Method Article

Somatosensoriyel Nöronlarda Nöronal Membran Proteazomunun Hücre Alt Tipine Özgü Analizi

DOI:

10.3791/69061

⸱

October 10th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal membran proteazomu (NMP) yakın zamanda somatosensoriyel nöronların bir alt kümesinde dokunma, ağrı ve kaşıntı algısının önemli bir düzenleyicisi olarak tanımlandı. Bu makale, hücre sınıflandırması, transkriptom profili oluşturma ve kültür bazlı immünofloresan analizleri kullanarak hücre tipine özgü NMP ekspresyonunu ve fonksiyonunu analiz etmek için sağlam bir iş akışı sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duyusal nöron sinyallemesi, fonksiyonel proteazomlara bağlıdır ve bunların hücre altı lokalizasyonu işlevi etkiler. Özel bir proteazom kompleksi olan nöronal membran proteazomu (NMP), yakın zamanda periferik somatosensoriyel nöronların bir alt popülasyonunda tanımlandı. NMP, yalnızca soma'nın plazma zarına ve hem proksimal hem de distal aksonlara lokalize olur. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), normal koşullar altında NMP'nin ağırlıklı olarak mekanik, kaşıntı ve ağrı hissine aracılık eden MrgprA3+ ve Cysltr2+ nöronlarında eksprese edildiğini ortaya çıkardı. Farelerin pençe derisindeki akut, seçici NMP inhibisyonu, termal hissi etkilemeden mekanik ve ağrı duyarlılığını azalttı. Özellikle, global proteazom inhibisyonunun aksine, seçici NMP inhibisyonu nöropatiye neden olmaz. İn vitro çalışmalar, NMP'nin potansiyel olarak sinyal peptitlerinin salınması yoluyla nöron-nöron iletişimini kolaylaştırdığını ve stimülasyona verilen normal nöronal tepkiler için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu bulgular NMP'yi normal dokunma, ağrı ve kaşıntı hissi için gerekli olan duyusal nöron karışmasının önemli bir düzenleyicisi olarak tanımlamaktadır. Bu nedenle NMP, ağrı yönetimi için potansiyel bir hedefi temsil eder. Bu makale, antikor besleme ve floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak hem NMP eksprese eden hem de NMP eksprese etmeyen nöronal popülasyonları izole etmek için yöntemler sunmaktadır. Bu popülasyonlar, scRNA-seq veya NMP ekspresyon dinamiklerinin kültüre dayalı analizleri yoluyla hücre tipine özgü ekspresyon profili oluşturma için uygundur. Bu yöntemler birlikte, NMP ekspresyon dinamiklerini ve bunun ağrıyla ilişkili hastalık durumlarına katkısını araştırmak için sağlam bir iş akışı sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteazom fonksiyonu, periferik sinir sisteminin (PNS) optimal gelişimi ve bakımı için gereklidir 1,2,3,4,5,6. Proteazom inhibitörlerini kullanan hem in vitro hem de in vivo çalışmalar, proteazomal aktivitenin nörogelişim, miyelinasyon, uyarılabilirlik ve glial hücre fonksiyonu için çok önemli olduğunu göstermektedir 7,8,9,10. Ayrıca, proteazom inhibitörü bazlı kemoterapi, hastaların %30-60'ında, genellikle ekstremitelerde kronik ağrı ve duyu değişikliği ile karakterize ağrılı nöropatilere neden olur 8,9,11,12,13. İlginç bir şekilde, aynı inhibitörlerin düşük dozda uygulanması, ağrılı uyaranlara duyarlılığı azaltır, bu da proteazom için duyusal işlemedekarmaşık bir rol olduğunu düşündürür 6,14,15. Bununla birlikte, bu kapsamlı çalışmalara rağmen, PNS'deki proteazomların spesifik işlevi tam olarak anlaşılamamıştır.

Proteazomlar, yaşamın tüm alanlarında birincil protein bozunma makinesidir ve protein homeostazını korumak için gereklidir16. 20S çekirdek proteazom, α, β, β α alt birimlerinden oluşan dört heptamerik halkadan oluşur ve ubikuitinden bağımsız protein bozunmasına aracılık eder 17,18. Düzenleyici partiküllerle ilişki, ubikuitine bağımlı protein bozunmasına aracılık eden 26S ve 30S kapaklı proteazomu oluşturur 4,17. Nöronlarda, proteazomlar tüm hücresel bölmelerde tanımlanmıştır ve bunların hücre altı lokalizasyonunun işlevi etkilediği bilinmektedir19. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan birçok proteazom inhibitörü, diferansiyel olarak lokalize proteazom popülasyonlarını seçici olarak hedeflemek için özgüllükten yoksundur.

