NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi

Özet

Burada, NgTET enzimini kullanarak bakteriyofajlardaki DNA modifikasyonlarını azaltmak, verimli ve izsiz CRISPR-Cas mutajenezi sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, biyoteknoloji ve faj terapisindeki uygulamalar için fajların genetik mühendisliğini kolaylaştırır.

Özet

Özellikle bakteri konakçılarını hedef alan virüsler olan bakteriyofajlar, özellikle çoklu ilaca dirençli enfeksiyonlarla mücadelede biyoteknoloji ve tıp için önemli bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, faj enfeksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde yeterince araştırılmamıştır. Fajların kesin, bölgeye özgü mutajenezi, gen fonksiyonlarını ve faj-konakçı etkileşimlerini aydınlatmak için güçlü bir araçtır.

Bununla birlikte, faj genom mutajenezindeki en büyük zorluk, CRISPR-Cas gibi geleneksel genom düzenleme araçlarına müdahale eden faj DNA modifikasyonlarının varlığıdır.

CRISPR-Cas sistemleri, çeşitli organizmalarda hedeflenen mutajenez için başarıyla kullanılmış olsa da, faj mutajenezindeki etkinlikleri genellikle sitozin glikosilasyonu gibi DNA modifikasyonları ile sınırlıdır. Bu engelin üstesinden gelmek için, faj DNA modifikasyonlarının bolluğunu geçici olarak azaltan, verimli CRISPR-Cas hedeflemesini ve faj genomlarına hassas mutasyon girişini mümkün kılan etkili bir yöntem geliştirdik. Spesifik olarak, DNA'daki metillenmiş ve hidroksimetillenmiş sitozinleri yinelemeli olarak demodifiye eden Naegleria gruberi'den (NgTET) Ten Eleven Translokasyon (TET) metilsitozin dioksijenazı kullanıyoruz. NgTET, faj DNA'sı içindeki hidroksimetillenmiş sitozinleri oksitleyerek, glikosilasyon gibi müteakip sitozin modifikasyonunu önler ve Kas aracılı DNA bölünmesinin etkinliğini önemli ölçüde artırır.

Sonuç olarak, burada sunulan izsiz ve hassas genom düzenleme yaklaşımı, faj genomlarında doğal gen mimarisini korurken nokta mutasyonlarının verimli bir şekilde tanıtılmasını sağlar. Bu yöntem, bozulmamış transkripsiyonel ve translasyonel çerçeveleri koruyarak, karmaşık düzenleyici ağlardaki istenmeyen kesintileri en aza indirir. Bu, özellikle esansiyel veya çok işlevli faj proteinlerini araştırmak için önemlidir. Yabancı diziler eklemeden hedeflenen genetik modifikasyonlar üretme yeteneği, faj biyolojisi için deneysel araç setini önemli ölçüde genişletir. Bu strateji yalnızca ayrıntılı fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda terapötik ve biyoteknolojik uygulamalar için fajların rasyonel mühendisliği potansiyelini de arttırır.

Giriş

Bakteriyofajlar, özellikle bakterileri hedef alan virüslerdir. Biyoteknoloji ve tıpta, özellikle çoklu ilaca dirençli bakterilere karşı mücadelede muazzam potansiyelleri nedeniyle önemli araştırma ilgisi çekmişlerdir ^1,2,3. Buna rağmen, faj biyolojisi nispeten az çalışılmış durumda. Bakteriyel konakçılarını ele geçirmeye yönelik moleküler mekanizmalarının daha derinlemesine anlaşılması, terapötik ve biyoteknolojik potansiyellerinden tam olarak yararlanmak için gereklidir⁴. Verimli faj enfeksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak ve ayrıca fajları belirli uygulamalar için tasarlamak için, faj genomlarını genetik olarak değiştirme yeteneği esastır. Yine de faj biyolojisi alanındaki en önemli zorluklardan biri olmaya devam ediyor ^3,5,6.

Faj DNA'sı genellikle pürin ve pirimidin bazlarının spesifik kimyasal değişiklikleri, örneğin sitozin glikosilasyonu ve metilasyonu ile değiştirilir. Bu modifikasyonlar, faj genetik materyalini, konakçı nükleazlar⁶ tarafından tanınmaya ve bozulmaya karşı korur. Bu modifikasyonlar faj uygunluğu için çok önemli olsa da, DNA hedefleme sistemlerine^dayanan faj genom mühendisliği yaklaşımları için önemli bir engeldir ^2,3,7.

