Mycobacteria'dan Optimize Edilmiş Sıcak Fenol Temelli RNA Ekstraksiyonu: Güvenilir Gen Ekspresyon Analizi İçin Sağlam Bir Yaklaşım

Özet

Bu çalışma, Mycobacterium için yüksek kaliteli ve transkriptomik analizlere uygun RNA sağlayan Sıcak Fenol tabanlı bir RNA ekstraksiyon yöntemini optimize etmektedir. Aynı koşullar altında TRIzol ve RNeasy ile kıyaslandığında, bu yöntem daha yüksek verim, benzer bütünlük ve gelişmiş maliyet etkinliği sağlamış olup geniş ölçekli gen ekspresyon çalışmaları için pratik bir alternatif sunmaktadır.

Özet

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), biyolojisini ve ilaç direnç mekanizmalarını anlamak için güvenilir transkriptomik çalışmalara olan ihtiyacı vurgulayarak küresel bir sağlık tehdidi olmaya devam etmektedir. Bu tür analizler, yüksek kaliteli ve yüksek verimli RNA elde edilmesine bağlıdır. Çeşitli RNA ekstraksiyon yöntemleri mevcut olsa da, birçoğu pahalı reaktifler, geniş kültür hacimleri veya özel ekipmanlar gerektirmekte; bu da özellikle kaynakların kısıtlı olduğu ortamlarda, geniş ölçekli çalışmalar için uygunluklarını sınırlamaktadır. Burada, mikobakteriler için özel olarak optimize edilmiş Sıcak Fenol tabanlı bir RNA ekstraksiyon yöntemi sunulmaktadır. Yöntem, yüksek throughput transkriptomik uygulamalar için uygun, yüksek kaliteli RNA'yı tutarlı bir şekilde elde etmek amacıyla minimum kültür hacmi ve yaygın olarak bulunan reaktifler kullanır. RNA miktarı ve bütünlüğü, jel elektroforezi ve RNA bütünlük analizi (RIN) ile değerlendirilmiş; aşağı akış uygulamaları için uygunluğu ise qPCR ve Qubit 4 ile doğrulanmıştır. Optimize edilen yöntemin performansını kıyaslamak için; aynı Mycobacterium türleri, kültür hacmi, büyüme evresi (logaritmik ve stasyoner) ve lizis koşulları dahil olmak üzere özdeş deneysel koşullar altında TRIzol ve RNeasy kullanılarak paralel bir RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir. Bu durum; verim, kalite, fizibilite ve maliyetin doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlamıştır. Optimize edilmiş Sıcak Fenol yöntemi, reaktif maliyetini ve özel ekipmana olan bağımlılığı önemli ölçüde azaltırken, benzer veya daha iyi RNA verimi ve kalitesi göstermiştir. Verimliliği, tekrarlanabilirliği ve uygun maliyeti sayesinde bu protokol, Mtb ve diğer mikobakteri türlerinde geniş ölçekli gen ekspresyonu ve transkriptomik çalışmaları için pratik bir alternatif sunmaktadır.

Giriş

M. tuberculosis (Mtb), tüberküloza (TB) neden olan ajan, HIV/AIDS'i geride bırakarak tek bir enfeksiyöz patojenden kaynaklanan ölümlerin başlıca nedeni olmaya devam etmektedir. 2024 yılında, dünya genelindeki ölümlerin yaklaşık 1,3 milyonu TB kaynaklıdır¹. Bu yük, çok ilaç dirençli (MDR) ve yaygın ilaç dirençli (XDR) suşların artan prevalansı ile daha da ağırlaşmaktadır. Bu nedenle, TB patogenezinin moleküler temelini anlamak ve yeni terapötik hedefler belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır².

