Research Article

Staphylococcus aureus ve Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus'un Multipleks Gerçek Zamanlı Floresan PCR ile Hızlı Tespiti

DOI:

10.3791/69004

⸱

September 19th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Department of Laboratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, SA'ya özgü nuc ve MRSA mecA genlerini hedefleyen primerler/problar ile multipleks gerçek zamanlı PCR kullanır. İnsan balgam örneklerinde SA/MRSA nükleik asitlerinin hızlı (<1 saat), kalitatif tespitini sağlayarak kültüre dayalı yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden gelir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus (S.aureus), lokal yüzeysel lezyonlar ve gıda zehirlenmesinden ölümcül sistemik enfeksiyonlara kadar çeşitli klinik belirtilerle toplum kökenli ve hastane enfeksiyonlarına neden olan yaygın bir Gram pozitif insan patojenidir. Antibiyotiklerin keşfi ölüm oranını önemli ölçüde azalttı, ancak ilaç direnci sorunu o zamandan beri giderek daha belirgin hale geldi. MRSA'nın 1960 yılında ilk tanımlanmasından bu yana, bu tür küresel bir halk sağlığı tehdidi olarak ortaya çıkmıştır. MRSA, endokardit, kronik osteomiyelit, pnömoni, piyojenik artrit ve bakteriyemi gibi çeşitli ciddi hastalıklara neden olabilen hastane enfeksiyonlarının önemli bir patojenidir. Bu nedenle, S. aureus'un ve ilaç direncinin hızlı ve doğru bir şekilde saptanması, klinik tedaviyi yönlendirmek için çok önemlidir.

S.aureus ve MRSA için mevcut rutin tespit yöntemlerinin önemli sınırlamaları vardır. Onlarca yıldır "altın standart" olarak hizmet veren geleneksel bakteri kültürü yöntemi, kesin tür tanımlama ve ilaç duyarlılığı sonuçları sağlayabilir, ancak süreç zaman alıcıdır ve 48 ila 72 saat sürer. Ayrıca, bu yöntem kontaminasyona karşı hassastır ve özel laboratuvar tesislerine ve vasıflı teknisyenlere dayanır. Serolojik testler, hasta serumunda S.aureus antikorlarını tespit ederek non-invaziv tanı sağlar, ancak aktif enfeksiyonlar ile geçmiş enfeksiyonlar arasında ayrım yapamaz ve ilaca dirençli suşları (MRSA gibi) tanımlayamaz.

Bu çalışma, yukarıda belirtilen sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni bir multipleks gerçek zamanlı floresan PCR tespit yöntemi geliştirmeye odaklanmaktadır. Bu yöntem, S.aureus'un türe özgü nuc genini ve metisilin direncine aracılık eden mecA genini hedef alan spesifik primerler ve TaqMan floresan probları tasarlayarak, tek bir reaksiyon sisteminde S.aureus ve MRSA'nın eşzamanlı amplifikasyonunu ve tespitini sağlar. Bu teknoloji, algılama süresini büyük ölçüde azaltarak S.aureus ve MRSA tespiti için hızlı, doğru ve uygun maliyetli bir çözüm sunar. Bu yenilikçi yaklaşım, klinik tanı etkinliğini büyük ölçüde artırır ve hedefe yönelik antibiyotik tedavisinin erken uygulanmasını kolaylaştırarak ilaca dirençli bakteriyel enfeksiyonların kontrolüne önemli katkılar sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus, sağlıklı bireylerin burun mukozasını kolonize eden yaygın bir Gram pozitif koşullu patojendir 1,2. Konak bağışıklığı tehlikeye girdiğinde, lokal cilt enfeksiyonlarına, derin doku invazyonuna veya sistemik hastalıklara (örneğin, pnömoni, endokardit, osteomiyelit ve bakteriyemi) neden olabilir3. Yarı sentetik bir penisilin olan metisilin, 1959'da S. aureus enfeksiyonları için klinik olarak uygulandı ve iki yıl sonra MRSA İngiltere'de ortaya çıktı ve hızla Danimarka, Fransa ve İsviçre gibi Avrupa ülkelerine yayıldı4. MRSA'nın β-laktam antibiyotiklere karşı direnci sadece klinik yönetimi zorlaştırmakla kalmaz, aynı zamanda enfeksiyon risklerini de önemli ölçüde artırır5. Kontrol edilemeyen kolonizasyon/yayılma, yüksek önleme maliyetleri ve aşırı antibiyotik kullanımı dahil olmak üzere birçok faktör, toplu olarak MRSA enfeksiyon oranlarını artırmıştır6. Hızlı bulaşması ve karmaşık direnç mekanizmaları nedeniyle, MRSA enfeksiyonları, AB ülkelerinde yılda yaklaşık 150.000 bildirilen vaka ve >7.000 ölümle yüksek vaka-ölüm oranları ile ilişkilidir7. CHINET sürveyans verilerine göre, Çin'deki MRSA enfeksiyon oranları son beş yıldır %30'un üzerinde kalmıştır8. Hastane çapraz enfeksiyonu riskinin yüksek olması, halk sağlığı yüklerini daha da yoğunlaştırmakta ve sağlık sistemlerini zorlamaktadır 9,10. Bu nedenle, erken tanı, kişiselleştirilmiş tedavi, mortaliteyi azaltmak ve bulaşma zincirlerini kesintiye uğratmak için verimli ve hassas hızlı MRSA tespit teknolojilerinin geliştirilmesi klinik olarak acildir.

