Yöntem makalesi

Kromatin ve Epigenetik Yaşlanmanın Görüntüleme Tabanlı Biyobelirteceri ile Tek Hücreli Yaşlanmanın Ölçülmesi

DOI:

10.3791/69057

⸱

30 Ocak 2026

 ,  ,  , 
1Harry Perkins Institute of Medical Research, QEII Medical Centre and Centre for Medical Research, The University of Western Australia, 2Scintillon Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, görüntüleme tabanlı kromatin ve epigenetik yaş (ImAge) çıkarmak ve doğrulamak için görüntüleme ve hesaplama iş akışını sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kişiselleştirilmiş sağlık hizmetlerini ilerletmek ve potansiyel yenilenme stratejilerini değerlendirmek için biyolojik yaşı yansıtan biyobelirteçler çok önemlidir. Görüntüleme tabanlı kromatin ve epigenetik yaş (ImAge) adlı görüntüleme tabanlı bir biyobelirteç olarak tanıttık; bu, tek çekirdeklerde kromatin ve epigenetik işaretlerin mekansal organizasyonundan türetilen görüntüleme tabanlı bir biyobelirteç olarak yaşa bağlı içsel değişiklikleri yakalıyor. ImAge, biyolojik yaşı modüle eden müdahalelerin etkilerini etkili bir şekilde yakalar ve nicelikleşir; gençleştirme stratejileri (örneğin kalori kısıtlaması ve geçici Oct4, Sox2, Klf4 ve Myc (OSKM) ifadesi yoluyla kısmi yeniden programlama gibi) ve kemoterapi gibi tedavilerden sonra artan hassasiyetle hassasiyeti gösterir. Ayrıca, daha düşük ImAge, daha yüksek lokomotor aktiviteyle korelasyonlu, biyolojik yaşın tersine çevrilmesiyle birlikte fonksiyonel iyileşmeleri yakaladığını ve uzun ömür müdahalelerini değerlendirmek için umut vadeden tek hücreli bir araç sunduğunu gösteriyor. ImAge, kaliteli görüntüleme ve titiz hesaplamalı analiz gerektiren bütünleşik bir yöntem olduğundan, onu çıkarmak ve doğrulamak için kapsamlı rehberlik sunmayı hedefliyoruz. Bu kapsamlı protokol, hem ıslak laboratuvar prosedürlerinin (örnek hazırlama ve görüntüleme) hem de açık kaynaklı hesaplama boru hattımızın (ortam kurulumu ve görüntüleme verilerinin işlenmesi) doğru şekilde kullanılması için iş akışını detaylandıracak; böylece ImAge'i çıkarıp doğrulayacak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artan ortalama yaşam süresi ve yaşlanan küresel nüfus, fonksiyonel veya biyolojikyaş 1,2,3 için etkili biyobelirteçlere olan kritik ihtiyacı vurgular. Bu biyobelirteçler, hastalık riskini ve yaşam süresini doğru şekilde tahmin etmek için gereklidir; bu da geriatrik bakımı önemli ölçüde artırabilir ve ilgili maliyetleri azaltabilir. DNA metilasyonu (DNAm) saatleri, biyolojik yaşlanmanın nicelendirilmesindekayda değer ilerlemeler kaydetmiş olsa da, genellikle doğrusal regresyona dayanır ve büyük grupları gerektirir; bu da bireylere özgü incelikli, bağlama bağlı biyolojik bileşenleri göz ardıedebilir 7,8. Ayrıca, bu dizileme tabanlı teknikler hücre lizisi, karmaşık örnek hazırlama ve her hücre için pahalı reaktifler gerektirir; bu da onları yüksek verimlilikli, büyük ölçekli veya uzunlamasına çalışmalar için daha maliyetli ve zorlaştırır; örneklerin yok edilmesinin dezavantajıolduğu yerlerde.

Bu sınırlamaları aşmak için, tek hücre çözünürlükte yaşlanma ve gençleşmeyi nicelikleştiren görüntüleme tabanlı kromatin ve epigenetik yaş (ImAge) adlı yeni bir teknik geliştirdik. Bu teknik, Alvarez-Kuglen ve ark.1 tarafından tanımlandığı şekilde fare periferik kanında ve çeşitli katı organlarda uygulanmış ve doğrulanmıştır. Bu yayın, optimize edilmiş protokoller, diğer araştırmacılar tarafından çeşitli uygulamalar için uyarlanıp benimsenebilecek şekilde ayrıntılı şekilde tanımlanır.

