Burada, NgTET enzimini kullanarak bakteriyofajlardaki DNA modifikasyonlarını azaltmak, verimli ve izsiz CRISPR-Cas mutajenezi sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, biyoteknoloji ve faj terapisindeki uygulamalar için fajların genetik mühendisliğini kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
NgTET Destekli CRISPR-Cas Sistemleri ile Hassas Faj Mutajenezi
Bu makalede
Özet
Özet
Özellikle bakteri konakçılarını hedef alan virüsler olan bakteriyofajlar, özellikle çoklu ilaca dirençli enfeksiyonlarla mücadelede biyoteknoloji ve tıp için önemli bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, faj enfeksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde yeterince araştırılmamıştır. Fajların kesin, bölgeye özgü mutajenezi, gen fonksiyonlarını ve faj-konakçı etkileşimlerini aydınlatmak için güçlü bir araçtır.
Bununla birlikte, faj genom mutajenezindeki en büyük zorluk, CRISPR-Cas gibi geleneksel genom düzenleme araçlarına müdahale eden faj DNA modifikasyonlarının varlığıdır.
CRISPR-Cas sistemleri, çeşitli organizmalarda hedeflenen mutajenez için başarıyla kullanılmış olsa da, faj mutajenezindeki etkinlikleri genellikle sitozin glikosilasyonu gibi DNA modifikasyonları ile sınırlıdır. Bu engelin üstesinden gelmek için, faj DNA modifikasyonlarının bolluğunu geçici olarak azaltan, verimli CRISPR-Cas hedeflemesini ve faj genomlarına hassas mutasyon girişini mümkün kılan etkili bir yöntem geliştirdik. Spesifik olarak, DNA'daki metillenmiş ve hidroksimetillenmiş sitozinleri yinelemeli olarak demodifiye eden Naegleria gruberi'den (NgTET) Ten Eleven Translokasyon (TET) metilsitozin dioksijenazı kullanıyoruz. NgTET, faj DNA'sı içindeki hidroksimetillenmiş sitozinleri oksitleyerek, glikosilasyon gibi müteakip sitozin modifikasyonunu önler ve Kas aracılı DNA bölünmesinin etkinliğini önemli ölçüde artırır.
Sonuç olarak, burada sunulan izsiz ve hassas genom düzenleme yaklaşımı, faj genomlarında doğal gen mimarisini korurken nokta mutasyonlarının verimli bir şekilde tanıtılmasını sağlar. Bu yöntem, bozulmamış transkripsiyonel ve translasyonel çerçeveleri koruyarak, karmaşık düzenleyici ağlardaki istenmeyen kesintileri en aza indirir. Bu, özellikle esansiyel veya çok işlevli faj proteinlerini araştırmak için önemlidir. Yabancı diziler eklemeden hedeflenen genetik modifikasyonlar üretme yeteneği, faj biyolojisi için deneysel araç setini önemli ölçüde genişletir. Bu strateji yalnızca ayrıntılı fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda terapötik ve biyoteknolojik uygulamalar için fajların rasyonel mühendisliği potansiyelini de arttırır.
Giriş
Bakteriyofajlar, özellikle bakterileri hedef alan virüslerdir. Biyoteknoloji ve tıpta, özellikle çoklu ilaca dirençli bakterilere karşı mücadelede muazzam potansiyelleri nedeniyle önemli araştırma ilgisi çekmişlerdir 1,2,3. Buna rağmen, faj biyolojisi nispeten az çalışılmış durumda. Bakteriyel konakçılarını ele geçirmeye yönelik moleküler mekanizmalarının daha derinlemesine anlaşılması, terapötik ve biyoteknolojik potansiyellerinden tam olarak yararlanmak için gereklidir4. Verimli faj enfeksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak ve a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NgTET ile muamele edilmiş T4 fajının oluşumunu gösteren bir şema Şekil 2'de gösterilmektedir.
Şekil 2: T4 faj mutajenezi ve mutant taraması için yerleşik iş akışına şematik genel bakış. İş akışı, LC-MS analizi veya alternatif olarak CRISPR-Cas bölünme testi ile doğrulanabilen NgTET kullanılarak hipomodifiye T4 fajının üretilmesini içerir. Daha sonra, ilgilenilen mutasyon, CRISPR-Cas aracılı bölgeye yöneli....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gradyandaki faj bandının tanımlanması.
Gradyandaki faj bandının görünürlüğü, gradyan üzerine yüklenen ilk numunedeki faj konsantrasyonuna bağlıdır. Faj yeterince konsantre olduğunda (~>1 × 1011 PFU/mL), gradyan bir ışık kaynağı ile alttan aydınlatılarak bant net bir şekilde görülebilir (bkz. Şekil 3).
