Yöntem makalesi

Bekçiyi Görselleştirmek: Evan'ın Yetişkin Zebra Balıklarında Kan-Beyin Bariyeri Geçirgenliğine İlişkin Mavi Boya Bazlı Değerlendirmesi

DOI:

10.3791/69010

⸱

30 Eylül 2025

 ,  ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, Kulliyyah of Medicine, International Islamic University Malaysia (IIUM), 2Department of Biotechnology, Kulliyyah of Science, International Islamic University Malaysia (IIUM), 3Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia, 4Clinical Pharmacology Department, Menoufia Medical School, Menoufia University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Evan'ın mavi boya bazlı değerlendirmesini kullanarak yetişkin zebra balığı (Danio rerio) modelinde kan-beyin bariyeri (BBB) bütünlüğünü değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sunar ve nörovasküler bozulmanın hem kalitatif hem de kantitatif analizini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan-Beyin Bariyeri (BBB), maddelerin beyne girip çıkmasını düzenleyerek merkezi sinir sistemi (CNS) homeostazını koruyan ve böylece sinir dokusunu potansiyel olarak zararlı ajanlardan koruyan yarı geçirgen bir arayüzdür. BBB'nin bozulması, Parkinson hastalığı (PD) ve Alzheimer hastalığı (AD) dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıkta iyi bilinen bir özelliktir ve burada artan geçirgenlik hastalığın ilerlemesine katkıda bulunur ve bunu şiddetlendirir. Yetişkin zebra balığı (Danio rerio), nörodejeneratif hastalıkları incelemek için giderek daha değerli bir model olarak kabul edilse de, bu türde BBB bütünlüğünü değerlendirmek için standartlaştırılmış yöntemler sınırlı kalmaktadır. Bu protokol, Evan'ın nörovasküler sistemden beyin dokusuna Mavi (EB) boya ekstravazasyonunu analiz ederek yetişkin zebra balıklarında BBB geçirgenliğini değerlendirmek için basit, tekrarlanabilir ve uygun maliyetli bir yaklaşımı açıklamaktadır. Yöntem, BBB bozulmasını tespit etmek için nitel görselleştirmeyi EB dağılımının nicel görüntü analiziyle birleştirir. Temel adımlar arasında EB boyasının uygun intraperitoneal enjeksiyonu, sistemik boya dolaşımının doğrulanması, dikkatli beyin diseksiyonu ve tutarlı görüntüleme ve gri tonlama yoğunluk ölçümü yer alır. Boya penetrasyonunu doğrulamak ve doğru yorumlamayı desteklemek için pozitif ve negatif kontroller dahil edilmiştir. Temsili sonuçlar, Parkinson zebra balığı beyinlerinde salin enjekte edilen kontrollerle karşılaştırıldığında daha fazla EB ekstravazasyonu olduğunu göstermektedir ve bu da BBB geçirgenliğinin arttığını göstermektedir. Bu teknik minimum düzeyde özel ekipman gerektirir ve sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar için uygundur. Genel olarak bu protokol, yetişkin zebra balığı modellerinde BBB bütünlüğünü araştırmak için pratik bir araç sunar ve hastalık mekanizmalarının incelenmesi ve nörovasküler fonksiyonu hedef alan terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere çeşitli uygulamalara uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan-Beyin Bariyeri (BBB), Merkezi Sinir Sistemi (CNS) mikro ortamını korumak için kan dolaşımı ile beynin interstisyel alanı arasındaki moleküler alışverişi düzenleyen, perisitler ve astrositler tarafından desteklenen, esas olarak özel serebral endotel hücreleri tarafından oluşturulan seçici, yarı geçirgen bir fizyolojik arayüzdür. Bütünlüğü, CNS homeostazını korumak ve nöral dokuyu zararlı veya toksik maddelerden korumak için gereklidir1. BBB'nin bozulması, Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda iyi bilinen bir patolojik özelliktir 2,3. Bozulmuş BBB fonksiyonu, nörotoksik bileşiklerin ve inflamatuar mediatörlerin beyin dokusuna sızmasına izin vererek geçirgenliğin artmasına yol açar ve böylece hastalığın ilerlemesini şiddetlendirir4. Bu nedenle, BBB bütünlüğünün değerlendirilmesi, bu bozuklukların altında yatan nörovasküler ve inflamatuar mekanizmalar hakkında daha derin bilgiler edinmek için kritik öneme sahiptir.

