Kawasaki Hastalığı ile İlişkili Koroner Arteritin Candida albicans Suda Çözünür Ekstrakt ile İndüklenen Murin Modelinin Oluşturulması ve Değerlendirilmesi

Mukokutanöz lenf nodu sendromunun bir formu olan Kawasaki hastalığı (KD), 5 yaşın altındaki çocuklarda ortaya çıkan ve ateşli vaskülit ^1,2,3'ün eşlik ettiği otoimmün bir hastalıktır. Çalışmalar, tedavi edilmeyen veya 10 günlük şiddetli KD'yi aşan tedavi kurslarının, esas olarak koroner anevrizmalar ve koroner arter stenozu dahil olmak üzere ciddi kardiyovasküler komplikasyonlara neden olma eğiliminde olduğunu göstermektedir ^4,5. Koroner anevrizmaların yırtılması, çocuklarda edinilmiş kalp hastalığının ana nedeni olan kardiyojenik şoka ve hatta ani ölüme yol açabilir ^6,7. İntravenöz immünoglobulin uygulaması prognozu önemli ölçüde iyileştirmiş olsa da, etiyolojisi ve patogenezi belirsizliğini korumaktadır^ve bu da hedefe yönelik terapötik stratejilerin geliştirilmesini kısıtlamaktadır ^8,9. Bu nedenle, insan hastalıklarının özelliklerini doğru bir şekilde simüle edebilen hayvan modellerinin oluşturulması, mevcut araştırmalar için acil bir ihtiyaç haline gelmiştir.

Şu anda, Kawasaki hastalığı araştırmalarındaki en büyük engel, insan hastalığı patolojisini tam olarak özetleyen iyi karakterize edilmiş hayvan modellerinin olmamasıdır. Şu anda geliştirilen çeşitli modeller arasında, Lactobacillus casei hücre duvarı ekstresi (LCWE) tarafından indüklenen vaskülit modeli nispeten olgun bir sistemdir ve bu model koroner arterite neden olabilir. KD benzeri vaskülitlerde immün düzensizlik mekanizmasını ve spesifik sitokinleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır^10,11. Candida albicans'ın (CAWS) suda çözünür ekstraktının neden olduğu vaskülit modeli, insan Kawasaki hastalığının^patolojik özelliklerine yüksek benzerliği nedeniyle de büyük ilgi görmüştür ^12,13. Birden fazla araştırma ekibi tarafından sistematik optimizasyon ve iyileştirmeden sonra, CAWS kaynaklı model, Kawasaki hastalığı araştırmaları için önemli bir araç haline geldi¹⁴. CAWS, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla koroner arter inflamasyonunu indükleyebilse de, insan KD vaskülitinin tam patolojik sürecini tam olarak yeniden üretememesi nedeniyle sınırlamaları vardır. Örneğin, insan KD^15'in geç patolojisinde hiçbir nötrofil bulunmadı, ancak bu modelde CAWS enjeksiyonundan 16 hafta sonrasına kadar nötrofil infiltrasyonu meydana geldi¹⁶. Ayrıca, CAWS'nin neden olduğu vaskülit mekanizması şu anda tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır, bu da model^9'un derinlemesine anlaşılmasını ve uygulanmasını sınırlamaktadır. Bu çalışma, KAWS'nin indüksiyon protokolünü optimize ederek, hastalık mekanizmasını aydınlatarak ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırarak KD'nin standartlaştırılmış bir hayvan modelini oluşturmayı amaçlamaktadır.

Bu çalışma, Kawasaki hastalığının daha standart bir hayvan modelini oluşturmak için CAWS'yi kullandı. Sistematik doz optimizasyon deneyleri sayesinde, art arda beş gün boyunca günde 8 mg intraperitoneal enjeksiyonun optimal uygulama rejimi olduğu belirlendi. Bu rejim, hayvanlarda yüksek bir hayatta kalma oranını korurken koroner arter lezyonlarını stabil bir şekilde indükleyebilir. Ek olarak, inflamasyondan fibrozise geçiş sırasında mitokondriyal apoptozu düzenleyen önemli bir protein olan voltaja bağlı anyon kanalı 1'in (VDAC1) olası mekanizmasına odaklanarak, KD'nin kronik fazı sırasında fibroz oluşumunda mitokondriyal disfonksiyonun rolünü daha da araştırdık¹⁷. Bu çalışmada otofagozom/lizozom ortak lokalizasyon analizi ile bu modelde anormal otofaji fonksiyonunun gözlemlendiğini belirtmekte fayda var. Bu optimize edilmiş model, Kawasaki hastalığında koroner arter lezyonlarının patogenezini sistematik olarak incelemek ve yeni tedavi stratejilerini değerlendirmek için önemli bir araç sağlar.

