Yöntem makalesi

Mycobacteria'dan Optimize Edilmiş Sıcak Fenol Temelli RNA Ekstraksiyonu: Güvenilir Gen Ekspresyon Analizi İçin Sağlam Bir Yaklaşım

176 görüntülenme

⸱

11 Eylül 2026

 ,  ,  , 
1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Mycobacterium için yüksek kaliteli ve transkriptomik analizlere uygun RNA sağlayan Sıcak Fenol tabanlı bir RNA ekstraksiyon yöntemini optimize etmektedir. Aynı koşullar altında TRIzol ve RNeasy ile kıyaslandığında, bu yöntem daha yüksek verim, benzer bütünlük ve gelişmiş maliyet etkinliği sağlamış olup geniş ölçekli gen ekspresyon çalışmaları için pratik bir alternatif sunmaktadır.

Özet

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), biyolojisini ve ilaç direnç mekanizmalarını anlamak için güvenilir transkriptomik çalışmalara olan ihtiyacı vurgulayarak küresel bir sağlık tehdidi olmaya devam etmektedir. Bu tür analizler, yüksek kaliteli ve yüksek verimli RNA elde edilmesine bağlıdır. Çeşitli RNA ekstraksiyon yöntemleri mevcut olsa da, birçoğu pahalı reaktifler, geniş kültür hacimleri veya özel ekipmanlar gerektirmekte; bu da özellikle kaynakların kısıtlı olduğu ortamlarda, geniş ölçekli çalışmalar için uygunluklarını sınırlamaktadır. Burada, mikobakteriler için özel olarak optimize edilmiş Sıcak Fenol tabanlı bir RNA ekstraksiyon yöntemi sunulmaktadır. Yöntem, yüksek throughput transkriptomik uygulamalar için uygun, yüksek kaliteli RNA'yı tutarlı bir şekilde elde etmek amacıyla minimum kültür hacmi ve yaygın olarak bulunan reaktifler kullanır. RNA miktarı ve bütünlüğü, jel elektroforezi ve RNA bütünlük analizi (RIN) ile değerlendirilmiş; aşağı akış uygulamaları için uygunluğu ise qPCR ve Qubit 4 ile doğrulanmıştır. Optimize edilen yöntemin performansını kıyaslamak için; aynı Mycobacterium türleri, kültür hacmi, büyüme evresi (logaritmik ve stasyoner) ve lizis koşulları dahil olmak üzere özdeş deneysel koşullar altında TRIzol ve RNeasy kullanılarak paralel bir RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir. Bu durum; verim, kalite, fizibilite ve maliyetin doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlamıştır. Optimize edilmiş Sıcak Fenol yöntemi, reaktif maliyetini ve özel ekipmana olan bağımlılığı önemli ölçüde azaltırken, benzer veya daha iyi RNA verimi ve kalitesi göstermiştir. Verimliliği, tekrarlanabilirliği ve uygun maliyeti sayesinde bu protokol, Mtb ve diğer mikobakteri türlerinde geniş ölçekli gen ekspresyonu ve transkriptomik çalışmaları için pratik bir alternatif sunmaktadır.

Giriş

M. tuberculosis (Mtb), tüberküloza (TB) neden olan ajan, HIV/AIDS'i geride bırakarak tek bir enfeksiyöz patojenden kaynaklanan ölümlerin başlıca nedeni olmaya devam etmektedir. 2024 yılında, dünya genelindeki ölümlerin yaklaşık 1,3 milyonu TB kaynaklıdır1. Bu yük, çok ilaç dirençli (MDR) ve yaygın ilaç dirençli (XDR) suşların artan prevalansı ile daha da ağırlaşmaktadır. Bu nedenle, TB patogenezinin moleküler temelini anlamak ve yeni terapötik hedefler belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır2.