İn vivo kemirgen ve in vitro modeller BBB araştırması5 için altın standartlar olmaya devam ederken, zebra balığı (Danio rerio), genetik izlenebilirlikleri, maliyet etkinlikleri, kullanım kolaylıkları ve memelilerle korunmuş nöroanatomik ve BBB özellikleri nedeniyle sinirbilimde değerli bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmıştır6. Nörodejeneratif çalışmalarda artan kullanımlarına rağmen, yetişkin zebra balıklarında BBB bütünlüğünü değerlendirme yöntemleri hala sınırlıdır 7,8. Floresan izleyici enjeksiyonları veya transgenik raportörler gibi teknikler larvalarda 9,10 yaygın olarak kullanılmıştır, ancak pigmentasyon ve azalmış şeffaflık nedeniyle yetişkinlerde önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, Evan's Blue (EB) boya ekstravazasyonunu kullanarak yetişkin zebra balıklarında BBB geçirgenliğini değerlendirmek için basit, tekrarlanabilir ve görsel olarak gösterilebilir bir protokol oluşturmaktır. Bu yöntem, beyin dokusuna boya sızıntısının hem kalitatif gözlemini hem de kantitatif ölçümünü içerir ve patolojik koşullar altında nörovasküler bütünlüğün değerlendirilmesi için pratik bir araç sağlar.

Serum albüminine bağlanan ve normalde bozulmamış BBB11'i geçemeyen Evan'ın Mavi boyası, bariyer bozulmasını12 değerlendirmek için uygun bir alternatif sunar. EB ekstravazasyonu, travmatik beyin hasarı, felç ve nöroinflamasyon gibi durumlarda BBB sızıntısını tespit etmek için kemirgen modellerinde yaygın olarak uygulanmaktadır13. Ancak yetişkin zebra balıklarındaki uygulaması büyük ölçüde keşfedilmemiş durumda. Bu çalışma, yetişkin zebra balığı için optimize edilmiş EB boya tekniğinin yeni bir uyarlamasını sunarak BBB geçirgenliğinin güvenilir niteliksel ve niceliksel değerlendirmesini mümkün kılmaktadır. Yöntem uygun maliyetlidir, minimum düzeyde özel ekipman gerektirir ve birden fazla hayvan için kolayca ölçeklendirilebilir, bu da tipik olarak larvalarda kullanılan daha karmaşık görüntülemeye dayalı yaklaşımlara göre pratik bir avantaj sunar.

Bu protokolü kullanarak hem sağlıklı hem de Parkinson yetişkin zebra balıklarında BBB bütünlüğünü değerlendirdik. Zebra balıklarında Parkinsonizmi indüklemek için, nörotoksin 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP), daha önce tarif edilen bir yöntem14 izlenerek intraperitoneal olarak uygulandı. Sonuçlar, Parkinson zebra balığının beyinlerinde, PD'de gözlemlenen iyi belgelenmiş BBB bozulmasıyla tutarlı olarak, önemli ölçüde daha fazla EB ekstravazasyonu ortaya çıkardı. Bu bulgular, yöntemin duyarlılığını ve güvenilirliğini doğrulayarak, vasküler patolojiyi moleküler ve davranışsal sonuçlarla ilişkilendirmedeki faydasını desteklemektedir. Dolayısıyla bu teknik, nörodejeneratif hastalıklara nörovasküler katkıları araştıran araştırmacılar için değerli bir aracı temsil eder ve hem genetik hem de toksin kaynaklı zebra balığı modellerinde uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol takip edildi ve Malezya Uluslararası İslam Üniversitesi (IIUM) bünyesindeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından hayvan etiği onayına atıfta bulunularak izin verildi (ref. no.: IIUM/504/14/2/IACUC).

1. Evans Blue boya stok solüsyonunu hazırlayın

  1. %1 (a/h) stok çözeltisi hazırlamak için 0,1 g EB boyasını 10 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün. Boya tamamen eriyene kadar iyice karıştırın.
    DİKKAT: EB, Kanserojen Kategori 1B olarak sınıflandırılır. Cilt ve gözlerle doğrudan temasından kaçının. Koruyucu giysi, eldiven, koruyucu gözlük ve toz maskesi kullanın. Tozu solumaktan kaçının ve üreticinin kullanım talimatlarına uyun. Evans Blue boyasını (katı veya çözelti) lavaboya atmayın. Atıkları etiketli orijinal kaplarda saklayın. Ulusal ve yerel tehlikeli atık yönetmeliklerine göre bertaraf edin.
  2. Çözeltiyi 0,45 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Süzüntüyü steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın. Tüpü alüminyum folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: Daha küçük gözenek boyutlu bir filtre (örn. 0,2 μm) de kullanılabilir. Stok çözeltisi 4 °C'de iki haftaya kadar veya -20 °C'de bir aya kadar saklanabilir ve donmuş halde saklandığında tekrarlanan donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için alikotlama önerilir.