Gerçekten de, geçirgenleştirilmemiş hücrelerde membran geçirimsiz proteazom inhibitörleri ve antikor etiketlemesi kullanılarak, nörona özgü bir proteazom kompleksinin, somatosensoriyel nöronların bir alt kümesinde plazma zarına lokalize olduğu bulundu20. Bir proteazom alt birimine karşı antikor beslemesi ve FACS sıralaması yoluyla NMP+ ve NMP- popülasyonlarına ayrılan birincil dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının scRNA-seq analizi, transkripsiyonel olarak farklı 20 hücre kümesi20 ile sonuçlandı. Daha ileri analizler, NMP+ hücrelerinin 20 kümeden sadece 3'ünde kümelendiğini ortaya çıkardı. Spesifik nöronal alt tipler için gen belirteç setleri kullanılarak 13 farklı somatosensoriyel nöron alt tipi tanımlandı20. NMP+ nöronlarının çoğu, MrgprA3+ ve Cysltr2+ duyu nöronları20 ile kümelenmiştir. Minimum sayıda NMP+ hücresi, hiçbir spesifik gen setinin tanımlanmadığı üçüncü bir kümede kümelendi ve bu nedenle bu küme atanmadan bırakıldı20. MrgprA3+ ve Cysltr2+ nöronları, sırasıyla CGRP-θ ve SST nöronal alt tiplerine karşılık gelen ısıya, mekanik ve kaşıntılı uyaranlara duyarlı C-tipi nosiseptörlerdir21,22. Tanımlanan 20 hücre kümesinden 7 NMP kümesi, Schwann hücreleri, uydu glia ve bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere nöronal olmayan hücrelerle tutarlı gen belirteçlerini eksprese etti ve ayrıca20'si atanmadan bırakıldı. DRG nöron kültürü20 sırasında nöronal olmayanları nöronal hücrelerden ayırmak mümkün olmadığından, bu hücre popülasyonları bekleniyordu.

İşlevinin araştırılması, NMP'nin in vitro inhibisyonu, nöronal uyarılabilirliği KCl, histamin ve αβ-metilenadenozin 5'-trifosfat stimülasyonu20'ye değiştirdi. İn vivo olarak, NMP inhibisyonu, termal duyu20 üzerinde hiçbir etkisi olmaksızın mekanik ve ağrı uyaranlarına duyarlılığı azalttı. Bu bulgular, NMP'nin mekanik, ağrı ve kaşıntı hissinin önemli bir düzenleyicisi ve ağrı yönetimi için potansiyel bir terapötik hedef olduğunu ortaya koymaktadır20. Bununla birlikte, NMP aktivitesini farklı hastalık bağlamlarında ağrı gelişimine bağlayan spesifik mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, ağrı ve nöropati ile ilişkili durumlarda NMP ekspresyon dinamikleri ve işlevi hakkında daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.

Burada, bu makale NMP+ DRG nöronal popülasyonlarını tanımlamak ve izole etmek için sağlam bir iş akışını (Şekil 1) açıklamaktadır. Bu yaklaşım, FACS sıralama, scRNA-seq ve immün boyama kullanılarak NMP ekspresyon dinamiklerinin hücre tipine özgü araştırılmasını sağlar. Bu yaklaşımlar, NMP'nin normal ve çeşitli ağrıyla ilişkili durumlardaki rolünü araştırmak için kullanılabilen, NMP ekspresyonunun hücre tipine özgü bir şekilde yüksek çözünürlüklü analizine olanak tanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney hayvanları kullanılarak açıklanan tüm yöntemler, Chicago Loyola Üniversitesi Stritch Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Sindirim çözeltilerinin, DRG ortamının ve FACS ortamının hazırlanması

