin göz merhemine batırın.
      1. Merhemi göz küresi yüzeyine ve iç göz kapağına eşit şekilde uygulayın. Göz kapağını kapatın, ardından merhemi eşit şekilde dağıtmak için parmak ucunuzla 10 saniye boyunca hafifçe masaj yapın. Kuru bir pamuklu çubuk kullanarak göz çevresindeki fazla merhemi silin.
  2. Fareyi bir köpük tahta üzerinde sırtüstü pozisyonda konumlandırın. Cerrahi makas kullanarak göğüs kıllarını kesin. Göğüs ve karın bölgelerini %75 etanol ile dezenfekte edin.
    1. Orta hat boyunca deri ve deri altı dokuyu kesin. Sternumun sol tarafı boyunca interkostal kasları uzunlamasına kesin. Kalbi açığa çıkarın.
  3. Kalbin tepesine yaklaşık 30°'lik bir açıyla bir şırınga (iğne eğimi yukarı bakacak şekilde) sokun. İğneyi yavaşça ilerletin ve yavaşça aspire edin. Elde edilen kanı 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne enjekte edin.
  4. Elde edilen kanı bir santrifüje koyun. Santrifüjü 4 °C'de 10 dakika boyunca 850 × g'a ayarlayın. Üst tabaka serumu çıkarmak için bir pipet kullanın ve 0,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. -80 °C'de saklayın.

5. Serum östrojen, FSH ve AMH'nin tespiti

  1. Dondurulmuş serumu yavaşça çözülmesi için gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabına koyun.
  2. İçindeki reaktiflerin oda sıcaklığına dönmesini sağlamak için ELISA kitini 30 dakika önceden buzdolabından çıkarın.
  3. Kitin talimatlarına göre, standart seyrelticiyi kullanarak standardın seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Genel olarak, 0, 10, 20, 40, 80, 160 pg/mL vb. gibi çoklu konsantrasyon gradyanları ayarlayın.
  4. Seyreltilmiş standardı ve test edilecek serum numunelerini ELISA plakasının ilgili kuyucuklarına, kuyu başına 100 μL ekleyin. Aynı zamanda, boş kontrol kuyuları kurun ve 100 μL numune seyreltici ekleyin.
  5. Antijen ve antikorun tamamen bağlanmasını sağlamak için ELISA plakasını 1-2 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre koyun.
  6. İnkübasyon bittikten sonra kuyucuklardaki sıvıyı dikkatlice aspire edin. ELISA plakasını yıkama solüsyonu ile 3-5 kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, kalan yıkama solüsyonunu çıkarmak için ELISA plakasını hafifçe kurulayın.
  7. Enzim etiketli antikor çalışma solüsyonunu, kuyucuk başına 100 μL ekleyin. 37 °C'lik bir inkübatörde 1 saat inkübe etmeye devam edin.
  8. Yukarıdaki yıkama adımlarını tekrarlayın, 3-5 kez yıkayın ve ELISA plakasını kurulayın.
  9. Her kuyucuğa 100 μL substrat çözeltisi ekleyin. Çalkalayarak hafifçe karıştırın. Berrak mavi bir renk oluşana kadar karanlıkta 37 °C'de 15-30 dakika inkübe edin.
  10. Reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa 100 μL sonlandırma solüsyonu ekleyin. Maviden sarıya renk değişimini gözlemleyin.
  11. 450 nm dalga boyunda her bir kuyucuğun absorbans değerlerini (A değerleri) okumak ve verileri kaydetmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
  12. Standart bir eğri çizmek için standardın konsantrasyonunu apsis ve karşılık gelen absorbans değerini ordinat olarak alın. Genel olarak, standart eğrinin korelasyon katsayısı r²'nin 0,99'dan büyük olmasını sağlamak için polinom uydurmayı kullanın.
    1. Standart eğriye göre, numunedeki hormon konsantrasyonunu hesaplamak için test edilecek serum numunesinin absorbans değerini standart eğri denklemine koyun.

6. Yumurtalık dokusunun toplanması

  1. Hala anestezi uygulanmış fareye servikal çıkık ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ve ardından farenin karnını açmak için cerrahi makas kullanın.
  2. Yumurtalıklar böbreklerin altında bulunur ve beyaz yağ yastıkçıklarına sarılır. Yumurtalıkları ve fallop tüplerini ortaya çıkarmak için yağ yastıkçıklarını forseps ile nazikçe kaldırın. Yumurtalıkları çevredeki bağ dokularından ayırmak için makas kullanın.
  3. Çıkarılan yumurtalık dokularını 24 saat boyunca fiksasyon için% 4 paraformaldehit içine yerleştirin.