Mtb'nin transkripsiyonel profillemesi; konak-patojen etkileşimlerinde³, çevresel strese adaptasyonda⁴ ve ilaç direncinin temelindeki mekanizmaları⁵ açıklığa kavuşturmak için önemli bir araç haline gelmiştir. Real-time PCR, mikro diziler ve RNA sekanslama (RNA-seq) gibi gelişmiş metodolojiler, mikobakteriyel transkriptomu analiz etme yeteneğini önemli ölçüde artırmıştır⁶. Ancak bu yöntemlerin başarısı, büyük ölçüde yüksek kaliteli RNA'nın mevcudiyetine bağlıdır ve bu da ekstraksiyon sırasında verimli hücre lizisine dayanır. Mtb'nin karmaşık mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan hücre duvarı, RNA ekstraksiyonunu özellikle zorlaştırmaktadır⁷. Enzimatik hidroliz⁸, sonikasyon⁹ ve boncukla parçalama (bead-beating)¹⁰ dahil mevcut lizis teknikleri, genellikle maliyetli ekipmanlar ve büyük kültür hacimleri gerektirmekte, bu da birçok BSL-3 laboratuvarındaki pratikliklerini sınırlamaktadır. Ayrıca, Mtb'nin yavaş büyüme hızı, yeterli biyokütle elde etmek için uzun kültür sürelerini zorunlu kılmaktadır¹¹.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için hızlı ve ekonomik, optimize edilmiş Sıcak Fenol bazlı bir RNA ekstraksiyon yöntemi geliştirilmiştir. Yalnızca 3 mL mid-log fazı kültürü kullanılarak uygulanan bu yöntem, alt akış transkriptomik analizleri için uygun, 45–60 µg yüksek kaliteli RNA sağlar. Hücre lizis işlemi, kompakt bir el tipi doku öğütücü ve kolayca temin edilebilen reaktifler kullanılarak gerçekleştirilmekte, böylece pahalı cihazlara olan ihtiyaç ortadan kaldırılmaktadır. Sıcak Fenol yöntemi daha önce bildirilmiş olsa da^11,12, optimize edilmiş Sıcak Fenol yöntemi kullanım kolaylığını, maliyet etkinliğini ve RNA verimini artırmaktadır. Optimizasyon M. smegmatis mc²155 (Msmeg) kullanılarak gerçekleştirilmiş ve Mtb H37Rv ile başarıyla valide edilmiştir.

Protokol

Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mycobacterium Kültürleme

1. Msmeg veya Mtb gliserol stokundan 1 mL'yi; %0,2 gliserol, %0,05 Tween 80 ve %10 ADC ile takviye edilmiş 10 mL Middlebrook 7H9 besiyerine inoküle edin ve OD değeri 1–1.5'e ulaşana kadar 37 °C'de 150 rpm hızda çalkalayarak inkübe edin.
2. Birincil kültürden %1 oranında ekleme yaparak 10 mL 7H9 besiyerinde, mid-log fazına (OD_600nm = 0,6–0,7) ulaşana kadar sekonder kültürü büyütün.
3. Kültürleri 3 mL'lik alikotlara ayırın ve oda sıcaklığında (23–25 °C) 5 dakika boyunca 2000 x g hızında santrifüjleyin.
4. Peletleri RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın.
   UYARI: Mtb kültürleri için uygun BSL3 kılavuzlarını izleyin ve peleti 95 ˚C'de 20–25 dakika boyunca ısı ile inaktive edin.
   NOT: Şekil 1, Sıcak Fenol yöntemi ile RNA ekstraksiyonu sırasında izlenen temel adımların akış şemasını göstermektedir.

Şekil 1: Sıcak-Fenol yönteminin ve analizinin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. RNA ekstraksiyonu