2. Yetişkin zebra balığına Evans Blue boyasını uygulayın

  1. Balık artık dokunsal uyaranlara tepki vermeyene kadar su sıcaklığını kademeli olarak 12 °C'den 7 °C'ye düşürerek zebra balığını hipotermik şok yoluyla uyuşturun.
    NOT: Suya birkaç dakika içinde yavaşça az miktarda kırılmış buz eklenerek sıcaklığın kademeli olarak düşürülmesi sağlanabilir ve sıcaklığın kademeli olarak düşmesine izin verilir. Trikain daldırma da uygun bir alternatif anestezi yöntemidir.
  2. 31 G'lik bir insülin şırıngası kullanarak intraperitoneal (IP) boşluğa 20 μL% 1 EB boyası enjekte edin. Geri akışı önlemek için enjeksiyon bölgesine 10 saniye boyunca hafif basınç uygulayın.
    NOT: Zebra balığı intraperitoneal boşluğu, pelvik kuşağın arkasında bulunur. EB uygulamasının başarı oranını artırmak için, enjeksiyondan önce balıkları 24 saat aç bırakın. Bu, intraperitoneal boşluğa daha iyi erişim ve doğruluk sağlamak için karın boşluğunu boşaltacaktır.
  3. Balıkları bir geri kazanım tankına aktarın ve 30 dakika boyunca toparlanmaya izin verin. Yaralanma, ölüm veya davranış değişikliklerini izleyin.
    NOT: Zebra balığının iyileşmesine yardımcı olmak için, hafif bir anestezik etki sağlamak ve enjeksiyon sonrası olası rahatsızlığı uyuşturmaya yardımcı olmak için geri kazanım tankı için biraz düşük su sıcaklığı (20-24 °C) kullanın. Enjekte edilen balık, başarılı boya sirkülasyonunu gösteren mavi bir renk tonu sergileyecektir (Şekil 1).
  4. 30 dakika sonra, balığa 1 °C ila 3 °C'de hipotermik şok yoluyla ötenazi yapın. Ardından, steril bir bıçak veya cerrahi makas kullanarak balığın başını kesin.
    NOT: Daha sonra beyin diseksiyonuna yardımcı olmak için, başını keserken başın arkasında fazladan et bırakın.
  5. Fazla kanı ve EB boyasını çıkarmak için kafayı 1x PBS'de (1:20 balık/PBS oranı) iki kez durulayın.
    NOT: Yetersiz yıkama, yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir ve analizin doğruluğunu tehlikeye atabilir. Bunu önlemek için, beyin dokusunu en az iki kez 1x PBS ile iyice yıkayın, tüm görünür kanın ve serbest akışlı boyanın çıkarıldığından emin olun. Herhangi bir boya kalıntısı kalırsa, üçüncü bir yıkama şiddetle tavsiye edilir.
  6. Kafayı gece boyunca 4 °C'de (1:20 balık/fiksatif oran) %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. Zebra balığı kafasının küçük boyutu ve yeterli fiksatif hacmi, statik koşullar altında etkili penetrasyona izin verdiğinden, fiksasyon sırasında çalkalama gerekli değildir.
    DİKKAT: PFA yutulması, solunması veya ciltle teması halinde zararlıdır. PFA solüsyonunu çeker ocak altında hazırlayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve tozun solunmasından kaçının. Üreticiye göre tüm güvenlik yönergelerine uyun. PFA'yı tehlikeli atık olarak değerlendirin. Kanalizasyona atmaktan kaçının. Atıkları kapalı kaplarda toplayın ve etiketleyin ve yerel ve ulusal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edin.
  7. Zebra balığı beynini inceleyin
    1. Sabit başlığı temiz bir petri kabına yerleştirin ve sivri uçlu cımbız kullanarak beyni daha önce tarif edildiği gibi15 parçalara ayırın. Dokuyu nemli tutmak ve kurumayı önlemek için diseksiyon sırasında sürekli olarak damla damla 1x PBS ekleyin.
    2. 1 g agarozu 100 mL damıtılmış suda çözerek agaroz plakasını hazırlayın. Tamamen eriyene kadar mikrodalgada pişirin, bir petri kabına dökün ve katılaşmasına izin verin.
    3. Disseke edilmiş beyni iki ayrı 1x PBS banyosunda iki kez durulayın. Ardından, nemi korumak ve büzülmeyi önlemek için dokuyu %1'lik bir agaroz plakasına yerleştirin.
      NOT: Yetersiz yıkama, yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir ve analizin doğruluğunu tehlikeye atabilir. Bunu önlemek için, beyin dokusunu en az iki kez 1× PBS ile iyice yıkayın, tüm görünür kanın ve serbest akışlı boyanın çıkarıldığından emin olun. Herhangi bir boya kalıntısı kalırsa, üçüncü bir yıkama şiddetle tavsiye edilir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Normal ve EB enjekte edilmiş zebra balığı arasındaki cilt renginin karşılaştırılması. (A) Tipik kahverengimsi bir cilt tonu sergileyen normal zebra balığı. (B) EB enjekte edilmiş zebra balığı, boyanın başarılı sistemik dolaşımını gösteren, gözle görülür mavimsi bir renk tonu sergiler. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Bıçak yarası yaralanması (SWI) yoluyla pozitif kontrol sağlayın