S.aureus ve MRSA için mevcut tespit teknolojileri, fenotipik tespit, genomik tespit, transkriptomik tespit, proteomik tespit, kütle spektrometrisi teknolojisi ve biyoinformatik tabanlı analizler dahil olmak üzere birçok alanı kapsamaktadır11.

Disk difüzyon yöntemi (KB yöntemi) ve minimum inhibitör konsantrasyon yöntemi (MIC yöntemi) gibi fenotipik tespit yöntemleri, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) ve Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi (EUCAST) tarafından "altın standart" olarak önerilmektedir. Bu yöntemler, direnç spektrumu sürveyansı ve epidemiyolojik araştırma için yaygın olarak kullanılan özel aletlere ihtiyaç duymama avantajlarına sahiptir. Bununla birlikte, dezavantajları da belirgindir: uzun kültür periyotları (24 saatin üzerinde) ve bazı yeni antibiyotikler için KB yönteminin sonuçları, insan faktörlerine duyarlı olan kesme noktası suşları için sonuçlarla MIC değerleri ile doğrulama gerektirir12,13.

Genomik düzeyde tespit yöntemleri arasında, geleneksel PCR, düşük maliyet ve yüksek verimlilikle direncin ön değerlendirmesini sağlayan ve deney süresini kısaltan yüksek duyarlılık ve güçlü özgüllük özelliklerine sahiptir. Ancak sınırlamaları, yalnızca bilinen direnç genlerini tespit edebilmek ve özel araçlara güvenmek14'te yatmaktadır. Mikrobiyal direncin mekanizması oldukça karmaşıktır, bu da bilinmeyen dirençli fenotipleri kapsayabilen ve hızlı tanımlamayı mümkün kılabilen teknik yöntemlerin geliştirilmesini çok önemli hale getirir. Ortaya çıkan GoPhAST-R (RNA tespiti yoluyla kombine genotipik ve fenotipik AST) teknolojisi, mRNA ekspresyon seviyelerini tespit ederek direnç fenotiplerini belirler, birden fazla patojende dirençle ilgili farklı genlerin aynı anda tespit edilmesini sağlar, deneysel geri dönüş süresini kısaltır ve makine öğrenimi15 ile birleştirildiğinde %94-99 doğruluk elde eder.

Proteomik düzeyde tespit yöntemleri arasında PBP2a lateks aglütinasyon yöntemi, MRSA için yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahip, basit kullanım ve hızlı sonuçlarla antijen-antikor spesifik bağlanmasına dayanmaktadır. Bununla birlikte, farklı stafilokok türleri arasında ayrım yapamaz ve ticari kitlerin tespit hassasiyetinde bir miktar azalma vardır, bu da oksasilin8 ile indüksiyondan sonra yeniden test yapılmasını gerektirir.