Bununla birlikte, düşük faj konsantrasyonlarında bant kolayca görülemeyebilir. Bu durumda, fajların tespit edilmesini sağlayabilece.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, tek nükleotid değişiklikleri de dahil olmak üzere bakteriyofaj genomlarına kesin nokta mutasyonları eklemek için sağlam ve uyarlanabilir bir strateji sunmaktadır. İş akışının merkezi bir unsuru, genom düzenlemenin hem doğruluğunu hem de verimliliğini sağlamak için gerekli olan sıkı doğrulama adımlarının her aşamada entegrasyonudur. Bu, iş akışının çok adımlı doğası ve faj mutajenezinin başarısını doğrudan etkileyebilecek çok sayıda değişkeni ortaya çıkaran fajlar ile bakteriy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
KH ve NP, "Faj Mühendisliği" için Avrupa Patent Başvurusu, Avrupa Patent Başvurusu No. 23 175 257.7 başvurusunda bulundu. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu proje, Alman Araştırma Konseyi'nden (DFG; Max Planck Topluluğu'ndan SPP 2330 proje numarası 464500427, RTG 2355 proje 11 ve RTG 2937 (proje numarası 505997786) (Max Planck Araştırma Grubu Lideri finansmanı K.H.'ye).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL reaksiyon tüpleri | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL Kanocial Tüpler | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 15 mL Üstü Açık İnce Duvarlı Polipropilen Tüpler | Beckman Coulter Yaşam Bilimleri | 361706 | 16 mm x 95 mm (ultrasantrifüjleme için) |
| 50 mL kanonik tüpler | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 5x GC arabelleği | Thermo Fisher Scientific | F519L Serisi | |
| 6x TriTrack DNA Yükleme Boyası | Thermo Fisher Scientific | R1161 Serisi | |
| Agaroz | Meridyen BİYOBİLİMİ | BIO-41025 | Moleküler Sınıf |
| Avanti J-30I Santrifüj | Beckman Coulter Yaşam Bilimleri | katalog yok sayı | Serien-No. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe |
| Borik asit | Merck | 10043-35-3 | |
| BsaI-HF v2 | NEB | R3733S | |
| Kalsiyumklorid Heksahidrat | ACROS ORGANİK | 7774-34-7 | %97, ekstra saf |
| Hücre yoğunluğu ölçer | Harvard Biochrom | 80211630 | |
| ChemiDoc MP | Biorad Hakkında | 12003154 | |
| Kloroform | VWR | 650498 | |
| Küvetler | Sarstedt | 67.742 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma Aldrich | D4540 Serisi | |
| Di-Sodyum hidrojen fosfat | neoFroxx GmbH | 7558-79-4 | İlaç sınıfı |
| Tek Kullanımlık Cam Pastör Pipetleri | VWR | 612-1702 | 230 mm |
| DNase I | Roche | 4716728001 | 10 U/µ L |
| dNTP karışımı (her dNTP'de 10 mM) | Sigma-Aldrich | 72004 | |
| DS_SPcas_ModA | Şirket içi ürün. | https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps | CRISPR-Cas12/ModA sgRNA içeren plazmit yapısı |
| DS-spCas (CRISPR-Cas9 sistemi) | Addgene | 48645 (addgene aksesuar numarası) | Faj mutajenezi için Spacer İçeren CRISPR-Cas Plazmitlerinin (CRISPR-Cas9 sistemi) Yapımı için Plazmit (adım 3.2) |
| T4 enfeksiyonu için E. coli B Suşu Suşu kullanıldı | DSMZ Dili | katalog yok sayı | Escherichia coli (Migula 1895) Castellani ve Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303) |
| E. coli BL21 (DE3) Ekspresyon suşu, yetkin hücre | Davetli | C600003 | Ekspresyon suşu, yetkin hücreler. |
| E. coli DH5&alfa; Suşu klonlama, yetkin hücreler | Davetli | 18265017 | Klonlama suşu, yetkin hücreler. |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Etanol (mutlak) | VWR | 200-578-6 | |
| Flongle Akış Hücresi | Oxford Nanopore Teknolojileri | katalog yok sayı | R10.4.1. kimya, https://nanoporetech.com/document/flongle |
| Gene JET Plazmid Miniprep Kiti | Thermo Fisher Scientific | 10242490 | |
| GeneRuler 1 kb Artı DNA merdiveni | Thermo Fisher Scientific | SM1331 Serisi | |
| GeneRuler ULR DNA merdiveni | Thermo Fisher Scientific | SM1213 Serisi | |
| Degrade Ustası 108 | BIYOCOMP | katalog yok sayı | https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming |
| Heraeus Pico 17 Santrifüj | Termo Bilimsel | 75002410 | |
| Infors HT İnkübatörü Minitron | Bilgi AG | katalog yok sayı | https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs |
| İzopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) | Sigma-Aldrich | 367-93-1 | |
| Kanamisin | Carl Roth | T832.1 | |
| LB-Agar | Carl-Roth Hakkında | X969.1 | |