  1. 137 mM NaCl, 5.3 mM KCl, 1 mM MgCl2·6H2O, 25 mM sorbitol, 10 mM HEPES ve 3 mM CaCl2·2H2O içeren Tam Salin Solüsyonu (CSS) hazırlayın. NaOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve filtre sterilize edin.
  2. 190 μL stok (H2O'da 5 mg / mL), 84 μL 50 mM EDTA ve 6.5 mL CSS'yi birleştirerek doku ayrışma enzim karışımı çalışma çözeltisini (orta derecede öğütme) hazırlayın. Kullanmadan önce taze hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
  3. 190 μL enzim karışımı stok çözeltisi, 150 μL papain, 84 μL 50 mM EDTA ve 6.5 mL CSS içeren doku ayrışma enzim karışımı (düşük öğütme)-papain çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce taze hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
  4. 5 mL DMEM/F12 ortamında 7.5 mg tripsin inhibitörü ve 7.5 mg BSA'yı birleştirerek BSA/TI/DMEM çözeltisini hazırlayın. Taze hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
  5. 430 mL DMEM/F12'de %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin, %1 glutamin ve %2 50x B27 takviyesini birleştirerek DRG nöron ortamını hazırlayın.
  6. Otoklavlanmış suda %1 FBS, 1x PBS, 25 mM HEPES ve %1 penisilin/streptomisin birleştirerek FACS tamponunu hazırlayın. Taze hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
  7. Protokolün başlamasından yirmi dört saat önce, iki adet 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı tüpü FACS tamponu ile doldurarak ve 4 °C'ye yerleştirerek kaplayın.

2. Tek hücreli DRG nöron süspansiyonunun hazırlanması

  1. Daha önce açıklanan yöntemleri 20,23 izleyerek 4-6 P20-P23 faresinden tüm DRG'leri hasat edin.
  2. DRG'leri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 7 mL doku ayrışma enzim karışımı (orta derecede öğütme) çalışma solüsyonu ekleyin. Hafif çalkalama (döndürerek) ile 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
  3. Gangliyonları 120 × g'da 2 dakika döndürün. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve gangliyonları 7 mL doku ayrışma enzim karışımı (düşük tritürasyon)-papain çalışma solüsyonunda yeniden süspanse edin. Hafif çalkalama (döndürerek) ile 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  4. 120 × g'da 2 dakika döndürün. Süpernatanı çıkarın ve gangliyonları 500 μL BSA/TI/DMEM çözeltisinde yeniden süspanse edin.
  5. Gangliyonları 1 mL tıkalı ateşle parlatılmış cam Pasteur pipetle 12-16x öğütün.
  6. Hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek hücresel kalıntıları filtreleyin. Tüm DRG nöronlarının toplanmasını sağlamak için süzgeci 1 mL BSA/TI/DMEM solüsyonu ile yıkayın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  7. 120 × g'da 2 dakika döndürün. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL DRG ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
    NOT: Bu, tek hücreli DRG nöron süspansiyonudur.

3. NMP pozitif nöronları etiketlemek için antikor besleme

  1. DRG nöron süspansiyonunu, her biri 500 μL içeren iki adet 1,5 mL'lik tüpe bölün ve iki tüpü "birincil" ve "birincil yok" olarak etiketleyin.
  2. "Birincil" etiketli tüpe (1:25 seyreltme) 20 μL keçi anti-proteazom 20S alt birim alfa 2 (PSMA2) antikoru ekleyin.
    1. İsteğe bağlı: PSMA2 antikorunun membran bütünlüğünü ve özgüllüğünü test etmek için, tavuk anti-nörofilament ağır zinciri (NF-H) (1:1.000) ve ardından anti-tavuk (örneğin, 488-konjuge) ikincil (1:250) (adım 3.10) ile inkübe edilen ek bir birincil DRG örneğini ekleyin.
      NOT: Anti-NF-H etiketleme kontrolü, nöronal membran sağlamsa hücresel etiketleme ile sonuçlanmamalıdır.
  3. Hücreleri 37 ° C'de 30 dakika boyunca hafif çalkalama altında inkübe edin.
  4. Birincil antikor inkübasyonu sırasında sıcak filtrelenmiş, sterilize edilmiş 1x PBS.
  5. Tüpleri 200 × g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanın% 90'ını çıkarın (atın).
  6. Nöronları 500 μL sıcak 1x PBS'de yeniden askıya alın. Tüpleri 37 ° C'de 3 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
  7. Toplam üç yıkama için 3.5-3.6 adımlarını tekrarlayın.
  8. Yıkama adımları devam ederken, 4 μL anti-keçi IgG'yi (555 nm florofor) 1.000 μL ılık DRG ortamında (1:250 seyreltme) seyrelterek ikincil antikor hazırlayın.
  9. Üçüncü yıkamadan sonra, hem "birincil" hem de "birincil olmayan" tüpleri 500 μL ikincil antikor çözeltisinde yeniden süspanse edin.
    NOT: Bu noktadan itibaren tüpleri alüminyum folyo ile sararak ışıktan koruyun.
  10. Tüpleri 37 ° C'de 40 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.
  11. Toplam üç yıkama için 3.5-3.6 adımlarını tekrarlayarak hücreleri yıkayın.
  12. Üçüncü yıkamadan sonra, nöronları 300 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri ayrı 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere aktarın ve ışıktan korumak için kapaklı bir buz kovasına buzun üzerine yerleştirin.
  13. Bir önceki güne ait FACS tamponu içeren ön işlem görmüş yuvarlak tabanlı tüpleri, hücreleri içeren tüplerle birlikte buz kovasına yerleştirin ve FACS sıralama adımına geçin.