Mtb'nin transkripsiyonel profillemesi; konak-patojen etkileşimlerinde3, çevresel strese adaptasyonda4 ve ilaç direncinin temelindeki mekanizmaları5 açıklığa kavuşturmak için önemli bir araç haline gelmiştir. Real-time PCR, mikro diziler ve RNA sekanslama (RNA-seq) gibi gelişmiş metodolojiler, mikobakteriyel transkriptomu analiz etme yeteneğini önemli ölçüde artırmıştır6. Ancak bu yöntemlerin başarısı, büyük ölçüde yüksek kaliteli RNA'nın mevcudiyetine bağlıdır ve bu da ekstraksiyon sırasında verimli hücre lizisine dayanır. Mtb'nin karmaşık mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan hücre duvarı, RNA ekstraksiyonunu özellikle zorlaştırmaktadır7. Enzimatik hidroliz8, sonikasyon9 ve boncukla parçalama (bead-beating)10 dahil mevcut lizis teknikleri, genellikle maliyetli ekipmanlar ve büyük kültür hacimleri gerektirmekte, bu da birçok BSL-3 laboratuvarındaki pratikliklerini sınırlamaktadır. Ayrıca, Mtb'nin yavaş büyüme hızı, yeterli biyokütle elde etmek için uzun kültür sürelerini zorunlu kılmaktadır11.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için hızlı ve ekonomik, optimize edilmiş Sıcak Fenol bazlı bir RNA ekstraksiyon yöntemi geliştirilmiştir. Yalnızca 3 mL mid-log fazı kültürü kullanılarak uygulanan bu yöntem, alt akış transkriptomik analizleri için uygun, 45–60 µg yüksek kaliteli RNA sağlar. Hücre lizis işlemi, kompakt bir el tipi doku öğütücü ve kolayca temin edilebilen reaktifler kullanılarak gerçekleştirilmekte, böylece pahalı cihazlara olan ihtiyaç ortadan kaldırılmaktadır. Sıcak Fenol yöntemi daha önce bildirilmiş olsa da11,12, optimize edilmiş Sıcak Fenol yöntemi kullanım kolaylığını, maliyet etkinliğini ve RNA verimini artırmaktadır. Optimizasyon M. smegmatis mc2155 (Msmeg) kullanılarak gerçekleştirilmiş ve Mtb H37Rv ile başarıyla valide edilmiştir.

Protokol

Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mycobacterium Kültürleme

  1. Msmeg veya Mtb gliserol stokundan 1 mL'yi; %0,2 gliserol, %0,05 Tween 80 ve %10 ADC ile desteklenmiş 10 mL Middlebrook 7H9 besiyerine inoküle edin ve OD 1–1.5 değerine ulaşana kadar 37 °C'de 150 rpm hızla çalkalayarak inkübe edin.
  2. Primer kültürden %1 oranında ekleme yaparak 10 mL 7H9 besiyerinde, mid-log fazına (OD600nm = 0,6–0,7) kadar sekonder kültürü büyütün.
  3. Kültürleri 3 mL'lik alikotlara ayırın ve oda sıcaklığında (23–25 °C) 5 dakika boyunca 2000 x g hızında santrifüjleyin.
  4. Pelletleri RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın.
    UYARI: Mtb kültürleri için uygun BSL3 kılavuzlarını takip edin ve pelletleri 95 ˚C'de 20–25 dakika boyunca ısı ile inaktive edin.
    NOT: Şekil 1, Sıcak Fenol yöntemiyle yapılan RNA ekstraksiyonu sırasında izlenen temel adımların akış şemasını göstermektedir.

Sıcak-fenol RNA ekstraksiyonu diyagramı; iş akışı santrifüjleme, faz ayrımı ve RNA bütünlük analizini göstermektedir.
Şekil 1: Sıcak-Fenol yönteminin ve analizinin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. RNA ekstraksiyonu

