Yöntem makalesi

Maya Hücrelerinde Stres Sonrası Sağkalımı Ölçmek için Akış Sitometrisi ile Birleştirilmiş Optimize Edilmiş Bir CANLI / ÖLÜ Testi

DOI:

10.3791/69005

⸱

29 Ağustos 2025

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, maya örneklerinde stres sonrası sağkalımı ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Test, plazma zarı bütünlüğünü ölçmek için SYTO 9 ve propidyum iyodür (PI) olmak üzere iki floresan boya kullanır. Oksidatif stres sonrası numuneler için canlı, ölü ve hasarlı hücre fraksiyonlarının kantitatif ve tekrarlanabilir tahminlerini sağlamak için akış sitometrisi kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayatta kalımı ölçmek, maya araştırmalarında yaygın ve kritik bir görevdir. Plazma membran bütünlüğüne dayalı CANLI/ÖLÜ boyalar, akış sitometrisi ile birleştiğinde mayanın hayatta kalması için hızlı ve yüksek verimli bir test sağlar. Bununla birlikte, boyama tamponu, boya konsantrasyonu, inkübasyon süresi ve akış sitometrisi ayarlarındaki farklılıklar veri kalitesini ve tekrarlanabilirliği etkileyebilir. Bu protokol, akış sitometrisi kullanılarak mayada stres sonrası sağkalım ölçümü için standartlaştırılmış bir CANLI/ÖLÜ testi sunar. Fırsatçı bir maya patojeni olan Candida glabrata'nın farklı dozlarda hidrojen peroksit ile muamele edilmesinden sonra, stres sonrası numuneler SYTO 9 ve propidyum iyodür (PI) içeren iki bileşenli CANLI/ÖLÜ bir boya ile boyandı. Canlı, hasarlı ve ölü hücre popülasyonlarını ayırt etmek ve her numunedeki yüzdelerini ölçmek için akış sitometrisi kullanıldı. Yüzde canlı istatistiğine dayalı sağkalım tahminleri, aynı numunedeki Koloni Oluşturma Birimi (CFU) sonucuyla karşılaştırıldı. İki yöntem, sahte ve öldürücü doz (1 M,H2O2) ile muamele edilen numuneler için tutarlı sonuçlar verdi. 100 mM H2O2'lik subletal dozda, SYTO 9 / PI, CFU'dan daha yüksek bir sağkalım oranı tahmin etti, bu da ikisi arasındaki önemli bir farkı yansıtıyor, burada sunulan protokol stresten hemen sonra hücre sağkalımını değerlendirirken, CFU iyileşebilen ve çoğalabilen hücrelerin yüzdesini ölçer. Bu nedenle, bu protokol hücre ölümü sürecinin daha erken bir aşamasında canlılığı ölçer. Özetle, burada açıklanan protokol, mayada stres sonrası sağkalım ölçümü için CFU'ya hızlı ve ölçeklenebilir bir alternatif sağlar. Sonuçları, sağkalımı daha erken bir aşamada değerlendirerek ve ölü ve hasarlı hücreler arasında ayrım yaparak CFU'ya tamamlayıcı bilgi sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomurcuklanan maya alt filumu birçok önemli biyolojik ve biyoteknolojik model içerir. Maya araştırmalarında yaygın ve kritik bir görev, stres veya ilaç tedavileri de dahil olmak üzere genetik veya çevresel bozulmaların etkisini ölçmektir. Örneğin endüstriyel fermantasyonda, üreticiler fermantasyon işleminin verimliliğini ve kalitesini sağlamak için maya kültürlerinin canlılığını izlemelidir 1,2. Patojenik maya türlerini incelerken, stres veya antifungal tedaviden sonra sağkalımlarını ölçmek, antifungal direnç gibi enfeksiyonla ilgili özelliklerin genetik ve mekanik temelini anlamak için kritik öneme sahiptir. Kateterlerde ve yüzeylerde sağkalımın ölçülmesi de klinik ortamlarda önemli bir görevdir3. Bu çeşitli senaryoların tümü, ilaç ve stres tedavilerinin sonucunu hızlı ve doğru bir şekilde ölçebilen nicel yaklaşımlar gerektirir.