4. NMP-pozitif (NMP+) ve NMP-negatif (NMP-) nöronların FACS sıralaması yoluyla ayrılması

  1. DRG nöronlarının antikor beslemesinden ve etiketlenmesinden hemen sonra, hücreleri ve kaplanmış tüpleri bir FACS sıralayıcısına götürün.
  2. Hem "birincil" hem de "birincil" tüplere 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) (1:1.000) ekleyin. Buz üzerinde 10-30 dakika inkübe edin.
    NOT: 7-AAD, ölü hücreleri sıralama işleminden çıkarmak için kullanılır.
  3. FACS tamponunu gece boyunca kaplanmış tüplerden çıkarın ve 1 mL taze FACS tamponu ile değiştirin. Bu tüpler, sıralanan nöronlar için toplama tüpleri görevi görür.
  4. Etiketlenmemiş nöronlar için parametreleri ve geçitleri ayarlamak için "birincil yok" etiketli tüpü kullanın.
  5. Duyusal nöronların boyutuyla tutarlı hücreleri izole etmek için ileri saçılma (FSC) geçitleme uygulayın. Duyusal nöron çapları 10 ila 50 μm arasında değişir.
  6. Ölü hücreleri ve kalıntıları (alt taraf saçılımı) dışlamak ve DRG nöronlarının ayrıntı düzeyiyle tutarlı olayları izole etmek (daha büyük yan saçılım) için yan saçılım (SSC) geçitleme uygulayın.
  7. Etiketlenmemiş (NMP-) ve 555 pozitif (NMP+) nöronal popülasyonları tespit etmek için "birincil" tüpü yükleyin ve geçit parametrelerini "birincil yok" numunesiyle belirlendiği şekilde ayarlayın.
  8. 100 μm'lik bir nozul ve 15-20 psi'lik bir sıralama basıncı kullanarak nöronları 555+ ve 555- olarak sıralayın.
  9. Sıralanmış nöronların aşağı akış analizine geçin.

5. NMP+ ve NMP- nöronlarının tek hücreli RNA dizilimi

  1. Sıralanan hücreleri 1,5 mL'lik tüplere aktarın ve buz üzerine yerleştirin. Hücreleri tek hücreli bir dizileme çekirdeğine taşıyın.
  2. NMP+ ve NMP sıralı nöronlar üzerinde hücre başına 30.000 ila 100.000 okuma derinliğinde tek hücreli RNA dizilimi gerçekleştirin.
  3. Spesifik gen ekspresyon profillerine göre hücre kümeleri oluşturmak için ücretsiz olarak kullanılabilen çeşitli yazılım programlarını kullanarak scRNA-seq verilerini analiz edin. Daha önce kullanılan analiz adımları ve programları hakkında daha fazla ayrıntı için Villalón Landeros ve ark.20'ye bakınız.
  4. https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ veya https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all gibi mevcut veritabanlarını kullanarak bireysel nöronal popülasyonları tanımlamak için spesifik gen belirteçlerinin bir listesini oluşturun
  5. Ortaya çıkan hücre kümelerini tanımlamak için spesifik gen belirteçleri listesini kullanın.
    NOT: Daha önce gerçekleştirilen scRNA-seq analizi bağımsız bir danışmanlık şirketi (www.cmcherryconsulting.com) tarafından gerçekleştirilmiştir.

