Yöntem makalesi

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/69026

⸱

5 Aralık 2025

 ,  ,  , 
1Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2The Boyce Thompson Institute for Plant Research, 3Department of Biology, University of Ottawa

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki enfeksiyonu sırasında mikroplar, bitki hücreleri tarafından tespit edilen ve stres yanıtlarını tetikleyen yapısal olarak çeşitli ikincil metabolitler salgılar. Bu yöntemde, aynı yaprak disk örneğinde iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimi ölçülür. İlk olarak, Arabidopsis veya arpa yaprağı diskleri 96 delikli bir plakaya vakum sızdırılır. 4-6 saat sonra iletkenlik ölçülür, ardından 24 saat içinde peroksidaz aktivitesi ve kallos birikintisi yapılır. flg22 peptidi üç yanıtı da indükler ve uygun fiyatlı bir pozitif kontrol sunar. Surfactin ve gramillin siklik lipopeptidler sırasıyla peroksidaz aktivitesi ve iyon sızıntısı oluştururken, fitotoksik T-2 trikotesen peroksidaz aktivitesini baskılar. Genel olarak, bu yaklaşım bitki genotipleri veya metabolit tedavileri arasında çoklu karşılaştırmalar yapılmasını sağlar. Bu yaklaşım, stres modüle eden bileşikleri belirlemek amacıyla kimyasal genetik veya biyokorumaya uygulanabilir ve daha ileri çalışmalar için kullanılabilir. Bitki genetiğinde, bu yaklaşım bitki popülasyonları arasında yanıtları genetik haritalama için karşılaştırmak ve bitki-mikrop etkileşimlerini daha iyi anlamak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler, çeşitli mikrobiyal moleküllere yanıt vererek hücresel stres yanıtlarını aktive eder ve bu da hastalık direncine yol açabilir. Bakteriyelden alınan flg22 peptidi gibi mikrobla ilişkili moleküler desenler (MAMP'ler), bitki reseptör proteinleri tarafından tespit edilir ve çeşitli hücresel sinyal yanıtları başlatılır. Bunlar arasında kinaz kaskadları, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, kalsiyum yükselmesi, membran depolarizasyonu ve kalloz birikintisi ile peroksidaz aktiviteindüksiyonu gibi geç yanıtlar yer alır. Mikrobiyal ikincil metabolitler (MSM'ler), büyüme ve gelişim için vazgeçilmez olan, ancak mikrobun hayatta kalmasını teşvik eden yapısal olarak çeşitli moleküller (50-1.500 Dalton) olarak tasarlanmıştır. Bazı MSM'ler bitkilerde hücresel stres yanıtlarını tetikler, ancak bu yanıtları başlatan mekanizmalar henüzçözülmemiştir 2,3. Bitki tarafından MSM'nin tanınması için önerilen mekanizmalar arasında mekanosensing, redoks-indüklenen protein modifikasyonları veya lipid tabanlı sinyalizasyon 4,5 yer almaktadır. Bazı durumlarda, MSM konsantrasyona bağlı olarak stres yanıtları oluşturur veya hücresel hasara yol açar. Örneğin, T-2 toksini 1 μM'de kallos ve ROS üretimini tetikler ve 10 μM'de hücre ölümüne neden olur; genellikle birfitotoksin 4 olarak tanımlanır. MSM'ler, bazı bitki-mikrop etkileşimlerinde patogenezi etkiler ve bitki hassasiyetini veya direncini tetikleyebilir. Örneğin, gramillin siklik lipopeptid ROS üretimini, iyon sızıntısını ve kallos üretimini indükler ve Fusarium graminearum2'ye karşı arpa kadar hassas olma riskini artırır. Syringomicin ve syringopeptin siklik lipopeptidler, bitki ROS üretimini tetikler ve Pseudomonas fluorescens bakterilerine karşı konak direncini destekler3. Surfactin ve itürin gibi diğer MSM'ler ise patojenik olmayan mikroplar tarafından üretilir ve bitki stres yanıtlarını tetikleyerek sonraki patojen enfeksiyonlarına karşı direnç destekler 6,7. Bu biyoprotektif MSM, iyon akışları, ROS üretimi, transkripsiyonel değişiklikler ve kallos üretimi gibi hücreselyanıtları indükler 8. MSM ile bitkiler arasındaki etkileşimleri anlamak, MSM'nin hastalık direncindeki rolünü belirlemeye ve ürün direncini artırmak için kullanılabilecek konak genlerini belirlemeye yardımcı olabilir.

MSM kaynaklı bitki stres yanıtlarını değerlendirmek için mevcut yöntemler genellikle bir zamanlı stres yanıtını testetmeyi içerir 8. İkincil MSM'nin çıkarılmasının zor olabileceği ve sınırlı miktarda metabolit mevcut olabileceği göz önüne alındığında, aynı örneklemde birden fazla yanıt test etmek, MSM'nin bitki hücreleri üzerinde etkisi olduğuna dair güvence sağlayabilir. Apoplastik ROS patlamalarını değerlendirmek için yüksek verimli yöntemlerden biri, oksitlenmiş luminol tarafından üretilen lüminesansı yabanturpu peroksidaz 9 varlığında tespit etmektir. Ne yazık ki, luminol bazlı lüminesans katyonlar ve bazı çözücülerle söndürülür; bu da tuz içeren ekstraktlar veya DMSO'da çözünmesi gereken polar olmayan moleküller için bu testin kullanımını sınırlar; bu da bu kirleticilerle çalışan bir yöntem gerektirir9. Bu sorunları ele almak için, mevcut yöntemleri aynı yaprak örneğinden üç stres yanıtını (iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kalloz) yüksek verimli bir testte değerlendirecek şekilde genişlettik (Şekil 1)10,11,12. Yaklaşımımız, MSM'lerle yaprak disklerinin 96 kuyu bir plakada vakum infiltrasyonu ile işlenmesini içerir. Sonrasında, işlem sonrası 4-6 saat içinde iyon sızıntısı değerlendirilmek için iletkenlik ölçümleri yapılır, ardından 24 saat içinde peroksidaz aktivitesi ve kallos birikintisi ölçümleri yapılır. Yaklaşımımız Arabidopsis ve arpa için optimize edildi, ancak deneysel doğrulamayla diğer bitki türlerine de genişletilebilir. Örneğin, bu yöntemle indüklenmiş arpa peroksidaz aktivitesi tespit edilemez, ancak toksik bileşiklerle aktivitenin bastırılması tespit edilebilir. Bu nedenle, yaprak özellikleri veya indüklenen yanıtın genliği türler arasında değişir ve bu yaklaşımın bazı bitki türlerine uygulanabilirliğini sınırlar.