Yukarıdaki hedefe ulaşmak için mevcut yöntemler, ölçtüklerine bağlı olarak üç ana kategoriye ayrılır. İlk kategori, klonojeniteyi veya tek tek maya hücrelerinin stresi takiben tek bir koloni oluşturma yeteneğini ölçer. Bu kategorideki temsili yöntem, Koloni Oluşturma Birimi (CFU) testidir. İkinci kategori, canlı hücrelerdeki enzimatik aktivitelerin tespit edilmesine dayanan canlılığı ölçer. Örnekler arasında FUN-1 boya4 gibi kimyasal problar bulunur. Üçüncü yöntem kategorisi plazma zarı bütünlüğünü ölçer - plazma zarı bütünlüğünün geri dönüşü olmayan bir kaybı, hücre ölümü için "geri dönüşü olmayan nokta" olarak kabul edilir5. Bu kategorinin örnekleri arasında propidyum iyodür (PI) gibi floresan boyalar bulunur.

Bu çalışma, stres tedavisinden sonra maya sağkalımının hızlı ve ölçeklenebilir bir şekilde ölçülmesini sağlamak için akış sitometrisi ile birleştirilmiş optimize edilmiş bir CANLI/ÖLÜ testi sunar. Bu membran geçirgenliğine dayalı test, CFU'dan daha hızlıdır ve kolonilerin oluşması için 24-48 saatlik inkübasyona kıyasla 15-30 dakikalık boyama gerektirir. Ayrıca, CANLI/ÖLÜ leke ile boyanmış numuneler, birkaç saniye içinde on binlerce hücreyi ölçen ve yüksek verimli tahliller için 96 oyuklu numuneleri kolayca işleyebilen mikroskopiye ek olarak akış sitometrisi kullanılarak kolayca test edilebilir. Sonuç olarak, bu test hızlı, nicel ve ölçeklenebilirdir. Bu protokolde, gelişmiş çözme gücü elde etmek için SYTO 9 ve PI'den oluşan iki bileşenli bir CANLI/ÖLÜ boyama kullanılır. SYTO 9, canlı veya ölü tüm hücreleri etiketlerken, PI yalnızca plazma zarları 6,7 olan hücrelere girer. Bu nedenle, canlı hücreler sadece SYTO 9 biriktirirken, ölü hücreler hem SYTO 9 hem de PI biriktirir. PI, nükleik asit için SYTO 9'dan daha yüksek bir afiniteye sahip olduğundan, nükleik asit için ikincisini hücre8'de rekabetçi bir şekilde dışlar. Ayrıca, iki boya, SYTO 9 emisyonunun uyarılması olarak PI tarafından emildiği bir Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) çifti oluşturur. Sonuç olarak, ölü hücreler sessiz yeşil ve güçlü kırmızı floresan sergiler. Buna karşılık, canlı hücreler parlak yeşil floresan8 gösterir. Bu fark, her gruptaki floresan yoğunluğundaki değişikliklerin varlığında canlı ve ölü hücreler arasında daha iyi ayrım yapılmasını sağlar.