  1. Sıcak Fenol yöntemi (HP yöntemi)
    1. Hücre peletine 200 µL TES tamponu (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; 1% β-merkaptoetanol) ekleyin ve peleti vorteksleyerek yeniden süspanse edin.
    2. Numuneye yaklaşık 0.1 g 0.1 mm silika boncuğu ekleyin. Pelet buz üzerinde tamamen çözülene kadar 10–15 s boyunca el tipi doku parçalayıcı kullanın. Bu adımı 2 döngü daha tekrarlayın ve her tekrardan sonra sıvı azot ile şok dondurma yapın.
    3. VEYA oda sıcaklığında 5 hız ayarında (5.0 m/s) 1 dk boyunca yüksek hızlı masaüstü boncuk parçalayıcı kullanın. Bu adımı 3 döngü boyunca tekrarlayın ve her döngüden sonra ısınmayı önlemek için numuneyi buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: Mtb hücre lizini, el tipi doku parçalayıcı veya boncuk parçalayıcı ile 6–8 döngü boyunca (her döngü 1 dk) tekrarlayın ve her döngüden sonra aralıklı olarak buz üzerinde soğutun. RNA ekstraksiyonu için gerekli tüm tamponların ve reaktiflerin hazırlanmasında DEPC (Dietilpirokarbonat) ile işlem görmüş su kullanın.
    4. Hacmi 400 µL'ye tamamlamak için her numuneye 200 µL ek TES tamponu (65 °C'ye ön ısıtılmış) ekleyin. Her numuneye 200 µL asidik fenol (100 mM sitrat tamponu ile dengelenmiş fenol, pH 4.5) ve 200 µL kloroform ekleyin (asidik fenol ve kloroformu numuneye eklemeden önce eşit oranda karıştırın).
    5. Numuneyi ısıtıcı blok üzerinde 900 rpm çalkalama ile 65 °C'de 30 dk boyunca inkübe edin ve oda sıcaklığında 12000 x g hızda 15 dk santrifüjleyin. Santrifüj sonrası uygun faz ayrımının gerçekleştiğinden emin olun (RNA içeren berrak bir üst sulu faz, belirgin bir DNA ara fazı ve proteinler ile lipidleri içeren bir alt organik faz gözlemlenecektir).
    6. Sulu fazın üst tabakasını alın ve yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tekrar eşit hacimde asidik fenol: kloroform ekleyin. Oda sıcaklığında 12,000 x g hızda 15 dk santrifüjleyin. Uygun faz ayrımını sağlayın.
    7. Üst sulu tabakayı taze bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne alın, ardından 30 µL 3 M sodyum asetat tamponu (pH 5.3) ve 240 µL soğutulmuş izopropanol ekleyin. −80 °C'de 30 dk ile 1 saat arası inkübe edin.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpü bu aşamada gece boyunca -80 °C'de saklanabilir. İnkübasyon sırasında 65 °C'de açılmasını önlemek için mikrosantrifüj tüpünü birden fazla kat parafim ile mühürleyin.
      DİKKAT: Fenol ve kloroform tehlikeli kimyasallardır; bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE), çeker ocak gibi mühendislik kontrolleri ve spesifik atık bertaraf prosedürleri uygulanmalıdır.
    8. Oda sıcaklığında 12,000 x g hızda 1 saat santrifüjleyin. Pelet oluşumunu sağlayın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın.
    9. Peleti 1 mL %75'lik etanol içinde yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 12,000 x g hızda 1 dk santrifüjleyin. Bu adımı iki kez uygulayın ve peleti havada kurutun.
    10. Peleti 50 µL nükleazden arındırılmış su ile yeniden süspanse edin.
      ​NOT: RNA'yı çözmek için, oda sıcaklığında 10–30 dk boyunca RNazden arındırılmış su içinde inkübe edin.
  2. TRIzol yöntemi
    1. Hücre peletine 200 µL TRIzol reaktifi ekleyin.
      DİKKAT: TRIzol tehlikeli bir kimyasaldır; bu nedenle uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE), çeker ocak gibi mühendislik kontrolleri ve spesifik atık bertaraf prosedürleri uygulanmalıdır.
    2. Hücre lizini yöntemini 2.1.2 - 2.1.3 adımlarında olduğu gibi uygulayın.
    3. Ek olarak 200 µL TRIzol reaktifi, ardından 200 µL kloroform ekleyin ve 1 dk boyunca vorteksleyin. 4 °C'de 13,400 x g hızda 15 dk santrifüjleyin. Santrifüj sonrası uygun faz ayrımını sağlayın.
    4. Sulu fazı dikkatlice yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    5. Sulu faza 500 µL izopropanol ekleyerek ve −80 °C'de 30 dk ile 1 saat arası inkübe ederek RNA'yı çöktürün.
    6. 4 °C'de 15,000 x g hızda 20 dk santrifüjleyerek RNA'yı peletleyin. Peleti dikkatlice gözlemleyin ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı uzaklaştırın.
    7. Peleti 1 mL %75'lik etanol ile yeniden süspanse edin ve 4 °C'de 13,400 x g hızda 1 dk santrifüjleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın, peleti oda sıcaklığında 30 dk havada kurutun ve 50 µL nükleazden arındırılmış su içinde yeniden süspanse edin.
  3. Ticari olarak mevcut RNA ekstraksiyon kiti yöntemi
    1. Hücre peletini 200 µL Resüspansiyon tamponunda (kit içerisinde sağlanmıştır) yeniden süspanse edin.
    2. Hücre lizini yöntemini 2.1.2 - 2.1.3 adımlarında olduğu gibi uygulayın.
    3. Sonraki deney aşamalarını üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.