Hayvan verilerini içeren tüm araştırma deneyleri, Nanjing Tıp Üniversitesi Bağlı Huai'an No.1 Halk Hastanesi'nin etik kurulu tarafından onaylanmıştır (KY-2024-250-01). Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. CAWS'nin Hazırlanması

1. Candida albicans'ı Sabouraud dekstroz suyuna Duong ve ^ark.18 tarafından belirlenen protokole göre aşılayın. Daha sonra, aşılanmış suyu 37 °C'de 48 saat boyunca bir gaz karışımı ile kapalı bir anaerobik odada anaerobik olarak kültürleyin.
   NOT: Kültür ortamının sterilitesini sağlamak için, çeşitli bakteriler tarafından kontaminasyonu önlemek için 37 ° C'deki anaerobik kültür koşulu sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir.
2. C sınırlayıcı ortamla tekrar tekrar durulayın ve 37 °C'de 48 saat boyunca 4,5 x g dönme hızında inkübe edin.
3. Eşit hacimde susuz etanol ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de bekletin.
4. 4 °C'de 15 dakika boyunca 4.5 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın, çökeltiye eşit hacimde susuz etanol ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de bırakın.
5. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın, çökeltiye 50 mL aseton ekleyin, santrifüjleyin ve çökeltiyi kurutun. Çökeltiyi daha sonra kullanmak üzere steril normal salin içinde çözün.

2. Kawasaki hastalığının fare modelinin oluşturulması

1. 4-6 haftalık seksen SPF dereceli erkek C57BL/6 fareyi seçin ve onları yiyecek ve suya ücretsiz erişimle kontrollü koşullar altında barındırın.
   NOT: Östrojen seviyesi dalgalanmalarının bağışıklık ve enflamatuar yanıtlar üzerindeki potansiyel etkileşimini en aza indirmek için, bu ön model oluşturma ve karakterizasyon çalışmasında¹⁹ sadece erkek fareler kullanılmıştır.
2. Fareleri, her grupta 20 fare olmak üzere 3 farklı doz CAWS enjeksiyon grubu (4 mg, 8 mg, 12 mg) ve 1 normal salin kontrol grubu dahil olmak üzere rastgele sayı tablosu yöntemiyle eşit olarak 4 gruba ayırın.
3. CAWS tozunu steril normal salin (% 0.9 NaCl) kullanarak 40 mg / mL, 80 mg / mL ve 120 mg / mL olmak üzere üç konsantrasyonda hazırlayın. Deney grubuna deneyin 1. gününden 5. gününe kadar sabahları 0.1 mL CAWS enjekte edin ve aynı programda kontrol grubuna eşit hacimde normal salin uygulayın.
   NOT: İntraperitoneal enjeksiyon 1 mL'lik bir insülin şırıngası kullanılarak yapıldı. Çalıştırırken, şırınga yerleştirildiğinde kalın ve ince bağırsaklar gibi organlara zarar vermemek için fareyi başı aşağıda ve kuyruğu daha yukarıda olacak şekilde konumlandırın.
4. Besleyicide kalan yemi aynı anda tartmak ve her fare kafesi için 24 saatlik yiyecek tüketimini hesaplamak için her gün sabah 9'da bir elektronik terazi kullanın.
5. Son enjeksiyondan sonraki 3., 7., 14. ve 28. günlerde, her zaman noktasında her gruptan rastgele 3 fare seçin ve kurban edin.
6. Fareleri önceden oda havasıyla doldurulmuş kapalı bir odaya yerleştirin. Dakikada hazne hacminin %30'u kadar bir akış hızında sıkıştırılmış_CO2 ekleyin. 5 dakika sonra ölümü doğrulamak için servikal çıkık yapıldı.
7. Kalp örneklerini toplayın ve tartın. HE boyama ile kalp ve kan damarlarının enflamatuar lezyonlarını gözlemleyin.