2004 yılında mayadaki uygulamasının ilk raporundan bu yana, maya çalışmalarında SYTO 9 / PI'nin kullanımı sivilceli olmuştur ve büyük ölçüde mikroskopi 7,9,10,11,12,13,14,15 kullanılarak yapılan kalitatif değerlendirmelerle sınırlıdır. Maya sağkalımı için kantitatif bir test olarak benimsenmesinin önündeki önemli bir sınırlama, sistematik karakterizasyon ve CFU gibi yaygın olarak kullanılan yöntemlerle karşılaştırma eksikliğidir. Bu protokol, C. glabrata ve diğer iki maya türüne uygulandığında artefaktları en aza indirdiği ve tekrarlanabilir sonuçlar ürettiği bulunan boyama tamponu, boya konsantrasyonu, boyama süresi ve akış sitometrisi ayarlarını içeren standart bir testi tanımlar16. SYTO 9 / PI boyama, boyama modellerinde hem canlı hem de ölü hücrelerden farklı olan bir ara "hasarlı" hücre popülasyonunu ortaya çıkardığından, stres tedavisinin maya hücreleri üzerindeki etkileri hakkında daha ayrıntılı bilgiler ortaya çıkararak CFU'yu tamamlayabilir ve potansiyel olarak yeni uygulamaları mümkün kılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hidrojen peroksit stresinin uygulanması

  1. Deneyden en az bir gün önce, taze çizgili bir plaka üzerindeki tek bir koloniden bir gece boyunca C. glabrata kültürünü 3 mL Sentetik Komple (SC) ortama (1.7 g / L Maya Azot Bazı, tam amino asit karışımı,% 2 w / v glikoz, su) innoküle edin ve cam tüpü bir silindir tamburuna yerleştirerek kültürleyin ve 30 ° C'de büyütün. Alternatif olarak, cam tüpü eğimli bir açıyla yerleştirerek ve kültürü 200 rpm'de sallayarak bir orbital çalkalayıcı kullanılabilir.
    1. Ertesi sabah gece boyunca kültürün optik yoğunluğunu (OD600) ölçün ve toplam 10 mL hacimde taze SC ortamı ile OD600 ~ 0.2'ye seyreltin. Orta kütük (OD600 ~ 1) fazına ulaşmak için yaklaşık 4 saat süren iki katına çıkmasına izin verin.
      ÖRNEK: Bir gecelik kültürün OD600 = 10'u varsa, bu kültürün 200 μL'sini 9.8 mL SC ortamına ekleyin.
  2. Stres tedavisinden 30 dakika önce hidrojen peroksit stres ortamını hazırlayın. %30 stoktan (9.798 M) hidrojen peroksiti istenen konsantrasyona kadar Sentetik Komple (SC) ortama seri olarak seyreltin. Sahte bir tedavi (hidrojen peroksit eklenmemiş SC) ve öldürücü bir doz ( C. glabrata için 1 M uygundur) ekleyin.
    ÖRNEK: 100 mM'lik bir hidrojen peroksit stres ortamı yapmak için, 10.3 μL'lik 9.798 M hidrojen peroksit stokunu 1 mL SC'ye ekleyin. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin. 10 mM'lik bir hidrojen peroksit stres ortamı yapmak için, 100 mM hidrojen peroksit stres ortamının 500 μL'sini 4.5 mL SC'ye seyreltin.
  3. Mid-log kültürünün OD600'ünü ölçün ve SC ortamı ekleyerek OD600 = 1 olarak standartlaştırın.
    ÖRNEK: Mid-log kültürü OD600 = 1.2'dir. 1 mL kültür başına 0.2 mL SC ortamı ekleyin.
  4. Test koşulu başına 600 μL orta log kültürünü 96 derin kuyulu bir plakaya aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile pelet hücreleri. Hücre peletini bozmadan süpernatanı aspirasyon yoluyla dikkatlice çıkarın.
  5. Her bir kuyucuğa adım 1.2'de hazırlanan 600 μL sahte veya hidrojen peroksit stres ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin.
  6. Plakayı 300 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de 120 dakika inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süresi, ilgilenilen biyolojik soruya bağlıdır.