Bu yöntemi kullanan deneysel tasarım, en iyi sonuçları sağlamak için kullanılan MSM'nin kontrollerini, çoğaltmasını ve konsantrasyonunu dikkate almalıdır. Negatif kontrol, yaralanmanın etkilerinden istatistiksel olarak farklı stres tepkisi seviyeleri oluşturan MSM'leri belirlemek için gereklidir. İdeal olarak, negatif kontrol MSM ile aynı çözücüyü içerir ancak MSM'den yoksundur. Hidrofobik MSM için tipik çözücüler arasında DMSO ve metanol bulunur; bunlar yüksek konsantrasyonlarda ROS üretimi gibi hücresel yanıtlaroluşturur (13,14). Bu testte, %10 veya daha yüksek DMSO ve metanol flg22 indükleyen peroksidaz aktivitesini blokladığı peroksidaz aktivitesi üzerinde bir etki gözlemliyoruz (Şekil 2). Karmaşık ekstraktlar durumunda, ilgilenilen metabolitler bilinmediğinde MSM eksikliği nedeniyle negatif bir kontrol geliştirmek zor olabilir. Bunun yerine, ekstraktların boyut, kutup veya yük temelinde fraksiyonlaştırılması, kesirler arasında göreli karşılaştırmalar yapılarak daha fazla analiz için en stres yaratan fraksiyonu belirlemeye olanak tanır. Ayrıca, 1 μM flg22 veya 10 μM T-2 toksini gibi pozitif bir kontrol dahil etmek, araştırmacının testin çalıştığını değerlendirebilmesi için yardımcı olur. Her tedavide dört teknik replika eklenmesini ve bir deneyde birden fazla plaka ölçülürken her plakada pozitif ve negatif kontrollerin dahil edilmesini öneriyoruz.

Genel olarak, bu yaklaşım üç MSM kaynaklı bitki stres yanıtını yakalıyor ve bitki-MSM etkileşimlerini incelemek için erişilebilir ve maliyet etkin bir yöntem sunuyor. Yüksek verimli format, araştırmacıların aynı deneysel birim içinde bitki genotipleri veya mikrobiyal özetler arasındaki ince farkları yakalamasına olanak tanır. Bu, bitki gen ailelerini anlamak veya genetik haritalama için bitki popülasyonlarını incelemek için sistem düzeyinde yaklaşımlar sağlar. Mikrob tarafında, bu yaklaşım potansiyel biyoprotektif bileşikleri taramak veya kimyasal genomikte spesifik stres yanıtlarını artıran veya bastıran bileşikleri belirlemek için kullanılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune hazırlama ve işleme

NOT: Deneyci ve çevre için riskleri en aza indirmek için tüm uygun güvenlik önlemleri ve bertaraf uygulamaları alınmalıdır.

  1. Bitki yetiştiriciliği
    1. Arabidopsis'i 4-5 haftalık aşamaya kadar Cornell toprak karışımında (300 turba yosunu: 630 vermikülit: 1 yavaş salınan gübre: 4.2 kireç) yetiştirin; saksıda 24 saksıda iki bitki. Bitkileri aşağıdan gerektiğinde tepsiye su ekleyerek sulayın. Büyüme odası koşullarını sürekli olarak 21 oC'ye ayarlayın, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık ile yaklaşık %30-50 nemde kalın. 5-9'uncutam açılmış yaprakları deneme ve hasat için sabah kullanın.
    2. Arpa yetiştirin, 75 saksı toprağında: 24 siyah toprak: 1 kireç toprak karışımında ilk ve ikinci gerçek yapraklar tamamen açılana kadar. Her saksıda 24 parde bir tohum ekin ve gerektiğinde sulayın. Büyüme odası koşullarını yaklaşık %30-50 nemde 16 saat ışık ve 8 saat karanlık ile 21 oC'ye ayarlayın. İlk ve ikinci tamamen genişlemiş yaprakları deneyin ve sabah hasat yapın.
  2. Her bitkiden üç yaprak diski topla, 4 mm çapında bir mantar delici kullanarak orta damardan kaçının. Dokuyu keskin bir delici kullanarak yumruklamaktan kaçının.
  3. Yaprak disklerini hemen ve nazikçe 196 μL steril Milli-QH 2O içinde 96 kuyuyla bir plakanın bir kuyusuna yerleştirin. Gerekli sayıda örnek toplanana kadar diskleri toplamaya devam edin.
  4. İstenilen konsantrasyonda ikincil metabolitler veya çözücü tedavileri ile 200 μL nihai hacmde bireysel kuyulara eklenir.
  5. 96 kuyuyla kapağı kapalı olan plakayı vakum nozullu bir çan kavanozuna yerleştirin.
  6. Vakum hortumunu çan kavanozunun memeliğine takın ve vakum basıncını açarak vakum inç kare 9,8 pound/inç kareye (genellikle 10 saniye) ulaşana kadar açın. Bu süreci bir kez daha tekrarlayın.
  7. Kapağı plakaya yerleştirin ve 4 saat boyunca ışık altında (13 W, 50 μmol∙m-2∙s-1) yörünge sallayıcısında (55 rpm) inkubasyon yapın.