3. HE boyama ve derecelendirme standartları

1. Kalp ve arkus aortik (yaklaşık 3 mm × 3 mm) hızla izole edildi. Açıklanan yönteme göre medyan sternotomi yapın²⁰. Kalbi aort arkından hızla ayırın (yaklaşık 3 mm × 3 mm). Toplanan dokular 24 saat boyunca %10 nötr tamponlu formalin içinde sabitlendi.
2. Fiksasyondan sonra, dokuları kademeli bir etanol serisi (1 saat boyunca %70 etanol, 1 saat boyunca %80 etanol, 1 saat boyunca %95 etanol ve 1 saat boyunca %100 etanol) ile dehidre edin, ksilen içinde berraklaştırın ve parafine gömün. Son olarak, blokları 5 μm sürekli dilimler halinde bölün.
3. H&E boyama için, bölümleri hematoxylin ile 5 dakika boyayın, akan suda 10 dakika durulayın, eozin ile 2 dakika karşı boyama yapın ve ardından dehidrasyon ve montaj²¹ ile devam edin.
   NOT: Vasküler intimal hasarın derecesine göre üç dereceye ayrılır: Derece I esas olarak endotelyal şişlik ve nötrofil agregasyonu ile karakterizedir; Derece II, düz kas dejenerasyonu, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve organel hasarı olarak kendini gösterir; Derece III, endotelyal nekroz ve dökülme ve fibrin birikimi gibi ciddi lezyonlarla kendini gösterir.

4. Masson trikrom boyama

1. Fiksasyondan sonra, doku örneklerini dereceli bir etanol serisinden dehidre edin, ksilen içinde berraklaştırın ve parafine gömün.
2. Mum alma işleminden sonra, boyamaya hazırlık olarak bölümleri kademeli bir etanol serisinden damıtılmış suya hidratlayın.
3. Çekirdekleri 5 dakika boyunca Weigert'in demir hematoksilini ile boyayın, akan su altında iyice durulayın ve ardından sitoplazmayı 5 dakika boyunca Lichun Kırmızı asit fuksin ile boyayın.
4. 1 dakika boyunca %1 fosfomolibdik asit ile farklılaştırın, ardından kollajen liflerini 3 dakika boyunca doğrudan anilin mavisi ile boyayın. %1 buzlu asetik asit ile hızlıca durulayın.
   NOT: Boyama özgüllüğünü sağlamak için farklılaşma adımının zamanlamasını kesinlikle kontrol edin.
5. Etanol ve ksilen ile dehidrasyondan sonra şeffaf hale geldikten sonra nötr filmi kapatın.
6. Fazla boyayı çıkarmak için lekeli bölümleri akan su altında durulayın.
7. Bölümleri kademeli bir etanol serisinden kurutun, ksilen içinde berraklaştırın ve nötr sakızla monte edin.
8. Kesitleri ışık mikroskobu altında tutarlı büyütmede gözlemleyin. Kollajen lifleri mavi, kas lifleri ve sitoplazma kırmızı ve çekirdekler koyu mavi görünmelidir.

5. İmmünofloresan boyama

1. Hücre veya doku bölümlerini sabitleyin ve spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için 1 saat boyunca %5 BSA ile bloke edin.
2. İkincil antikorla aynı tür kökenli normal serumu kullanın, PBS ile 1:10 oranında seyreltin ve numunenin üzerine bırakın. Oda sıcaklığında 30 dakika kapatın. Kapattıktan sonra PBS ile iki kez hafifçe durulayın.
3. Bölümleri birincil antikorla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. PBS ile yıkadıktan sonra floresan sekonder antikoru ekleyin ve karanlıkta 1 saat inkübe edin.
4. Çekirdeğin DAPI ile boyanması, söndürme önleyici montaj maddesi ile kapatılması ve konfokal mikroskopi altında gözlemlenmesi.

6. İmmünohistokimya

1. Parafin bölümlerinin mumu alındıktan ve hidrasyonundan sonra, antijen onarımı yapın ve endojen peroksidazı bloke edin.
2. Antikor İnkübasyonu ve Renk Gelişimi: Önce normal serumla bloke edin, ardından birincil antikoru ve HRP etiketli ikincil antikoru sırayla inkübe edin ve son olarak DAB renk gelişimi. Reaksiyon derecesini mikroskop altında kontrol edin.
3. Hücre çekirdeklerini hematoksilin ile yeniden boyayın. Dehidrasyon ve şeffaflıktan sonra plakaları kapatın ve kahverengimsi sarı pozitif sinyali mikroskop altında gözlemleyin.
   NOT: Deneyin kontrolleri ayarlaması ve restorasyon ve renk geliştirme koşullarını sıkı bir şekilde kontrol etmesi gerekir.