Kısıtlama modifikasyon sistemleri ve Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)-CRISPR ile ilişkili (Cas) protein bazlı teknolojiler dahil olmak üzere mevcut mutajenez stratejileri, sitozin glikosilasyonu⁸ gibi koruyucu epigenetik modifikasyonlar nedeniyle faj DNA'sını değiştirirken önemli zorluklarla karşı karşıyadır. Bakteriyel ve ökaryotik hücrelerde oldukça etkili olan CRISPR-Cas aracılı genom düzenleme, iki temel adıma dayanır: DNA'nın hedeflenen genomik lokuslarda Cas nükleazı tarafından kesin olarak bölünmesi, ardından istenen mutasyonu taşıyan donör DNA ile homolog rekombinasyon yoluyla DNA onarımı¹. Bununla birlikte, fajlarda, DNA modifikasyonları genellikle Cas nükleazlarının genomu verimli bir şekilde bağlamasını veya parçalamasını engeller. Ek olarak, faj replikasyonunun hızlı ve geçici doğası, homolog rekombinasyonun verimliliğini daha da sınırlayabilir. Bu engeller, faj mutajenezi için DNA hedefli CRISPR-Cas teknolojisinin uygulanmasını özellikle zorlaştırmaktadır. Faj DNA modifikasyonlarının, CRISPR-Cas ile faj DNA hedeflemesini hem in vitro hem de in vivo^{olarak bozduğu} gösterilmiştir ^6,7.

Fajlardaki koruyucu DNA modifikasyonlarının yarattığı zorlukların üstesinden gelmek için, on-onbir translokasyon (TET) metilsitozin dioksijenazın, özellikle NgTET'in aktivitesinden yararlanan bir genom mutajenez stratejisi sunuyoruz. Ökaryotlarda, TET enzimleri, yinelemeli işlemlerle metillenmiş sitozinin kademeli oksidasyonunu katalize eder: metilsitozin (5mdC) önce hidroksimetilsitozine (5hmdC), ardından formilsitozine (5fdC) ve son olarak karboksisitozine (5cadC) dönüştürülür (Şekil 1).

Faj mutajenezi yaklaşımımızda, NgTET, koruyucu DNA modifikasyonlarının bolluğunu geçici olarak azaltmak için kullanılır, böylece faj DNA'sının Cas enzimleri⁹ gibi genom düzenleme araçlarına erişilebilirliğini arttırır. NgTET, heterolog bir bakteri konakçısında, özellikle E. coli'de aktif çözünür formda başarılı ekspresyonuna ilişkin önceki raporlar nedeniyle bakteriyofaj genomunu modüle etmek için seçilmiştir. NgTET'in faj enfeksiyonu¹⁰ sırasında aktif kalması gerektiğinden bu özellik önemlidir.