Bu yaklaşım, geleneksel DNA saatlerinden temel olarak farklıdır ve tek çekirdek1 içindeki kromatin ve epigenetik işaretlerin mekansal organizasyonuna dayalı yaşa bağlı içsel yörüngeleri yakalar. Görüntüleme tabanlı yöntemlerin belirgin avantajları vardır: doğası gereği yıkıcı değildir, yani hücreler işlem sırasında yok edilmez, dizileme tabanlı yöntemlerin aksine. Bu yıkıcı olmayan yapı, kromatin ve epigenetik işaretlerin mekansal yapısının tek hücre düzeyinde korunmasını ve doku içindeki hücrelerin mekansal bağlamını korumasını önemli ölçüde sağlar - bu bakış açısı geleneksel dizileme iş akışlarında sıklıkla kaybolur. Ayrıca, görüntüleme teknikleri genellikle büyük ölçekli veya uzunlamasına çalışmalar için daha maliyet etkilidir; çünkü her hücre için pahalı reaktifler veya karmaşık kütüphane hazırlığı gerektirmezler; bu da onları zaman içinde tekrar edilen gözlemler için uygunkılar 10,11.

ImAge'in temel avantajlarından biri, yaşla ilgili yörüngeleri, verinin kendisinin temel özellikleri olarak ortaya koyabilmesi, kronolojik yaş üzerine gerginlik gerektirmeden. ImAge, fare periferik kan mononükleer hücrelerinde ve çeşitli katı organlarda kronolojik yaşla güçlü bir korelasyongöstermiştir 1. Önemli olarak, ImAge biyolojik yaşa yönelik beklenen bozulmaları etkili bir şekilde yakalar; kemoterapi tedavisi sonrası artış ve karaciğer ile iskelet kaslarında geçici OSKM ekspresyonuyla kalori kısıtlaması ve kısmi yeniden programlama ile azalma gösterir. Ayrıca, ImAge okumalarının kronolojik olarak aynı farelerde lokomotor aktiviteyle ters korelasyon gösterdiği gözlemlenmiştir; bu da biyolojik ve fonksiyonel yaşın ölçülmesinde faydalarını gösterir.

ImAge metodolojisinin uygulanması, hem ıslak laboratuvar deneyselprosedürlerinde 12 hem de hesaplamalıanalizlerde uzmanlık gerektirir (Şekil 1); Bu nedenle, bu makale her iki yön için de kapsamlı ve adım adım protokoller sunmaktadır. Bu optimize edilmiş protokol, ImAge'in yaygın benimsenmesini kolaylaştırmayı amaçlar ve araştırmacıların çeşitli hücre tipleri ve dokular arasında tek hücre çözünürlükte kromatin ve epigenetik organizasyondaki yaşa bağlı değişiklikleri araştırmalarını sağlar. Bu protokolde, ImAge'i belirlemek için yeterli kontrast ve çözünürlük sağlayan iki işaretçi olan H3K27ac ve H3K27me3, temsilci işaretler olarak seçildi. Araştırmacılar, bu protokolü biyolojik yaşlanmayı niceliklendirmek, uzun ömür müdahalelerinin etkisini değerlendirmek ve bireysel organizma düzeyinde yaşlanma ve yenilenme süreçlerindeki doğuştan gelen heterojenliği keşfetmek için çoğaltabilirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Scripps Araştırma Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan yönergeler ve protokollere göre yürütülür (Protokol 09-0004-6). Bu makalede sunulan veriler, yaşları 2 ila 14 ay arasında değişen erkek i4F fareleri kullanılarak elde edilmiştir. İlgi çekici organlar (karaciğer ve iskelet kasları) 13,8 aylık i4F ve littermate kontrol farelerinden alındı ve 1 hafta boyunca düşük dozda dokksisiklin (0,2 mg/ml) ile tedavi edildi14. Çekirdekler, genç (3,2 aylık), yaşlı (13,8 aylık) ve doksisiklinle aşırı eksprese edilen OSKM faktörleri (yaşlı-OSKM) ile tedavi edilen yaşlanmış örneklerden izole edildi.