3. DNaz işlemi, miktar tayini ve görselleştirme

  1. Genomik DNA kontaminasyonunu gidermek için, her RNA örneğine 1 µL DNase I (10units) ve 5 µL RDD tamponu (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk inkübe edin.
  2. RNA örneğini Nanodrop kullanarak spektrofotometrik olarak, RNA bütünlüğünü ise Qubit4 kullanarak nicelendirin. Kabul edilebilir RIN değeri 7,5 -10 arasındadır. A260/A280 ve A260/A230 için kabul edilebilir değerler sırasıyla 1,8–2,0 ve 2,0–2,2 aralığındadır.
  3. 1X RNA yükleme boyası kullanarak RNA'yı %1'lik agaroz jelde görselleştirin.

4. cDNA sentezi ve kantitatif gerçek zamanlı PCR

  1. cDNA Ters Transkripsiyon kiti ve 1 µg RNA kullanarak, üretici talimatlarını takip ederek bir termal döngüleyici cihazda cDNA hazırlığı için 20 µL'lik bir reaksiyon kurun.
  2. Üretici talimatlarına göre 50 ng cDNA, her bir primerden 0.4 µM ve SYBR kullanarak 10 µL'lik bir gerçek zamanlı PCR reaksiyonu kurun. Örneği Real-Time PCR termal döngüleyici cihazında çalıştırın.
    NOT: qPCR analizi için aşağıdaki primerler kullanılmıştır:
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. İstatistiksel analiz

  1. Graph Pad Prism kullanarak tüm biyolojik tekrarlarla Student t-testi gerçekleştirin; P ≤ 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Hata çubukları, en az üç biyolojik tekrardan elde edilen standart hatayı temsil etmektedir.

Sonuçlar

RNA kalitesi ve verimi

RNA kalitesi ve miktarı agaroz jel elektroforezi ile değerlendirilmiştir (Şekil 2). Tüm ekstraksiyon yöntemleri için 23S ve 16S rRNA'ya karşılık gelen belirgin ve keskin bantlar gözlemlenmiş olup, bu durum toplam RNA'nın başarılı bir şekilde izole edildiğini doğrulamaktadır. Sıcak Fenol ve TRIzol yöntemleri, bozulmamış ve yüksek kaliteli RNA'ya işaret eden 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) ve 5S rRNA'yı (~120 bp) temsil eden üç net bant göstermiştir. Buna karşılık, kolon bazlı kit yöntemi yalnızca 23S ve 16S bantlarını göstermiş, 5S rRNA bandı ise muhtemelen kolon saflaştırması sırasında küçük RNA'ların seçici kaybı nedeniyle yoktu veya tespit sınırının altındaydı. Nicel olarak, Sıcak Fenol yöntemi, TRIzol ve RNeasy'den sırasıyla 1,5–2 kat daha fazla RNA sağlamıştır (Şekil 2A,C). Ortalama verimler Sıcak Fenol için ~60 µg, TRIzol için ~45 µg ve RNeasy için ~30 µg olarak gerçekleşmiş olup; sonuncusu, Sıcak Fenol'e göre ~%50 daha düşük verimi temsil etmektedir. Verim farklarına rağmen, RNA bütünlüğü ve saflığı yöntemler arasında benzerlik göstermiştir (Şekil 2D,E).

Liz yöntemi verimliliğini değerlendirmek için, RNA aynı zamanda bir boncuklu parçalayıcı (bead ruptor) kullanılarak da ekstrakte edilmiştir. Benzer verim, kalite ve bütünlük değerleri elde edilmiş; bu da boncuklu parçalayıcı/karıştırıcı gibi özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan, basit bir el tipi doku öğütücü kullanılarak etkili liz işleminin gerçekleştirilebileceğini göstermiştir (Şekil 2B,F–H).