Şekil 1: 5-metilsitozinin TET dioksijenaz¹ ile kademeli oksidasyonu. TET dioksijenaz, 5-metil-2'-deoksisitididin'in (5mdC) 5hmdC'ye, 5-formil-2'-deoksisitidine (5fdC) ve nihayetinde 5-karboksil-2'-deoksisitidine (5cadC) ardışık oksidasyonunu katalize eder. Nihai ürün olan 5cadC, kendiliğinden veya enzimatik olarak değiştirilmemiş sitozine (dC) geri döner ve böylece dinamik epigenetik düzenlemeye katkıda bulunur. Bu çok aşamalı süreç, ökaryotlarda aktif DNA metilasyonunun merkezinde yer alır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Metilsitozin ve hidroksimetilsitozin, glikosilasyonlar gibi hacimli koruyucu yapılar da dahil olmak üzere faj DNA hipermodifikasyonlarının yaygın öncüleri olduğundan, TET dioksijenazın oksidatif aktivitesi, bu DNA hipermodifikasyonlarının oluşumunu önlemek için kullanılabilir⁹. Bu TET tabanlı genom mutajenez yaklaşımında, enfeksiyon üzerine faj genomundaki hidroksimetillenmiş sitozinleri oksitlemek için NgTET'i E. coli'de heterolog olarak rekombinant olarak eksprese ediyoruz, böylece hacimli glikosilasyon oluşumunu önlüyoruz. Yaklaşımımız, bu hacimli DNA modifikasyonlarının bolluğunu azaltarak, faj DNA'sının CRISPR-Cas nükleazlarına erişilebilirliğini artırabilir. Bu gelişmiş erişilebilirlik, verimli hedef tanımayı, hassas DNA bölünmesini ve faj genomuna izsiz nokta mutasyonlarının dahil edilmesini kolaylaştırarak, onu gen silmelerine, raportör gen eklemelerine veya PCR tabanlı mutant seçimi için yapay bağlantıların entegrasyonuna dayanan geleneksel faj mutajenez yöntemlerinden ayırır ^1,11. Bu geleneksel stratejiler, şimdiye kadar faj genomlarında hedeflenen mutajenez için mevcut tek araç olmuştur ve bu nedenle burada sunulan yöntem için önemli bir temeli temsil etmektedir. Bununla birlikte, tek faj proteinleri birden fazla işleve sahip olabilir. İlgilenilen bir proteini kodlayan tüm genin silinmesi, ilişkili tüm fonksiyonları bozar. Buna karşılık, nokta mutasyonlarının hedeflenen şekilde tanıtılması, belirli işlevlerin seçici olarak etkisiz hale getirilmesine izin vererek rollerinin ayrıntılı analizine olanak tanır. Bugüne kadar, birçok faj proteininin işlevleri büyük ölçüde karakterize edilmemiştir; bu nedenle, belirli bir gene bağlı ek aktiviteleri gözden kaçırabiliriz. Bu nedenle, genel proteinde minimum değişikliklere neden olurken yalnızca tek bir işlevi ortadan kaldırmayı amaçlayan minimalist bir yaklaşım tercih edilmektedir^12,13. Burada açıklanan yöntem, genel genomik organizasyonu veya işlevi bozmadan hassas genetik modifikasyonlara olanak tanır. Önceki faj mutajenez yöntemlerinin bir diğer büyük zorluğu, tipik olarak yaklaşık %0.1'lik mutasyon oranları veren düşük verimlilikleri olmuştur ^1,11. Bu teknikle, hedefleme verimliliğinde yedi kat kayda değer bir artış elde ederek, tek kodon değişiklikleri getirebilen ilk mutajenez stratejisini sunuyoruz. ONT tabanlı yüksek verimli bir tarama yöntemiyle birleştirilerek, nokta mutasyonlarının tespiti basitleştirilir ve bir mutantı izole etmek için büyük faj popülasyonlarını tarama ihtiyacı ortadan kalkar. Burada açıklanan TET tabanlı mutajenez stratejisi, bu alanda uzun süredir devam eden bir sınırlamayı ele alır ve daha güvenilir genom düzenlemesi sağlar¹⁴.

Genel olarak, bu yöntem yalnızca bakteriyofaj enfeksiyon mekanizmalarına ilişkin anlayışımızı ilerletmek için uygulanamaz, aynı zamanda sentetik biyoloji için de önemli umut vaat etmektedir. Hassas ve etkili faj genom mühendisliğini mümkün kılarak, fajların belirli uygulamalara göre uyarlanmasının önünü açıyor ve böylece biyoteknolojik ve tıbbi uygulamalara yönelik potansiyellerini artırıyor.

Protokol

NgTET ile muamele edilmiş T4 fajının oluşumunu gösteren bir şema Şekil 2'de gösterilmektedir.

Şekil 2: T4 faj mutajenezi ve mutant taraması için yerleşik iş akışına şematik genel bakış. İş akışı, LC-MS analizi veya alternatif olarak CRISPR-Cas bölünme testi ile doğrulanabilen NgTET kullanılarak hipomodifiye T4 fajının üretilmesini içerir. Daha sonra, ilgilenilen mutasyon, CRISPR-Cas aracılı bölgeye yönelik mutajenez yoluyla faj genomuna dahil edilir ve karşı seçim ile tanımlanır. İstenen mutasyonun varlığı daha sonra Nanopore dizilimi kullanılarak doğrulanabilir. Doğrulamayı takiben, mutant faj, DNA hipermodifikasyonlarını eski haline getirmek için çoğaltılabilir. Bu, tasarlanmış fajın, lizis tahlilleri ve patlama boyutu ölçümleri yoluyla enfeksiyon fenotiplerinin analizi de dahil olmak üzere, aşağı akış uygulamalarında kullanılmasını sağlar. Şekildeki her adım, protokol adımlarının şeklin ilgili bölümleriyle bağlanmasını kolaylaştırmak için parantez içinde karşılık gelen protokol numarasıyla açıklanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. NgTET ön tedavisini kullanarak faj DNA modifikasyonlarının azaltılması (~2 gün)