7. Otolizozom tespiti

1. RAW264.7 makrofajlarını Candida albicans sporları ile uygun bir oranda (10:1) birlikte kültürleyin ve 37 °C'de inkübe edin ve% 5 CO₂ 4 saat, 8 saat, 12 saat, 16 saat, 20 saat, 24 saat, 28 saat, 32 saat, 36 saat, 40 saat, 44 saat ve 48 saat fagositik bir model oluşturmak için.
2. Fagositik olmayan sporları çıkarmak için önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın.
3. İlk olarak, numuneleri 30 dakika boyunca% 5 BSA ile bloke edin. Daha sonra, LC3'e karşı birincil antikor (1:200 seyreltme) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca art arda inkübe edin, ardından Alexa Fluor 488 etiketli ikincil antikor oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
4. Lizozomal lokalizasyonu görselleştirmek için Lyso-Tracker Red lizozom probunu doğrudan hücrelere ekleyin. Son olarak, çekirdekleri 5 dakika boyunca DAPI (1 μg/mL) ile boyayın.
   NOT: Antikorun inkübasyon süresinin ve konsantrasyonunun doğru bir şekilde kontrol edilmesini sağlamak için tüm operasyon süreci karanlıkta gerçekleştirilmelidir.

Başlangıçta, farelerde farklı dozlarda CAWS'nin neden olduğu miyokardiyal patolojik değişiklikleri sistematik olarak değerlendirdik. PBS kontrol grubunda, 4 mg CAWS grubunda ve 8 mg CAWS grubunda (her grupta n=20) ölüm gözlenmedi. Buna karşılık, 4 mg grubundaki inflamatuar yanıt hafifti ve modelleme gereksinimlerini karşılamıyordu. Mortalite oranı 12 mg CAWS grubunda daha yüksekti (9/20, %45) ve ölümler enjeksiyondan sonraki 3. ila 10. günler arasında meydana geldi. Bu bulgular, 12 mg'lık bir dozun aşırı lokal inflamatuar hasara ve sistemik toksisiteye neden olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, bu doz sonraki çalışmalardan çıkarıldı. 8 mg'lık doz, kabul edilebilir bir sağkalım oranını ve minimal lokal advers reaksiyonları korurken önemli koroner arteriti etkili bir şekilde indükleyebildiği için nihayetinde optimal doz rejimi olarak seçildi. (Şekil 1A). Sonunda, 8 mg CAWS'nin intraperitoneal enjeksiyonunun optimal modelleme dozu olduğu belirlendi. Deney grubunun HE boyama sonuçları, tipik bir dinamik inflamasyon ve fibroz süreci gösterdi. Üçüncü gün, esas olarak perivasküler nötrofiller ve monositlerden oluşan fokal inflamatuar infiltrasyon meydana geldi. Yedinci günde, inflamatuar aralık, önemli miyokardiyal hücre şişmesi ve interstisyel ödem ile birlikte miyokardiyal interstisyuma genişledi. 14. günde enflamasyon zirveye ulaştı ve miyokardiyal lif düzenleme bozukluğu ve fokal nekroz meydana geldi. 28. günde enflamasyon hafiflemesine rağmen erken fibrozis oluşmuştu (Şekil 1B ve Şekil 2A). Buna karşılık, kontrol grubunda miyokardiyal yapı tüm zaman noktalarında normal kaldı. Tüm sonuçlar, 8 mg'lık bir CAWS dozunun, Kawasaki hastalığının özellikleriyle tutarlı bir miyokardiyal hasar modelini stabil bir şekilde indükleyebileceğini doğrulayan çift kör bir değerlendirme ile doğrulandı.