Mtb, Msmeg'e göre lizeye karşı daha dirençli olduğundan, optimize edilmiş Sıcak Fenol yöntemini Mtb H37Rv suşu kullanarak daha detaylı şekilde valide ettik. Hem doku öğütücü hem de boncuklu parçalayıcı kullanılarak gerçekleştirilen hücre lizi, iyi verim, kalite ve bütünlüğe sahip RNA ile sonuçlanarak (Şekil 3A–D) yöntemin sağlamlığını doğrulamıştır. El tipi doku öğütücü kullanılarak yapılan RNA ekstraksiyonu, boncuklu parçalayıcıya (50–60 µg/3 mL) kıyasla daha düşük bir verim (~35–45 µg/3 mL kültür) göstermiş olsa da, bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı bulunmuştur ve ayrıca elde edilen miktar, büyük ölçekli gen ekspresyon çalışmaları için yeterli ve kabul edilebilir aralıktadır. Tüm RNA ekstraksiyonları birden çok kez tekrarlanmış ve tüm bağımsız biyolojik tekrarlar sunulmuştur. Jel görüntüler üzerinde densitometrik analiz yapılmış olup, bu analizler farklı yöntemler arasındaki RNA verimindeki istatistiksel farkları daha da doğrulamış ve Sıcak Fenol yönteminin en yüksek verimi sağladığını göstermiştir (Ek Şekil 1A–D).

RNA saflığı ve bütünlüğü

Tüm yöntemler, protein kontaminasyonunun minimum düzeyde olduğunu gösteren 2,0 civarında kabul edilebilir A260/A280 oranlarına sahip RNA sağlamıştır (Şekil 2D). RNA bütünlüğü (RIN), 7,5 ile 10 arasında değişen değerlerle tüm yöntemler arasında benzerlik göstermiştir (Şekil 2D–H, Ek Şekil 2, alt panel). Bu durum, iyi kaliteyi, bütünlüğü ve minimum degredasyonu göstermektedir.

RNA kalitesini kontrol etmek için kantitatif PCR analizi

Her bir yöntemle ekstrakte edilen RNA'nın sonraki gen ekspresyon çalışmaları için uygunluğunu değerlendirmek amacıyla qRT-PCR gerçekleştirilmiştir. Eşit miktarda RNA girişi kullanarak Msmeg housekeeping geni mysA (MSMEG 2758) ve iki transkripsiyonel regülatör olan sigE (MSMEG 5072) ve sigH (MSMEG 1914) genlerinin ekspresyonu incelenmiştir. Elde edilen Ct (eşik döngüsü) değerleri, her bir örnekteki sağlam ve amplifiye edilebilir RNA'nın göreceli bolluğunu yansıtmaktadır. (Şekil 2I)'de gösterildiği gibi, Sıcak Fenol ve TRIzol kullanılarak ekstrakte edilen RNA'lar yaklaşık 22–25 aralığında benzer Ct değerleri vermiş; bu durum daha yüksek RNA bütünlüğünü ve ters transkripsiyon ile amplifikasyona olan uyumluluğu yansıtmıştır. Kit yöntemi ise saptanabilir transkript seviyelerinin daha düşük olduğunu belirten, biraz daha yüksek Ct değerleri (~27–30) sergilemiştir. Erime eğrisi analizi, mysA, sigE ve sigH genlerinin spesifik amplifikasyonunu göstererek qPCR spesifitesini ve verimliliğini kanıtlamıştır (Ek Şekil 2, üst panel). Mtb genleri kullanılarak yapılan qPCR analizi de kabul edilebilir Ct değerleri (~20–25) vermiş ve sonraki gen ekspresyon çalışmaları için uygunluğu doğrulamıştır (Şekil 3E).