NOT: Bu adım, faj DNA modifikasyonlarının bolluğunu azaltarak mutajenez sırasında verimli Cas nükleaz hedeflemesini sağlamak için kritik öneme sahiptir.

1. Materyali bir gliserol stoğundan 30 μg/mL kanamisin ile desteklenmiş 10 mL LB ortamına aktararak pET28a_NgTET ile dönüştürülmüş E. coli BL21 (DE3) suşunu aşılayın. Gece boyunca 37 °C'de 160 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
2. Ertesi gün, bir ana kültürü 30 μg/mL kanamisin içeren 50 mL LB ortamında 0.1'lik bir başlangıç OD_600'e aşılamak için gece kültürünü kullanın. 0,4'lük bir OD_600'e ulaşıldığında kültürü 50 μM IPTG ile indükleyin.
3. Kültürü 37 °C'de, 160 rpm'de çalkalayarak OD₆₀₀ 0.8'e ulaşana kadar büyütün.
4. Kültürü, 0.1'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) ilgilenilen faj ile enfekte edin ve 120 rpm'de çalkalayarak oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin.
5. Hücreleri 4000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyerek hasat edin.
6. Hipomodifiye DNA ile NgTET ile muamele edilmiş fajlar elde etmek için süpernatanı 0.45 μm'lik bir filtreden geçirin. Filtrelenmiş fajları ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
   NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Filtrelenmiş fajlar, bir cam şişede LB ortamında saklanarak 4 °C'de birkaç ay stabildir.

2. Doğrulama

NOT: Bu adımın amacı, faj DNA modifikasyonlarının bolluğunun azaldığını deneysel olarak doğrulamaktır.