NOT: Bıçak yarası yaralanması BBB'yi kırar ve yaralanma bölgesinde EB ekstravazasyonunu sağlar.

  1. Balıkları hipotermik şok yöntemini kullanarak uyuşturun (bkz. adım 2.1). Anestezi uygulandıktan sonra, 20 μL %1 EB boyası enjekte edin ve balığın 2.2 ve 2.3 adımlarında açıklandığı gibi 30 dakika iyileşmesine izin verin.
  2. 30 dakikalık iyileşme süresinden sonra, bir insülin şırıngasına bağlı steril bir 31 G iğne hazırlayın ve aşağıdaki gibi bir bıçak yarası yaralanması prosedürü uygulayın:
    1. Balıkları tekrar uyuşturun.
    2. Balığı düz, soğuk bir yüzeye dik olarak yerleştirin (örn. buz jeli paketi). İğneyi telensefalonun bir tarafına 90° açıyla 1,5 mm'yi geçmeyen bir derinliğe sokun (Şekil 2).
      NOT: Buz jeli paketiyle doğrudan cilt temasını önlemek ve olası cilt hasarını önlemek için, balık ile soğuk yüzey arasına bir gazlı bez veya kağıt havlu tabakası yerleştirin (Şekil 2). Alternatif olarak balık, doğrudan temas olmadan soğutmayı sürdürmek için soğuk paketin üzerine yerleştirilen sığ bir petri kabına yerleştirilebilir. Aşırı penetrasyonu önlemek için iğne üzerinde 1,5 mm işaretleyin.
    3. Balıkları bir geri kazanım tankına aktarın ve 30 dakika dinlenmeye bırakın.
    4. 2.4 ila 2.7. adımlarda açıklandığı gibi beyni ötenazi yapın, başını kesin, düzeltin ve parçalara ayırın.
    5. Negatif kontrol için, EB boyası yerine 2.1 μL 2.7x PBS kullanarak 20 ila 1 arasındaki adımları tekrarlayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Pozitif kontrol için bıçak yarası yaralanması. (A) EB boyasının beyin dokusuna nüfuz etmesini kolaylaştırmak için telensefalona (kırmızı daire) kısaca bir 31G iğne sokun; Yaralanmamış bir beyin ile bıçaklanmış bir beynin yan yana karşılaştırılması, (B) bıçak bölgesinin dorsal görünümü (kırmızı daire), (C) bıçak bölgesinin yandan görünümü. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. EB ekstravazasyonunun kalitatif analizi

  1. Disseke beyin dokularını stereomikroskop altında gözlemleyin. Tutarlılığı sağlamak için görüntü ayarlarını (yakınlaştırma, beyaz dengesi, pozlama, kontrast vb.) optimize edin.
  2. Mikroskop monteli bir kamera kullanarak görüntüleri yakalayın ve . TIFF formatı.
    NOT: Karşılaştırmalı geçerliliği sağlamak için tüm numuneler için aynı görüntüleme ayarlarını kullanın.