RNA ekstraksiyon karşılaştırması; jel elektroforezi (28S, 18S, 5S) ve verim, Ct, saflık sütun grafikleri.
Şekil 2için RNA ekstraksiyon yöntemlerinin karşılaştırılması Mycobacterium. (A) Sıcak Fenol, TRIzol ve RNeasy yöntemleri kullanılarak ekstrakte edilen toplam RNA'yı gösteren agaroz jel elektroforezi. Tüm örneklerde belirgin 23S ve 16S rRNA bantları görülmektedir; bu durum RNA'nın sağlam olduğunu göstermektedir. (B) Sıcak Fenol kullanılarak ekstrakte edilen toplam RNA'yı gösteren agaroz jel elektroforezi aracılığıyla farklı lizis yöntemleri, yani boncuklu parçalayıcı (bead ruptor) ve el tipi doku öğütücü. (C) En yüksek verimin Sıcak Fenol'den, ardından TRIzol ve kit yönteminden elde edildiğini gösteren toplam RNA verimi. (DRNA saflığı A260/A280 oranları ile değerlendirilmiş ve tüm yöntemler protein kontaminasyonunun minimum düzeyde olduğunu gösteren ~2,0 civarında değerler vermiştir.E) Benzer bütünlüğü gösteren RNA bütünlük numarası (RIN). (F–H) El tipi doku öğütücü ve Bead Ruptor ile lize edilen ve Sıcak Fenol yöntemiyle izole edilen örnekler arasında RNA verimi, 260/280 oranı ve RNA bütünlüğü açısından karşılaştırma. (I) Bir housekeeping genini (örneğin, mysA) ve transkripsiyon faktörleri (sigE ve sigH). Hata çubukları, üç biyolojik tekrardan (n = 3) elde edilen standart hatayı temsil etmektedir. PStudent’s t-testi kullanılarak hesaplanan p-değeri t-testi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mycobacterium RNA ekstraksiyon karşılaştırması, jel elektroforezi ve verim ile saflığı analiz eden sütun grafikleri.
Şekil 3: Sıcak fenol yöntemi kullanılarak Mtb'den RNA izolasyonu. (A) Mtb H37Rv suşundan optimize edilmiş Sıcak Fenol yöntemiyle, boncuk parçalayıcı (bead ruptor) ve el tipi doku öğütücü kullanılarak ekstrakte edilen toplam RNA'yı gösteren agaroz jel elektroforezi. (B–D) İzole edilen RNA'nın verim, 260/280 oranı ve RNA bütünlüğü (RIN) tahmini açısından karşılaştırılması. (E) sigA, 16s rRNA ve hsp70 genlerini hedefleyen qRT-PCR'dan elde edilen Ct değerleri. Hata çubukları üç biyolojik tekrardan (n = 3) elde edilen standart hatayı temsil etmektedir. P-değeri Student's t-test kullanılarak hesaplanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sıcak FenolTrizolRNeasy kit
Verim60 -70 μg35 -50 μg30 - 45 μg
Süre2.5-3 hrs2-2.5 hrs30-45min
Reaksiyon başına maliyet$0.10 – $0.20$1.500 – $2.00$7.00 – $10.00
Sınırlamalar Zaman alıcı, güçlü denatüranlar (fenol/SDS) Zaman alıcı, Trizol gibi yüksek derecede toksik reaktifler, soğutmalı santrifüj gereksinimi, Sıcak Fenol yönteminden 15 kat daha pahalıPahalı (Sıcak Fenol'den 72 kat daha pahalı), daha düşük verim, kolon tıkanması
AvantajlarDüşük hacimden daha yüksek verim, düşük maliyet, hücre lizisi için beat beater gereksinimi yok, soğutmalı santrifüj gereksinimi yokOrta düzeyde verim ve orta düzeyde maliyet, soğutmalı santrifüj gereksinimiOrta düzeyde verim, çok pahalı
Temel maliyet unsuruYaygın laboratuvar reaktifleri (TES tampon bileşenleri, asidik fenol, kloroform, izopropanol, etanol)Ticari TRI Reagent®, kloroform veya kloroform: izoamil alkol, izopropanol, etanolTescilli Qiagen spin kolonları ve tamponlar
RIN8-10 RIN7.5-10 RIN9-10 RIN

Tablo 1: 3 farklı RNA ekstraksiyon prosedüründe (Sıcak Fenol, TRIzol ve RNeasy yöntemleri) maliyet, süre ve kısıtlamaların karşılaştırılması.