1. LC-MS ile tedavi validasyonu (~ 2 gün)
   1. Sükroz gradyanı yoluyla faj saflaştırması
      1. Artık nükleik asidi lizattan çıkarmak için, 500 μL faj süspansiyonunu (>10¹⁰ PFU/mL) 20 U DNase I ve 2 μL RNase A/T1 Karışımı (4 μg RNase A, 10 U RNase T1) ile işleyin.
      2. Karışımı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      3. TM tamponunda (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 7.5) %0-45'lik bir sükroz gradyanı hazırlayın. Degradeyi bir degrade karıştırıcı kullanarak veya manuel olarak hazırlayın.
         NOT: Manuel hazırlık için, 5 mL TM tamponunu bir gradyan tüpüne pipetleyerek başlayın. Daha sonra, künt uçlu bir kanül kullanarak, tüpün dibinden 5 mL E sükroz çözeltisini yavaşça pipetleyin ve %0'lık çözeltinin kademeli olarak yükselmesine izin verin.
      4. Gradyanın üzerine 500 μL işlenmiş faj çözeltisi yükleyin.
      5. 4 °C'de 20 dakika boyunca 70.000 × g'da santrifüjleyin.
      6. Santrifüj tüpünü alttan yakın. Bu, gradyanda bulanık bir bant olarak görünen fajın görselleştirilmesine izin verecektir. Faj içeren fraksiyonu künt bir kanül kullanarak dikkatlice çıkarın.
      7. Ekstrakte edilen faj fraksiyonunu yeni bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
      8. 30 mL buz gibi soğuk TM tamponu ekleyin ve 4 °C'de 1 saat boyunca 100.000 × g'da santrifüjleyin.
      9. Süpernatanı atın ve peleti 500 μL TM tamponunda yeniden süspanse edin.
      10. Yeniden süspanse edilen fajları gece boyunca 4 °C'de bir cam şişede saklayın.
   2. Faj DNA izolasyonu
      1. Yeniden süspanse edilen fajlara 1 μg Proteinaz K ekleyin.
      2. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      3. 1 hacim fenol/kloroform/izoamil alkol (P/C/I) karışımı ekleyin. Ters çevirerek karıştırın. Fazları 4 °C'de 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleme ile ayırın. Sulu fazı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Çıkarma işlemini üç kez tekrarlayın.
         DİKKAT: Fenol/kloroform/izoamil alkol (P/C/I) oldukça toksik, aşındırıcı ve uçucudur. Laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve çift nitril eldiven dahil olmak üzere uygun koruyucu ekipman giyerek her zaman çeker ocak içinde tutun. Cilt ve göz temasından kaçının ve sıkıca kapatılmış bir kapta, belirlenmiş bir kimyasal dolapta saklayın. Atıkları onaylı tehlikeli atık kanalları aracılığıyla bertaraf edin. Temas halinde derhal su ile yıkayın ve tıbbi yardım alın.
      4. Artık fenolü uzaklaştırmak için, 1 hacim kloroform ile üç kez kloroform geri ekstraksiyonu gerçekleştirin.
      5. DNA'yı gece boyunca 0.1 hacim 3 M NaOAc (pH 5.5) ve 2.5 hacim etanol ile -20 °C'de çökeltin.
      6. Ertesi gün, DNA'yı 4 °C'de 1 saat boyunca 15.000 × g'da santrifüjleme ile peletleyin.
      7. DNA peletini 200 μL p etanol ile iki kez yıkayın, hafifçe çalkalayın, 4 °C'de 15 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.
      8. Saflaştırılmış DNA'yı ultra saf suda yeniden süspanse edin.
      9. DNA'yı daha fazla kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
         NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Çökeltilmiş DNA, -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.
   3. LC-MS analizi için faj DNA'sının hazırlanması
      1. Saflaştırılmış DNA'yı bir Nükleozid Sindirim Karışımı kullanarak tek nükleositlere sindirin.
      2. LC-MS ile DNA bileşiminin analizi.
         NOT: Bu adım, NgTET tedavisinin etkinliğinin doğrulanmasını sağlar. Protokol, laboratuvarda bulunan belirli ekipmana ve sütuna uyarlanmıştır, ancak mevcut kaynaklara ve koşullara göre ayarlanabilir.
      3. Saflaştırılmış fajdan izole edilmiş sindirilmiş DNA kullanın (adım 2.1.10).
      4. Ölçümler için piyasada bulunan aşağıdaki standartları ekleyin: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Varsa, faj DNA'sında bulunan sitozin hipermodifikasyonunun standardını ekleyin.
      5. Bir C18 kolonu (150 × 2,1 mm, 100 Å, 3 μm) ve 20 × 2,1 mm koruma kolonu ile donatılmış bir HPLC sistemi kullanın.
      6. Kolon sıcaklığını 40 °C'ye ve eluent akış hızını 0,2 mL/dk'ya ayarlayın.
      7. Eluentleri aşağıdaki gibi hazırlayın:
         Eluent A: Suda 10 mM Amonyum Asetat (pH 4.5).
         Eluent B: Metanol içinde %0.1 formik asit.
         DİKKAT: Metanoldeki %0,1 formik asit yanıcıdır ve cildi, gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir. Daima iyi havalandırılan bir alanda veya çeker ocakta kullanın. Laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve nitril eldiven dahil uygun koruyucu ekipman kullanın. Isıdan, kıvılcımlardan ve açık alevlerden uzak tutun. Yanıcı bir saklama dolabında saklayın. Onaylı tehlikeli atık protokolleri ile bertaraf edin.
      9. 
         
2. 
   

1. 1. 
      
2. 
   

1. 3. 
      
2. 
   
   2. 
      
   6. 
      
   9. 
      

7. 
   
8. 2. 
      

Sonuçlar

Gradyandaki faj bandının tanımlanması.
Gradyandaki faj bandının görünürlüğü, gradyan üzerine yüklenen ilk numunedeki faj konsantrasyonuna bağlıdır. Faj yeterince konsantre olduğunda (~>1 × 10¹¹ PFU/mL), gradyan bir ışık kaynağı ile alttan aydınlatılarak bant net bir şekilde görülebilir (bkz. Şekil 3).

Bununla birlikte, düşük faj konsantrasyonlarında bant kolayca görülemeyebilir. Bu durumda, fajların tespit edilmesini sağlayabilece...