5. EB ekstravazasyonunun kantitatif analizi

  1. Fiji'yi indirin ve yükleyin (yazılımı indirmek için bir bağlantı Malzeme Tablosunda mevcuttur). Resmi Fiji'de açın.
  2. Tıklayarak renk ters evrişimi gerçekleştirin: RGB'> Renk > Renk Ters Evrişimi > Görüntü, kırmızı, yeşil ve mavi tonları temsil eden üç ayrı görüntüyle sonuçlanır.
    NOT: Bu adım, mavi tonu diğer renk bileşenlerinden izole ederek yalnızca mavi boyanın yoğunluğunun ölçülmesini sağlar.
  3. Resme tıklayarak mavi kanal görüntüsünü (genellikle "Color_3" olarak etiketlenir) etkinleştirin. Tıklayarak 8 bit gri tonlamaya dönüştürün: Görüntü > Yazın > 8 bit.
    NOT: Gri tonlama dönüştürme, renk bozulmalarını en aza indirir ve yoğunluğa dayalı analizi geliştirir.
  4. 8 bitlik görüntünün gri yoğunluğunu ölçün.
    1. Ölçümleri şu şekilde ayarlayın: Ölçümleri Analiz Et > Ayarla; Alan ve Ortalama gri değer'i seçin.
    2. Dikdörtgen seçim aracını kullanarak, tek tip boyutlu bir ilgi alanı (ROI) çizin ve Analiz > Ölç'ü seçerek veya Ctrl + M tuşlarına basarak gri yoğunluğu ölçün.
      NOT: Tüm örneklerde aynı ROI boyutu kullanılmalıdır. ROI'nin mutlak boyutları, elde edilen görüntünün büyütme ve çözünürlüğüne bağlı olarak değişebilir, bu nedenle araştırmacılar, karşılaştırılabilirliği sağlamak için veri setlerindeki ROI boyutunu standartlaştırmalıdır. 8 bit gri tonlamalı görüntüdeki her piksel, 0 ile 255 arasında değişen bir yoğunluk değerine sahiptir, burada 0 saf siyahı, 255 saf beyazı ve aradaki değerler grinin çeşitli tonlarını temsil eder.
    3. Önyargıyı azaltmak için, tüm örneklerde beynin anatomik olarak tutarlı bölgelerinde üç ila beş yatırım getirisi çizin. Artefaktların veya tutarsız boyamaların olduğu bölgelerden kaçının.
      NOT: Yerleştirme tutarlılığı, anatomik işaretlere atıfta bulunularak ve ROI konumlandırmasının deney grupları arasında simetrik olmasını sağlayarak elde edilebilir.
    4. Beyin başına tek bir yoğunluk değeri elde etmek için her görüntü için ROI'lerden ortalama gri değerlerin ortalamasını alın. Gruplar arasında istatistiksel karşılaştırma için bu ortalamayı kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol bir Parkinson zebra balığı modeli üzerinde test edildi. BBB'nin uzlaşması, PD hastalarında 16,17,18 ve çeşitli Parkinson hayvan modellerinde 19,20,21 iyi belgelenmiş bir olgudur. Yetişkin zebra balığı Parkinson modelinde BBB bütünlüğünü araştırmak için, beyin dokularına EB boya ekstravazasyonu, salin enjekte edilen (kontrol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB'nin bütünlüğünün değerlendirilmesi, beyinle ilgili hastalıkların patofizyolojisini anlamak için gereklidir, çünkü tehlikeye atılmış bir BBB hastalığın ilerlemesine hem neden olabilir hem de kötüleştirebilir4. Yetişkin zebra balığı, nörodejeneratif hastalıkları incelemek için etkili bir model olarak ortaya çıkmış olsa da, bu türde BBB bütünlüğünü değerlendirme yöntemleri az gelişmiş kalmaktadır8. Burada sunulan protokol, nörovaskülatürde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Malezya Yüksek Öğrenim Bakanlığı (MoHE) tarafından Temel Araştırma Hibe Programı (FRGS), hibe numarası FRGS19-125-0734 kapsamında finanse edilmiştir. Bu çalışmanın yayın yardımı, Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM) Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agaroz tozuVivantisPC0701
Evan'ın mavi boyasıSigma-AldrichE2129
Fiji ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri, ABDİndirme bağlantısı: https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mikroskop kamerasıShenzhen Hayear Elektronik Ltd. Şti.HY-500M
Paraformaldehit (PFA) tozuSigma-Aldrich158127
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-AldrichP4417
Sodyum klorür (NaCl)HmbG Kimyasallar7647-14-5
StereomikroskopOlympus ŞirketiSZ40 Serisi
Şırınga filtre ünitesi, 0.45µ mMerck Millipore SLHV004SL