DOT-MGA (DNA Oligonükleotid Etiketi-Genomik Amplifikasyonun Mikrodizi Tespiti) yöntemi gibi MALDI-TOF MS tabanlı tespit yöntemleri, %96,4'e varan tespit oranıyla 6-8 saatlik inkübasyonda optimum analitik performansa ulaşır ve hem duyarlılık hem de özgüllük %100'dür. Ancak maliyeti yüksektir ve hedef plaka üzerindeki sınırlı konumlar, yüzlerce numuneyi aynı anda tespit etmeyi zorlaştırır16,17.

Direnç tahmini için omik verilerle birleştirilen biyoinformatik analiz teknolojileri arasında, tüm genom dizileme teknolojisi, yüksek çözünürlük ve kapsamlı bilgi analizi yetenekleriyle öne çıkıyor. Resfinder gibi direnç geni analizi veritabanları ile birleştirildiğinde, suşların spesifik direnç genleri taşıyıp taşımadığını analiz edebilir, direnç potansiyelini tahmin edebilir, tek nükleotid polimorfizmlerini (SNP'ler) ve dirençle ilişkili gen mutantlarını tespit edebilir, aynı zamanda tüm genom verilerinin depolanmasını ve yeniden analizini destekleyebilir18. Bununla birlikte, bu yöntem biyoinformatik geçmişi olan profesyoneller tarafından çalıştırılmasını gerektirir, günlük testlerde nadiren kullanılır ve patojenlerin epidemiyolojik analizi veya moleküler sürveyansı için yaygın olarak kullanılır19.

Yukarıda bahsedilen metodolojiler ya maliyet açısından yüksek, zaman alıcı ya da hala araştırma ve geliştirme aşamasındadır. Klinik olarak, "aciliyet" ve "doğruluk" arasında denge kuran bir çözüme acil ihtiyaç vardır - yeni bir multipleks floresan PCR teknolojisi, nuc/mecA genlerini tek bir tüpte aynı anda amplifiye ederek ve tespit döngüsünü 1 saate sıkıştırarak bu boşluğu doldurur. Geleneksel "acil durum taraması - direnç yazma" sürecindeki zaman penceresi boşluğunu hassas bir şekilde kapatarak, hastane enfeksiyonunun önlenmesi ve kontrolü için zaman açısından daha verimli bir moleküler tanı aracı sağlar. Bu spesifik PCR testi, tipik bir örnek olarak balgam örnekleri ile öncelikle solunum örneklerinin tespiti için kullanılır. 500 kopya/mL duyarlılık ve yüksek özgüllük sergilerken, antibakteriyel ajanlardan etkilenmez. Bu olumlu performans özellikleri nedeniyle, bu PCR testi, solunum yolu enfeksiyonlarının teşhisi ve MRSA'nın neden olduğu hastane enfeksiyonlarının sürveyansı için önemli bir uygulama değerine sahiptir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Guangdong İl Halk Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Etik No.: KY2025-510-01). Bu araştırmada kullanılan malzemelerle (reaktifler, kimyasallar, ekipman ve yazılım) ilgili ayrıntılı bilgi Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Numune toplama ve koruma protokolü

  1. Dahil edilme kriterleri: Kalite kontrol materyalleri haricinde, toplanan tüm numuneleri altın standart yöntemi (kültüre dayalı tahlil) kullanarak pozitif numuneler olarak tanımlayın.
  2. İnsan balgamı toplama
    1. Steril örnekleme tüpleri kullanarak deneklerin alt solunum yollarından 1-3 mL derin öksürüklü balgam toplayın. Tüpleri hemen kapatın ve analiz için taşıyın. Numuneleri test için hemen işleyin.
  3. Numune saklama:
    1. Yukarıdaki yöntemle toplanan numuneleri derhal analiz edin. Kısa süreli depolamaya aşağıdaki koşullar altında izin verilir:
      2-8 °C: ≤7 gün
      -20 °C ± 5°C: ≤6 ay
      -70 °C ± 5°C: ≤24 ay
      NOT: Bu çalışmada balgam örnekleri koruyucularla (BHI et suyu + gliserol vb.) muamele edilmemiştir. Toplandıktan sonra yukarıda açıklanan koşullar altında saklandılar ve tekrarlanan donma ve çözülmelerden kesinlikle kaçınıldı. Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının. İzin verilen maksimum donma-çözülme döngüleri: ≤3.