1. Örneklerin görüntülemesi

  1. Numune hazırlama
    1. Yeni disseksiya edilmiş farelerden (veya başka ilgi çekici türden) ilgi çekici organları (karaciğer ve iskelet kasları) toplayın ve sıvı azotla ani donduruldu. Numuneleri kullanmaya hazır olana kadar -80 °C'de sakla.
    2. Organları ve dokuları önceden soğutulmuş bir harva aktarın ve kuru buzun üzerine koyun. Donmuş dokuya sıvı azot dökün ve önceden soğutulmuş bir tokma ile öğütün. Numuneyi önceden soğutulmuş harç ve tokan ile ezerek düzgün ince bir toz elde edilene kadar ezin.
    3. Aliquot, önceden soğutulmuş metal spatula kullanarak dokuyu öğüterek birden fazla tüpe ayırır ve kullanılmayan örnekleri -80 °C'de saklar.
      NOT: Tüplerdeki topraklanmış doku örnekleri -80 °C'de saklanabilir veya çekirdek izolasyonuna devam edebilir.
    4. Üreticinin talimatlarına uygun ticari olarak bulunan Nuclei Lysis Buffer kiti kullanılarak donmuş aliquotlardan çekirdekleri çıkarın.
    5. Trypan Blue kullanarak çekirdekleri say. Çekirdekleri ve Trypan Blue'yu ayrı bir tüpte eşit oranda karıştırın. Çekirdek-Trypan Blue çözeltisinden 10 μl hemositometreye veya otomatik hücre sayacına aktarın.
    6. Örnekleri PBS + %0,5 BSA ile seyreltin ve böylece 10.000 çekirdek 20-30 μL hacimde kaplanabilir.
  2. Kaplama hazırlığı
    1. Plaka hazırlığı ve hesaplama analizi için tüm ilgili meta verileri Plaka Haritası'na girin ( Ek Dosya 1'de sağlanmıştır). Örnek tanımlayıcıları (örneğin, numaralar veya karakterler) sampleID sekmesinde gerçek kuyu plakasıyla aynı düzende kaydedin. Örnek yaşını da dahil olmak üzere deneysel koşulları, durum sekmesindeki gerçek kuyu plakasıyla aynı düzende kaydedin.
      NOT: Durum sekmesinde verilen bilgiler, her örneklemin yaş grubunu (yani genç veya yaşlı) tanımlamak için kullanılacaktır. Bu belirlenen yaş grupları, yaşlanma (ImAge) tahmin modelinin oluşturulmasında referans olarak hizmet verecektir. Bu nedenle, durum sekmesi yaşla ilişkilendirilebilecek verileri ve gerektiğinde diğer ilgili deneysel koşulları içermelidir.
    2. Hedef biyobelirteçleri (örneğin, H3K27me3) kanal# sekmesindeki gerçek kuyu plakasıyla aynı düzende kaydedin (# sayı ile değiştirilir). Tüm metaveri kombinasyonlarının eşleşip platemap sekmesinde ardışık bir tablo formatında doğru şekilde yansıtıldığından emin olun.
      NOT: Tablodaki her sütun, belirlenmiş bir sekme adına (örneğin, "sampleID") karşılık gelmelidir. Proje hedeflerini belgelemek ve detayları boyamak için "metadata" adlı ek bir sekme sunulur; Bu bilgiler veri analizinde kullanılmayacak. Bu sekmeyi gerekli gördüğünde kullanın.
    3. Tab plaka haritasını csv dosya formatı olarak kısa, tanımlayıcı proje adıyla (örneğin, project.csv) dışa aktarın.
      NOT: Meta veri sekmesi, proje amaçlarını ve bağışıklık boyama bilgilerini özetlemek için bir şablon sunar. Platemap şablonundaki meta veri sekmesinin kullanımı, kaplama süreci için isteğe bağlıdır. Ancak, hesaplamalı analiz için sampleID, channel# (# bir numara ile değiştirilir) gibi diğer sekmeler gereklidir.