2. SYTO 9/PI boyasının uygulanması

  1. Deneyden önce en az 10 mL steril% 0.85 tuzlu su tamponu hazırlayın.
    NOT: Deiyonize su veya büyüme ortamı 16 ile karşılaştırıldığında, sahte muamele edilmiş numunelerde minimum boyama artefaktları, yani lekelenmemiş ve ölü benzeri hücreler üretmek için%0.85 salin tamponu bulduk.
  2. Steril, deiyonize su kullanarak 0.2 mM'de bir PI çalışma stoğu çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Bu çalışma PI stoğu, 4 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  3. Deneyden hemen önce, steril, deiyonize su ile 33.4 μM'de çalışan bir SYTO 9 stok çözeltisi hazırlayın.
    NOT: SYTO 9 çalışma stoğunu her deney için taze olarak hazırlayın. Saklamayın ve tekrar kullanmayın.
  4. Tedavi plakasından her bir oyuktaki hücreleri karıştırmak için hafifçe pipetleyin. Her tedavi koşulunun OD600'ünü ölçün ve hücreleri 1'in OD600'üne yeniden süspanse etmek için gereken tampon miktarını hesaplayın.
    NOT: Verimli ve homojen karıştırma için çok kanallı pipetler kullanılabilir. Numuneleri aşırı karıştırmaktan kaçının.
  5. Sahte veya stres işleminden sonra maya hücrelerini 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanı aspirasyon yoluyla dikkatlice çıkarın. Steril% 0.85 tuzlu su tamponundaki hücreleri OD600 = 1'e yeniden süspanse edin (adım 2.4'te hesaplanmıştır).
    NOT: Hücreleri yeniden süspanse etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Tedavi sonrası tüm kültürleri dikkatli bir şekilde kullanın ve aşırı karıştırmaktan kaçının.
  6. Lekesiz ve tek boya boyama kontrolleri olarak hizmet etmek için her numuneden 50 μL ayırın.
    NOT: SYTO 9 ve PI için her iki kanalda vahşi tip C. glabrata için minimal otofloresan bulundu. Bununla birlikte, her zaman boyanmamış numuneleri otofloresan açısından kontrol edin ve uygun arka plan çıkarma işlemini gerçekleştirin veya düşük otofloresan büyüme ortamı kullanın.
  7. Aliquot 16 μL tedavi sonrası numune,% 0.85 salin tamponunda 50 μL'lik bir PCR tüpüne yeniden süspanse edildi. Hücre süspansiyonuna 0.2 mM çalışma stoğunun 2 μL'sini ekleyin. Daha sonra, SYTO 9'un 33.4 μM çalışma stoğunun 2 μL'sini aynı tüpe 20 μL'lik bir nihai hacme ekleyin.
    1. PI ve SYTO 9'un nihai konsantrasyonları sırasıyla 20 μM ve 3.34 μM olacaktır. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta (kara kutu kullanılabilir) 30 dakika inkübe edin.

3. Akış sitometresinin kurulması ve kalibre edilmesi

NOT: Bu, her yeni cihazda ve ayrıca farklı bir tür/suş, yeni stres etkeni veya büyüme protokolü vb. dahil olmak üzere SYTO 9/PI boyamanın yeni uygulamalarında yapılmalıdır. Aşağıdaki ayarlar bir Attune NxT akış sitometresi üzerinde geliştirilmiştir. Özel talimatlar için kullanılan cihazın kullanım kılavuzuna bakın.