6. Zenginleştirilmiş NMP+ ve NMP- nöronlarının birincil kültürleri

  1. Deneyden bir gün önce, 12 mm'lik yuvarlak lameller 24 oyuklu bir kültür plakasına (1 lamel / kuyu) yerleştirin ve 15 dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayın. Daha sonra 3 kez steril suyla durulayın ve steril bir doku kültürü başlığında havayla kurutun.
  2. Lameller kuruduktan sonra, 0,1 mg/mL poli-L-lizin hidrobromür (PLL) ile kaplayın ve gece boyunca 4 °C'ye koyun.
  3. Deney günü, PLL'yi çıkarın, lamelleri 3 kez steril suyla durulayın ve bir doku kültürü başlığında kurumaya bırakın.
    NOT: PLL kaydedilebilir ve yeniden kullanılabilir.
  4. 125 μL DRG ortamında 10 μL 1 mg/mL laminini seyreltin ve her lamel ortasına 20-30 μL noktalayın.
  5. Kullanmadan önce lamelleri en az 40 dakika laminin ile kaplayın.
  6. FACS ile sınıflandırılmış hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri toplamak için 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve nöronları 50 μL sıcak DRG ortamında yeniden süspanse edin.
  7. Lamelden laminini aspire edin ve lamelin kurumasını bekleyin.
  8. Her lamel üzerine 15-20 μL yeniden askıya alınmış nöron tohumlayın. Tohumlanmış lameller içeren plakayı dikkatlice bir doku kültürü inkübatörüne taşıyın ve hücrelerin yapışmasını sağlamak için en az 30 dakika (en fazla 1 saat) inkübe edin.
  9. Plakayı bir doku kültürü başlığına geri taşıyın ve lameller üzerindeki hücreleri içeren her bir oyuğa 1 mL steril ılık DRG ortamı ekleyin.
    NOT: Pipet ucunu kuyunun alt köşesine indirin ve lamel ile dokunmamak ve hücreleri bozmamak için yavaşça dağıtın. Medyayı çok hızlı eklemek türbülans yaratabilir ve hücreleri yerinden çıkarabilir.
  10. Kültürleri 37 °C'de %5 CO2/%95 nem ile her 2-3 günde bir %75 ortam değişimi ile koruyun.