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17, 1-24 (2020).
  2. Knox, E. G., Aburto, M. R., Clarke, G., Cryan, J. F., O'Driscoll, C. M. The blood-brain barrier in aging and neurodegeneration. Mol Psychiatry. 27 (6), 2659-2673 (2022).
  3. Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 14 (3), 133-150 (2018).
  4. Kim, S., Jung, U. J., Kim, S. R. The crucial role of the blood-brain barrier in neurodegenerative diseases: Mechanisms of disruption and therapeutic implications. J Clin Med. 14 (2), 386(2025).
  5. Guarino, V., et al. Advancements in modelling human blood-brain barrier on a chip. Biofabrication. 15 (2), 022003(2023).
  6. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends Pharmacol Sci. 35 (2), 63-75 (2014).
  7. Eliceiri, B. P., Gonzalez, A. M., Baird, A. The blood-brain and other neural barriers: reviews and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2010).
  8. Li, Y., et al. Zebrafish: A promising in vivo model for assessing the delivery of natural products, fluorescence dyes and drugs across the blood-brain barrier. Pharmacol Res. 125, 246-257 (2017).
  9. Fleming, A., Diekmann, H., Goldsmith, P. Functional characterisation of the maturation of the blood-brain barrier in larval zebrafish. PLoS One. 8 (10), e77548(2013).
  10. Kislyuk, S., van den Bosch, W., Adams, E., De Witte, P., Cabooter, D. Development of a sensitive and quantitative capillary LC-UV method to study the uptake of pharmaceuticals in zebrafish brain. Anal Bioanal Chem. 410, 2751-2764 (2018).
  11. Jaffer, H., Adjei, I. M., Labhasetwar, V. Optical imaging to map blood-brain barrier leakage. Sci Rep. 3 (1), 3117(2013).
  12. Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans blue dye: A revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media Mol Imaging. 2018 (1), 7628037(2018).
  13. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83(2019).
  14. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front Neurosci. 18, 1432102(2024).
  15. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. J Vis Exp. (108), e53617(2016).
  16. Al-Bachari, S., Naish, J. H., Parker, G. J., Emsley, H. C., Parkes, L. M. Blood-brain barrier leakage is increased in Parkinson's disease. Front Physiol. 11, 593026(2020).
  17. Gray, M. T., Woulfe, J. M. Striatal blood-brain barrier permeability in Parkinson's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 747-750 (2015).
  18. Hourfar, H., et al. The impact of α-synuclein aggregates on blood-brain barrier integrity in the presence of neurovascular unit cells. Int J Biol Macromol. 229, 305-320 (2023).
  19. Olmedo-Díaz, S., et al. An altered blood-brain barrier contributes to brain iron accumulation and neuroinflammation in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease. Neuroscience. 362, 141-151 (2017).
  20. Ravenstijn, P. G., et al. Evaluation of blood-brain barrier transport and CNS drug metabolism in diseased and control brain after intravenous L-dopa in a unilateral rat model of Parkinson's disease. Fluids Barriers CNS. 9, 1-14 (2012).
  21. Wu, Y. C., Sonninen, T. M., Peltonen, S., Koistinaho, J., Lehtonen, Š Blood-brain barrier and neurodegenerative diseases-modeling with iPSC-derived brain cells. Int J Mol Sci. 22 (14), 7710(2021).
  22. Hosseini, S., et al. Efficient phenotypic sex classification of zebrafish using machine learning methods. Ecol Evol. 9 (23), 13332-13343 (2019).
  23. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. 25 (11), 5601(2024).
  24. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), e2126(2010).
  25. Nishimura, Y., et al. Identification of a novel indoline derivative for in vivo fluorescent imaging of blood-brain barrier disruption in animal models. ACS Chem Neurosci. 4 (8), 1183-1193 (2013).
  26. Schoknecht, K., Eilers, J. Brain-to-blood transport of fluorescein in vitro. Sci Rep. 14 (1), 25572(2024).
  27. Harris, W. J., et al. In vivo methods for imaging blood-brain barrier function and dysfunction. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 50 (4), 1051-1083 (2023).
  28. Hamilton, N., Allen, C., Reynolds, S. Longitudinal MRI brain studies in live adult zebrafish. NMR Biomed. 36 (7), e4891(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Evans Blue BoyasZebrafish ModeliKKB Ge irgenli iN rovask ler De erlendirmeBeyin DiseksiyonuFiji G r nt AnaliziParkinsonlu ZebrafishBoya EkstravazasyonuGri Tonlamal Kantifikasyon

İlgili makaleler