7. Parafin bölümlerinin hazırlanması

  1. Dehidrasyon: Yumurtalıkları çıkarın ve her adım 1 saat sürecek şekilde sırayla farklı konsantrasyonlarda (%75, %85, %95, %100) etanol çözeltilerinden geçirin.
  2. Şeffaflık tedavisi: İlk olarak, yumurtalıkları 15 dakika boyunca ksilen ve etanol karışımında tedavi edin. Ardından, her biri 15 dakika boyunca Xylene I ve Xylene II'ye daldırın.
  3. Balmumu emdirme: Yumurtalıkları ksilen ve parafin karışımına batırın. Ardından, her biri 0,5 saat boyunca Parafin I, Parafin II ve Parafin III'e aktarın.
  4. Gömme: Balmumu emdirilmiş yumurtalıkları bir gömme kalıbına yerleştirin. Dokuların yönünü ayarlayın (kesilen yüzey aşağı bakacak şekilde). Eritilmiş parafini kalıba dökün ve soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.
  5. Kesitleme: Parafin bloğunu bir mikrotom kullanarak 5 μm kalınlığında kesitler halinde kesin. Seri kesit alın ve şeridi bir fırça ile yavaşça aktarın, su banyosunda yüzdürüldüğünde bozulma olmadan düz duran düzgün, yarı saydam bir bant oluşturmasını sağlayın

8. H&E boyama

  1. Mum alma: Parafine gömülü bölümleri 10 dakika boyunca Ksilen I'e batırın. Ardından bölümleri Xylene II'ye aktarın ve 10 dakika daha bekletin.
  2. Rehidrasyon: Kesitleri sırayla farklı konsantrasyonlardaki bir dizi etanol çözeltisinden geçirin: %100 etanol, %95 etanol, %85 etanol ve %75 etanol, her biri için 5 dakikalık bir daldırma süresiyle. Son olarak, bölümleri 1 dakika boyunca damıtılmış suyla durulayın.
  3. Hematoksilen boyama: Bölümleri 5 dakika boyunca hematoksilen boyama solüsyonuna batırın. Bölümleri 30 saniye boyunca akan su altında durulayın.
  4. Farklılaşma: Bölümleri 1-3 saniye boyunca %1 hidroklorik asit-etanol çözeltisine batırın. Bölümleri akan su altında 1-2 dakika durulayın.
  5. Sitoplazmik boyama: Eozin Y çözeltisine daldırın (1 dakika). Fazla lekeyi filtre kağıdı ile kurulayın.
  6. Dehidrasyon: Bölümleri bir dizi etanol çözeltisinden geçirin: %85 etanol, %95 etanol ve %100 etanol (iki kez), her biri için 5 saniyelik bir daldırma süresiyle.
  7. Temizleme: Bölümleri 5 dakika boyunca Ksilen I'e batırın. Ardından bölümleri Xylene II'ye aktarın ve 5 dakika daha bekletin.
  8. Montaj: Lekeli bölüme nötr reçine damlatın. Bölümün üzerine dikkatlice bir lamel yerleştirin.
  9. Folikül sayımı: Lekeli kesitleri mikroskop altında gözlemleyin. Farklı gelişim aşamalarındaki folikül sayısını sayın ve kaydedin.

9. Yumurtalık dokusunda Kaspaz-3 için immünohistokimya

  1. Antijen alımı: Mumu alınmış ve rehidre edilmiş bölümleri sodyum sitrat tamponuna (pH 6.0) yerleştirin. Bölümleri mikrodalga fırında yüksek güçte 5 dakika ısıtın. Sonra onları çıkarın ve soğumaya bırakın.
    1. Toplam 3 ısıtma döngüsü için ısıtma işlemini 2 kez daha tekrarlayın. Doğal soğutmadan sonra, bölümleri her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez PBS ile yıkayın.
  2. Endojen peroksidazın ortadan kaldırılması: Kesitlerin üzerine damla damla %3 H₂O₂ ekleyin. Bölümleri oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Bölümleri PBS ile her seferinde 3 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın.
  3. Serum blokajı ve antikor inkübasyonu: Tavşan anti-kaspaz-3 primer antikorunu bölümlere damla damla ekleyin. Kesitleri gece boyunca 4 °C'de ıslak bir kutuda inkübe edin. Ertesi gün, bölümlerin 30 dakika oda sıcaklığına dönmesine izin verin. Bölümleri PBS ile her seferinde 5 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın.
  4. Renk geliştirme, karşı boyama ve montaj: Genellikle yaklaşık 1-5 dakika süren renk gelişimi için DAB kullanın. Bölümleri 2 dakika boyunca hematoksilen ile boyayın. Karşı boyamadan sonra bölümleri 5 dakika yıkayın.
    1. Daha sonra bölümleri maviye çevirmek için 1 dakika amonyaklı suda bekletin. Son olarak, bir etanol gradyanı ile dehidrasyon gerçekleştirin, bölümleri temizleyin ve monte edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