2. İyon sızıntısı ölçümleri

  1. Probu Milli-Q suyla yıkayın ve kuruması için hafifçe Kimwipe üzerine dokunun. Referans olarak suyun iletkenlik okumasına dikkat edin.
  2. İşlemden 4-6 saat sonra, probu yaprak diskinin çevresindeki sıvıya daldırarak bireysel kuyulardan iletkenliği örnekleyin ve kaydedin. Probun tamamen emerlenmiş olduğundan emin olmak için plakayı 45° açıyla tutun.
  3. Probu örnekler arasında Milli-Q suya batırıp sondayı bir Kimwipe ile kurutarak durulayın. Ara sıra, prob okumalarının sabit kaldığından emin olmak için suyun iletkenliğini test edin.
  4. Plakaya plastik bir sızdırmazlık filmi yerleştirin ve gece boyunca kuluçka için orbital sarsıntıya geri döndürün.

3. Peroksidaz aktivite ölçümleri

  1. Peroksidaz substratını her gün 50 mL çözelti olarak taze hazırlayın. 40 ml distile steril suyu bir kabada karıştırıcı çubukla 70 o C'yeısıtın ve ısıtılan suda 50 mg 5-aminosalisilik asit (1 mg/mL) çözün. 50 mL'ye kadar su ekleyin ve NaOH ile pH'ı 6'ya ayarlayın. Çözelti ışığa hassastır, bu yüzden alüminyum folyo ile örtün veya amber bir tüp kullanın.
  2. 50 mL kehribar konik bir tüpte, 1,7 mL %30 H2O 2 ekleyerek %1,7 H2O çözeltisi ile 48,3 mL Milli-QH 2O ekleyin.
  3. Testten hemen önce, testin ortamı üretmesi için gereken 5-aminosalisilik çözeltinin mililitresine 10 μL H2O 2 çözeltisi ekleyin.
  4. İşlenmiş yaprak disklerini örneklemek için, istenen zaman noktasında her kuyidan 50 μL alın. Berrak, düz tabanlı 96 kuyu bir plakaya aktarın ve 50 μL test ortamı ekleyin, 5x pipetle karıştırın.
  5. Reaksiyonu oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka edin, ardından 20 μL 2 N NaOH ekleyerek hafifçe karıştırarak reaksiyonu durdurun.
  6. Kuyunun 595 nm emilimini bir plaka okuyucuda ölçün.