2. Nükleik asit ekstraksiyonu

NOT: Kontaminasyonu önlemek için tüm prosedürleri bir biyogüvenlik kabini içinde tamamlayın.

  1. Balgam numunesi ön işlemi için, viskoz balgam numunelerini sıvılaştırmak ve enterferans yapan safsızlıkları ortadan kaldırmak için numuneyi 1:4 oranında %4 NaOH solüsyonu (balgam numunesi: %4 NaOH solüsyonu) ile karıştırın, ardından iyice vorteksleyin (30 s) ve sıvılaşmayı sağlamak için oda sıcaklığında (22-25 °C) 30 dakika inkübe edin.
  2. Nükleik asit ekstraksiyon reaktiflerinin hazırlanması
    1. Önceden paketlenmiş 96 oyuklu plakayı kitten çıkarın. Reaktifleri ve manyetik boncukları 96 oyuklu plakanın dibine konsantre etmek için 96 oyuklu plakayı hafifçe hafifçe vurun.
    2. Sıvının dışarı sıçramasını önlemek için 96 oyuklu plakayı titreştirmekten kaçınarak alüminyum folyo sızdırmazlık filmini dikkatlice yırtın.
    3. 96 oyuklu plakanın Sütun 1 ve Sütun 7'nin çözeltilerinde: Önce 20 μL Proteinaz K ekleyin, ardından ekstrakte edilecek 200-300 μL numune ekleyin.
  3. Otomatik nükleik asit ekstraksiyonu (Manyetik boncuk bazlı yöntem)
    1. Önceden paketlenmiş 96 oyuklu plakayı, eklenmiş numunelerle birlikte otomatik nükleik asit ekstraksiyon cihazının ilgili yuvasına yerleştirin.
    2. Aşağıda açıklandığı gibi nükleik asit ekstraksiyon işlemini izleyin.
      1. Laboratuvar odasındaki mıknatıs çubuğunu kullanarak, nükleik asitle adsorbe edilen manyetik boncukları farklı reaktif deliklerine aktarın.
      2. Sıvıyı hızlı ve tekrar tekrar karıştırmak için karıştırma setini kullanın, böylece sıvı ve manyetik boncuklar eşit şekilde karışır.
      3. Sıvı ve manyetik boncuklar uyumlu bir şekilde birleştikçe, otomatik nükleik asit ekstraksiyon makinesi, hücre lizizi, nükleik asit adsorpsiyonu (70 °C, 15 dakika, 3 kez manyetik adsorpsiyon), yıkama (3 kez, her seferinde 2 dakika karıştırın, ardından iki kez manyetik adsorpsiyon gerçekleştirin (her biri 15 sn) ve elüsyon (2 kez, her seferinde 5 dakika karıştırın, 3 kez manyetik adsorpsiyon), sonunda yüksek saflıkta nükleik asit elde eder.
      4. Bir spektrofotometre kullanarak nükleik asit konsantrasyonunu ve saflığını doğrulayın. Nükleik asit numunesinin hacmi 50 μL idi, konsantrasyonu 50 ila 100 ng/μL arasında değişiyordu ve A260/A280 oranı 1.8 ± 0.2 idi.
    3. Program sona erdikten sonra, sonraki testler için Sütun 6 ve Sütun 12'den nükleik asit içeren elüsyon çözeltisini doğrudan emdirin. Gerekirse, ekstrakte edilen kalan nükleik asit numunelerini uzun süreli koruma ve ileride kullanmak üzere -20 derecede saklayın.