  1. Akış sitometresi için uygun floresan kanallarını/filtrelerini seçin: yeşil (SYTO 9) ve kırmızı (PI ve SYTO 9) kanallardaki sinyalleri toplamak için 530 nm ± 30 nm bant geçiren filtre (BL1) ve 600 nm uzun geçiren filtre (> 600 nm, BL3) kullanıldı. Her ikisi de 488 nm mavi lazerle heyecanlandı.
  2. Akış hızını 200 μL/dk'ya ayarlayın ve en az 30.000 olay toplandığında durdurun.
    NOT: Örnek başına olay sayısı, yüzdelerin sağlam tahminleri elde etmek amacıyla ayarlanabilir. Çok az olay (hücre) içeren örnekler hariç tutulmalıdır. Bir sonraki adım, ilk kurulum sırasında FSC ve SSC kanallarındaki voltajları ayarlamaktır.
  3. 16 μL'lik sahte işlem görmüş, boyanmamış numuneyi 200 μL steril% 0.85 tuzlu su tamponuna seyreltin. Akış sitometrisinden hemen önce karıştırmak için nazikçe pipetleyin. Bu örneği çalıştırın ve FSC ve SSC kanallarının voltajlarını, popülasyon FSC'nin merkezinde olacak şekilde ayarlayın. SSC yoğunluk grafiği.
    NOT: FSC ve SSC için sırasıyla 345 mV ve 399 mV'luk bir voltaj kullanılmıştır. Sonraki adımlar, ilk kurulum sırasında toplama (BL1 ve BL3) kanallarındaki voltajları ayarlamaktır.
  4. 24 μL'lik sahte işlem görmüş numuneyi 24 μL 1000 mM hidrojen peroksit ile muamele edilmiş veya ısıyla öldürülmüş numune ile karıştırın.
  5. Karışık canlı ve ölü hücre örneğini her biri 16 μL'lik üç tüpe bölün. Üç tüpü (1) 2 μL SYTO 9 ve 2 μL su ile 30 dakika boyayın; (2) 30 dakika boyunca 2 μL PI ve 2 μL su; (3) 30 dakika boyunca 2 μL SYTO 9 ve 2 μL PI. Önceki bölümdeki boyama protokolünü izleyin.
    1. İnkübasyondan sonra, her tüpe 200 μL steril% 0.85 salin tamponu ekleyin. Artık akış sitometrisi için hazırlar.
  6. Yeşil floresan (BL1) kanalının voltajını ayarlamak için tüpü (1) çalıştırın; daha sonra kırmızı floresan (BL2) voltajını ayarlamak için tüpü (3) çalıştırın. Amaç, cihazın tam dinamik aralığını kullanmak için her kanalın yoğunluk dağılımı modunun ~ 104-10 5 olmasını sağlamaktır.
    NOT: Voltajları ayarlarken lütfen özel akış sitometrenizin talimatlarını izleyin. Bazı akış sitometrelerinin sabit voltajları vardır ve bu adım atlanır.
  7. Canlı ve ölü hücre popülasyonlarının iyi ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için tüpü (3) çalıştırın. Gerekirse BL1 veya BL3 kanal voltajlarını ayarlayın.
    NOT: Attune NxT'deki hem BL200 hem de BL1 kanalları için 3 mV'luk bir voltaj kullanılmıştır.
  8. Numunenin ilgilenilen kanallarda minimum otofloresansa sahip olduğundan emin olmak için sahte işlem görmüş, boyanmamış numuneyi belirlenen voltaj ayarları altında çalıştırın (<102).

4. Numunelerin akış sitometresinde çalıştırılması

  1. Yukarıda belirtilen akış sitometresi ayarlarını uygulayın ve hem BL1 hem de BL3 kanallarında otofloresan sinyallerinin 102'nin altında olduğundan emin olmak için önce boyanmamış numuneyi çalıştırın.
  2. Her lekeli numuneye 200 μL %0.85 salin tamponu ekleyin ve akış sitometresinde çalıştırın.
    NOT: Birden fazla numune test edilirse, boyama adımını, akış sitometresinde çalıştırılmadan önce her numune 30 dakika boyunca boyanacak şekilde kademelendirin.
  3. Akış sitometrisi çıktısını .fcs dosyaları (FCS 3.0 veya 3.1 standardı) olarak dışa aktarın.

5. R'de veri analizi

NOT: Örnek bir analiz komut dosyası Ek Dosya 1 olarak sağlanmıştır. Örnek geçit stratejileri Temsilci Sonuçları bölümünde verilmiştir.