4. Kalloz görüntüleme ve görüntü analizi

  1. Peroksidaz testi için kuyulardan numune alındıktan sonra, kalan sıvıyı kuyulardan çıkarır ve fiksasyon ve detainleme için 100 μL asetik asit:etanol (1:3) çözeltisi eklenir. Bir kapak tabağa koyup plakayı bir çalkalayıcıda (60 rpm) oda sıcaklığında 24 saat kuluçka yapın.
  2. Damarlama çözümünü taze çözeltiyle değiştirin ve oda sıcaklığında 24 saat daha kuluçka yapın.
  3. Destaining çözeltisini pipetleyin ve her kuyuya 100 μL 150 mMK 2HPO4 ekleyin. Tabağı çalkalayıcıya koyun ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
  4. K2HPO4 yıkama çözeltisini çıkarın ve 100 μL 150 mM K2HPO4 ile 0.1 mg/mL anilin mavisi ekleyin. 96 kuyu tabakasını bir kapak ve alüminyum folyo ile kaplayın ve en az 2 saat (Arabidopsis) veya gece boyunca (arpa) bir çalkalayıcıda kuluçka yapın.
    NOT: Anilin mavisi ışığa duyarlıdır ve her teknik kopya için taze yapılmalıdır.
  5. Anilin mavisi çözeltiyi çıkarın ve yerine %50 gliserol verin. 96 kuyu tabaklarını alüminyum folyoyla kaplayın ve görüntülemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
  6. Temiz bir cam slayta %50 gliserol solüsyesi damlasını koyun. Bir yaprak diskini cımbızla nazikçe alın ve kaydırığa abaxial tarafı yukarı koyun. Hava kabarcıklarını en aza indirerek 1.5 cap kaplama ile örtün ve gerekirse örtü altını doldurmak için ekstra %50 gliserol ekleyin.
  7. Yaprak malzemesini, 20x kuru objektif lens altında ileten beyaz ışık (parlak alan) kullanarak netleştirin.
  8. Aniline mavi görüntüleme için uyarım dalga boyunu 370 nm, emisyon dalga boyunda ise 509 nm seçin ve bir pozlama süresi ayarlayın. Yeterli sinyal sağlamak için pozlama süresini optimize edin ancak piksellerin aşırı doygunluğunu önleyin. Görüntülerin nicel karşılaştırması için, tüm biyolojik kopyalar, tedaviler ve teknik kopyalar için lazer yoğunluğu ve pozlama süresinin tutarlı olduğundan emin olun.
  9. Her yaprak disk için üç farklı görüş alanı seçin ve her biri için 4.8. adımda belirlenen parametreleri kullanarak görüntü alın. Tüm görüntüleri bitki materyaliyle alın, görüş alanı tamamen minimum arka plan bölgesi (bitki dışı materyal) ile doldurun. Yaprak yüzeyinde tek bir z-düzleminde görüntüler alın.
    NOT: Biraz arka plan olması kaçınılmaz olabilir ve sonraki görüntü niceleme adımlarında düzeltilebilir. Bu örnekte, görüntüler dik epifloresans mikroskobu, cıva lambası ve DAPI filtre küpü ile çekilir (uyarılma 360/40 nm, emisyon 460/50 nm). Bir cıva lambası bulunmadığı durumlarda, çok dalga boylu LED ışık kaynağı kullanılabilir.
  10. Görsellerden kallos noktalarını ölçmek için, https://imagej.net/Fiji/Downloads'daki çevrimiçi talimatları kullanarak ücretsiz olarak erişilebilen FIJI görüntü işleme yazılımını indirip kurun. FIJI'yi açın ve analiz için anilin mavisi görüntüleri içe aktarın. Bu analiz için en az 300 dpi çözünürlüğe sahip .tiff dosyalar kullanın. Analiz öncesi mikroskop yazılımı kullanarak .tiff formatta görüntü dosyalarını dışa aktarın veya FIJI'nin dosyaları açmasına izin verin.
    NOT: Fiji, çoğu özel dosya türünü açabilir (örneğin, .czi, .nd2, .lif, .vsi).
  11. Resme ölçeği ayarlayın ( Analyze | Ölçeği Ayarla), mikroskop kurulumundan alınan mesafe değerlerini kullanarak.
  12. Görüntüyü 32-bit gri tonlu bir görüntüye dönüştürün ( Resim | Tip | 32 bit).
  13. Eşiği ayarlayın ( Resim | Ayarlan | Threshold) ile yalnızca anilin mavisi boyamanı temsil eden floresans sinyalini içermek için Auto tuşuna tıklayıp eşik eğrisinde minimum ve maksimum değerleri manuel olarak ayarlayabilir. Eşik kesinleştiğinde, Uygula | Maskeye dönüştür. Elektronik tablo yazılımı kullanarak, her görüntü için seçilen eşik parametrelerini yazın.
    NOT: Bitki örneklerinin doğal otofloresansı ve bitki dokusunun temizlenmesi nedeniyle, eşik örnekler arasında farklılık gösterebilir. Tekrarlanabilirlik için, her görüntünün eşiğini kaydetmek ve örnekler arasında eşik değerleri tutarlı ayarlamak gereklidir.
  14. Analyze Particles ile anilin mavi puncta'nın sayısını ve boyutunu nicelikle ölçün ( tıklayın Analyze | Parçacıkları Analiz Et) varsayılan ayarları kullanarak kullanır. Görseldeki tüm puncta'ların ortalama değerleri için açılır kutuda Summarize'u seçin ve OK tuşuna tıklayın.
  15. Bu sonuçları Özet kutusundan eşik parametreleriyle birlikte elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın ve daha fazla analiz yapın. Bu nicelik göstergesinde yer alan değerler arasında Sayı (anilin mavi nokta sayısı), Toplam alan (anilin mavinoktanın 2 . birimlerindeki toplam alan), Ortalama boyut (anilin mavi noktanın2 . birimlerindeki ortalama büyüklük), %Alan (anilin mavisi floresans2 . birimlerdeki ortalama örtü yüzdesi toplam alana karşı), Çevre (noktanın ortalama çevresi) ve IntDen (anilin mavisi boyamanın floresans yoğunluğunun göstergesi) yer alır.
  16. Deney sırasında elde edilen tüm görüntüler için 4.11-4.15 adımlarını tekrarlayın. FIJI'den eşikli bir görüntüyü kapatırken, ham veri görselini eşik maskeye dönüştürmemek için Kaydetme ' seçeneğini seçin.
  17. Eğer herhangi bir görselde bitki dışı arka plan bulunan alan varsa, bitki dokusunun alanını Polygon veya Freehand seçim araçlarıyla manuel olarak çizerek ve alanı ölçerek ölçün (tıklayın Analiz | Ölçü). Bu değeri her görüntü için elektronik tabloya kopyalayın.
  18. Bir elektronik tabloda, bir biyolojik kopyadan alınan üç görüş alanı görüntüsünün değerlerini ortala. Deneydeki bazı görüntülerde bitki dışı alan varsa (bkz. adım 4.17), her görseldeki bitki dokusu alanına göre tüm değerleri düzeltin. Örneğin, grafik ve istatistiksel karşılaştırmalardan önce her görüntü için Count değerini bitki dokusu alanına bölebilirsiniz.