3. qPCR S. aureus nükleik asitlerinin ve MRSA nükleik asitlerinin tespiti

  1. Amplifikasyon reaktiflerinin hazırlanması
    1. Kitten nükleik asit amplifikasyon reaksiyon solüsyonunu ve nuc/mecA reaksiyon solüsyonunu çıkarın (S. aureus için nuc genine özgü primerler/prob ve MRSA için mecA). 22-25 °C'de çözüldükten sonra tamamen salınım yapın ve eşit şekilde karıştırın, ardından anında santrifüjleme yapın (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
    2. Test edilecek numune sayısına göre N, toplam N+2 miktarına göre reaktifler hazırlayın (N numune sayısı, 2 negatif ve pozitif kalite kontrolleridir). Belirli adımlar aşağıdaki gibidir:
      1. Reaksiyon sistemi karışımını hazırlayın (16 μL nükleik asit amplifikasyon reaksiyon çözeltisi (Tampon, dNTP'ler, DNA Polimeraz, UDG Enzimi) + 4 μL nuc/mecA reaksiyon çözeltisi (Hedef saptama genleri nuc, mecA ve GAPDH dahili referansı için primerler ve problar).
      2. Uygun boyutta bir santrifüj tüpüne ekleyin, tamamen salınım yapın ve eşit şekilde karıştırın ve anında santrifüjleme gerçekleştirin (~6000 g, 15 sn, 22 °C-25 °C). Daha sonra tüp başına 20 μL'yi PCR reaksiyon tüplerine dağıtın.
  2. Nükleik asit ve kalite kontrol numuneleri ekleyin:
    1. Yukarıda hazırlanmış PCR reaksiyon tüplerine (20 μL), sırasıyla, test edilen numunelerden, pozitif kontrolden ve negatif kontrolden 5 μL nükleik asit ekleyin ve tüp başına 25 μL'lik bir nihai hacim elde edin.
    2. Tüpleri sıkıca kapatın ve anında santrifüjleme yapın (~6000 × g, 15 sn, 22-25 °C) ve ardından tüpleri PCR cihazına yerleştirin.
  3. PCR amplifikasyonu:
    1. Döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın: Ön denatürasyon: 97 °C, 90 sn, 1 döngü; 42 döngü için aşağıdaki 2 adım: 2 saniye boyunca 97 °C denatürasyon ve 15 saniye boyunca 55 °C tavlama.
    2. Floresan sinyal algılama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: nuc genlerinin FAM floresan etiketlemesini kullanın; mecA genlerinin VIC floresan etiketlemesi; ve kitin dahili kontrolü olarak GAPDH geninin CY5 floresan etiketlemesi. 55 °C'de veri toplayın. Reaksiyonun tamamlanmasının ardından, verilerin gelecekteki analizler için kaydedildiğinden emin olun.
    3. qPCR'ye özel yazılım (SLAN 96P) kullanarak verileri analiz edin:
      1. Örnek bilgi: Yazılımın kuyu plakası yerleşim şemasında, numune yükleme konumlarına karşılık gelen numune türlerini (örn. pozitif kontrol, negatif kontrol, bilinmeyen numune, dahili referans geni vb.) etiketleyin.
      2. Reaksiyon tüplerinin yerleştirilmesi: Cihazın ısıtma modülünün kapağını açın, kapalı PCR plakasını/tüplerini sabit bir şekilde içeriye yerleştirin, ısıtma modülüne tam oturduklarından emin olun ve modül kapağını sıkıca kapatın (sıcaklık eşitsizliğini önlemek için)
      3. Reaksiyonun başlatılması: Yazılımdaki program ayarlarının doğru olduğunu onayladıktan sonra, Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın ve ileride başvurmak üzere deney kimliğini kaydedin.
      4. Çalıştırmanın durdurulması ve tüplerin çıkarılması: Programın çalışması bittikten sonra, ısıtma modülünün sıcaklığının 50 °C'nin altına düşmesini bekleyin, ardından PCR plakasını/tüplerini çıkarmak için kapağı açın ve numuneleri uygun şekilde kullanın.
  4. Veri analizi
    1. Veri analizinden önce üç görsel sonucu doğrulayın: 1) Tüm numunelerin amplifikasyon eğrileri (dahili kontrol dahil), düz veya anormal derecede gecikmeli yükselen eğriler olmaksızın tipik bir S şekli gösterir; 2) Floresan eşik çizgisi, eğrilerin üstel fazını geçer ve iç kontrolün (örneğin, GAPDH) Ct değerleri ≤ 38 döngü içindedir (varyasyon katsayısı %5<); 3) Kontaminasyon olasılığını izlemek için tüm deney boyunca negatif/pozitif kontroller dahil edilmiştir.
      1. Deney kontrolden çıkarsa, tüm partiyi yeniden kontrol edin. Bir numune anormal amplifikasyon gösteriyorsa (atipik bir S-eğrisi veya kritik aralıkta bir Ct değeri gibi), söz konusu numuneyi tekrar kontrol edin.
    2. Yazılımdaki deneysel verileri çağırın, eşiği ve taban çizgisini ayarlayın ve cihaz temel eşiği otomatik olarak seçtiği için Ct değerlerini otomatik veya manuel olarak hesaplayın. Son pozitif belirleme değerini Ct ≤ 36 olarak ayarlayın; dahili referans geni için referans aralığı Ct ≤ 38 gerektirir. Amplifikasyon eğrilerinin karakteristik S-şekilli profiller sergilediğini doğrulayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