  1. Gerekli paketleri kurun ve yükleyin: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. .fcs dosyalarını geçerli R ortamına aktarın.
  3. Dosya adlarını ayarlayın ve tedavi koşullarını belirtin.
  4. FSC'deki tüm olaylar için bir 2B yoğunluk grafiği oluşturun. SSC.H'ye karşı H. Hücre dışı olayları dışlamak için bir çokgen kapısı kullanın. Bu kapıyı "hücreler" olarak adlandırın.
    NOT: Bazı akış sitometrelerinde, Alan parametresi Yükseklik yerine önerilir. Cihaza özel önerileri kontrol edin.
  5. "Hücreler" kapılı popülasyon için, FSC'de bir 2B yoğunluk grafiği yapın. Tipik olarak, benzer FSC aralıklarına sahip iki küme görülebilir. H ama farklı FSC.W. Daha düşük ortalama FSC'ye sahip küme. W seviyesi tek hücreleri ("singlet") içerir. Seçmek için bir çokgen kapısı çizin ve kapıyı "singlets" olarak adlandırın.
  6. "Singlets" kapılı popülasyon için, BL1'de bir 2B yoğunluk grafiği yapın. BL3.H'ye karşı H. Canlı ve ölü hücre kontrollerine dayalı olarak canlı, hasarlı ve ölü popülasyonlar için çokgen kapılar çizin. Temsili Sonuçlar bölümünde bir örnek verilmiştir.
  7. Her popülasyonun yüzdelerini kullanarak hayatta kalmayı belirleyin ve istatistikleri dışa aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SYTO 9/PI boyası, yeşil (500 nm-560 nm) ve kırmızı (>600 nm) kanallardaki floresan sinyallerine dayanarak canlı maya hücrelerini ölü hücrelerden ayırır. Sadece SYTO 9 biriktiren canlı hücreler, minimum kırmızı sinyalle yeşil kanalda güçlü bir şekilde floresan floresan yayılır. Ölü hücreler hem SYTO 9 hem de PI'yi biriktirir ve SYTO 9'un PI ve FRET tarafından rekabetçi bir şekilde dışlanması nedeniyle canlı hücrelere kıyasla daha düşük yeşil floresan sinya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, SYTO 9 ve PI olmak üzere iki floresan boya kullanan ve mayada stres sonrası sağkalımı ölçmek için akış sitometrisi kullanan bir CANLI/ÖLÜ testini tanımlar. Bu iki boya, literatürde çeşitli maya türlerinde sağkalımı değerlendirmek için uygulanmış ve ticari bir kit olarak mevcut olsa da, ne üretici el kitabı ne de literatür, boyama protokolü veya akış sitometrisi ayarları hakkında yeterli ayrıntı sağlamamaktadır7. Burada, optimal bir boyama tamponu, boy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Michael Dailey'e ve Carver Görüntüleme Merkezi'ne mikroskopi konusundaki eğitimleri ve destekleri için teşekkür ederiz. Protokol hakkında paha biçilmez geri bildirimler için Gen Düzenleme Laboratuvarı'nın geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96-Well Derin Kuyu PlakasıThermo Fisher278606NUNC 96
Plaka okuyuculu Attune NxT akış sitometresiThermo Fisher A24858A24858Autosampler (A42901)
Candida glabrataCG99, klinik izolattan türetilen laboratuvar suşu (Cormack & Cormack & Falkow, 1999)
FungaLight Maya CANLI/ÖLÜ KitiThermo Fisher A24858L34952SYTO 9 (3,34 mM) ve Propidium iyodid (20 mM) içerir. Bu iki bileşen ayrıca farklı satıcılardan ayrı olarak da satın alınabilir.
Hidrojen PeroksitSigma AldrichH1009
Leica Konfokal SP8 MikroskobuLeicaTCS SP8 X
Sodyum KlorürSigma AldrichS9888Sterilize edilmiş %0,85 NaCl çözeltisi yapmak için kullanılır
Amino asitler içermeyen maya azot bazıSigma AldrichY0626%2 glikoz ve amino asit karışımıyla Sentetik Tam ortam yapmak için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yeast SurvivalPlasma Membrane IntegrityCandida GlabrataHydrogen Peroxide StressSYTO 9 StainingPropidium IodideColony Forming Unit

İlgili makaleler