5. Veri analizi

  1. Deneyin kalitesini t-testi kullanarak aynı plaka içindeki pozitif kontrolleri negatif kontrollerle karşılaştırarak değerlendirin. Pozitif kontroller stres yanıtlarında önemli değişiklikler yaratmadıysa, bitkilerin sağlığı, tedavi zamanlaması, negatif kontrol ve MSM'lerin potansiyel bozulması gibi deneysel koşulları yeniden değerlendirin.
  2. Anlamlılık testi
    1. Bir tedavinin tüm teknik kopyaları aynı plaka içinde değerlendirilirse, bireysel tedaviler ile negatif kontrol arasındaki farkları, Tukey testi ile tek yönlü ANOVA gibi standart istatistiksel yaklaşımlarla analiz edin.
    2. Bir tedavinin teknik tekrarları birden fazla plaka üzerinde değerlendirildiğinde, her örneği negatif kontrole göre normalize ederek plakadan plakaya hatanın etkisini en aza indirin. Her değeri, aynı plaka içindeki negatif kontrol örneklerinin ortalamasına böl. Normalleştirilmiş değerleri standart istatistiksel yöntemlere tabi kılın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemle, bir MSM'nin bitki hücresi stres yanıtlarının bir alt kümesini aktive edip etmediği belirlenebilir. Bu testin sonuçları, peroksidaz aktivitesi, iyon sızıntısı ve kallos üretiminin nicelendirilmesini sağlayarak bir MSM'nin negatif kontrole kıyasla farklı yanıtlar indükleyip indüklemediğini belirler. Bir bileşik için olumlu sonuç, iyon sızıntısı ve kallos üretimini indükleyen gramillin ionoforu için gösterildiği gibi negatif kontrolden anlamlı bir farkla gösterilir (Şekil 3)2. Üç yanıtı da indükleyen 1 μM flg22 gibi pozitif bir kontrol dahil etmek, bitki performansını ve deneysel koşulları sağlam sağlar (Şekil 3)11,15. Gramillin ve flg22 suda çözünürken, hidrofobik surfactin ve T-2 toksini DMSO'da çözünür. Hidrofobik molekülleri hazırlamak için önce DMSO'da 10 mM stok hazırlıyoruz. Bu stok, yaprak arıtması için %0,1 DMSO içeren Milli-Q suda 10 μM nihai konsantrasyon oluşturmak için kullanılır. Surfactin (10 μM) peroksidaz aktivitesi ve kallozu indüklerken, T-2 toksini (10 μM) peroksidaz aktivitesini baskılar ve kallos üretimini tetikler; muhtemelen hücre ölümünedeniyle 2,6,16. Belirtilen tedaviler için negatif kontrol olarak su veya %0,1 DMSO kullanılması uygundur, çünkü her iki kontrol benzer sonuçlar verir (Şekil 2).

Ticari olarak mevcut 100 MSM'nin ön taramalarında, incelediğimiz çoğu bileşik için kallos indüksiyonu (%>70) görüyoruz; iyon sızıntısı ve peroksidaz aktivitesi ise daha az bileşikle tetikleniyor (%30 ve %35). Bu bileşiklerin çoğu, deoksinivalenol (DON) ve T-2 toksini gibi yedi farklı trikotesen dahil olmak üzere Fusarium türleri tarafından üretilir. Bu sonuçları doğrulamak için daha fazla çoğaltma devam etse de, olumlu kontrol kontrollerimizde (Şekil 3) görülen benzer eğilimleri gösteriyor; kallos tüm tedavilerde indüklenmiş, bazı tedavilerde iyon sızıntısı veya peroksidaz tetiklenmiştir ama hepsi değil.

figure-results-1
Şekil 1: Yapraklarda MSM kaynaklı hücresel yanıtların değerlendirilmesi prosedürünün genel görünümü. Yaprak diskleri, ilgi çeken tedavileri içeren 96 kuyruklu bir plakaya yerleştirilir ve diskler vakumla sızdırılır. Her plaka, bir negatif kontrol (çözücü su) ve bir pozitif kontrol (flg22 veya T-2 toksini) dört kopyasını içerir. 4-6 saat sonra, yaprak diski çevreleyen sıvının iletkenliği, iyon sızıntısının nicelendirilmesi olarak ölçülür. 24 saat sonra, yaprak diskini çevreleyen sıvı kullanılarak kolorimetrik bir test kullanılarak peroksidaz aktivitesi nicelendirilir ve yaprak diski kallos niceliği için ayrılır ve işlenir. Kısaltma: MSM = mikrobiyal ikincil metabolit. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Çözücünün flg22 kaynaklı iyon sızıntısı veya peroksidaz aktivitesi üzerindeki etkisi. Dört replika edilen Arabidopsis örneği, 1 μM flg22 ile DMSO veya metanol kombinasyonuyla (0, 0,01, 0,01, 0,1, 1, 10%) işlendi. Bar grafikler, tek bir deneyden (n = 4, SD) 4 saat sonra alınan 4 saat sonra alınan ortalama iletkenliği veya peroksidaz aktivitesini (OD600) gösterir. Deney iki kez tekrarlandı ve benzer sonuçlar elde edildi. Su kontrolünden anlamlı fark t-testi ile belirlenmiş ve yıldız ile gösterilmiştir (p < 0.05). Kısaltmalar: DMSO = dimetil sülfoksit; MeOH = metanol. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Mikrobiyal köken moleküller tarafından Arabidopsis yaprak disklerinde iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi veya kallos birikiminin indüklenmesi. Tedaviler arasında immünojenik, toksik olmayan peptid flg22 (1 μM), siklik lipopeptidler gramillin ve surfactin (10 μM) ile T-2 toksini (10 μM)2,6 yer aldı. Tüm veriler su + %0,1 DMSO kontrolüne normalize edildi. Kutu ve bıyık grafikleri, 4 saat sonra numunenin iletkenliğini, 24 saat sonra peroksidaz aktivitesini (OD 600) veya tek bir deneyden (n = 4-16 bitki) 24 saat sonra kalloz birikintilerinin sayısını gösterir. Kutu grafikleri, ortalamanın değerini göstermek için bir 'x' işareti gösterirken, kutular ilk dörtlük, medyan ve üçüncü çeyrek aranmayı gösterir. En yüksek ve en düşük gözlemler, istisna olmayan bıyıklarla gösterilir (>1,5x çeyreklerarası aralık, dairelerle gösterilir). Su kontrolünden belirgin fark bir yıldız ile gösterilir ve tek yönlü ANOVA ile Tukey testi (p < 0.05) belirlenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki kolonileştiren mikrobiyal topluluklar, biyofilm oluşumunu kolaylaştırmak, rakip mikropları bastırmak ve bitki konakçısını etkilemek için çeşitli MSM'ler salgılar. Bazı MSM'ler bitki üzerinde hiçbir etkisi olmasa da, diğerleri hızlı hücre ölümünü tetikler, hücre fonksiyonunu baskılar veya bitkidirencini tetikler. Bazı MSM'ler, bitkilerin MSM üreten mikrobuna karşı direncini etkiler ve dirençli genotipler MSMhassasiyetsizliği 2,3,18 temelinde seçilebilir. Diğer MSM'ler sistemik direnç oluşturur ve mikrobiyal patojenlere karşı koruma sağlar; bu hastalık tarımda hastalıkları bastırmak için biyoprotektif ürünler geliştirmek içinkullanılmıştır 8. Etkili ve sürdürülebilir ürün iyileştirme stratejileri geliştirmek için, faydalı MSM'leri ve optimal MSM yanıt vermesini sağlayan bitki genlerini belirlemek çok önemlidir.