7. Hücre tipine özgü NMP ekspresyon analizi

  1. Büyük bir parafilm parçasıyla kaplayarak 140 mm'lik bir kültür plakası veya immünofloresan boyama tepsisi hazırlayın.
  2. Steril 5/45 forseps kullanarak, DRG nöronlarını içeren tarafın yukarı baktığından emin olarak, lamellerin doku kültürü kabından boyama tepsisindeki parafilme aktarın.
  3. Hücrelerin kurumasını önlemek için parafilm üzerindeki her lamel üzerine 100 μL DRG ortamı ekleyin.
    NOT: Lamelin hemen kenarından yavaşça pipetleyerek sıvıları ekleyin.
  4. Keçi anti-PSMA2 birincil antikorunu sıcak DRG ortamında 1:20 seyreltmede seyreltin.
  5. P10 filtrelenmemiş uçlu bir aspiratör kullanarak, kenardan aspire ederek medyayı lamelden yavaşça çıkarın. Lamellere 100 μL keçi anti-PSMA2 antikor solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
  6. Birincil antikor solüsyonunu lamellerden dikkatlice aspire edin. 100 μL PBS (oda sıcaklığında) ekleyin ve yıkamak için oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
  7. PBS'yi lamelden aspire edin ve toplam üç yıkama için PBS ilavesini ve aspirasyonunu tekrarlayın.
  8. Keçi karşıtı (örneğin, 555-konjuge) ikincil antikoru sıcak DRG ortamında 1:250 seyreltmede hazırlayın.
  9. Üçüncü yıkamayı takiben, lamel üzerine 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu adımdan itibaren hücreleri ışıktan koruyun.
  10. İkincil antikor solüsyonunu lamelden aspire edin ve 7.6-7.7 adımlarında açıklandığı gibi 3 kez yıkayın.
  11. Son PBS yıkamasını çıkarın ve 1x PBS'de %4 paraformaldehit (PFA), %4 sükroz içeren 100 μL fiksatif çözelti ekleyerek hücreleri sabitleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  12. Fiksatifi aspire edin ve 7.6-7.7 adımlarını tekrarlayarak 3 kez yıkayın.
  13. 1x PBS'ye 100 μL %0.1 iyonik olmayan deterjan (örneğin, Triton X-100) ekleyerek hücreleri geçirgen hale getirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  14. Geçirgenlik çözeltisini aspire edin ve 7.6-7.7 adımlarını tekrarlayarak 3 kez yıkayın.
  15. 1x PBS'de %5 FBS, %5 eşek serumundan oluşan 100 μL bloke edici solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
  16. Bloke edici çözeltide aşağıdaki seyreltmelere göre bir DRG nöron hücre tipine özgü birincil antikor karışımı hazırlayın: tavşan anti-kalsitonin geni ile ilişkili peptit (CGRP) (1:500); izolektin B4, biyotin konjugatı (IB4) (1:50); tavuk anti-NF-H (1:1000).
    NOT: Bu antikorlar birbirleriyle etkileşime girmez ve aynı çözelti içinde bir araya getirilebilir.
  17. Bloke edici solüsyonu çıkarın ve birincil antikor karışımını lamel içine ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
  18. Antikor solüsyonunu çıkarın ve 7.6-7.7 adımlarını tekrarlayarak 3 kez yıkayın.
  19. Streptavidin (örneğin, 647-konjuge), eşek anti-tavşan (örneğin, 488-konjuge) ve eşek anti-tavuğu (örneğin, 405-konjuge) her biri 1:500'e seyrelterek ikincil antikor karışımı çözeltisi hazırlayın.
  20. Son PBS yıkamasını çıkarın ve lamellere 100 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
  21. 7.6-7.7 adımlarını tekrarlayarak 3 kez yıkayın.
  22. İsteğe bağlı: 1-10 μg/mL'de nükleer leke hazırlayın. 100 μL nükleer leke çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin ve 7.6-7.7 adımlarını tekrarlayarak 2x deiyonize su (diH2O) ile yıkayın.
  23. Lamelin son yıkamasını aspire edin ve ince uçlu forseps kullanarak lameli parafilmden kaldırın. Lamelin kenarına tüy bırakmayan bir mendile hafifçe dokundurarak fazla sıvıyı kurulayın.
  24. Bir mikroskop lamı üzerine 7 μL'lik bir montaj ortamı damlacığı yerleştirin. Lameli montaj ortamı damlacığının üzerine yavaşça yerleştirin, hücrelerin aşağı baktığından ve ortamla temas halinde olduğundan emin olun.
  25. Lamelli mikroskop lamlarını kuruması ve lamelin kenarını kapatması için en az 1 saat karanlık, kuru bir çekmeceye veya kutuya koyun. Lamellerin kenarlarını hızlı kuruyan oje ile kapatmayı bitirin ve görüntülemeden önce 10-15 dakika bekleyin.