qPCR kullanılarak S. aureus ve MRSA tespiti
Türe özgü nuc genine dayanarak S. aureus ve mecA MRSA'nın ilaç direnci geni, qPCR tespiti için farklı floroforlarla etiketlenmiş primerler ve problar tasarladık. qPCR deneyleri boyunca tüm kalite kontrol sonuçları sürekli olarak önerilen eşikler dahilinde kaldı ve tespit sonuçlarının güvenilirliğini doğruladı (Şekil 1).

Bu çalışmada, test kitinin d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metisilin direncinin doğru ve erken tespiti, S. aureus'un neden olduğu enfeksiyonların prognozu için kritik öneme sahiptir. S. aureus ve MRSA'nın erken teşhisi, geniş spektrumlu antibiyotiklerin yanlış kullanımını azaltabilir ve bakteriyel direncin ortaya çıkmasına ve yayılmasına yol açan seçici baskıyı azaltabilir.

Sefoksitin disk difüzyonu gibi geleneksel fenotipik tespit yöntemleri, 18-24 saatlik bir yetiştirme süresi gerektirir ve heterod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Guangdong Tıbbi Araştırma Vakfı (A2025034) tarafından finanse edildi. Bu çalışma Shanghai BioGerm Medical Technology Co., Ltd. tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlama kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Otomatik nükleik asit çıkarıcıDAANAkıllı 32DNA ekstraksiyonu için
BSC-1500IIA2-XBİYOBAZSEDA 20143222263Biyogüvenlik kabini
E-SantrifüjWEALTECKalan sıvıyı tüpün duvarından santrifüjleyin
Metisiline dirençli Staphylococcus aureus ilaç direnci gen tespit kitiBOJIEZC-HX-38-2 SerisiMetisiline dirençli Staphylococcus aureus direnç genlerinin tespiti
Nükleik asit ekstraksiyon kitiBOJIETQ-BG-001-96BNükleik asidi çıkarın
SLAN Tam otomatik tıbbi PCR analiz sistemiHONGSHIVeri Analizi
SLAN-96S Gerçek Zamanlı PCR makinesiHONGSHISLAN-96'LARFloresan kantitatif PCR amplifikasyonu
Termo Bilimsel NanoDamlaTermo BilimselNanoDrop BirDNA, RNA ve proteinlerin kantitatif analizi
Ultra düşük sıcaklıklı dondurucular (DW-YL450)MELINGSEDA 20172220091-20 &derece; Reaktifleri saklamak için C
Girdap-5Kylin çanıReaktifi karıştırmak için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gherardi, G. Staphylococcus aureus infection: pathogenesis and antimicrobial resistance. Int J Mol Sci. 24 (9), Int J Mol Sci(2023).
  2. Linz, M. S., Mattappallil, A., Finkel, D., Parker, D. Clinical impact of Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections. Antibiotics. 12 (3), 557(2023).
  3. Gao, Y., Chen, Y., Cao, Y., Mo, A., Peng, Q. Potentials of nanotechnology in treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur J Med Chem. 213, 113056(2021).
  4. Barber, M. Methicillin-resistant staphylococci. J Clin Pathol. 14 (4), 385-393 (1961).
  5. Arêde, P., Milheiriço, C., de Lencastre, H., Oliveira, D. C. The anti-repressor MecR2 promotes the proteolysis of the mecA repressor and enables optimal expression of β-lactam resistance in MRSA. PLoS Pathog. 8 (7), e1002816(2012).
  6. Ayliffe, G. A. The progressive intercontinental spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis. 24 (Suppl 1), S74-S79 (1997).
  7. Borg, M. A., Camilleri, L. What is driving the epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in Europe. Microb Drug Resist. 27 (7), 889-984 (2021).
  8. Wang, B., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in China: a multicentre longitudinal study and whole-genome sequencing. Emerg Microbes Infect. 11 (1), 532-542 (2022).
  9. Wang, X., et al. Phylogenetic analysis and virulence characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST45 in China: a hyper-virulent clone associated with bloodstream infections. mSystems. 8 (2), e0002923(2023).