Faydalı MSM'lerin bulunması, bu bileşiklerin enzimatik olarak üretilmesi ve nihai ürün için birden fazla enzimin gerekmediği gerçeğiylekarmaşıktır 2. Bu durum, genetik çalışmalar için MSM üretimini ortadan kaldırmak için hangi genin hedefleneceğini belirlemeyi zorlaştırır. Enzimatik biyosentez, aynı MSM'nin potansiyel olarak farklı biyoaktivitelere sahip birden fazla yapısal varyasyonuortaya çıkarır 19. Bu MSM'leri ayırıp arıtarak biyoaktif molekülleri bulmak zaman alıcı veya imkansız olabilir. Bazı durumlarda, yalnızca düşük bireysel MSM konsantrasyonları arındırılabilir ve birden fazla turarındırma gerektirir 2. Biyoaktif bir bileşik veya ekstrakt elde edildikten sonra, mikrobun bitkiyi nasıl etkilediğini anlamak için çeşitli yaklaşımlar kullanılabilir.

Önceki çalışmalar, model bitkilerde MSM'nin transkripsiyonel yeniden programlama veya biyokoruma üzerindeki etkisini izlemeyeodaklanmıştır 20. Model tesislerin ötesinde MSM yanıtlarını değerlendirmek için, çeşitli MSM'lere yanıtları yakalayan ve minimum MSM gerektiren yüksek verimli testler potansiyel olarak faydalıdır. Son çalışmalar, ROS patlamalarının MSM'lere karşı yaygın erken bir yanıt olduğunu göstermektedir; bunlar arasında gramillin, surfactin, syringomycin ve syringopeptin 2,3,7 bulunmaktadır. Luminol bazlı bir test, peroksidazlar ve NADPH oksidazlar tarafından üretilen apoplastik ROS patlamasını tespit eder ve yüksek verimliliklitestlere uygundur 21. Ne yazık ki, MSM'ler tarafından indüklenen hücre içi ROS, örneğin surfactin, bu yöntemle tespit edilemez7. Peroksidaz aktivitesinin nicelendirilmesi, stres11 sırasında ROS üreten enzimlerin geçici aktivasyonunu tespit etmek için luminol bazlı testten daha hassas bir alternatif sunar. Surfactin'in peroksidaz aktivitesini tetiklediği gözlemimiz, Arabidopsis'te peroksidaz aktivitesinin surfactin ve beauverisin tarafından tetiklendiğini gösteren son çalışmalarla uyumludur (Şekil 3)2. Ayrıca, flg22 ve iyonofor gramillinin iyon sızıntısını indüklediğini ve flg22, T-2 toksini, surfactin ve gramillin dahil test edilen tüm bileşiklerin beklendiği gibi kallose indüklediğini gösterdik (Şekil 3)2,4,7.

Aynı örneklemde birden fazla yanıtı değerlendirerek, bu özelliklerin her birini ayrı ayrı değerlendirirken deneysel varyasyonu en aza indirmiş ve bitki stres yanıtları üzerine sistem düzeyinde çalışmalar için özellikler arasında korelasyon sağlanmasını sağlarız. Aynı deneysel birim içinde birden fazla tedavi veya genotipin değerlendirilmesi, popülasyon genetiği için popülasyon düzeyinde fenotiplemenin de mümkün olmasını sağlar. Örneğin, benzer bir yaklaşım, arpa22'de flg22 kaynaklı ROS üretiminin altında yatan QTL'yi belirlemek için kullanılmıştır. Bu test, bitki stres yanıtlarının modülatörlerini bulmak veya mikrobiyal özetlerden potansiyel biyoprotektif MSM'leri belirlemek için kimyasal genetik taramalarında da kullanılabilir.

Deneysel yöntemin ilgi duyulan sistem içinde çalıştığından emin olmak için araştırmacılar aşağıdaki faktörleri ve sınırlamaları göz önünde bulundurmalıdır:

Yaprak dokusunun kalitesi
Hasat öncesi bitki yaprak dokusunun stresli olmadığından emin olun. Bitkilerin stresli olduğuna dair işaretler türden farklı olsa da, genellikle solma, sararma, kızarma, lekeler, aşırı yaprak kıvrımı veya yuvarlanma içerir. Yaprak dokusunun örneklenmesi yaralanmaya neden olur, bu yüzden dokunun aşırı maserasyonundan kaçınmak işlem nedeniyle arka plan hatasını azaltır.