Ek Şekil 1: RNA ekstraksiyonunun optimizasyonu. (A) Sıcak Fenol kullanılarak RNA ekstraksiyonu ve el tipi doku öğütücü kullanılarak lizis. (B) TRIzol kullanılarak RNA ekstraksiyonu. (C) RNeasy yöntemi kullanılarak RNA ekstraksiyonu. (D) Farklı yöntemler kullanılarak Msmeg'den yapılan RNA ekstraksiyonu jel görüntülerinin densitometrik analizi. Hata çubukları, GraphPad Prism kullanılarak hesaplanan standart hatayı temsil eder (n = 8). (E) Mtb suşundan Sıcak Fenol kullanılarak RNA ekstraksiyonu. Tüm jel resimleri bağımsız biyolojik tekrarlardır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: (Üst panel) M. smeg'den mysA, sigE ve sigH genlerinin erime eğrisi analizi, n = 3; (Alt panel) RNA bütünlük analizi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Mycobacterium için basit ve dayanıklı bir RNA ekstraksiyon yöntemi geliştirmek amacıyla Hot Phenol yöntemi optimize edilmiştir. Ardından, ekstrakte edilen RNA, yaygın olarak kullanılan iki yaklaşım olan TRIzol ve kolon tabanlı kit yöntemi ile karşılaştırılmıştır12,13. Bu teknikler, alt moleküler uygulamalar için pratikliklerini değerlendirmek amacıyla RNA verimi, saflığı, bütünlüğü, maliyeti ve işlem süresi açısından karşılaştırılmıştır. Kit tabanlı yönteme kıyasla nispeten daha fazla zaman alan Hot Phenol ve TRIzol yöntemlerinin her ikisi de bozulmamış, yüksek kaliteli RNA üretmiştir. Her üç yöntem de benzer saflıkta ve bütünlükte RNA sağlamıştır; ancak Hot Phenol yöntemi tutarlı bir şekilde daha yüksek RNA verimi sağlamıştır. Ayrıca, Hot Phenol ve TRIzol kullanılarak ekstrakte edilen RNA benzer Ct değerleri vermiştir. Buna karşın, Hot Phenol ve RNeasy yöntemleri arasında Ct değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmiştir. Deneyde eşit miktarda RNA kullanıldığından, tüm yöntemlerde benzer Ct değerleri beklenmekteydi. RNeasy yönteminde gözlemlenen farklılıklar, RNA ekstraksiyon kimyasındaki varyasyonlara bağlanabilir. Hot Phenol ve TRIzol organik tabanlı yöntemlerdir ve genellikle intrinsik membran proteinlerini kodlayanlar veya yüksek GC içeriğine sahip transkriptler gibi zorlayıcı transkriptleri çözmede daha etkilidirler. Buna karşın RNeasy, silika kolon tabanlı bir yöntemdir ve fenol tabanlı yöntemlerle karşılaştırıldığında, membrana verimli şekilde bağlanmayan veya yıkama basamakları sırasında kaybolan belirli transkriptlerin daha düşük geri kazanımıyla sonuçlanabilir (Şekil 2). Önemli bir nokta olarak, hücre lizisi için el tipi doku öğütücü veya boncuklu parçalayıcı (bead ruptor) kullanıldığında benzer RNA verimleri elde edilmiş, böylece hücre lizisinin gerçekleştirilmesinde operasyonel esneklik sağlanmıştır. Ayrıca, ekstraksiyon yöntemi düşük kültür hacimleriyle çalışacak ve soğuk santrifüj gerektirmeyecek şekilde optimize edilmiştir. Bu basitleştirme, örnek işlemenin genel kolaylığını ve verimliliğini artırmaktadır.