  3. Bir kuyu plakasında 20 - 30 μL hacimde 10.000 çekirdek/kuyuyu (örneğin, 384 kuyu plakalar) plaka oluşturulur. 1.000 x g (ivme dokuz, yavaşlama 4) 4 °C'de 10 dakika boyunca spin plakası.
  4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de %8 paraformaldehit (PFA) 1:1 hacminde uygula.
    DIKKAT: PFA adımlarını bir duman kapasonesine yerleştirin ve atıkları kurumsal güvenlik prosedürlerine uygun olarak bertaraf edin.
  5. Çözeltiyi çıkarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde 30 μL 0.1 M glisin ekleyin. Çözeltiyi çıkarın. 100 μL PBS ile 2 kat yıkayın ve depolama için 30 μL PBS ekleyin.
    NOT: Hücreler 4 °C'de depolanabilir veya hemen immünoetiketleme işlemi yapılabilir.
  6. İmmünoetiketleme
    1. PBS'i kaldırın. 30 μL bloklayıcı çözelti (%2 BSA ve %0,5 Triton X-100 PBS) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın. Engelleme çözümünü çıkar.
    2. 25 μL birincil antikor ekleyin: Mouse anti-H3K27ac (1:250) ve Rabbit anti-H3K27me3 (1:250) bloklayıcı tamponda seyreltilmiş (0.4 - 2 μg/mL). 4 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
    3. Birincil antikor çözeltisini çıkarın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 μL PBS ile 3 kez yıkayın.
    4. 25 μL ikincil antikor ekleyin: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) ve Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) bloklama tamponu içinde seyreltilmiş (1 - 10 μg/mL). 4 °C'de 2 saat veya oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
    5. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 μL PBS ile 3 kez yıkayın. DAPI/Hoechst ile 30 μL 0.01 mg/mL konsantrasyonda boyan. 100 μL PBS ile yıkayın.
      NOT: Plakayı folyoda 4 °C'de saklayın veya hemen görüntülemeye başlayın. Çekirdek segmentasyonu aşaması için DAPI/Hoechst gereklidir.
  7. Görüntüleme
    1. Yüksek içerikli görüntüleyicide maksimum çözünürlük için görüntü hücreleri (bu veri seti için 20x kullanılmış, ancak 63x önerilir).
      NOT: Görüntüleme herhangi bir yüksek içerikli görüntüleyiciyle yapılabilse de, bu protokol alınan görüntülerin düz klasör yapısını ve elde edilen görüntü çıktısı olarak genel bir görüntü formatını (örneğin .tiff) varsayır (Şekil 2).
    2. Her kuyu başına birden fazla alan ve hücre çekirdeklerinin üstünden aşağısına kadar kapsayan birden fazla z-yığını toplayın. 10 μm kapsama alanı ve z-ekseni (örneğin, 0,5 μm z-adımında 20 z-dilimi) genellikle çoğu fare hücresi çekirdeğini kapsar. Boyut ve gerekli kapsama, ilgi çeken türlere ve hücre türlerine bağlıdır. Temsil eden görüntüleme Şekil 3'te gösterilmiştir.
    3. Görüntüleme verilerini, Şekil 2'de sunulan klasör yapısına uygun olarak hesaplamalı analizin yapılacağı bilgisayara aktarın.
    4. Yukarıda 1.2.2 adımında tanımlanan proje adının kare-paranezli önekini görüntü veri klasörüne ekleyin (örneğin, [proje]original_folder_name)