POI fare modelini oluşturma süreci Şekil 2'de gösterilmektedir. Farelerin vücut ağırlığı ve kızgınlık döngüsü, ilaç enjeksiyonunun ilk gününden itibaren kaydedildi. 15 günlük CTX enjeksiyonundan sonra, POI grubundaki farelerin ortalama vücut ağırlığı düşüş oranı (%3.717 ± %1.463), BLANK grubundan (%0.2526 ± %0.1469) ve NS grubundan (%0.4305 ± %0.2494) önemli ölçüde daha yüksekti (p < 0.0001). NS grubu ile BLANK grubu arasında vücut ağırlığı açısından istatistiksel olarak anlamlı ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Erken yumurtalık yetmezliği (POI), kadınların fiziksel sağlığını ve yaşam kalitesini ciddi şekilde etkilemektedir ve küresel prevalansı her geçen yıl artmaktadır. Bununla birlikte, şu anda, POI için hala güvenli ve etkili tedavi yöntemleri eksikliği vardır. Güvenilir ve tekrarlanabilir bir hayvan modeli oluşturmak, POI araştırmalarını ilerletmek için çok önemlidir. Klinik olarak, POI'nin nedenleri çeşitlidir ve kemoterapi ilaçları bilinen önemli patojenik faktörlerdir8<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Wu Jieping Tıp Vakfı'ndan Klinik Araştırma Özel Finansman Programı (Hibe No. 320.6750.17067) aracılığıyla alınan mali desteği minnetle kabul ederler. Ayrıca Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd'nin sağladığı araştırma platformunu ve teknik desteği de minnetle kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%4 paraformaldehitSangon Biyomühendislik Co, LtdA500684-0500
%75 alkolShandong Dexinkang Tıbbi Teknoloji Co, Ltd200603
Susuz etanolBengbu Kimyasal Reaktif Fabrikası
Santrifüj tüpleriBiyokeskinBS-15-M
Soğuk masaQuanlin TıbbiQL-LT20230003
Pamuk toplarıShandong Parlaklık Co, Ltd20241008
LamellerJiangsu Shitai Deneysel Ekipman Co, Ltd80312-3412
SiklofosfamidBaxter Onkoloji GmbH3K645A Serisi
DehydratorHubei Xiaogan Haikuo Tıbbi Teknoloji Co, LtdKH-TS
Boyama makinesiHubei Xiaogan Haikuo Tıbbi Teknoloji Co, LtdKH-S101 
EA50 boyama solüsyonuHubei Taikang Tıbbi Ekipman Co, LtdJ7EC20
Kulak küpesi pensesiShenzhen Ruiwode Yaşam Bilimleri ve TeknolojisiC22002-10 (İngilizce)
Parafinin verimli bir şekilde kesilmesiTongxiang Hualing Balmumu Sanayi A.Ş., Ltd20241018
Elektrikli şok kurutma fırını (fırın)Şangay Yuejin Tıbbi Ekipman Co, LtdHCZF-11
Elektrik ısıtmalı termostatik su inkübatörüŞangay Yuejin Tıbbi Ekipman Co, LtdHSW-600 Serisi
Gömme makinesiPrisstar Changzhou Tıbbi Cihaz Co, LtdPMB-A
Eozin lekesiSewell Biyoteknoloji Co, LtdG1005-2 Serisi
Hematoksilen farklılaşma solüsyonuSewell Biyoteknoloji Co, LtdG1039-500ML
Hematoksilen boyama solüsyonuSewell Biyoteknoloji Co, LtdG1005-1 Serisi
İzofluranShandong Ante Hayvancılık Teknolojisi Co, Ltd2024101501
mikroskopAnhui Jiashang Biyoteknoloji Co, LtdSQS-12P
Fare anti-Müllerian hormonu (AMH) ELISA kitiHengyuan BiyoteknolojiHB1334-MU
Fare estradiol (E2) enzime bağlı immünolojik test kitiHengyuan BiyoteknolojiHB975-MU
Fare folikül uyarıcı hormon (FSH) ELISA kitiHengyuan BiyoteknolojiHB967-MU
Nötr sakızNanchang Yulu Deney Ekipmanları Co, Ltd240504
Patolojik doku beyazlatma aparatıPrisstar Changzhou Tıbbi Cihaz Co, LtdPHY-III
PBS arabelleğiBiyokeskinBL302A
Pipet uçlarıBiyokeskinBS-10-T
PipetlerDalong Tıbbi Ekipman Co, LtdYE213AT0257922
Hızlı doku kurutucuHubei Xiaogan Haikuo Tıbbi Teknoloji Co, LtdKH-TS
DilimleyiciGheddyYD-315
SlaytJiangsu Shitai Deneysel Ekipman Co, Ltd80312-3161
Smear makinesiHubei Taikang Tıbbi Ekipman Co, Ltd131001305
Sodyum klorür enjeksiyonuWuhan Binhu Shuanghe İlaç Co, Ltd240525K04
şırıngaJiangsu Zhiyu Tıbbi Cihaz Co, Ltd
Titreşimli dilimleyiciŞangay Zhixin Enstrüman Co, LtdZQP-86 Serisi
KsilenTianjin Kaitong Kimyasal Reaktif Co, Ltd20240102