1. Sıcak Fenol yöntemi (HP yöntemi)
   1. Hücre peletine 200 µL TES tamponu (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; %1 β-mercaptoethanol) ekleyin ve peleti vorteksleyerek yeniden süspande edin.
   2. Numuneye yaklaşık 0.1 g 0.1 mm silika boncuk ekleyin. Pelet buz üzerinde tamamen çözülene kadar 10–15 sn boyunca el tipi doku parçalayıcı kullanın. Bu adımı 2 döngü daha tekrarlayın ve her tekrardan sonra sıvı azotta şok dondurma işlemi uygulayın.
   3. VEYA oda sıcaklığında, 5 (5.0 m/s) hız ayarında 1 dk boyunca yüksek hızlı masaüstü boncuk parçalayıcı kullanın. Bu adımı 3 döngü boyunca tekrarlayın ve her döngüden sonra ısınmayı önlemek için numuneyi buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: Mtb hücre lizisini, el tipi doku parçalayıcı veya boncuk parçalayıcı ile 6–8 döngü boyunca (her döngü 1 dk) tekrarlayın ve her döngüden sonra aralıklarla buz üzerinde soğutun. RNA ekstraksiyonu için gerekli tüm tamponların ve reaktiflerin hazırlanmasında DEPC (Dietilpirokarbonat) işlem görmüş su kullanın.
   4. Hacmi 400 µL'ye tamamlamak için her numuneye ek olarak 200 µL TES tamponu (65 °C'ye ön ısıtılmış) ekleyin. Her numuneye 200 µL asidik fenol (100 mM sitrat tamponu ile dengelenmiş fenol, pH 4.5) ve 200 µL kloroform ekleyin (asidik fenol ve kloroformu numuneye eklemeden önce eşit oranda karıştırın).
   5. Numuneyi bir ısıtıcı blok üzerinde 65 °C'de, 900 rpm çalkalamayla 30 dk boyunca inkübe edin ve oda sıcaklığında 12000 x g hızda 15 dk santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra uygun bir faz ayrışması olduğundan emin olun (RNA içeren berrak bir üst sulu faz, belirgin bir DNA ara fazı ve proteinler ile lipidleri içeren alt bir organik faz gözlemlenecektir).
   6. Üstteki sulu faz tabakasını alın ve yeni bir 1.5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tekrar olarak eşit hacimde asidik fenol: kloroform ekleyin. Oda sıcaklığında 12,000 x g hızda 15 dk santrifüjleyin. Uygun bir faz ayrışması olduğundan emin olun.
   7. Üstteki sulu tabakayı taze bir 1.5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın, ardından 30 µL 3 M sodyum asetat tamponu (pH 5.3) ve 240 µL soğutulmuş izopropanol ekleyin. −80 °C'de 30 dk ile 1 sa arası inkübe edin.
      NOT: Mikro santrifüj tüpü bu adımda -80 °C'de gece boyunca saklanabilir. İnkübasyon sırasında 65 °C'de açılmasını önlemek için mikro santrifüj tüpünü birden fazla parafilm tabakasıyla mühürleyin.
      DİKKAT: Fenol ve kloroform tehlikeli kimyasallardır; bu nedenle, uygun kişisel koruyucu donanım (KKD), çeker ocak gibi mühendislik kontrolleri ve özel atık bertaraf prosedürleri uygulanmalıdır.
   8. Oda sıcaklığında 12,000 x g hızda 1 sa santrifüjleyin. Pelet oluşumunu doğrulayın ve peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın.
   9. Peleti 1 mL %75 etanol içinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında 12,000 x g hızda 1 dk santrifüjleyin. Bu işlemi iki kez gerçekleştirin ve peleti havada kurutun.
   10. Peleti 50 µL nükleazden arındırılmış su içinde yeniden süspande edin.
       ​NOT: RNA'yı çözmek için, RNazden arındırılmış su içinde oda sıcaklığında 10–30 dk inkübe edin.
2. TRIzol yöntemi
   1. Hücre peletine 200 µL TRIzol reaktifi ekleyin.
      DİKKAT: TRIzol tehlikeli bir kimyasaldır; bu nedenle, uygun kişisel koruyucu donanım (KKD), çeker ocak gibi mühendislik kontrolleri ve özel atık bertaraf prosedürleri uygulanmalıdır.
   2. 2.1.2 - 2.1.3 adımlarında olduğu gibi hücre liziz yöntemini uygulayın.
   3. Ek olarak 200 µL TRIzol reaktifi, ardından 200 µL kloroform ekleyin ve 1 dk boyunca vorteksleyin. 4 °C'de 13,400 x g hızda 15 dk santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra uygun faz ayrışması olduğundan emin olun.
   4. Sulu fazı dikkatlice yeni bir 1.5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın.
   5. Sulu faza 500 µL izopropanol ekleyip −80 °C'de 30 dk ile 1 sa arası inkübe ederek RNA'yı çöktürün.
   6. 4 °C'de 15,000 x g hızda 20 dk santrifüjle RNA'yı peletleyin. Peleti dikkatlice gözlemleyin ve peleti bozmadan süpernatantı uzaklaştırın.
   7. Peleti 1 mL %75 etanol ile yeniden süspande edin ve 4 °C'de 13,400 x g hızda 1 dk santrifüjleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın, peleti oda sıcaklığında 30 dk havada kurutun ve 50 µL nükleazden arındırılmış su içinde yeniden süspande edin.
3. Ticari olarak mevcut RNA ekstraksiyon kiti yöntemi
   1. Hücre peletini 200 µL Resuspension tamponu (kit ile sağlanmıştır) içinde yeniden süspande edin.
   2. 2.1.2 - 2.1.3 adımlarında olduğu gibi hücre liziz yöntemini uygulayın.
   3. Sonraki deneyleri üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.