2. Görüntüleme verilerinin hesaplamalı analizi

  1. Sistem yazılımı gereksinim hazırlığı (Sadece İlk kurulum için gereklidir)
    1. Windows makinesinde çalışıyorsa Windows Alt Sistemi (WSL) kurulumu için https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install'daki talimatları takip edin. Anaconda veya Miniconda'yı kurmak için https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
  2. Hesaplama ortamının hazırlanması (Sadece İlk kurulum için gereklidir)
    1. İş akışı betiklerini github deposundan indirin https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. İndirilen dosyayı açın.
      NOT: Veri depolama yeri keyfi olarak belirlenebilir; ancak, sistem dosya depolama konumundan (örneğin, Windows'ta C sürücüsü) farklı bir dizin seçilmesi önerilir.
    2. Klonlanmış ImAge deposunu varsayılan klasör yapısına uygun şekilde düzenleyin ve doğru script çalıştırma sağlanabilir (Şekil 2).
    3. Linux veya macOS kullanıyorsanız terminal uygulamasını aç. Windows kullanıyorsa WSL uygulamasını açın.
    4. Klasörü klonlanmış depo dosyasına değiştir. Bundan sonra, Komut: terimi, sonraki kodun terminal uygulamasına kopyalayıp yapıştırılması ve ardından Enter tuşuna basılması talimatını ifade eder.
      Komut: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      NOT: "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" yerine kullanıcıya özgü ayar ekleyin. Örneğin, depo D sürücüsünün "analysis" klasöründe açılıp WSL'den erişildiğinde, bu "/mnt/d/analysis" olur.
    5. Conda (Anaconda/miniconda ile yüklenmiş komut satırı uygulaması) kullanarak Python sürüm 3.10 ile yeni bir hesaplama ortamı oluşturun.
      Komut: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
    6. Yeni oluşturulan ortamı etkinleştirin.
      Komut: conda aktive ImAge_workflow
    7. Poetry (bir python paket yöneticisi) pip installer (ImAge_workflow ortamı oluşturulduğunda python paket yükleyicisi kurulmuş) ile kurun.
      Komut: pip install poetry
    8. Şiir kullanarak ön koşulları olan python paketlerini kurun.
      Komut: şiir kurulumu
      DIKKAT: Mevcut klasörün ImAge_workflow klasör olduğundan emin olun; bu da bir komut çalıştırarak doğrulanabilir: pwd.
    9. Daha hızlı hesaplama için segmentasyon aşamasında grafik işlem birimi (GPU) işlevselliğini etkinleştirecek şekilde Conda ortamında CUDA'yı yapılandırın (yalnızca Linux veya Nvidia GPU ile Windows PC için geçerlidir).
      Komut: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "nvidia'yı içe aktar; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; [ -d "$dir/lib" ]; sonra LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      NOT: Scriptler sunucuda GPU kullanılabilirliğini otomatik olarak tespit eder. Eğer GPU yoksa, varsayılan olarak CPU'da çalışır.
  3. Aşağıda açıklandığı gibi hesaplamaları çalıştırın.
    NOT: Hesaplamalı analiz dört adımdan oluşur: çekirdek segmentasyonu, görüntü özelliği çıkarılması, yaşlanma (ImAge) ekseninin inşası ve ImAge'in tahmini. Her işlem python scriptleri kullanılarak gerçekleştirilir; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features ve o4_ImAge_validation. Tüm bu adımlar tek bir Python betiğinde yer alır, main.py. Alınan ImAge okumaları, şu şekilde sunulduğu gibi bir kutu ve keman hikayesi kullanılarak görselleştirilebilir. Şekil 4. ImAge okuması ayrıca basit bir tablo formatında (standart .csv dosya formatı) çıkarılabilir; örnekler satır olarak, ilgili okumalar ve meta veriler sütun olarak temsil edilir. Kullanıcılar, ihtiyaç duyduklarında ImAge okumaları üzerinde ek sayısal analizler yapma esnekliğine sahiptir. Bu grafikler ve CSV dosyası tek bir Python betiği ile elde edilebilir, visualization.py. ImAge tahmin süreci, aynı dokudaki bireysel hücrelerden elde edilen önyükleme sinyallerini kullanır. Bu önlisans sinyalleri, rastgele örnekleme ve tekrarlanan yinelemelerden türetilen ortalamalı sinyallerdir. Bu yaklaşım, analizin en güvenilir ve temsilci okumaları yakalamasını ve analizin belirsizliğinin dokunun doğal heterojenliğine orantılı olmasını sağlamayı amaçlar.
    1. Linux veya macOS kullanıyorsanız terminal uygulamasını aç. Windows kullanıyorsa WSL uygulamasını açın.
      Komut: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      DIKKAT: Mevcut klasörün ImAge_workflow klasör olduğundan emin olun; bu da bir komut çalıştırarak doğrulanabilir: pwd.