  26. Mavi, yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı floresansı görselleştirmek için uygun ışık filtreleriyle donatılmış bir floresan veya dönen diskli konfokal mikroskop kullanılarak görüntü slaytları.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMP ile hücre içi proteazomlar arasında ayrım yapma yeteneği, membran geçirimsiz etiketleme yaklaşımlarına dayanır. Antikor beslemesi, yalnızca hücrenin dışından erişilebilen proteazomları etiketlemek için canlı nöronlar üzerinde proteazom alt birimine özgü antikorların kullanılmasına izin verir. Boyutları ve hidrofiliklikleri nedeniyle antikorlar, bozulmamış hücre zarlarını geçemezler24. Canlı nöronlar membran bütünlüğünü koruyarak antikorların hücreye girmesini e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteazomlar tüm hücrelerde gereklidir ve hücre19 boyunca tüm bölmelerde bulunabilir. Merkezi 25,26,27 ve periferik20 sinir sistemlerinin nöronlarında özel bir proteazom kompleksi olan NMP'nin yakın zamanda keşfi, proteazomların işlevine ilişkin mevcut anlayışımızı değiştirdi. Önceki çalışmalar, NMP'nin mekanik, ağrı ve kaşıntı hissine duyarlılığı ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVL, Loyola Üniversitesi Chicago Stritch Tıp Fakültesi'nin başlangıç fonları tarafından desteklendi. FACS ile ilgili tavsiyeleri ve yardımları için Robert Ladd'e teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M HEPES tampon çözeltisi, pH 7,3Kaliteli Biyolojik118-089-721FACS arabelleği
10x PBSThermo Fisher Bilimsel70011-044FACS arabelleği
%16 Paraformaldehit (PFA) stok çözeltisi; EM sınıfıEMS15710Fiksatif Çözüm
1x Fosfat tamponlu salin (PBS)Fisher Bilimsel10-010-023FACS yıkamaları
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpFisher Bilimsel14-959-6FACS tüpleri
7-Aminoaktinomisin D (7-AAD)DavetliA1310 SerisiÖlü hücreleri etiketler
B27 takviyesiThermo Fisher Bilimsel17504044Kültür ortamı
Sığır serum albüminiMilliporeSigmaA9647; CAS: 9048-46-8BSA/TI/DMEM
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl?-2H? O)MilliporeSigmaC7902 (İngilizce)Komple tuzlu su çözeltisi
Tavuk anti-nörofilament ağır zincir (NF-H)MilliporeSigmaAB5539 Serisiantikor
DMEM/F12 1:1Thermo Fisher Bilimsel11320033kültür ortamı; BSA/TI/DMEM
Eşek anti-keçi IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher BilimselA32816 Serisiantikor
Eşek anti-tavşan IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher BilimselA32790 Serisiantikor
DyLight 405 eşek anti-tavukJackson İmmünoAraştırma703-475-155antikor
EDTAMilliporeSigmaE5134; CAS: 6381-92-6Liberase TM/Liberase TL-papain çalışma çözümleri
Fetal Sığır Serumu (FBS)MilliporeSigmaA9647 Serisikültür ortamı/FACS tamponu/bloke edici çözelti
Cam pastör pipeti, 9 inçFisher Bilimsel1367820DTitrurasyon
Keçi anti-PSMA2evde yapılmıştırNAantikor
HEPES tozuMilliporeSigmaH4034 SerisiKomple tuzlu su çözeltisi
HoechstThermo Fisher BilimselH21492nükleer leke
At serumuThermo Fisher Bilimsel26050070Engelleme çözümü
IB4, biyotin konjugatıMilliporeSigmaL2140 Serisiantikor
LamininSigma-AldrichL2020-1MGKültür yemeği
L-glutaminThermo Fisher Bilimsel25030081Kültür ortamı
Liberase öğütme düşük (TL)MilliporeSigma54010200001Liberase TL stok çözümü
Liberase öğütme orta (TM)MilliporeSigma5401119001Liberase TM stok çözümü
Magnezyum klorür heksahidrat (MgCl?-6H? O)MilliporeSigmaM2393 SerisiKomple tuzlu su çözeltisi
Montaj ortamıGüney Biyoteknoloji0100-01Flor Montajı-G
PapainWorthingtonKedi #: 9001-73-4Liberase TL-papain çalışma çözümü
Penisilin/streptomisinMilliporeSigma15140122kültür ortamı/FACS tamponu
Poli-L-lizin hidrobromür (PLL)MilliporeSigmaP4707Kültür yemeği
Potasyum klorür (KCl)MilliporeSigmaP5405 (İngilizce)Komple tuzlu su çözeltisi
Tavşan anti-CGRPİmmünostar24112antikor
sodyum klorür (NaCl)MilliporeSigmaS9888; CAS: 7647-14-5Komple tuzlu su çözeltisi
SorbitolMilliporeSigma56755-MKomple tuzlu su çözeltisi
Streptavidin Alexa Fluor 647 eşleniğiThermo Fisher BilimselS21374antikor
SakarozSigma-AldrichS0389-500GFiksatif Çözüm
Tripsin inhibitörüMilliporeSigmaT9253; CAS: 9035-91-8BSA/TI/DMEM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cartelli, D., Cavaletti, G., Lauria, G., Meregalli, C. Ubiquitin proteasome system and microtubules are master regulators of central and peripheral nervous system axon degeneration. Cells. 11 (8), 1358(2022).
  2. Fortun, J., et al. Impaired proteasome activity and accumulation of ubiquitinated substrates in a hereditary neuropathy model. J Neurochem. 92 (6), 1531-1541 (2005).
  3. Thibaudeau, T. A., Smith, D. M. A practical review of proteasome pharmacology. Pharmacol Rev. 71 (2), 170-197 (2019).