  10. Tong, S. Y., et al. Genome sequencing defines phylogeny and spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a high transmission setting. Genome Res. 25 (1), 111-118 (2015).
  11. Sanchini, A. Recent developments in phenotypic and molecular diagnostic methods for antimicrobial resistance detection in Staphylococcus aureus: a narrative review. Diagnostics. 12 (1), 208(2022).
  12. Humphries, R. M., et al. The continued value of disk diffusion for assessing antimicrobial susceptibility in clinical laboratories: report from the Clinical and Laboratory Standards Institute Methods Development and Standardization Working Group. J Clin Microbiol. 56 (8), e00437-e00518 (2018).
  13. Schön, T., et al. Multicentre testing of the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination on Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 27 (2), 288.e1-288.e1 (2021).
  14. Pancholi, P., et al. Multicenter evaluation of the Accelerate PhenoTest BC kit for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing using morphokinetic cellular analysis. J Clin Microbiol. 56 (4), e01329-e01417 (2018).
  15. Martinsen, M. A., Jaramillo Cartagena, A., Bhattacharyya, R. P. Core antibiotic-induced transcriptional signatures reflect susceptibility to all members of an antibiotic class. Antimicrob Agents Chemother. 65 (6), e02296-e02320 (2021).
  16. Josten, M., et al. Identification of agr-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus harbouring the class A mec complex by MALDI-TOF mass spectrometry. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1018-1023 (2014).
  17. Nix, I. D., et al. Detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus from agar cultures and directly from positive blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry-based direct-on-target microdroplet growth assay. Front Microbiol. 11, 232(2020).
  18. Bortolaia, V., et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother. 75 (12), 3491-3500 (2020).
  19. Cunningham, S. A., Jeraldo, P. R., Schuetz, A. N., Heitman, A. A., Patel, R. Staphylococcus aureus whole genome sequence-based susceptibility and resistance prediction using a clinically amenable workflow. Diagn Microbiol Infect Dis. 97 (3), 115060(2020).
  20. Skov, R., et al. Phenotypic detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus by disk diffusion testing and Etest on Mueller-Hinton agar. J Clin Microbiol. 44 (12), 4395-4399 (2006).
  21. Bhowmik, D., Das, B. J., Pandey, P., Chetri, S., Chanda, D. D., Bhattacharjee, A. An array of multiplex PCR assays for detection of staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec) types among staphylococcal isolates. J Microbiol Methods. 166, 105733(2019).
  22. Pereira, E. M., et al. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus: methicillin-resistant isolates are detected directly in blood cultures by multiplex PCR. Microbiol Res. 165 (3), 243-249 (2010).
  23. Vandenbussche, F., Vandemeulebroucke, E., De Clercq, K. Simultaneous detection of bluetongue virus RNA, internal control GAPDH mRNA, and external control synthetic RNA by multiplex real-time PCR. Methods Mol Biol. 630, 97-108 (2010).
  24. Cui, C., Ba, X., Holmes, M. A. Prevalence and characterization of mecC MRSA in bovine bulk tank milk in Great Britain, 2017–18. JAC Antimicrob Resist. 3 (1), dlaa125(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Staphylococcus AureusMethicillin Resistant StaphylococcusMRSA DetectionMultiplex Real Time PCRFluorescent PCRBacterial Drug ResistanceRapid Pathogen DetectionmecA Genenuc GeneNosocomial Infections

Related Articles