    2. Ortamı aktive et.
      Komut: conda aktive ImAge_workflow
    3. Kod veya metin düzenleyicide iş akışı/main.py dosyasında analiz parametrelerini yapılandırın (örneğin, Notepad uygulaması, Microsoft Visual Studio Code vb.).
      1. P değişkenindeki proje adını, çıktıları düzenlemek için kullanılan kısa, dosya sistemi güvenli bir tanımlayıcıya ayarlayın (örneğin, p = brain_3ages_k27me3).
      2. Özellik çıkarma kanallarının listesini chs içinde ayarlayın. Analiz için o kanaldan özellikler gerekiyorsa segmentasyon kanalını ekleyin (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. ImageIndex kullanarak dosya adlarından plaka harita sütunlarına görüntü kanalı tanımlayıcılarını haritalayın. Görüntü verisini elde etmek için görüntüleme sisteminin kullandığı kanal etiketi formatını belirleyin ve bu etiketi anahtar olarak kullanın. Her etiketi, 1.2.2. adımda kaydedilen plaka haritasındaki tam ve büyük harf duyarlı sütun başlığına eşleyin (örneğin, imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
        DIKKAT: Sütun adları büyük harf duyarlıdır ve plaka harita dosyanıza karşılık gelmelidir.
      4. Veri konumlarını ayarlayın: orgDataLoadPath veri seti köküne, gerekirse orgDataSubFolder resim alt klasörüne ve resultsSavePath çıktı köküne.
      5. imageFileFormat'ta dosya adı uzantını onaylayın ve imageFileRegEx'i gerekli tüm parçalar için Python isimli yakalama gruplarını kullanacak şekilde düzenleyin: satır, kol, alan, zposition ve kanal. Aşağıdaki sözdizimi kullanın: (? P\d+), burada GROUP satır, kol, alan, zposition veya kanal ile değiştirilir.
        NOT: Dosya adları farklıysa, regex'i güncelleyin; Tüm adlandırılmış gruplar doğru şekilde ayrıştırmalıdır. Örneğin, dosya adı r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff aşağıdaki şekilde dönüştürülmelidir: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. segmentation_ch'deki segmentasyon kanalını, nesne algılamak için kullanılan nükleer kanala ayarlayın (örneğin, segmentation_ch = 'DAPI').
      7. IllumiCorrection ayarlayarak aydınlatma düzeltmesi kullanıp kullanmayacağına karar verin. BaSiC modellerini hesaplamak ve uygulamak için True olarak ayarlanır; Raw görüntüleri işlemek için False olarak ayarlandı.
        NOT: 25 ≥kuyuya sahip plakalar için, sistematik yanlılığı azaltmak amacıyla aydınlatma düzeltmesi önerilir.
      8. Fiziksel voxel boyutunu voxel_dim içinde mikrometre cinsinden [z, y, x] olarak ayarlayın. Aralığı belirlemek için mikroskop meta verileri kullanın (örneğin, voxel_dim = [1.0, 0.6, 0.6]). Dosyayı kaydedin ve her parametreyi doğruladıktan sonra düzenleyiciyi kapatın
    4. ImAge okumalarını elde etmek ve doğrulama yapmak için script çalıştırın. Script çalıştırılırken, terminali veya WSL uygulamasını kapatmayın.
      Komut: Python iş akışı/main.py
      NOT: Script (main.py) segmentasyon, özellik çıkarma, ImAge ekseninin inşasını ve varsayılan olarak tahmin gibi tüm adımları kapsar. Script, her adım için tahmini tamamlanma süresi üretir (örneğin, çekirdek segmentasyonu). Her süreç (örneğin o1_illumination_correction), her işlemden elde edilen sonuçları içeren .pickle formatında ara dosyalar oluşturur. Ancak, bu yalnızca süreçler arasında veri transferi için standartlaştırılmış işlem için tasarlanmıştır ve bu makalede kullanıcı manipülasyonu için değildir. Bununla birlikte, kullanıcıların bu dosyaları manipüle etmesi veya benimsemesi gerekiyorsa, her Python fonksiyonunda yer alan13 veri şekli ve tipleri için dokümantasyona bakabilirsiniz.
    5. Sonuçları görselleştirin ve ham ImAge okumalarını dışa aktararak harici yazılımda ek analiz yapın. Komut: Python iş akışı/visualization.py
      NOT: Bu adım, ImAge okumalarının şekilleri ve tablolarını oluşturur ve dosyalar sırasıyla fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN ve export_o4_ImAge_validation konumundadır (Şekil 2).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temsil edici görüntüler tek hücreler elde etmek için iyi doldurulmalıdır, ancak bireysel çekirdekler birbirine temas etmemelidir, çünkü bu hücre çekirdeklerinin segmentasyonunun kalitesini düşürecektir. Şekil 3, sağlam hesaplamalı analiz sonuçları elde etmek için temsil görüntülemeyi göstermektedir.