Tartışma

Bu çalışma, tek nükleotid değişiklikleri de dahil olmak üzere bakteriyofaj genomlarına kesin nokta mutasyonları eklemek için sağlam ve uyarlanabilir bir strateji sunmaktadır. İş akışının merkezi bir unsuru, genom düzenlemenin hem doğruluğunu hem de verimliliğini sağlamak için gerekli olan sıkı doğrulama adımlarının her aşamada entegrasyonudur. Bu, iş akışının çok adımlı doğası ve faj mutajenezinin başarısını doğrudan etkileyebilecek çok sayıda değişkeni ortaya çıkaran fajlar ile bakteriy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL reaksiyon tüpleri	Sarstedt	72.690.001
15 mL Kanocial Tüpler	Sarstedt	62.554.502
15 mL Üstü Açık İnce Duvarlı Polipropilen Tüpler	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	361706	16 mm x 95 mm (ultrasantrifüjleme için)
50 mL kanonik tüpler	Sarstedt	62.547.254
5x GC arabelleği	Thermo Fisher Scientific	F519L Serisi
6x TriTrack DNA Yükleme Boyası	Thermo Fisher Scientific	R1161 Serisi
Agaroz	Meridyen BİYOBİLİMİ	BIO-41025	Moleküler Sınıf
Avanti J-30I Santrifüj	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	katalog yok  sayı	Serien-No. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Borik asit	Merck	10043-35-3
BsaI-HF v2	NEB	R3733S
Kalsiyumklorid Heksahidrat	ACROS ORGANİK	7774-34-7	%97, ekstra saf
Hücre yoğunluğu ölçer	Harvard Biochrom	80211630
ChemiDoc MP	Biorad Hakkında	12003154
Kloroform	VWR	650498
Küvetler	Sarstedt	67.742
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma Aldrich	D4540 Serisi
Di-Sodyum hidrojen fosfat	neoFroxx GmbH	7558-79-4	İlaç sınıfı
Tek Kullanımlık Cam Pastör Pipetleri	VWR	612-1702	230 mm
DNase I	Roche	4716728001	10 U/µ L
dNTP karışımı (her dNTP'de 10 mM)	Sigma-Aldrich	72004
DS_SPcas_ModA	Şirket içi ürün.	https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps	CRISPR-Cas12/ModA sgRNA içeren plazmit yapısı
DS-spCas (CRISPR-Cas9 sistemi)	Addgene	48645 (addgene aksesuar numarası)	Faj mutajenezi için Spacer İçeren CRISPR-Cas Plazmitlerinin (CRISPR-Cas9 sistemi) Yapımı için Plazmit (adım 3.2)
T4 enfeksiyonu için E. coli B Suşu Suşu kullanıldı	DSMZ Dili	katalog yok  sayı	Escherichia coli (Migula 1895) Castellani ve Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) Ekspresyon suşu, yetkin hücre	Davetli	C600003	Ekspresyon suşu, yetkin hücreler.
E. coli DH5&alfa; Suşu klonlama, yetkin hücreler	Davetli	18265017	Klonlama suşu, yetkin hücreler.
EDTA	Roth	8043.2
Etanol (mutlak)	VWR	200-578-6
Flongle Akış Hücresi	Oxford Nanopore Teknolojileri	katalog yok  sayı	R10.4.1. kimya, https://nanoporetech.com/document/flongle
Gene JET Plazmid Miniprep Kiti	Thermo Fisher Scientific	10242490
GeneRuler 1 kb Artı DNA merdiveni	Thermo Fisher Scientific	SM1331 Serisi
GeneRuler ULR DNA merdiveni	Thermo Fisher Scientific	SM1213 Serisi
Degrade Ustası 108	BIYOCOMP	katalog yok  sayı	https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Heraeus Pico 17 Santrifüj	Termo Bilimsel	75002410
Infors HT İnkübatörü Minitron	Bilgi AG	katalog yok  sayı	https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
İzopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1
Kanamisin	Carl Roth	T832.1
LB-Agar	Carl-Roth Hakkında	X969.1
LB-orta (Luria/Miller)	Carl-Roth Hakkında	X968.1
Magnezyum klorür heksahidrat	Sigma-Aldrich	7791-18-6
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	7487-88-9