Kaynaklar

  1. Federici, S., et al. Primary ovarian insufficiency: update on clinical and genetic findings. Front Endocrinol. 15, 1464803(2024).
  2. Soleimani, R., Heytens, E., Darzynkiewicz, Z., Oktay, K. Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: Double-strand DNA breaks and microvascular compromise. Aging (Albany NY). 3 (8), 782-793 (2011).
  3. Bellusci, G., et al. Kinase-independent inhibition of cyclophosphamide-induced pathways protects the ovarian reserve and prolongs fertility. Cell Death Dis. 10 (10), 726(2019).
  4. Yuksel, A., et al. The magnitude of gonadotoxicity of chemotherapy drugs on ovarian follicles and granulosa cells varies depending upon the category of the drugs and the type of granulosa cells. Hum Reprod. 30 (12), 2926-2935 (2015).
  5. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertil Re Pract. 6, 5(2020).
  6. Wang, Z., Wang, Y., Yang, T., Li, J., Yang, X. Study of the reparative effects of menstrual-derived stem cells on premature ovarian failure in mice. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 11(2017).
  7. Shen, J., et al. Transplantation of the LRP1(high) subpopulation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improves ovarian function in mice with premature ovarian failure and aged mice. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 64(2024).
  8. Letourneau, J. M., et al. Acute ovarian failure underestimates age-specific reproductive impairment for young women undergoing chemotherapy for cancer. Cancer. 118 (7), 1933-1939 (2012).
  9. Nynca, A., et al. Tamoxifen decreases ovarian toxicity without compromising cancer treatment in a rat model of mammary cancer. BMC Genomics. 24 (1), 325(2023).
  10. Feng, Y., et al. Protective effect of Luffa cylindrica fermentation liquid on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in female mice by attenuating oxidative stress, inflammation and apoptosis. J Ovarian Res. 17 (1), 24(2024).
  11. Huang, Y., et al. Bushen Huoxue recipe ameliorates ovarian function via promoting BMSCs proliferation and homing to ovaries in POI mice. Phytomedicine. 129, 155630(2024).
  12. Ai, G., et al. Adipose-derived stem cells promote the repair of chemotherapy-induced premature ovarian failure by inhibiting granulosa cells apoptosis and senescence. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 75(2023).
  13. Anderson, R. A., et al. Anti-Müllerian hormone as a marker of ovarian reserve and premature ovarian insufficiency in children and women with cancer: A systematic review. Hum Reprod Update. 28 (3), 417-434 (2022).
  14. Jiao, X., et al. Ovarian reserve markers in premature ovarian insufficiency: within different clinical stages and different etiologies. Front Endocrinol. 12, 601752(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

POI Fare ModeliSiklofosfamid nd ksiyonustrus D ng s zlemeVajinal Yayma SitolojisiWright BoyamaSerum Hormon AnaliziOver HistopatolojisiFolik ler AtreziGran loza H cresi Apoptozu

İlgili makaleler