Bu yöntem el yazmasında özetlenen sonuçlar, Alvarez-Kuglen ve ark.1'in ImAge el yazmasından uyarlanmıştır. Im...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek Hazırlama
Numune hazırlamak için, ilgi çekici dokuları hemen toplayın ve hemen sıvı azotta hızlı dondurun. Doku harç ve tokan ile öğütülürken, örnek kaybını önlemek için silikon bir harç örtüsü kullanılabilir. Doku ezilmesi zorsa, daha fazla sıvı azot ekleyin. Daha hassas dokular için, örnekler mekanik bozulmaları veya doku hasarını azaltmak için dondurulmadan taze olarak işlenebilir. Çekirdek izolasyon protokolleri doku tipine bağlı olarak optimizasyon gerektir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokollerin ve hesaplama çerçevesinin oluşturulmasında yardımcı oldukları için mevcut ve eski tüm Terskikh laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin R21 AG068913, R21 AG075483, R21 AG083782 hibeleri ve WA Sağlık Bakanlığı'nın Gelecek Sağlık Araştırma ve İnovasyon Fonu (BU/PG: 01760/47004300 A.V.T.'ye kadar desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serum AlbüminiSigma-Aldrich A9647
Eşek Anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa 488 InvitrogenA-21202
Eşek Anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa 555InvitrogenA-31572
GlisinBio-Rad161-0718
Histon H3K27ac antikor (mAb) & nbsp;Aktif Motif39685
Histon H3K27me3 antikor (pAb) Aktif Motif39155
Hoechst 33342InvitrogenH3570
Çekirdek İzolasyon Kiti: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNUC101
Operetta CLS Yüksek İçerikli İmaj CihazıRevvityhttps://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldehit 16% Sulu Çözelti EM DerecesiElektron Mikroskopi Bilimleri15710-S
PBSThermo FisherAM9624
PhenoPlate 384-kuyu MikroplakaRevvity6057302
Triton-XSigmaT8787
Trypan Blue Solution, %0,4 Gibco 15250061 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Kuglen, M., et al. ImAge quantitates aging and rejuvenation. Nat Aging. 4, 1308-1327 (2024).
  2. Zampino, M., et al. Biomarkers of aging in real life: three questions on aging and the comprehensive geriatric assessment. GeroScience. 44 (6), 2611-2622 (2022).
  3. Moqri, M., et al. Biomarkers of aging for the identification and evaluation of longevity interventions. Cell. 186 (18), 3758-3775 (2023).
  4. Bell, C. G. DNA methylation aging clocks: challenges and recommendations. Genome Biol. 20 (1), 249(2019).
  5. Horvath, S., Raj, K. DNA methylation-based biomarkers and the epigenetic clock theory of ageing. Nat Rev Genet. 19 (6), 371-384 (2018).
  6. Field, A. E., et al. DNA methylation clocks in aging: Categories, causes, and consequences. Mol Cell. 71 (6), 882-895 (2018).
  7. Galow, A. M., Peleg, S. How to slow down the ticking clock: Age-associated epigenetic alterations and related interventions to extend life span. Cells. 11 (3), 468(2022).
  8. Westneat, D. F., Wright, J., Dingemanse, N. J. The biology hidden inside residual within-individual phenotypic variation. Biol Rev Camb Philos Soc. 90 (3), 729-743 (2015).
  9. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  10. Ninomiya, K. ImAge: quantifying epigenetic ageing with single-cell images. Nat Rev Cancer. 25, 755(2025).
  11. Stepanov, A. I. Genetically encoded epigenetic sensors for visualization of H3K9me3, H3K9ac and H3K4me1 histone modifications in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150715(2024).
  12. Farhy, C., et al. Improving drug discovery using image-based multiparametric analysis of the epigenetic landscape. Elife. 8, e49683(2019).
  13. ImAge_workflow. , https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow (2025).
  14. Chondronasiou, D., et al. Multi-omic rejuvenation of naturally aged tissues by a single cycle of transient reprogramming. Aging Cell. 21 (3), e13578(2022).
  15. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189 (5), 777-782 (2010).
  16. The Open Microscopy Environment. , bioformats. https://github.com/ome/bioformats (2025).
  17. González-Ramírez, M., et al. Differential contribution to gene expression prediction of histone modifications at enhancers or promoters. PLoS Comput Biol. 17 (9), e1009368(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kromatin BiyobelirteciBiyolojik Ya De erlendirmesiekirdek zolasyonumm nofloresan BoyamaHesaplamal G r nt AnaliziHiston ModifikasyonuGen le tirme Stratejileri

İlgili makaleler