MinION cihazı	Oxfrod Nanopore Teknolojileri	katalog yok  sayı	https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fw	IDT	GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT	ModA E165A için nokta mutasyonunun tanıtılması ve Golden Gate Klonlama için yapışkan uçların tanıtılması için ileri astar (Adım 3.1)
ModA E165A_rev	IDT	CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC	ModA E165A için nokta mutasyonunun eklenmesi ve Golden Gate Klonlama için yapışkan uçların eklenmesi için ters astar (Adım 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fw	IDT	TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG	Faj mutajenezi ve karşı seçim için CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 sistemleri için ara parça oluşturmak için ileri primer (adım 3.2 ve adım 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_rev	IDT	AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC	Faj mutajenezi ve karşı seçim için CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 sistemleri için ara parça oluşturmak için ters primer (adım 3.2 ve adım 4.1)
NanoDrop ND-1000 Spektrofotometre	Thermo Fisher Bilimsel	AZY2019944
NucleoMag Kit	Machery Nagel	REFERANS 744970.50
Nükleozid sindirim karışımı	New England Biyolaboratuvarları	M0649S
pBA560 (CRISPR-Cas13 sistemi)	Addgene	186236 (addgene aksesuar numarası)	Karşı seçim için plazmit kodlama CRISPR-Cas13 sistemi (adım 4.1)
pCpfl-sp plazmidi (CRISPR-Cas12 sistemi)	Addgene	122186
pCpfl-sp plazmidi (CRISPR-Cas12 sistemi)	Addgene	122186 (addgene aksesuar numarası)	Faj mutajenezi için Spacer İçeren CRISPR-Cas Plazmitlerinin (CRISPR-Cas12 sistemi) Yapımı için Plazmit (adım 3.2)
PCR reaksiyon damarları	Sarstedt	72.991.002
PeqYEŞİL	VWR	732-3196
pET28a_NgTET	Şirket içi ürün.	katalog yok  sayı	Plazmit istek üzerine temin edilebilir, plazmit haritası aşağıdaki https://zenodo.org/records/10615143  bulunabilir;
pET28a_NgTET	Şirket içi ürün.	katalog yok  sayı	Golden Gate Klonlama (adım 3.1) yoluyla pET28a_NgTET_donor DNA yapımı için plazmit, plazmit  istek üzerine temin edilebilir, plazmit haritası aşağıdaki https://zenodo.org/records/10615143  bulunabilir;
Petri Plakaları	Sarstedt	82.1473.001	92 x 16 mm kamlarla birlikte
Phusion DNA Polimeraz	Thermo Fisher Scientific	F-530XL Serisi	2 U/µ L
Potasyum fosfat	Sigma Aldrich	7778-77-0	Tek temel
PowerPac Evrensel Güç Kaynağı	Biyo Rad	1645070
Proteinaz K	Carl Roth	7528.1	100 mg/mL
QIAquick PCR Arıtma Kiti	QIAGEN	28506
Quantus Florometre, QuantiFluor dsDNA sistemi	Promega	E2670 (İngilizce)
RNase A/T1	Thermo Fisher Bilimsel	EN0551 (İngilizce)	2 mg/mL RNase A 5000 U/mL RNase T1  karıştırın;
Roti-Aqua P/C/I DNA ekstraksiyonu için	Carl Roth	X985.1
Sodyum asetat	Sigma-Aldrich	127-09-3
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	7647-14-5
SQK-LSK109 Ligasyon dizileme kiti	Oxford Nanopore Teknolojileri	katalog yok  sayı	https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Steritop filtreler, 0.22 µ m gözenek boyutu	Kırlangıç	S2GPT05RE	250 mL ve 500 mL
Streptomisin 50 mg/L	Carl Roth	HP66.1
Sükroz	NeoFroxx GmbH	57-50-1	moleküler biyoloji için
Sallanan Kova Alüminyum Rotor	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	JS[1]24.15
T4 DNA Ligaz 5 U/µ L	Thermo Fisher Scientific	EL0011
T4 DNA Ligaz Tamponu	Thermo Fisher Scientific	B69
Test tüpleri, ağır duvarlı - çerçevesiz	Karl Hecht GmbH	42775054	100 mm x 18 mm
Termal döngüleyici, T100	Biorad Hakkında	1861096
Termomikser konforu	Eppendorf Belediyesi	5382000015
Trizma Baza	Sigma Aldrich	77-86-1
Su banyosu, VWB2	VWR	462-0557	12 L hacim