Daha sonra, CAWS'nin neden olduğu Kawasaki hastalığı benzeri vaskülitin koroner arterleri (CA) çevreleyen kalıcı fibrozise neden olup olmayacağını araştırmak için Masson üç renkli boyama yöntemi kullanıldı. Deneysel sonuçlar, farelerin CAWS enjeksiyon grubunda, iltihaplı koroner arterlerin ve aortun duvarları çevresinde belirgin kollajen lifi birikintilerinin tespit edildiğini ve bu fibrotik alanların, inflamatuar hücre infiltrasyonunun dağılım konumlarıyla yüksek oranda çakıştığını gösterdi. Buna karşılık, PBS kontrol grubundaki fareler, yalnızca vasküler duvarın normal yapısal aralığı içinde sınırlı olan zayıf kollajen boyaması gösterdi (Şekil 2A). Kantitatif analiz, 14 günde önemli kollajen lifi birikiminin meydana geldiğini ve fibroz derecesinin kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı olduğunu gösterdi (Şekil 2C).

Kawasaki hastalığındaki merkezi patolojik değişikliğin, çoklu bağışıklık hücrelerinin22,23 koordineli etkisini içeren vasküler duvarın immün-inflamatuar yanıtı olduğu göz önüne alındığında, daha sonra immünofloresan (IF) boyama yoluyla CAWS modelindeki immün mikro ortamın karakteristik değişikliklerini araştırdık. CAWS enjeksiyonundan sonraki 14. günde, CAWS enjekte edilen farelerin kalp dokularına immün hücre belirteçlerinin IF boyaması yapıldı. Deneysel sonuçlar, CAWS tedavi grubundaki fareler için modellemenin 14. gününde, koroner arterlerde ve miyokardiyal dokularda CD3+ T hücreleri, CD8+ sitotoksik T hücreleri, CD86+ M1 tipi makrofajlar, F4/80+ makrofajlar ve NK1.1+ doğal öldürücü hücrelerin infiltrasyonunun PBS kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttığını göstermiştir (Şekil 2B,D). Bu bağışıklık belirteçlerinin ekspresyon değişikliklerini sistematik olarak analiz ederek, CAWS modelinin yalnızca insan Kawasaki hastalığının immünolojik özelliklerini doğru bir şekilde simüle edebildiğini doğrulamakla kalmadı, daha da önemlisi, hastalığın ortaya çıkmasında ve gelişmesinde farklı bağışıklık hücresi alt kümelerinin olası mekanizmasını ortaya çıkardı ve hedeflenen bağışıklık müdahale stratejilerinin daha sonra geliştirilmesi için teorik bir temel sağladı.

Araştırmalar, mitokondriyal disfonksiyonun miyokardiyal fibrozun altında yatan anahtar bir mekanizma olduğunu ortaya koymuştur 24,25,26. İnflamatuar stres altında, mitokondriyal kalite kontrolü için kritik bir protein olan voltaja bağlı anyon kanalı 1'in (VDAC1), ekspresyonu yukarı regüle edildiğinde mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin (mPTP) anormal açılmasını tetikleyebileceği kabul edilmektedir. Bu da apoptozu indükler ve fibroblastları17,27 aktive eder. Bu mekanizmayı araştırmak için, immünohistokimya kullanarak kronik fazda VDAC1 ekspresyonunu değerlendirdik. Bulgularımız, PBS kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, CAWS ile tedavi edilen gruptaki farelerin miyokardiyal dokusundaki VDAC1 protein ekspresyonunun, modellemeden 28 gün sonra önemli ölçüde yükseldiğini ortaya koydu (Şekil 3). Pozitif sinyaller ağırlıklı olarak fibrotik alanlarda ve kan damarlarının çevresinde lokalizeydi, bu da VDAC1 aracılı mitokondriyal disfonksiyonun Kawasaki hastalığı modelinde miyokardiyal fibrozise katkıda bulunabileceğini gösteriyor. Bu veriler, CAWS'nin neden olduğu miyokard hasarının moleküler mekanizmaları hakkında deneysel kanıtlar sağlar.