3. DNase işlemi, kantifikasyon ve görselleştirme

1. Genomik DNA kontaminasyonunu gidermek için, her bir RNA örneğine 1 µL DNase I (10units) ve 5 µL RDD tamponu (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
2. RNA örneğini Nanodrop kullanarak spektrofotometrik olarak, RNA bütünlüğünü ise Qubit4 kullanarak nicel olarak belirleyin. Kabul edilebilir RIN değeri 7,5 - 10 arasındadır. Kabul edilebilir A₂₆₀/A₂₈₀ ve A₂₆₀/A₂₃₀ değerleri sırasıyla 1,8–2,0 ve 2,0–2,2 aralığındadır.
3. 1X RNA yükleme boyası kullanarak RNA'yı %1'lik agaroz jelde görselleştirin.

4. cDNA sentezi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR

1. cDNA Ters Transkripsiyon kiti ve 1 µg RNA kullanarak, üretici talimatlarına uygun olarak bir termal döngüleyici cihazda cDNA hazırlama için 20 µL'lik bir reaksiyon kurun.
2. Üretici talimatlarına göre 50 ng cDNA, her bir primerden 0.4 µM ve SYBR kullanarak 10 µL'lik bir real-time PCR reaksiyonu kurun. Örnekleri Real-Time PCR termal döngüleyicide çalıştırın.
   NOT: qPCR analizi için aşağıdaki primerler kullanılmıştır:
   Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
   Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
   Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
   Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
   Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
   Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. İstatistiksel analiz

1. Tüm biyolojik tekrarlar kullanılarak Graph Pad Prism ile Student t-testi uygulandı, P ≤ 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Hata çubukları, en az üç biyolojik tekrardan elde edilen standart hatayı temsil etmektedir.

Sonuçlar

RNA kalitesi ve verimi

RNA kalitesi ve miktarı agaroz jel elektroforezi ile değerlendirilmiştir (Şekil 2). Tüm ekstraksiyon yöntemleri için 23S ve 16S rRNA'ya karşılık gelen belirgin, keskin bantlar gözlemlenmiş ve böylece toplam RNA'nın başarılı bir şekilde izole edildiği doğrulanmıştır. Sıcak Fenol ve TRIzol yöntemleri; 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) ve 5S rRNA'yı (~120 bp) temsil eden üç net bant göstermiş, bu da sağlam ve yüks...

Tartışma

Mycobacterium için basit ve dayanıklı bir RNA ekstraksiyon yöntemi geliştirmek amacıyla Hot Phenol yöntemi optimize edilmiştir. Ardından, ekstrakte edilen RNA, yaygın olarak kullanılan iki yaklaşım olan TRIzol ve kolon tabanlı kit yöntemi ile karşılaştırılmıştır^12,13. Bu teknikler, alt moleküler uygulamalar için pratikliklerini değerlendirmek amacıyla RNA verimi, saflığı, bütünlüğü, maliyeti ve işlem süresi açısından karşılaştırılmıştır. Kit tabanlı yönt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,1 mm silika boncuklar	MP Biomedicals	MP116911050
2-propanol	Sigma	278475
Bead Ruptor 4	Revvity
Kloroform	Sigma	288306
Soğutmalı santrifüj	ThermoScientific	42541217
DNaz I	qiagen	79254
EDTA	sigma	E02SS
HCl	SRL	62889
Isıtma bloğu	MIULAB	MU-E02-1049
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon kiti	Thermo Fisher Scientific	4368814
Motorlu doku öğütücü G10	Korona	G22616008
NaCl	sigma	S5886
Nanophotometer N50	UYGULAMA	T51601
0,1 M sitrat tamponu (pH 4,5) ile dengelenmiş fenol	Sigma	P4682
PowerUP SYBR	Applied Biosystems	A25742
Qubit 4 florometresi	Invitrogen	2,32262E+12
Gerçek Zamanlı PCR Termal Döngüleyici	Analytik Jena AG	844-00503-2
RNA easy Kit	Qiagen	74104
SDS	Sigma	S9888
Sodyum asetat	Sigma	S2889
termal döngüleyici	Biorad	621BR29739
TRI Reagent	Sigma	T9424
Tris bazı	Himedia	MB029
β-merkaptoetanol	Sigma	516732