Bir RNA ekstraksiyon yöntemi seçerken önemli bir faktör; maliyet, zaman ve çıktı kalitesi arasındaki dengeyi kurmaktır (Tablo 1). Sıcak Fenol yöntemi, biraz zaman alıcı olmasına rağmen, yaygın laboratuvar kimyasallarının kullanımı ve şimdiye kadar yayınlanmış yöntemlerin çoğunda kullanılan üst düzey boncuk parçalayıcı (bead ruptor) ekipmanlara ihtiyaç duymadan, 3 mL gibi düşük kültür hacimlerinden bile yüksek RNA verimleri (3 mL orta logaritmik faz kültür hacmi başına Msmeg RNA 60–70 µg ve Mtb RNA 35–45 µg) sağlayabilmesi sayesinde oldukça maliyet etkin kalmaktadır. Bu durum, yöntemi özellikle düşük kaynaklı ortamlarda çalışan laboratuvarlar için avantajlı kılmaktadır. Daha önce yayınlanmış sıcak fenol tabanlı RNA ekstraksiyon yöntemleri birkaç temel açıdan farklılık göstermektedir. Örneğin, Mangan ve arkadaşları sıcak fenol yöntemini kullanarak RNA ekstraksiyonu için M. bovis kullanmış ve 109 hücre başına yaklaşık 20 µg RNA verimi bildirmişlerdir. Ancak, kültür hacmi ve ekstraksiyon sıcaklığı gibi kritik parametreler net bir şekilde belirtilmemiştir. Ayrıca, yöntemleri mekanik hücre parçalamadan önce kolayca temin edilemeyen bir reaktif olan Divolab-1 ile deterjan yıkamasını, ardından kloroform ve izoamil alkol ile ekstraksiyonu içermektedir11. Bir başka Sıcak Fenol yönteminde, Mtb hücrelerinden RNA ekstraksiyonu yapılmış ve burada optimize edilen yöntemle karşılaştırılabilir düzeyde, yaklaşık 39 µg toplam RNA elde edilmiştir. Ancak bu yöntem, nispeten yüksek bir kültür hacmi (25 mL) gerektirmiş, bu da işlem süresini artırmış ve daha büyük santrifüjlerin kullanımını zorunlu kılmıştır. Ayrıca, ekstraksiyon bir kloroform–izoamil alkol karışımını içermekte olup ekstraksiyon sıcaklığı bildirilmemiştir12,14. TRIzol, orta düzey bir maliyetle iyi RNA verimi ve kalitesi elde etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır15; ancak verim nispeten düşüktür. RNeasy kiti, üstün kolaylık ve hız sunarak zamanla sınırlı iş akışları veya daha az deneyimli kullanıcılar için uygun hale gelmektedir, ancak diğer iki yönteme göre maliyeti önemli ölçüde daha yüksektir ve verim belirgin şekilde düşüktür. Özetle, burada açıklanan yöntem, mikobakteriyel hücre lizisinde ve ardından gelen RNA ekstraksiyonunda operasyonel esneklik sağlamaktadır. Bu sayede kullanıcılar, üç yöntemde de benzer RNA kalitesini ve bütünlüğünü korurken; maliyet ve verim veya işlem süresi gibi önceliklerine göre en uygun yöntemi seçebilmektedirler.

Açıklamalar

Yazarlar arasında herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır. Tüm yazarlar gönderimi onaylamıştır.

Teşekkürler

Biyoteknoloji Departmanı (DBT), Hindistan Tıbbi Araştırmalar Konseyi (ICMR) ve Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'nun (SERB) desteklerini belirtmek isterim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,1 mm silika boncuklarMP BiomedicalsMP116911050
2-propanolSigma278475
Bead Ruptor 4 Revvity
KloroformSigma288306
Soğutmalı santrifüjThermoScientific42541217
DNaz I qiagen79254
EDTAsigmaE02SS
HClSRL62889
Isıtma bloğuMIULABMU-E02-1049
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon kiti Thermo Fisher Scientific4368814
Motorlu doku öğütücü G10KoronaG22616008
NaClsigmaS5886
Nanophotometer N50 UYGULAMAT51601
0,1 M sitrat tamponu (pH 4,5) ile dengelenmiş fenolSigmaP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
Qubit 4 florometresi Invitrogen2,32262E+12
Gerçek Zamanlı PCR Termal DöngüleyiciAnalytik Jena AG844-00503-2
RNA easy KitQiagen74104
SDSSigmaS9888
Sodyum asetatSigmaS2889
termal döngüleyici Biorad621BR29739
TRI ReagentSigmaT9424
Tris bazıHimediaMB029
β-merkaptoetanolSigma516732

Kaynaklar

  1. Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
  2. Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
  3. Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
  4. Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
  5. Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
  6. Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
  7. Brennan, P. J., Nikaido, H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).
  8. Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. Methods Mol Biol. 101, 31-44 (1998).
  9. Manganelli, R., et al. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression. Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).
  10. Rustad, T. R., et al. Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).
  11. Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).
  12. Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).
  13. Hiebert, R. M., et al. RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis. Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).
  14. Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
  15. Alli, A. O., et al. Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression. Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S cak Fenol EkstraksiyonuMycobacterium TuberculosisTranskriptomik al malarRNA B t nlJel ElektroforeziqPCR AnaliziTRIzol Kar la t rmasRNeasy Kar la t rmas
Mycobacteria'dan Optimize Edilmiş Sıcak Fenol Temelli RNA Ekstraksiyonu: Güvenilir Gen Ekspresyon Analizi İçin Sağlam Bir Yaklaşım
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.