| LB-orta (Luria/Miller) | Carl-Roth Hakkında | X968.1 | |
| Magnezyum klorür heksahidrat | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Magnezyum sülfat | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| MinION cihazı | Oxfrod Nanopore Teknolojileri | katalog yok sayı | https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html |
| ModA E165A_fw | IDT | GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT | ModA E165A için nokta mutasyonunun tanıtılması ve Golden Gate Klonlama için yapışkan uçların tanıtılması için ileri astar (Adım 3.1) |
| ModA E165A_rev | IDT | CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC | ModA E165A için nokta mutasyonunun eklenmesi ve Golden Gate Klonlama için yapışkan uçların eklenmesi için ters astar (Adım 3.1) |
| ModA_sgRNA_Cas12_fw | IDT | TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG | Faj mutajenezi ve karşı seçim için CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 sistemleri için ara parça oluşturmak için ileri primer (adım 3.2 ve adım 4.1) |
| ModA_sgRNA_Cas12_rev | IDT | AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC | Faj mutajenezi ve karşı seçim için CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 sistemleri için ara parça oluşturmak için ters primer (adım 3.2 ve adım 4.1) |
| NanoDrop ND-1000 Spektrofotometre | Thermo Fisher Bilimsel | AZY2019944 | |
| NucleoMag Kit | Machery Nagel | REFERANS 744970.50 | |
| Nükleozid sindirim karışımı | New England Biyolaboratuvarları | M0649S | |
| pBA560 (CRISPR-Cas13 sistemi) | Addgene | 186236 (addgene aksesuar numarası) | Karşı seçim için plazmit kodlama CRISPR-Cas13 sistemi (adım 4.1) |
| pCpfl-sp plazmidi (CRISPR-Cas12 sistemi) | Addgene | 122186 | |
| pCpfl-sp plazmidi (CRISPR-Cas12 sistemi) | Addgene | 122186 (addgene aksesuar numarası) | Faj mutajenezi için Spacer İçeren CRISPR-Cas Plazmitlerinin (CRISPR-Cas12 sistemi) Yapımı için Plazmit (adım 3.2) |
| PCR reaksiyon damarları | Sarstedt | 72.991.002 | |
| PeqYEŞİL | VWR | 732-3196 | |
| pET28a_NgTET | Şirket içi ürün. | katalog yok sayı | Plazmit istek üzerine temin edilebilir, plazmit haritası aşağıdaki https://zenodo.org/records/10615143 bulunabilir; |
| pET28a_NgTET | Şirket içi ürün. | katalog yok sayı | Golden Gate Klonlama (adım 3.1) yoluyla pET28a_NgTET_donor DNA yapımı için plazmit, plazmit istek üzerine temin edilebilir, plazmit haritası aşağıdaki https://zenodo.org/records/10615143 bulunabilir; |
| Petri Plakaları | Sarstedt | 82.1473.001 | 92 x 16 mm kamlarla birlikte |
| Phusion DNA Polimeraz | Thermo Fisher Scientific | F-530XL Serisi | 2 U/µ L |
| Potasyum fosfat | Sigma Aldrich | 7778-77-0 | Tek temel |
| PowerPac Evrensel Güç Kaynağı | Biyo Rad | 1645070 | |
| Proteinaz K | Carl Roth | 7528.1 | 100 mg/mL |
| QIAquick PCR Arıtma Kiti | QIAGEN | 28506 | |
| Quantus Florometre, QuantiFluor dsDNA sistemi | Promega | E2670 (İngilizce) | |
| RNase A/T1 | Thermo Fisher Bilimsel | EN0551 (İngilizce) | 2 mg/mL RNase A 5000 U/mL RNase T1 karıştırın; |
| Roti-Aqua P/C/I DNA ekstraksiyonu için | Carl Roth | X985.1 | |
| Sodyum asetat | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| SQK-LSK109 Ligasyon dizileme kiti | Oxford Nanopore Teknolojileri | katalog yok sayı | https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109 |
| Steritop filtreler, 0.22 µ m gözenek boyutu | Kırlangıç | S2GPT05RE | 250 mL ve 500 mL |
| Streptomisin 50 mg/L | Carl Roth | HP66.1 | |
| Sükroz | NeoFroxx GmbH | 57-50-1 | moleküler biyoloji için |
| Sallanan Kova Alüminyum Rotor | Beckman Coulter Yaşam Bilimleri | JS[1]24.15 | |
| T4 DNA Ligaz 5 U/µ L | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 DNA Ligaz Tamponu | Thermo Fisher Scientific | B69 | |
| Test tüpleri, ağır duvarlı - çerçevesiz | Karl Hecht GmbH | 42775054 | 100 mm x 18 mm |
| Termal döngüleyici, T100 | Biorad Hakkında | 1861096 | |
| Termomikser konforu | Eppendorf Belediyesi | 5382000015 | |
| Trizma Baza | Sigma Aldrich | 77-86-1 | |
| Su banyosu, VWB2 | VWR | 462-0557 | 12 L hacim |
Kaynaklar
- Pozhydaieva, N., et al. Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications. PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).
- Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