  4. Türker, F., Cook, E. K., Margolis, S. S. The proteasome and its role in the nervous system. Cell Chem Biol. 28 (7), 903-917 (2021).
  5. VerPlank, J. J. S., Lokireddy, S., Feltri, M. L., Goldberg, A. L., Wrabetz, L. Impairment of protein degradation and proteasome function in hereditary neuropathies. Glia. 66 (2), 379-395 (2018).
  6. Moss, A., et al. A role of the ubiquitin-proteasome system in neuropathic pain. J Neurosci. 22 (4), 1363-1372 (2002).
  7. Meregalli, C., et al. Bortezomib-induced painful neuropathy in rats: a behavioral, neurophysiological and pathological study. Eur J Pain. 14 (4), 343-350 (2010).
  8. Meregalli, C. An overview of bortezomib-induced neurotoxicity. Toxics. 3 (3), 294-303 (2015).
  9. Velasco, R., Alberti, P., Bruna, J., Psimaras, D., Argyriou, A. A. Bortezomib and other proteosome inhibitors-induced peripheral neurotoxicity: from pathogenesis to treatment. J Peripher Nerv Syst. 24 (Suppl 2), S52-S62 (2019).
  10. Cavaletti, G., et al. Bortezomib-induced peripheral neurotoxicity: a neurophysiological and pathological study in the rat. Exp Neurol. 204 (1), 317-325 (2007).
  11. Cata, J. P., et al. Quantitative sensory findings in patients with bortezomib-induced pain. J Pain. 8 (4), 296-306 (2007).
  12. Meng, L., et al. Peripheral neuropathy during concomitant administration of proteasome inhibitors and factor Xa inhibitors: identifying the likelihood of drug-drug interactions. Front Pharmacol. 13, 757415(2022).
  13. Mina, S. A., et al. Post-marketing analysis of peripheral neuropathy burden with new-generation proteasome inhibitors using the FDA adverse event reporting system. Turk J Hematol. 38 (3), 218-221 (2021).
  14. Holzer, A. -K., Suciu, I., Karreman, C., Goj, T., Leist, M. Specific attenuation of purinergic signaling during bortezomib-induced peripheral neuropathy in vitro. Int J Mol Sci. 23 (7), 3734(2022).
  15. Meng, L., et al. a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (18), 10403-10408 (1999).
  16. Maupin-Furlow, J. Proteasomes and protein conjugation across domains of life. Nat Rev Microbiol. 10 (2), 73-82 (2012).
  17. Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem. 65 (1), 801-847 (1996).
  18. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 Å resolution. Nature. 386 (6624), 463-471 (1997).
  19. Pines, J., Lindon, C. Proteolysis: anytime, any place, anywhere. Nat Cell Biol. 7 (8), 731-735 (2005).
  20. Landeros, E. V., et al. The nociceptive activity of peripheral sensory neurons is modulated by the neuronal membrane proteasome. Cell Rep. 43 (4), 114058(2024).
  21. Qi, L., et al. A mouse DRG genetic toolkit reveals morphological and physiological diversity of somatosensory neuron subtypes. Cell. 187 (6), 1508-1526.e16 (2024).
  22. Sharif, B., Ase, A. R., Ribeiro-da-Silva, A., Séguéla, P. Differential coding of itch and pain by a subpopulation of primary afferent neurons. Neuron. 106 (6), 940-951.e4 (2020).
  23. Krueger, E. R., Church, T. R., Brennan, A., Türker, F., Landeros, E. V. Protocol to study neuronal membrane proteasome function in mouse peripheral sensory neurons. STAR Protoc. 6 (1), 103552(2025).
  24. Chiu, M. L., Goulet, D. R., Teplyakov, A., Gilliland, G. L. Antibody structure and function: the basis for engineering therapeutics. Antibodies. 8 (4), 55(2019).
  25. Ramachandran, K. V., et al. Activity-dependent degradation of the nascentome by the neuronal membrane proteasome. Mol Cell. 71 (1), 169-177.e6 (2018).
  26. He, H. -Y., et al. Neuronal membrane proteasomes regulate neuronal circuit activity in vivo and are required for learning-induced behavioral plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (3), e2216537120(2023).
  27. Paradise, V., et al. ApoE isoforms differentially regulate neuronal membrane proteasomes to shift the threshold for pathological aggregation of endogenous tau. bioRxiv. , (2022).
  28. Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , 2nd edn, MIT Press. (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuronal Membrane ProteasomeSomatosensory NeuronsSensory Neuron SignalingDorsal Root GangliaAntibody FeedingFlow CytometryCell Type SpecificitySingle Cell RNA SequencingProteasome InhibitionPain Sensation

Related Articles