Önceki çalışmalar, VDAC1 aracılı mitokondriyal disfonksiyonun Kawasaki hastalığının miyokardiyal fibroz sürecinde rol oynadığını bulmuştur, ancak spesifik mekanizması henüz açıklığa kavuşturulmamıştır. Mitokondriyal homeostazın korunmasının otofaji-lizozomal sistemin normal fonksiyonuna bağlı olduğu göz önüne alındığında. VDAC1'in otofagolizozomların oluşumunu veya işlevini etkileyerek anormal mitokondriyal birikime yol açarak fibrozu şiddetlendirebileceğini düşünüyoruz. Bu hipotezi doğrulamak için önce makrofajlarda bir Candida albicans spor enfeksiyonu modeli (RAW264.7) (Şekil 4) kurduk ve modelde otofajik akış ve lizozomal aktivitenin dinamik değişikliklerini tespit ettik. Deneysel sonuçlar, otofaji lizozomlarının oluşumunun erken aşamada (hücre enfeksiyonundan sonraki 2-3 saat içinde) arttığını, daha sonraki aşamada (hücre enfeksiyonundan 3-4 saat sonra) otofajik akışın engellendiğini göstermektedir. Otofaji akışındaki değişiklik, otofagozom ve lizozom birlikte lokalizasyonundan sonra birleşme boyamanın değişmesi ile değerlendirilebilir. Bu sonuç, otofagolizozomların işlev bozukluğunun gerçekten de hücresel klirensin bozulmasına yol açabileceğini doğrulamaktadır.

Şekil 1: Kalp ve koroner arterlerin histopatolojik analizi. (A) PBS veya farklı dozlarda CAWS (4 mg, 8 mg ve 12 mg; n = grup başına 20) enjekte edilen farelerin hayatta kalma eğrileri. (B) CAWS tedavi grubundaki (8 mg) kalbin farklı zaman noktalarında (3 gün, 7 gün, 14 gün, 28 gün) HE boyama sonuçları sunuldu. Ölçek çubukları: 1500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kollajen fibrozu ve bağışıklık hücresi infiltrasyonunun analizi. (A) CAWS 8 mg grubunun ve kontrol grubunun Masson boyama sonuçları. Kollajen lifleri karakteristik bir mavi renk sunar, kas lifleri ve sitoplazma kırmızıdır ve hücre çekirdeği koyu mavidir. Oklar mantar sporlarını gösterir. Ölçek çubukları: 1500 μm. (B) CAWS 8 mg grubu ve kontrol grubunun (CD3 etiketli CD3+ T hücreleri, CD8 etiketli CD8+ sitotoksik T hücreleri, CD86 etiketli CD86+ M1 tipi makrofajlar, F4/80 etiketli F4/80+ makrofajlar ve NK1.1 etiketli NK1.1+ doğal öldürücü hücreler) immünofloresan boyama sonuçları. Ölçek çubukları: 200 μm. (C) Kardiyak fibrozun derecesini değerlendirin. Kardiyak fibrozis derecesi, 800x büyütmede görme alanının kalp dokusundaki trikromatik boyanma alanı yüzdesine göre değerlendirildi. Spesifik yöntem aşağıdaki gibidir: Kollajen lifleri makromoleküler anyonik boyalarla parlak yeşile boyandığından, 800 kat büyütmede 100 görsel alan (5 μm kalınlığında tüm dilimler) gözlendi ve kardiyak fibrozun derecesi toplam alandaki yeşil alan yüzdesi ile belirlendi. Yüzde ne kadar yüksek olursa, fibroz o kadar şiddetli olur. (D) Bağışıklık hücrelerinin yüzdesi, immünofloresan boyama sonuçlarına göre istatistiksel olarak analiz edildi,***p 0.001<. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 28. günde PBS grubunda ve CAWS grubunda VDAC1 ekspresyonunun immünohistokimyasal analizi. (A) VDAC1 ekspresyonunun immünohistokimyasal analizi. Ölçek çubuğu: 800 μm. Kahverengi siyah parçacıklar olumlu sonuçlardır. (B) VDAC1 immünohistokimyasal olarak pozitif hücrelerin yüzdesinin istatistiksel analizi, p < 0.001. (C) VDAC1 immünohistokimyasının H-skorunun istatistiksel analizi. Veriler birden fazla biyolojik kopyadan elde edildi (n = grup başına 20 fare) ve sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi ve istatistiksel olarak analiz edildi (***p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Candida albicans'ın fare RAW264.7 hücreleri tarafından fagositozundan sonra otolizozomun tespiti. (A) Oklar mantar sporlarını gösterir. Ölçek çubukları: 25 μm. Otofaji akışındaki değişiklik, otofagozom ve lizozom birlikte lokalizasyonundan sonra birleşme boyamanın değişmesi ile değerlendirilebilir. (B) Otolizozom oluşum hızının zaman süreci analizi, ilgili parametreleri ölçer. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi ve istatistiksel olarak analiz edildi (***p < 0,001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.