Bitki Türleri
Bu protokol, arpa ve Arabidopsis yapraklarıyla kullanım için optimize edilmiştir. Arpa yaprakları, callose için Arabidopsis'e göre daha uzun boyama süresi gerektirir; muhtemelen otlardaki kalın kütiküler mumu nedeniyle, bu da hidrofobikliği artırır ve tedavilerin yaprak23'e yayılmasını sınırlar. Bu, yöntemimizde peroksidaz aktivite indüksiyonunun eksikliğini kısmen açıklayabilir, ancak Arabidopsis'te sunduğumuz gibi toksik bileşikler tarafından peroksidaz aktivitesinin baskılanmasını görebildik (Şekil 3). Bir numune başındaki yaprak diski sayısını 5'e çıkarmaya, pH'ı 5, 6 veya 7'ye ayarlamaya, vakum sızma sayısını 10'a çıkarmaya ve substrat konsantrasyonunu değiştirmeyi veya substratı guaiacol24'e değiştirmeyi denedik. Daha fazla yaprak diski ve infiltrasyon turlarıyla artan peroksidaz aktivitesi gördük, ancak negatif kontrol ile flg22 arasındaki farklar küçük (flg22 ile %10 artış) veya deneyler arasında anlamlı kalmadı. Arpanın flg22'ye ROS üretimini, kallos üretimini ve peroksidazekspresyonunu tetikleyerek yanıt verdiğini biliyoruz 25,26. Mısır köklerinde, protein özleri MAMP kaynaklı peroksidaz aktivitesi göstermiştir; bu da indüksiyonu görmek için protein çıkarmanın gerekebileceğini göstermektedir; yapraklardan sızan protein aktivitesini tespit etmek yerine24 testimizde olduğu gibi. Testimizde, yaralanma negatif kontrol örneğinde peroksidaz aktivitesini açıkça tetikler, çünkü hücreler toksin maruziyeti nedeniyle öldüğünde bu aktivite kaybolur. flg22 tedavisinin, yaralama ile aynı peroksidazları indüke etmesi ve böylece hiç indüksiyon gerçekleşmemiş gibi görünmesi mümkündür. Alternatif olarak, testimiz ince değişiklikleri tespit edecek kadar hassas olmayabilir veya peroksidazlar çözeltiye iyi difüzyon edemeyebilir.

Bu protokolü diğer bitki türlerine uygulamak için, tarif edilen yöntemi kullanmanızı ve protokolün çalıştığından emin olmak için Arabidopsis'i kontrol olarak yanına eklemenizi öneririz. Peroksidaz aktivitesi düşük görünüyorsa, örnek başına yaprak disklerinin sayısını artırmak, vakum sızma sayısını 5 veya 10'a çıkarmak ve diğer MAMP'ler, iyonoforlar veya T-2 toksini dahil olmak üzere farklı tedaviler denemek olumlu sonuç verebilir.

Negatif kontrol tedavileri
Bu yöntem, karşılaştırmalar için etkili ve uygun bir negatif kontrole dayanır. İdeal olarak, negatif bir kontrol MSM tedavisiyle aynı arka plan çözücüsünü içerir ancak MSM içermez. Arka plan çözücüsü su olur veya ölçülen gerilimler üzerinde su ile aynı etkiye sahiptir. Bu, MSM'nin zaten arındırılmış ve tercih edilen bir çözücüde çözülebildiği durumlarda pratik bir yaklaşımdır. Mikrobiyal ekstraktlar karşılaştırıldığında, negatif kontrol, aynı arka plan ortamını içeren ancak fraksiyonlaşmadan sonra MSM konsantrasyonu azalmış MSM'nin kısmi saflaştırılmasının yan ürünü olabilir. Ya da deneyci, MSM içeren ekstraktı üretmek için kullanılan kültürleme ortamını negatif kontrol olarak kullanabilir. Bu daha karmaşık örneklerde, negatif kontrol iletkenlik ölçümü şişiren tuzlar içerebilir veya çözücüler peroksidaz aktivitesini baskılayabilir (Şekil 2). Tuzların iyon sızıntısı sonuçlarını etkileyip etkilemediğini belirlemek için, deney yapıcısı yaprak diski yokken negatif kontrol ve numunenin iletkenliğini test ederek numunenin mi yoksa yaprağın da iletkenlikte değişiklik yapıp oluşturmadığını belirleyebilir. Çözücülerin peroksidaz yanıtlarını etkileyip etkilemediğini belirlemek için, deneyci negatif kontrole flg22 ekleyebilir ve sonucu suda çözünmüş flg22 ile karşılaştırarak fark olup olmadığını belirleyebilir. Çözücüler, renkli bileşikler veya aşırı tuzlar negatif kontrolde MSM'nin bitki stres tepkileri üzerindeki etkilerini gizleyebilir ve bu nedenle bu yaklaşım her durumda uygun olmayabilir.

Örnekleme süresi
Tedavilere sabah başlamak önemlidir, çünkü indüklenebilir savunma yanıtları bir sirkadiyen döngü takip eder ve sabah erken saatlerde en yüksek genliğesahiptir 27. Deneyimimize göre, Arabidopsis, gramillin'e karşı iyon sızıntısını arpa ve mısırdan (4-7 saat) daha hızlı (4 saat) üretir ve bu nedenle, deneyselparametreleri belirlemek için bir zaman süreci gerekebilir 2,28. Hücre yanıt verme süresi zamanla azalır ve tedavi sonrası 30+ saat sonrasında stres yanıtlarının test edilmesini önermeyiz.

Konsantrasyon
MSM yoğunluğu, bitki stres tepkilerini tetiklemede doğrusal olmayan bir etki yaratabilir; bu durumhormesis 20 olarak adlandırılan bir olgudur. MSM'nin kullanılabilirliği ve çözünürlüğüne bağlı olarak, deneyciler ideal olarak bitki stres yanıtlarını MSM konsantrasyonları aralığında test ederler. Tipik konsantrasyonlar başlangıç noktası olarak 100 nM ile 1.000 μM arasındadeğişir (2,11,20).

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mali destek, federal-eyalet-bölgesel bir girişim olan Sürdürülebilir Kanada Tarımsal Ortaklığı (#20230098) kapsamında sağlandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5-aminosalisilik asitMillipore Sigma A79809
Barnart vakum pompasıZanaatkar Teknoloji Grubu400-3910
COND-905 mikro iletkenlik probuLazar Araştırma Laboratuvarları MM.
FLG22 peptidiAnaSpecAS-62633
Infinite 200PRO FTeCan Group Ltd.30190086
SurfactinSigma-AldrichS3523
T-2 toksiniCayman Kimya Şirketi Inc20433

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annu Rev Phytopathol. 55 (1), 109-137 (2017).
  2. Brauer, E. K., et al. A cyclic lipopeptide from Fusarium graminearum targets plant membranes to promote virulence. Cell Rep. 43 (7), 114384(2024).
  3. Thoms, D., et al. Innate immunity can distinguish beneficial from pathogenic rhizosphere microbiota. bioRxiv. , (2023).
  4. Nishiuchi, T., et al. Fusarium phytotoxin trichothecenes have an elicitor-like activity in Arabidopsis thaliana, but the activity differed significantly among their molecular species. Mol Plant Microbe Interact. 19 (5), 512-520 (2006).
  5. Schellenberger, R., et al. Apoplastic invasion patterns triggering plant immunity: plasma membrane sensing at the frontline. Mol Plant Pathol. 20 (11), 1602-1616 (2019).
  6. Henry, G., Deleu, M., Jourdan, E., Thonart, P., Ongena, M. The bacterial lipopeptide surfactin targets the lipid fraction of the plant plasma membrane to trigger immune-related defence responses. Cell Microbiol. 13 (11), 1824-1837 (2011).
  7. Pršić, J., et al. Mechanosensing and sphingolipid-docking mediate lipopeptide-induced immunity in Arabidopsis. bioRxiv. , (2023).
  8. Crouzet, J., et al. Biosurfactants in plant protection against diseases: rhamnolipids and lipopeptides case study. Front Bioeng Biotechnol. 8, 1014(2020).
  9. Khan, P., et al. Luminol-based chemiluminescent signals: clinical and non-clinical application and future uses. Appl Biochem Biotechnol. 173, 333-355 (2014).
  10. Schenk, S. T., Schikora, A. Staining of callose depositions in root and leaf tissues. Bio-protoc. 5 (6), e1429(2015).
  11. Mott, G. A., Desveaux, D., Guttman, D. S. A high-sensitivity, microtiter-based plate assay for plant pattern-triggered immunity. Mol Plant Microbe Interact. 31 (5), 499-504 (2018).
  12. Hatsugai, N., Katagiri, F. Quantification of plant cell death by electrolyte leakage assay. Bio-protoc. 8 (5), e2758(2018).
  13. Zhang, X. H., Yu, X. Z., Yue, D. M. Phytotoxicity of dimethyl sulfoxide (DMSO) to rice seedlings. Int J Environ Sci Technol. 13, 607-614 (2016).
  14. Mannan, A., et al. DMSO triggers the generation of ROS leading to an increase in artemisinin and dihydroartemisinic acid in Artemisia annua shoot cultures. Plant Cell Rep. 29, 143-152 (2010).
  15. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant J. 18 (3), 265-276 (1999).
  16. Jourdan, E., et al. Insights into the defense-related events occurring in plant cells following perception of surfactin-type lipopeptide from Bacillus subtilis. Mol Plant Microbe Interact. 22 (4), 456-468 (2009).
  17. Raaijmakers, J. M., De Bruijn, I., Nybroe, O., Ongena, M. Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas: more than surfactants and antibiotics. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1037-1062 (2010).
  18. vábová, L., Lebeda, A. In vitro selection for improved plant resistance to toxin-producing pathogens. J Phytopathol. 153 (1), 52-64 (2005).
  19. Mousa, W. K., Raizada, M. N. The diversity of antimicrobial secondary metabolites produced by fungal endophytes: an interdisciplinary perspective. Front Microbiol. 4, 65(2013).
  20. Bektas, Y., Eulgem, T. Synthetic plant defense elicitors. Front Plant Sci. 5, 804(2015).
  21. Saeed, B., Trujillo, M. Analysis of immunity-related oxidative bursts by a luminol-based assay. Environ Responses Plants: Methods Protoc. , 339-346 (2022).
  22. Brauer, E. K., et al. Transcriptional and hormonal profiling of Fusarium graminearum-infected wheat reveals an association between auxin and susceptibility. Physiol Mol Plant Pathol. 107, 33-39 (2019).
  23. Taylor, P. The wetting of leaf surfaces. Curr Opin Colloid Interface Sci. 16 (4), 326-334 (2011).
  24. Mika, A., Boenisch, M. J., Hopff, D., Lüthje, S. Membrane-bound guaiacol peroxidases from maize (Zea mays L.) roots are regulated by methyl jasmonate, salicylic acid, and pathogen elicitors. J Exp Bot. 61 (3), 831-841 (2010).
  25. Brauer, E. K., et al. Transcriptional profiling and genetic mapping of barley responses to bacterial flagellin. Mol Plant Microbe Interact. 38 (2), 344-352 (2025).
  26. Takáč, T., et al. TALEN-based HvMPK3 knock-out attenuates proteome and root hair phenotypic responses to flg22 in barley. Front Plant Sci. 12, 666229(2021).
  27. Kim, M. G., Macoy, D. M., Lee, J. Y., Cha, J. Y., Kim, W. Y. Interactions between plant immunity, temperature, light, and circadian rhythm. J Plant Biochem Physiol. 9, 260(2021).
  28. Bahadoor, A., et al. Gramillin A and B: cyclic lipopeptides identified as the nonribosomal biosynthetic products of Fusarium graminearum. J Am Chem Soc. 140 (48), 16783-16791 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bitki Mikrop Etkile imleriYaprak Diski Deneyiyon S z nt sPeroksidaz AktivitesiKalloz retimi96 Kuyucuklu PlakaArabidopsis YapraklarArpa YapraklarPop lasyon Geneti i

İlgili makaleler